Штамм бифидобактерий bifidobacterium lactis 668, используемый для приготовления кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, бактериальных препаратов и косметических средств

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой, косметической, биотехнологической, медицинской промышленности и ветеринарии с целью укрепления здоровья, в частности при приготовлении кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Штамм Bifidobacterium lactis 668 выделен из содержимого кишечника здорового ребенка и депонирован в ВКПМ под №Ас-1673. Изобретение обеспечивает повышение биологической активности штамма и его устойчивости к условиям внешней среды, ускорение размножения на искусственных питательных средах, кислотообразующую и антагонистическую активность в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Получение штаммов, обладающих подобными свойствами, способствует расширению ассортимента пробиотиков, используемых для поддержания здоровья, в частности для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов человека и животных. 2 табл.

 

Область техники

Изобретение относится к новым штаммам бифидобактерий и их использованию в пищевой, косметической, биотехнологической, медицинской промышленности и ветеринарии с целью укрепления здоровья. Заявляемый штамм, в частности, может использоваться при приготовлении кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.

Уровень техники

В связи с неблагоприятными экологическими условиями, длительной и иногда бессистемной антибиотикотерапией увеличивается количество людей и животных, страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам, содержащим бифидобактерии.

Продукты, содержащие бифидобактерии, являются эффективным средством профилактики, а также лечения различных желудочно-кишечных заболеваний, а также кишечных дисбактериозов, обусловленных перенесенными кишечными и другими заболеваниями, длительной антибиотикотерапией, лучевой и химиотерапией, стрессовыми воздействиями, неблагоприятными условиями окружающей среды и другими факторами.

Устойчивость бактерий к условиям желудочно-кишечного тракта является важным критерием для отбора штаммов, способствующих укреплению здоровья.

Качество лечебно-профилактических продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента - его специфической активностью и технологичностью. Большой ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий делает возможной разработку новых моно- и комплексных продуктов лечебно-профилактического питания и бакпрепаратов, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека и животных, восстановить их нормальную микрофлору и снизить заболеваемость различными кишечными инфекциями.

Известны зарубежные моно- и комплексные препараты - эубиотики и кисломолочные продукты, включающие в свой состав бифидобактерии видов Bifidobacterium bifidum (патент FR 2336886, 29.07.1977, А 23 С 9/12), Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis (патент FR 2411008, 06.07.1979, A 61 K 35/74), Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve (патент CH 637297, 29.07.1983, A 61 K 39/02), Bifidobacterium lactis (патент US 6379663, 14.03.2002, A 01 N 63/00.

В нашей стране для приготовления бактерийных препаратов и продуктов лечебно-диетического питания применяют штаммы бифидобактерий видов Bifidobacterium bifidum ВКПМ Ac-1578 (патент RU 2152993, 20.07.2000, C 12 N 01/20), Bifidobacterium bifidum ВКПМ S-1257 (патент RU 2108383, 10.04.1998, C 12 N 01/20), Bifidobacterium longum B379M, Bifidobacterium bifidum 791 (патент RU 2092064, 10.10.1997, А 23 С 09/12), Bifidobacterium adolescentis MC-42 (авторское свидетельство SU 863639, 15.09.1981, C 12 N 15/00). В кисломолочных продуктах, обогащенных бифидобактериями, используют и зарубежные штаммы, например Bifidobacterium lactis HN-019 (патент RU 2208632, 20.07.2003, С 12 N 01/20), Bifidobacterium lactis 420 (спецификация на штамм, Bifidobacterium lactis 420 компании «DANISCO», от 02.05.2003).

До настоящего времени ничего не известно об использовании отечественных штаммов Bifidobacterium lactis в вышеуказанных областях.

Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм Bifidobacterium lactis 420 (прототип) (спецификация на штамм, Bifidobacterium lactis 420 компании «DANISCO», от 02.05.2003). Штамм обладает антагонистической активностью в отношении некоторых патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

По ряду проверенных свойств известный штамм Bifidobacterium lactis 420 уступает заявляемому штамму Bifidobacterium lactis 668, в частности, он более чувствителен к фенолу, желчи и менее активен в отношении некоторых патогенных микроорганизмов (см. табл.1 и табл.2).

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов вида Bifidobacterium lactis для использования его при изготовлении кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, биологически активных добавок, бактерийных препаратов, косметических средств и т.п. средств, содержащих бифидобактерии.

