Способ дифференциации микрофлоры урогенитального тракта человека
Владельцы патента RU 2260054:
Кузьмин Михаил Дмитриевич (RU)
Черкасов Сергей Викторович (RU)
Бухарин Олег Валерьевич (RU)
Иванов Юрий Борисович (RU)
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в практической работе бактериологических лабораторий для установления диагностической значимости микроорганизмов при местных инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиотических состояниях урогенитального тракта человека. Способ осуществляют путем забора исследуемого материала, его посева на селективные питательные среды, выделения и идентификации чистых культур микроорганизмов, определения у выделенных микроорганизмов способности к инактивации антимикробного белка тромбоцитов. К нормальной микрофлоре урогенитального тракта человека относят микроорганизмы, не обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов или обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов 20% и менее. Использование способа позволяет повысить точность диагностики воспалительных заболеваний урогенитального тракта человека микробной этиологии и эффективность выбора рациональной антибиотикотерапии. 6 табл.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в практической работе бактериологических лабораторий для установления диагностической значимости микроорганизмов при местных инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиотических состояниях урогенитального тракта человека с целью повышения эффективности диагностики и корригирующей терапии.
Рост вялотекущих и персистирующих инфекций урогенитального тракта человека [1], вызываемых условно-патогенными микроорганизмами [2], диктует необходимость поиска новых способов дифференциации нормальной микрофлоры урогенитального тракта от этиологических агентов местных инфекционно-воспалительных процессов.
Известно определение видового состава микрофлоры урогенитального тракта человека для дифференциации нормальной микрофлоры от возбудителей местных инфекционно-воспалительных заболеваний [3, 4].
Однако в настоящее время большинство дисбиотических и местных инфекционно-воспалительных состояний урогенитального тракта вызывается микроорганизмами, которые могут быть отнесены к нормальной либо контаминирующей микрофлоре, что затрудняет дифференциацию представителей нормальной микрофлоры от возбудителей инфекционно-воспалительного процесса [4, 5, 6].
Известна дифференциация резидентной и транзиторной стафилококковой микрофлоры, основанная на оценке способности микроорганизмов к инактивации лизоцима [7] или их устойчивости к коммерческому препарату лейкоцитарного интерферона [8].
Однако указанные способы предназначены лишь для дифференциации резидентной и транзиторной стафилококковой микрофлоры у бактерионосителей в носовой полости и не могут быть использованы для других видов микроорганизмов и иных экологических ниш.
Наиболее близким по совокупности признаков к заявляемому способу является способ дифференциации микрофлоры урогенитального тракта человека, основанный на определении видового состава микроорганизмов и их способности к инактивации бактерицидных факторов - лизоцима (антилизоцимной активности) и комплемента (антикомплементарной активности) [9].
Существенным недостатком данного способа является необходимость определения у выделенных микроорганизмов способности к инактивации нескольких бактерицидных факторов (лизоцима и комплемента), что трудоемко в условиях клинической лаборатории и занимает длительное время. Кроме того, известно, что представители нормальной микрофлоры также обладают выраженной способностью к инактивации лизоцима и комплемента [10, 11], что также затрудняет дифференциацию нормальной микрофлоры от возбудителей инфекционно-воспалительного процесса.
Заявляемый способ решает задачу повышения эффективности дифференциации микрофлоры урогенитального тракта человека, что способствует улучшению диагностических и лечебных мероприятий.
Для решения указанной задачи в заявляемом способе дифференциации микрофлоры урогенитального тракта человека проводят забор исследуемого материала, его посев на селективные питательные среды, выделение и идентификацию чистых культур микроорганизмов, у выделенных микроорганизмов определяют способность к инактивации антимикробного белка тромбоцитов, при этом к нормальной микрофлоре урогенитального тракта человека относят микроорганизмы, не обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов или обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов 20% и менее.
