Тест-набор для определения лекарственной чувствительности и первичной идентификации микобактерий туберкулеза
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологии и может быть использовано при индивидуальном подборе лекарственных препаратов для лечения туберкулеза. Тест-набор на основе среды Левенштейна-Йенсена состоит из 8 флаконов. Четыре флакона из которых дополнительно содержат противотуберкулезные препараты, первый флакон - изониазид, второй флакон - рифампицин, третий - стрептомицин, четвертый - этамбутол. Следующие два флакона, один из которых дополнительно содержит салицилат натрия, а другой - тиофенкарбоксигидразид. Другие два флакона являются контрольными. Набор дополнительно содержит один флакон с реактивом Грисса. Изобретение позволяет ускорить определение лекарственной чувствительности и проводить одновременно их идентификацию. 4 табл.
Изобретение относится к медицинской микробиологии, касается производства диагностических препаратов и может быть использовано при индивидуальном подборе лекарственных препаратов для лечения туберкулеза.
В практических лабораториях России для определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза в основном используют среду Левенштейна-Йенсена лабораторного приготовления с добавлением противотуберкулезных препаратов, рекомендованную к применению Приказом МЗ РФ №109 (Приложение 11. Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза) [1]. Однако использование этой среды позволяет получить данные о лекарственной чувствительности возбудителя лишь через 3-5 недель. Кроме этого среды лабораторного приготовления являются нестандартными, что приводит к получению недостоверных результатов.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является набор для определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза «Mycobiogramme» производства французской фирмы «BioMerieux» [2], состоящий из пробирок со средой Левенштейна-Йенсена следующего состава, г/л:
| калия дигидрофосфат | 1,50 г |
| магния сульфат | 0,15 г |
| магния цитрат | 0,38 г |
| L-аспарагин | 2,25 г |
| глицерин | 7,50 мл |
| крахмал картофельный | 18,75 г |
| малахитовый зеленый | 0,25 г |
| яичная масса | 625 мл |
| дистиллированная вода | 375 мл |
с добавлением противотуберкулезных препаратов в концентрациях, мкг/мл:
| изониазид | 0,1 |
| изониазид | 1,0 |
| рифампицин | 20,0 |
| рифампицин | 40,0 |
| стрептомицин | 4,0 |
| стрептомицин | 10,0 |
| этамбутол | 2,0 |
| этамбутол | 3,0 |
| ПАСК (парааминосалициловая кислота) | 0,5 |
| ПАСК | 1,0 |
| пиразинамид | 200,0 |
Определение лекарственной чувствительности микобактерий с использованием набора-прототипа проводят визуально по наличию видимого роста. Этот процесс длительный и занимает от 14 до 28 дней, что значительно осложняет своевременную корреляцию проводимого больному этиотропного лечения. Помимо этого набор - дорогостоящий и недоступен большинству практических лабораторий России.
Задачей настоящего изобретения является создание тест-набора для ускоренного определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза с их одновременной первичной идентификацией по появлению красной окраски.
Поставленная задача решается тем, что разработан тест-набор для определения лекарственной чувствительности и первичной идентификации микобактерий туберкулеза на основе среды Левенштейна-Йенсена с добавлением противотуберкулезных препаратов, отличающийся тем, что набор состоит из 8 флаконов со средой Левенштейна-Йенсена, дополнительно содержащей нитрат натрия или нитрат калия в концентрации 0,6-1,2 г/л, а крахмал - в растворимой форме в концентрации 15,0-20,0 г/л, при этом четыре флакона, предназначенные для определения лекарственной чувствительности, дополнительно содержат противотуберкулезные препараты, первый флакон - изониазид в концентрации 1 мкг/мл, второй флакон - рифампицин в концентрации 40 мкг/мл, третий - стрептомицин в концентрации 10 мкг/мл, четвертый - этамбутол в концентрации 2 мкг/мл, два флакона, предназначенные для первичной идентификации микобактерий туберкулеза, один из которых дополнительно содержит салицилат натрия в концентрации 1000 мкг/мл, а другой - 2-тиофенкарбоксигидразид в концентрации 2 мкг/мл, два флакона являются контрольными, и дополнительно набор содержит один флакон с реактивом Грисса для регистрации результатов по появлению красной окраски.
Предлагаемый тест-набор по сравнению с прототипом характеризуется короткими сроками 2-7 суток определения лекарственной чувствительности микобактерий по появлению красной окраски, возможностью в эти же сроки провести идентификацию микобактерий. Это достигается за счет
1) введения в среду Левенштейна-Йенсена крахмала в растворимой форме, что улучшает ростовые свойства среды, повышает скорость роста микобактерий, сокращает сроки учета результатов и не влияет на критические концентрации противотуберкулезных препаратов (табл.1, 2),
2) введения в среду нитрата натрия или калия, а в состав тест-набора реактива Грисса, что позволяет провести учет результатов по появлению красной окраски, не дожидаясь видимого роста микобактерий на среде.