При решении поставленной задачи достигаются следующие технические результаты: штамм обладает высокой биологической активностью, в частности высокой антиоксидантной активностью (супероксиддисмутазной активностью) в сравнении с информацией, имеющейся в литературных источниках, устойчивостью к условиям внешней среды, быстро размножается на искусственных питательных средах, обладает кислотообразующей и антагонистической активностью в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Получение штаммов, обладающих подобными свойствами, способствует расширению ассортимента пробиотиков, используемых для поддержания здоровья, в частности для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов человека и животных.

Поставленная задача реализуется путем использования штамма Bifidobacterium lactis 668 (Ac-1673 ВКПМ) в составе заквасок, продуктов питания, лекарственных, бактериальных, косметических средств и т.д.

Штамм Bifidobacterium lactis 668 может быть использован в моно- или композиционной пробиотической концепции при получении или изготовлении различных заквасок, кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, бактериальных препаратов, косметических средств.

Штамм Bifidobacterium lactis 668 выделен из содержимого кишечника здорового ребенка и депонирован в ВКПМ (Россия, Москва, 113545, 1-й Дорожный проезд, 1, ГНИИГ-ВКПМ) под №Ас-1673.

Заявляемый штамм выживает в условиях in vitro, имитирующих условия желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), в частности, в присутствии 40% желчи, 0,4% фенола, ферментов ЖКТ и при низких значениях рН.

Заявляемый штамм Bifidobacterium lactis 668 может быть использован при производстве кисломолочной продукции, ферментированных пищевых продуктов, таких как квас и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например соки, напитки и т.п., заквасок и биологически активных добавок к пище. Также штамм Bifidobacterium lactis 668 может широко использоваться для производства косметических средств, например кремов, лосьонов, питательных масок, гелей, косметического молочка и т.д.

Кроме того, штамм Bifidobacterium lactis 668 может быть использован и при производстве бактериальных препаратов, в виде свечей, пероральных и других средств.

Культуральные, морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма Bifidobacterium lactis 668.

Клетки представляют собой грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, каталазоотрицательные, анаэробные, полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2-х концах; в жидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза; при росте на агаризованной среде ГМК в анаэробных условиях образуют мелкие (до 1 мм в диаметре) круглые бесцветные колонии.

Оптимальная температура выращивания 37-39°С.

Штамм Bifidobacterium lactis 668 сбраживает глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, салицин, ксилозу, арабинозу, раффинозу с образованием уксусной и молочной кислот, без образования газа;

сквашивает молоко к 32 ч с образованием сгустка;

активно наращивает микробную массу при росте на кукурузно-лактозной среде (ГМК-1) (состав ГМК-1: кукурузно-молочная смесь - 15 г; пептон - 15 г; лактоза - 9 г; аскорбиновая кислота - 0,5 г; натрий лимоннокислый трехзамещенный - 0,6 г; магний сернокислый - 0,12 г; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1 г; агар - 3 г; дистиллированная вода - 1 л), бифидум среде (БФ) (состав бифидум среды: глюкоза - 7,5 г; лактоза - 2,5 г; панкреатический гидролизат казеина - 30 г; натрий хлористый - 2,5 г; магний сернокислый - 0,5 г; L-цистеин - 0,5 г; аскорбиновая кислота - 0,5 г; дрожжевой экстракт - 5 г; ацетат натрия - 0,3; агар - 0,75 г; дистиллированная вода - 1 л);

максимально накапливает микробную массу к 12-24 ч, достигая в 1 мл Ig КОЕ (колониеобразующие единицы) равного 8-9;

проявляет антагонистические свойства в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры (таблицы 1 и 2 приведены в конце описания), а именно более чем в 100 раз угнетают рост Candida albicans и Proteus vulgaris, более чем в 10000 раз угнетают рост Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, более чем в 100000 раз угнетают рост Shigella sonnei, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis при совместном культивировании в условиях in vitro.

Таким образом, предлагаемый штамм Bifidobacterium lactis 668 технологичен, поскольку активно размножается в питательной среде с накоплением производственной биомассы в короткие, 12-24 ч, сроки культивирования с высокой концентрацией микробных клеток (Ig КОЕ˜9); обладает кислотообразующими и ингибирующими свойствами в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры, высокой антиоксидантной активностью (супероксиддисмутазной активностью, СОД-активность равна 95,0±0,1 в ед/мг белка).