Новым в заявляемом способе является то, что у выделенных микроорганизмов определяют способность к инактивации антимикробного белка тромбоцитов, при этом к нормальной микрофлоре урогенитального тракта человека относят микроорганизмы, не обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов или обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов 20% и менее.
Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат состоит в том, заявляемый способ путем определения способности микрофлоры урогенитального тракта к инактивации антимикробного белка тромбоцитов позволяет повысить точность диагностики воспалительных заболеваний урогенитального тракта микробной этиологии, что способствует выбору рациональной антибиотикотерапии.
Известно, что одним из бактерицидных факторов макроорганизма, играющих ключевую роль в уничтожении различных микроорганизмов, является антимикробный белок тромбоцитов [12].
Известно использование феномена способности микроорганизмов к инактивации бактерицидных факторов в клинике для дифференциальной диагностики заболеваний, вызываемых патогенными и условно-патогенными микроорганизмами [13], а также для выбора рациональной терапии и оценки ее эффективности [14].
Авторами установлены различия в распространенности и выраженности способности к инактивации лизоцима, комплемента, антимикробного белка тромбоцитов у микроорганизмов, выделенных из урогенитального тракта здоровых лиц и больных хроническими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта (уретрит, простатит).
Антимикробный белок тромбоцитов получали известным способом [15].
| Таблица 1 Распространенность способности к инактивации различных бактерицидных факторов у микроорганизмов, выделенных из урогенитального тракта здоровых лиц (n=10) | |||
| микроорганизмы | Распространенность способности к инактивации бактерицидных факторов (абс./%) | ||
| Лизоцим | Комплемент | Антимикробный белок тромбоцитов | |
| Staphylococcus spp. (n=25) | 18/72 | 16/64 | 5/20 |
| Micrococcus spp. (n=10) | 5/50 | 10/100 | 2/20 |
| Streptococcus spp. (n=10) | 7/70 | 9/90 | 1/10 |
| Corynebacterium spp.(n=17) | 14/82,4 | 14/82,4 | 1/5,9 |
| Таблица 2 Распространенность способности к инактивации различных бактерицидных факторов у микроорганизмов, выделенных от больных хроническими неспецифическими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта (n=21) | |||
| микроорганизмы | Распространенность способности к инактивации бактерицидных факторов (абс./%) | ||
| Лизоцим | Комплемент | Антимикробный белок тромбоцитов | |
| Staphylococcus spp. (n=39) | 36/92 | 31/86,1 | 20/51,3 |
| Micrococcus spp. (n=5) | 3/60 | 5/100 | 2/40 |
| Streptococcus spp. (n=11) | 7/63,6 | 9/81,8 | 3/27,3 |
| Enterococcus spp. (n=15) | 15/100 | 15/100 | 11/73,3 |
| Enterobacteriaceae (n=9) | 9/100 | 9/100 | 9/100 |
| Corynebacterium spp. (n=11) | 10/90,9 | 10/90,9 | 4/36,4 |
Способность выделенных микроорганизмов к инактивации комплемента, лизоцима, антимикробного белка тромбоцитов определяли по известным методикам [16, 17, 18].
Результаты исследований представлены в таблицах 1, 2, 3, 4. Как видно из таблиц 1 и 2, у штаммов микроорганизмов, выделенных от здоровых лиц и больных хроническими неспецифическими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, отсутствуют достоверные различия по распространенности способности к инактивации лизоцима и комплемента. В то же время от больных хроническими неспецифическими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта достоверно чаще выделяются микроорганизмы, обладающие способностью инактивировать антимикробный белок тромбоцитов.