3) использования в составе тест-набора одного флакона с салицилатом натрия и одного флакона с 2-тиофенкарбоксигидразидом, совокупность которых позволяет провести первичную идентификацию анализируемой культуры микобактерий (табл.3).
| Таблица 1 Влияние используемой формы крахмала на скорость роста M.tuberculosis | |||
| Микобактерии | Время культивирования при 37°С (сут.) | Контрольный флакон (Среда Левенштейна-Йенсена с нитратом натрия или калия) | |
| крахмал в растворимой форме | крахмал картофельный (из прототипа) | ||
| М.tuberculosis 1 | 7 | Красная окраска | Окраски нет |
| М.tuberculosis 2 | 7 | Красная окраска | Розовая окраска |
| М.tuberculosis 3 | 7 | Розовая окраска | Окраски нет |
| M.tuberculosis 4 | 6 | Красная окраска | Розовая окраска |
| M.tuberculosis 5 | 5 | Розовая окраска | Окраски нет |
| M.tuberculosis 6 | 5 | Розовая окраска | Окраски нет |
| M.tuberculosis 7 | 6 | Красная окраска | Окраски нет |
| M.tuberculosis 8 | 6 | Красная окраска | Окраски нет |
| M.tuberculosis 9 | 4 | Розовая окраска | Окраски нет |
| Красная окраска - характеризует интенсивный рост культуры Розовая окраска - характеризует слабый рост культуры Окраски нет - отсутствие роста культуры |
| Таблица 2 Влияние формы крахмала на результаты определения лекарственной чувствительности M.tuberculosis | ||||||||||
| Исследуемый изолят | Срок наблюдения | Крахмал | Контроль | Контроль | Изониазид | Рифампицин | Стрептомицин | Этам-бутол | Натрия салицилат | ТКГ |
| М.tuberculosis H37Ra | 7 | Раств. форма | + | + | - | - | - | - | - | + |
| 7 | Карт. | + | + | - | - | - | + | - | + | |
| М.tuberculosis Академия | 7 | Раств. форма | + | + | - | - | - | - | - | + |
| 7 | Карт. | + | + | + | - | + | - | - | + | |
| М.tuberculosis 138 | 7 | Раств. форма | + | + | - | - | + | - | - | + |
| 7 | Карт. | + | + | - | - | + | + | - | + | |
| М.tuberculosis 8 | 7 | Раств. форма | + | + | + | - | - | - | - | + |
| 7 | Карт. | + | + | + | + | - | - | - | + | |
| M.tuberculosis 118 | 7 | Раств. форма | + | + | - | + | - | - | - | + |
| 7 | Карт. | + | + | + | + | - | + | - | + | |
| * + - наличие красной окраски во флаконах - - отсутствие красной окраски во флаконах |
Пример 1.
Приготовление питательной среды. Навески ниже перечисленных ингредиентов питательной среды:
| калия дигидрофосфат | 1,50 г |
| натриянитрат | 1,00 г |
| магния сульфат | 0,15 г |
| магния цитрат | 0,38 г |
| L-аспарагин | 2,25 г |
| глицерин | 7,50 мл |
| крахмал в растворимой форме | 18,75 г |
| малахитовый зеленый | 0,25 г |
растворяют в указанной последовательности в 375 мл дистиллированной воды при подогревании, не доводя до кипения, и стерилизуют в автоклаве 20 мин при температуре 121°С.
После охлаждения к основе питательной среды добавляют 625 мл яичной массы, фильтруют.
Пример 2.
Питательную среду готовят, как описано в примере 1, но ингредиенты, отличающие среду от среды Левенштейна-Йенсена: калия нитрат и крахмал в растворимой форме, используют в следующих концентрациях:
| калия нитрат | 1,2 г |
| крахмал растворимый | 20,0 г |
Пример 3.
Питательную среду готовят, как описано в примере 1, но натрия нитрат и крахмал в растворимой форме, используют в следующих концентрациях:
| калия нитрат | 0,6 г |
| крахмал растворимый | 15,0 г |
Пример 4.
Приготовленную питательную среду в соответствии с примерами 1, 2, 3 разливают поровну в восемь стерильных колб.
