Питательная среда для селективного накопления yersinia enterocolitica и yersinia pseudotuberculosis

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии, в частности, для диагностики иерсиниоза и псевдотуберкулеза. Питательная среда содержит дистиллированную водку, пептон, дрожжевой экстракт, натрия хлорид, иргасан. Изобретение позволяет улучшить селективность питательной среды, сократить срок накопления иерсений. 1 табл.

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для диагностики иерсиниоза и псевдотуберкулеза путем выделения энтеропатогенных иерсиний из клинического материала и объектов внешней среды.

Известно использование для накопления бактерий Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis буферно-казеиново-дрожжевой (БКД) среды [1]. Недостатками указанной среды являются низкие селективные свойства и длительное время накопления энтеропатогенных иерсиний.

Целью настоящего изобретения является улучшение селективности среды и сокращение срока накопления иерсиний в материале.

Поставленная цель достигается тем, что для приготовления И-бульона используют пептон, дрожжевой экстракт, натрия хлорид, иргасан и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, г/л:

пептон	9,0-11,0
дрожжевой экстракт	4,9-5,1
натрия хлорид	19,0-21,0
иргасан	0,0039-0,0040
дистиллированная вода	остальное

Все компоненты среды, за исключением иргасана, растворяют в дистиллированной воде и доводят значение рН до 7,4±0,2. Среду стерилизуют в автоклаве при температуре 120-122°С в течение 14-16 минут. Иргасан растворяют в асептических условиях при помешивании в 1,5-2,5 мл стерильной дистиллированной воды при температуре 45-50°С. После стерилизации в остывшую до 45-50°С основу вносят раствор иргасана и тщательно перемешивают. Готовую среду разливают в стерильные пробирки.

Посев материала в среду производят общепринятыми методами. Учет производят после 24-48 часов инкубации при температуре 32°С. Культура иерсиний вырастает в виде равномерного помутнения среды.

Для сравнения со средой БКД в серии экспериментов у И-бульона определяли чувствительность, селективные свойства, морфолого-физиологические признаки выделенных на этой среде иерсиний.

Для определения чувствительности сред производили смыв ночных культур иерсиний со скошенного питательного агара и стандартизировали полученную суспензию до 10 единиц по ОСО 42-28-59-85 и готовили ее десятикратные разведения. По 0,1 мл взвеси из разведении 10^-5, 10^-6, 10^-7 и 10^-8 засевали в пробирки с испытуемыми средами (по 3 пробирки). Пробирки с И-бульоном инкубировали при 32°С, со средой БКД - при 5°С, время инкубации в обоих случаях составило 24 ч. Чувствительность сред определяли по наибольшему разведению, обеспечивающему видимый рост во всех пробирках с испытуемой средой. Установлено, что по изучаемому показателю И-бульон не отличается от среды БКД (показатель чувствительности составил 10^-7).

Селективные свойства сред оценивали путем посева 0,1 мл микробной взвеси ночных агаровых культур, содержащих 1000 колониеобразующих единиц иерсиний или возможных ассоциантов в чистой культуре в пробирки с испытуемыми средами. В качестве ассоциантов использовали культуры Providencia rettgeri, Providencia stuartii, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Salmonella Typhimurium, а в качестве контрольной среды - триптонсоевый агар в общепринятой прописи. Посевы в И-бульоне инкубировали при 32°С, а в среде БКД при 5°С в течение 24 ч. До начала инкубирования и после него содержимое пробирок перемешивали и высевали методом секторных посевов [2] на 3 чашки с TSA, которые инкубировали 24 часа при 37°С. Показатель подавления роста (ППР) определяли как отношение концентраций микроорганизмов в испытуемых средах (КОЕ/мл) в конце и начале инкубирования. Результаты приведены в таблице.

Показатели подавления роста (ППР) сред через 24 ч инкубирования
Тест-штаммы	Величина ППР испытанных сред
Предложенная среда	Ближайший аналог
У. enterocolitica серовара 03	100000	5
У. enterocolitica серовара 09	100000	5
У. pseudoluberculosis	100000	5
Р. rettgeri	0	1
Р. stuartii	0	1
К. oxytoca	0	3
К. pneumoniae	0	1
S. aureus	0	1
Е. coli	0	1
Е. faecalis	0	3
Е. cloacae	0	1
Р. aeruginosa	100000	1
Р. mirabilis	0	1
Р. vulgaris	0	1
S. liquefaciens	10	3
S. marcescens	10	3
S. typhimurium	0	1

Морфологические, тинкториальные, физиолого-биохимические и антигенные свойства иерсиний, выросших в И-бульоне, соответствовали таковым после культивирования на среде сравнения - БКД.

Пример.

В фекалии здоровых людей, помещенные в И-бульон, вносят культуру штамма ГИСК188 Y. enterocolitica 03 (1000 КОЕ/мл). Посевы инкубируют при 32°С в течение 24 ч. Из пробирок делают высевы на чашки с И-агаром, которые затем инкубируют 48 ч при 32°С. Выделенные на них культуры иерсиний подвергают реидентификации по физиолого-биохимическим и антигенным свойствам. После 24 ч инкубации иерсинии обнаружены в 34 пробах из 36 (94,4%).

Таким образом, по сравнению с ближайшим аналогом, И-бульон имеет улучшенные селективные характеристики и позволяет проводить накопление энтеропатогенных иерсинии в более сжатые сроки.

Источники информации

1. Ценева Г.Я. Жидкая питательная среда для выделения иерсинии / Г.Я.Ценева, Ф.Г.Дятлов, М.С.Идина // Лаб. дело. - 1990. - №5. - С.66-68.

2. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / Под. ред. В.В.Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - С.316-317.

Питательная среда для селективного накопления Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis, содержащая пептон, дрожжевой экстракт, натрия хлорид, иргасан и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, г/л:

Пептон	9,0-11,0
Дрожжевой экстракт	4,9-5,1
Натрия хлорид	19,0-21,0
Иргасан	0,0039-0,0040
Дистиллированная вода	Остальное