| Таблица 3 Выраженность способности к инактивации различных бактерицидных факторов у микроорганизмов, выделенных из урогенитального тракта здоровых лиц (n=10). | |||
| Микроорганизмы | Выраженность способности к инактивации бактерицидных факторов | ||
| Лизоцим, мкг/мл | Комплемент, ан ти-СН50 | Антимикробный белок тромбоцитов, % | |
| Staphylococcus spp. (n=25) | 0,7±0,5 | 3,6±2,7 | 11±2,2 |
| Micrococcus spp. (n=10) | 0,6±0,3 | 2,5±1,2 | 6,5±3,7 |
| Streptococcus spp. (n=10) | 0,8±0,5 | 3,47±2,03 | 15,0 |
| Corynebacterium spp.(n=17) | 0,7±0,3 | 4,3±2,1 | 7,0 |
| Таблица 4 Выраженность способности к инактивации различных бактерицидных факторов у микроорганизмов, выделенных от больных хроническими неспецифическими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта (n=21). | |||
| микроорганизмы | Выраженность способности к инактивации бактерицидных факторов | ||
| Лизоцим, мкг/мл | Комплемент, анти-СН50 | Антимикробный белок тромбоцитов, % | |
| Staphylococcus spp. (n=39) | 2,3±0,8 | 7,3±2,5 | 27,5±2,5* |
| Micrococcus spp. (n=5) | 1,1±0,2 | 11±2,2 | 14,5±2,5 |
| Streptococcus spp. (n=11) | 1,3±0,6 | 3,7±2,5 | 13,7±2,1 |
| Enterococcus spp. (n=15) | 2,1±0,9 | 7,2±2,9 | 34,8±2,5* |
| Enterobacteriaceae (n=9) | 1,5±0,5 | 16,7±0,5 | 57,7±1,5* |
| Corynebacterium spp. (n=11) | 1,2±1,2 | 7,4±3,2 | 9,5±2,5 |
| *- p<0,05 по сравнению со штаммами, выделенными от здоровых лиц. |
Как видно из таблиц 3 и 4, у штаммов микроорганизмов, выделенных от здоровых лиц и больных хроническими неспецифическими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, отсутствуют достоверные различия по степени выраженности способности к инактивации лизоцима и комплемента, тогда как выраженность способности микроорганизмов, выделенных от больных хроническими неспецифическими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, к инактивации антимикробного белка тромбоцитов достоверно выше.
Авторами при изучении клинических штаммов микроорганизмов установлены пороговые значения способности микроорганизмов к инактивации антимикробного белка тромбоцитов, позволяющие отнести их к нормальной микрофлоре урогенитального тракта. Результаты представлены в таблицах 5 и 6.
| Таблица 5 Выраженность способности к инактивации антимикробного белка тромбоцитов у микроорганизмов, выделенных из урогенитального тракта здоровых лиц (n=10) | |||
| Микроорганизмы | Выраженность способности к инактивации антимикробного белка тромбоцитов, % (абс./%) | ||
| 0-10 | 11-20 | >20 | |
| Staphylococcus spp. (n=25) | 23/92 | 2/8 | 0/0 |
| Micrococcus spp. (n=10) | 9/90 | 1/10 | 0/0 |
| Streptococcus spp. (n=10) | 9/90 | 1/10 | 0/0 |
| Corynebacterium spp. (n=17) | 17/100 | 0/0 | 0/0 |
| Таблица 6 Выраженность способности к инактивации антимикробного белка тромбоцитов у микроорганизмов, выделенных от больных хроническими неспецифическими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта (n=21) | |||
| микроорганизмы | Выраженность способности к инактивации антимикробного белка тромбоцитов, % | ||
| 0-10 | 10-20 | >20 | |
| Staphylococcus spp. (n=39) | 20/51,3 | 2/5,1 | 17/43,6 |
| Micrococcus spp. (n=5) | 3/60 | 2/40 | 0/0 |
| Streptococcus spp. (n=11) | 8/72,7 | 3/27,3 | 0/0 |
| Enterococcus spp. (n=15) | 4/26,7 | 0/0 | 11/73,3 |
| Enterobacteriaceae (n=9) | 0/0 | 0/0 | 9/100 |
| Corynebacterium spp. (n=11) | 10/90,9 | 1/9,1 | 0/0 |
Как видно из таблиц 5 и 6, микроорганизмы, выделенные из урогенитального тракта здоровых лиц, не обладают способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов более 20%, тогда как микроорганизмы, выделенные от больных местными неспецифическими инфекционно-воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, гораздо чаще (от 43,6 до 100%) инактивируют антимикробный белок тромбоцитов более 20%.