В шесть колб вносят при перемешивании один из следующих препаратов:
изониазид - 0,125 мг,
рифампицин - 5 мг,
стрептомицин - 1,25 мг,
этамбутол - 0,25 мг,
натрия салицилат - 125 мг,
2-тиофенкарбоксигидразид (ТКГ) - 0,25 мг
для получения конечных концентраций изониазида - 1 мкг/мл, рифампицина - 40 мкг/мл, стрептомицина - 10 мкг/мл, этамбутола - 2 мкг/мл салицилата натрия - 1000 мкг/мл, ТКГ - 2 мкг/мл. Затем содержимое всех восьми колб разливают в стерильные флаконы и проводят термокоагуляцию.
Тест-набор комплектуют в соответствии с составом:
| Питательная среда (контроль) | - 2 флакона, |
| Питательная среда с 1 мкг/мл изониазида | - 1 флакон, |
| Питательная среда с 40 мкг/мл рифампицина | - 1 флакон, |
| Питательная среда с 10 мкг/мл стрептомицина | - 1 флакон, |
| Питательная среда с 2 мкг/мл этамбутола | - 1 флакон, |
| Питательная среда с 1000 мкг/мл салицилата натрия | - 1 флакон, |
| Питательная среда с 2 мкг/мл ТКГ | - 1 флакон, |
| Реактив Грисса | - 1 флакон. |
Хранение тест-набора осуществляют в темном месте при температуре 2-8°С не более 5 месяцев.
Пример 5.
Определение лекарственной чувствительности культур микобактерий проводят параллельно на предлагаемом тест-наборе и на наборе-прототипе. На тест-наборе дополнительно осуществляют первичную идентификацию микобактерий туберкулеза. Определение лекарственной чувствительности и первичную идентификацию микобактерий туберкулеза осуществляют методом, основанным на способности микобактерий туберкулеза восстанавливать нитраты в нитриты. Нитраты легко определяются с помощью реактива Грисса, который вызывает появление красной окраски. Определение лекарственной чувствительности микобактерий с использованием набора-прототипа осуществляют методом пропорций по наличию видимого роста.
Восемь флаконов с питательными средами предлагаемого тест-набора засевают культурами микобактерий туберкулеза в соответствии с Приказом МЗ РФ №109. Пробирки с питательными средами набора-прототипа засевают в соответствии с инструкцией по применению.
Учет результатов на прототипе проводят через 14-28 суток инкубирования посевов по наличию визуального роста микобактерий, на предлагаемом тест-наборе - через 2-7 суток по изменению окраски путем внесения реактива Грисса в виде водного 7,5% раствора реактива Грисса в количестве 0,5 мл или в сухом виде в количестве нескольких кристалликов в каждый из 8 флаконов тест-набора. Культура считается чувствительной к противотуберкулезному препарату, если во флаконе с данным препаратом не происходит появления красной окраски (при интенсивной окраске в контрольном флаконе). Культура считается устойчивой при появлении красной окраски во флаконе с противотуберкулезным препаратом.
Первичную идентификацию микобактерий туберкулеза проводят по появлению красной окраски во флаконе с ТКГ и отсутствию красной окраски во флаконе с салицилатом натрия. Нетуберкулезные микобактерии, обладающие способностью восстанавливать нитраты в нитриты, вызывают одновременное появление красной окраски во флаконах и с салицилатом натрия, и с ТКГ.
Результаты испытаний трех примеров тест-набора получились идентичными и представлены в таблицах 3,4.
| Таблица 3 Определение лекарственной чувствительности и первичная идентификация микобактерий | ||||||||
| Исследуемый изолят | Срок наблюдения | Контроль | Натрия салицилат | ТКГ | Изониазид | Рифампицин | Стрептомицин | Этам-бутол |
| М. tuberculosis H37Ra | 7 | *+ | - | + | - | - | - | - |
| М. tuberculosis 135 | 7 | + | - | + | + | + | + | + |
| М. tuberculosis | 6 | + | - | + | + | - | - | - |
| Исследуемый изолят | Срок наблюдения | Контроль | Натрия салицилат | ТКГ | Изониазид | Рифампицин | Стрептомицин | Этам-бутол |
| 138 | ||||||||
| М. kansasii 413 | 7 | + | + | + | + | - | + | + |
| М. fortuitum 12 | 2 | + | + | + | + | + | + | + |
| + - наличие изменения окраски во флаконах - - отсутствие изменения окраски во флаконах |
Данные, представленные в таблицах, позволяют охарактеризовать исследуемые культуры, как штамм М. tuberculosis H37Ra, чувствительный к четырем лекарственным препаратам; клинический изолят М. tuberculosis 135, устойчивый к изониазиду, рифампицину, стрептомицину, этамбутолу; клинический изолят М. tuberculosis 138, устойчивый к изониазиду, а также М. kansasii 413, устойчивый к изониазиду, стрептомицину, этамбутолу и М. fortuitum 12, устойчивый ко всем четырем противотуберкулезным препаратам, что полностью совпадает с результатами, полученными на наборе-прототипе.