Способ осуществляется следующим образом.
Стерильным уретральным зондом или ложкой Фолькмана осуществляют забор исследуемого материала (отделяемое уретры и/или секрет простаты). Семенную жидкость получают путем мастурбации.
Исследуемый материал методом секторных посевов [19] засевают на селективные питательные среды. Посевы инкубируют при 37°С в течение 24-48 часов.
Идентификацию выделенных штаммов микроорганизмов проводят общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических и антигенных свойств [20].
У выделенных культур микроорганизмов определяют способность к инактивации антимикробного белка тромбоцитов.
Способность микроорганизмов к инактивации антимикробного белка тромбоцитов выражают в % инактивации антимикробного белка тромбоцитов в опыте по сравнению с контролем.
При этом к нормальной микрофлоре урогенитального тракта человека относят микроорганизмы, не обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов, либо обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов 20% и менее.
Примеры конкретного выполнения способа.
Пример 1. У больного В., 34 лет, с диагнозом "хронический неспецифический уретрит" уретральным зондом был осуществлен забор отделяемого уретры, которое было засеяно на селективные питательные среды (Columbia-agar, среда Эндо, желточно-солевой агар). Через 48 часов инкубации при 37°С были выделены в чистой культуре и по совокупности признаков идентифицированы как Staphylococcus epidermidis (показатель микробной обсемененности - 104 КОЕ/мл) и Corynebacterium genitalium (показатель микробной обсемененности -103 КОЕ/мл). Для дифференциации нормальной микрофлоры от возбудителя уретрита у выделенных микроорганизмов была изучена способность к инактивации антимикробного белка тромбоцитов. Штамм C.genitalium не обладал способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов, что позволило отнести его к нормальной микрофлоре урогенитального тракта, а штамм S.epidermidis обладал способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов 25%, что позволило отнести его к возбудителю уретрита. Изучение спектра чувствительности к антибиотикам и проведение целенаправленной антибиотикотерапии привело к элиминации возбудителя и клиническому выздоровлению.
Пример 2. У больного М., 45 лет, с диагнозом "Хронический простатит. Бесплодие" из эякулята были выделены в чистой культуре микроорганизмы, которые по совокупности признаков идентифицированы как Esherichia coli, Staphylococcus hominis и Enterococcus faecalis. С целью дифференциации нормальной микрофлоры от возбудителей простатита у выделенных микроорганизмов была определена способность к инактивации антимикробного белка тромбоцитов согласно примеру 1. Выявлено, что штамм E.coli обладал способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов 50%, штамм S. hominis обладал указанной способностью 10% и штамм Е. faecalis - 35%. На основании полученных данных S. hominis был отнесен к представителю нормальной микрофлоры урогенитального тракта, a E.coli и E.faecalis - к возбудителям хронического простатита. Проведение курса направленной антибиотикотерапии привело к элиминации E.coli и E.faecalis и купированию воспалительного процесса в предстательной железе.
Таким образом, использование заявляемого способа позволяет повысить точность диагностики воспалительных заболеваний урогенитального тракта человека микробной этиологии и выбора рациональной антибиотикотерапии.
Источники информации
1. Wong E.S., Hooton T.M., Hill C.C. et al. Clinical and microbiological features of persistent or recurrent nongonococcal urethritis in men // J.Infect. Dis. - 1988. - Vol.158(5). - P.1098-1101.
2. Nickel J.C., Costerton J.W. Coagulase-negative staphylococcus in chronic prostatitis // J.Urol. - 1992. - Vol.147(2). - P.398-400; discussion P.400-401.