| Таблица 4 Сроки определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза | |||
| Исследуемый материал | Сроки окончания наблюдения (сутки) | Совпадение результатов (%) по чувствительности | |
| тест-набор | прототип | ||
| М tuberculosis 129 | 7 | 28 | 100 |
| М. tuberculosis 131 | 6 | 28 | 100 |
| М. tuberculosis 106 | 7 | 28 | 100 |
| M. tuberculosis 112 | 5 | 28 | 100 |
| M. tuberculosis 107 | 5 | 21 | 100 |
| Исследуемый материал | Сроки окончания наблюдения (сутки) | Совпадение результатов (%) по чувствительности | |
| тест-набор | прототип | ||
| М. tuberculosis 104 | 7 | 28 | 100 |
| М. tuberculosis 156 | 6 | 28 | 100 |
| M. tuberculosis 161 | 7 | 28 | 100 |
| M. tuberculosis 130 | 7 | 28 | 100 |
| M. tuberculosis 147 | 7 | 28 | 100 |
| M. fortuitum 12 | 2 | 14 | 100 |
| M. tuberculosis H37Ra | 7 | 21 | 100 |
| M. tuberculosis 135 | 5 | 21 | 100 |
| M. tuberculosis 138 | 5 | 28 | 100 |
Из приведенных данных видно, что использование предлагаемого тест-набора приводит к сокращению сроков определения лекарственной чувствительности микобактерий до 2-7 суток по отношению к 14-28 суткам на наборе-прототипе при 100% совпадении результатов. Кроме определения лекарственной чувствительности предлагаемый тест-набор позволяет провести дополнительно первичную идентификацию микобактерий туберкулеза.
Предлагаемый тест-набор нетрудоемок и удобен в использовании, не требует дополнительного оборудования и специальной подготовки персонала, и что немаловажно, дешев, а по срокам определения лекарственной чувствительности приближается к автоматизированным системам типа ВАСТЕС.
Разработана технология и организовано производство промышленного изготовления тест-набора в удобной упаковке для транспортировки и последующей работы. Промышленное производство с осуществлением входного контроля сырья и контроля конечного продукта позволяет производить стандартные недорогие тест-наборы. Проведены клинические испытания тест-набора в пяти регионах страны при исследовании около 1000 клинических изолятов микобактерий туберкулеза, получены положительные результаты. Оформлен пакет научно-технической документации на производство тест-набора, который находится на утверждении в Фармакопейном комитете.
Использование во фтизиобактериологических лабораториях предлагаемого тест-набора промышленного изготовления позволит ускорить определение лекарственной чувствительности микобактерий, увеличить надежность получаемых результатов, а также даст возможность получать сравниваемые данные по регионам для точной оценки эпидемической ситуации в стране. А удобная форма выпуска в герметично закрытых флаконах и достаточный срок хранения позволяет доставлять и использовать тест-наборы в самых отдаленных регионах страны.
Источники информации
1. О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации. Приказ МЗ РФ №109 от 21.03.03 г.
2. Culture Media Manual, bio Merieux, 1994 Edition.
Тест-набор для определения лекарственной чувствительности и первичной идентификации микобактерий туберкулеза на основе среды Левенштейна-Йенсена с добавлением противотуберкулезных препаратов, отличающийся тем, что набор состоит из 8 флаконов со средой Левенштейна-Йенсена, дополнительно содержащей нитрат натрия или нитрат калия в концентрации 0,6-1,2 г/л, а крахмал - в растворимой форме в концентрации 15,0-20,0 г/л, при этом четыре флакона, предназначенные для определения лекарственной чувствительности, дополнительно содержат противотуберкулезные препараты, первый флакон - изониазид в концентрации 1 мкг/мл, второй флакон - рифампицин в концентрации 40 мкг/мл, третий - стрептомицин в концентрации 10 мкг/мл, четвертый - этамбутол в концентрации 2 мкг/мл, два флакона, предназначенные для первичной идентификации микобактерий туберкулеза, один из которых дополнительно содержит салицилат натрия в концентрации 1000 мкг/мл, а другой - 2-тиофенкарбоксигидразид в концентрации 2 мкг/мл, два флакона являются контрольными, и дополнительно набор содержит один флакон с реактивом Грисса для регистрации результатов по появлению красной окраски.