3. Шмидт У., Хартманн М., Пфютцнер X. Спектр возбудителей при негонококковых уретритах // Вести, дерматол. венерол. - 1988. - №10. - С.32-34.
4. Magnanelli S., Wilks М., Boake T. et al. Quantitative bacteriology of seminal fluid in health and disease // Microb. Ecol. Health. Dis. - 1990. - Vol.3. - No.3. - P.129-137.
5. Kumar В., Dawn G., Sharma М., Malla N. Urethral flora in adolescent boys // Genitourin. Med. - 1995. - Vol.71. - No.5. - P.328-329.
6. Dominigue G.J., Sr., Hellstrom W.J.G. Proctatitis // Clin. Microbiol. Rev. - 1998. - Vol.11. - No.4. - P.604-613.
7. Чернова О.Л. Антилизоцимная активность стафилококков при бактерионосительстве // Персистенция микроорганизмов." Куйбышев, 1987. - С.22-30.
8. Патент РФ 2092562 C 12 Q 1/04. Опубл. 10.10.1997.
9. Иванов Ю.Б. Факторы персистенции микрофлоры репродуктивного тракта мужчин в норме и при патологии. Автореф. дисс... канд. мед. наук. - Оренбург, 1998. - С.7-11. (прототип).
10. Бухарин О.В., Иванов Ю.Б., Кузьмин М.Д., Михайленко С.В. Характеристика изменений микробиоценоза у больных хроническим неспецифическим уретритом // Журн. микробиол. - 2001. - №4. - С.86-89.
11. Черкасов С.В., Забирова Т.М., Сгибнев А.В., Черкасов И.В. Роль биологических свойств вагинальных лакбобацилл в процессах колонизации // Журн. микробиол. - 2003. - №4. - С.61-64.
12. Yeaman M.R. The role of platelets in antimicrobial host defense // din. Infect. Dis. - 1997. - Vol.25. - P.951-970.
13. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство. - Екатеринбург: УрО РАН, 1996. - С.114-132.
14. Иванов Ю.Б., Кузьмин М.Д. Коррекция микроэкологических нарушений урогенитального тракта мужчин препаратами андрогенов // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2002. - №3. - С.151-154.
15. Yeaman M.R., Puentes S.M., Norman D.C., Bayer A.S. Partial characterization and staphylocidal activity of thrombin-induced microbicidal protein // Infect. Immun. - 1992. - Vol.60. - P.1202-1209.
16. Брудастов Ю.А. Антикомплементарная активность бактерий: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук, - Челябинск, 1992. - 21 с.
17. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Малышкин А.П., Немцева Н.В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов // Журн. микробиол. - 1984. - №2. - С.27-28.
18. Бухарин О.В., Сулейманов К.Г., Чернова О.Л. и др. Способность микроорганизмов к инактивации бактерицидного действия тромбоцитарного катионного белка (β-лизина) // Бюлл. экспер. биол. мед. - 1998. - Т.126. - №7. - С.66-67.
19. Фельдман Ю.М., Маханева Л.Г., Шапиро А.В., Кузьменко В.Д. Количественное определение микроорганизмов в клиническом материале // Лаб.дело. - 1984. - №10. - С.616-619.
20. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. // J.G.Holt ed, 9th ed. Vol.1-2. - Baltimore, 1986.
Способ дифференциации нормальной микрофлоры урогенитального тракта человека от возбудителей инфекционно-воспалительного процесса, включающий забор исследуемого материала, его посев на селективные питательные среды, выделение и идентификацию чистых культур микроорганизмов, определение способности выделенных микроорганизмов к инактивации бактерицидных факторов, отличающийся тем, что в качестве бактерицидного фактора используют антимикробный белок тромбоцитов и к нормальной микрофлоре урогенитального тракта человека относят микроорганизмы, обладающие 20%-ной и менее способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов либо не обладающие такой способностью.