Кроме того, изучение спектра чувствительности к антибиотикам и антибактериальным препаратам выявило, что штамм Bifidobacterium lactis 668 обладает природной устойчивостью к азтреонаму, амикацину, гентамицину, канамицину, неомицину, нетилмицину, полимиксину, сизомицину, стрептомицину, сульфаниламиду, тобрамицину, цефтазидиму; чувствителен к левомицетину, ампициллину, бензилпенициллину, ванкомицину, доксициклину, карбенициллину, линкомицину, меропенему, оксациллину, олеандомицину, офлоксацину, пиперациллину, рифампицину, фурагину, фурадонину, фуразолидону, цефепиму, цефотаксиму, цефтриаксону, цефуроксиму.

Таким образом, по ряду свойств и их совокупности штамм Bifidobacterium lactis 668 обладает большей биологической активностью по сравнению с известными штаммами Bifidobacterium lactis.

Штамм Bifidobacterium lactis 668 обладает устойчивостью к фенолу и желчи; устойчивостью к низким значениям рН и ферментам ЖКТ; выраженной антагонистической активностью в отношении Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Shigella sonnei, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis; природной устойчивостью к азтреонаму, амикацину, гентамицину, канамицину, неомицину, нетилмицину, полимиксину, сизомицину, стрептомицину, сульфаниламиду, тобрамицину, цефтазидиму; хорошей технологичностью (способностью штамма вырастать в большом титре равном Ig КОЕ˜9 на подобранных средах и хорошо сохраняться в кисломолочных продуктах в течение необходимого продолжительного срока годности); выраженной антиоксидантной активностью.

Способность штамма Bifidobacterium lactis 668 вырастать в большом титре в питательной среде в короткие сроки культивирования, его антагонистическая, кислотообразующая, антиоксидантная активности, способность сохраняться в течение длительного времени в кисломолочной продукции и другие полезные свойства делают возможным использование штамма в составе различных продуктов питания и средств лечебно-профилактического назначения.

Осуществление изобретения

Пример 1. Использование штамма Bifidobacterium lactis 668 в составе биологических веществ, в частности в составе биологически активных добавок.

1 пассаж: лиофилизированный штамм Bifidobacterium lactis 668 в количестве ˜0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной бифидум средой и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при температуре 37-38°С до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную бифидум среду и культивируют при температуре 37-38°С в течение 12-24 ч до образования густого роста с видимой зоной аэробиоза.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10⁸ КОЕ/мл.

В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой суспензию клеток бифидобактерий Bifidobacterium lactis 668 с титром не менее 10⁸ КОЕ/мл, при необходимости можно получить концентрат клеток бифидобактерий с более высоким титром.

Пример 2. Использование штамма Bifidobacterium lactis 668 для приготовления неферментированных пищевых продуктов.

1 пассаж: лиофилизированный штамм Bifidobacterium lactis 668 в количестве ˜0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной бифидум средой и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при 37-38°С до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную бифидум среду и культивируют при температуре 37-38°С в течение 12-24 ч до образования густого роста с хорошо видимой зоной аэробиоза.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10⁸ КОЕ/мл.

Получение неферментированного пищевого продукта: выросшую и, при необходимости, сконцентрированную биомассу вносят в пищевое сырье (молоко, соки и пр.), перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с концентрацией живых бифидобактерий не менее 10⁶ КОЕ/мл.

Пример 3. Приготовление кисломолочного продукта лечебно-профилактического назначения с использованием штамма Bifidobacterium lactis 668 в качестве компонента заквасочных культур для приготовления ферментированных кисломолочных продуктов.

1 пассаж: лиофилизированный штамм вносят в бифидум среду культивирования и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при 37-38°С до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру штамма Bifidobacterium lactis 668 из последних разведений вносят в среду накопления объемом до 10% и культивируют при температуре 37-38°С до получения биомассы с содержанием бифидобактерий не менее 10⁸ КОЕ/мл.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10⁸ КОЕ/мл.

Получение кисломолочного продукта: полученную биомассу штамма Bifidobacterium lactis 668 в объеме до 10% вносят в пастеризованную молочную смесь при температуре 37-38°С вместе с другими заквасочными культурами, используемыми по норме, культивируют до образования сгустка (рН 4,5-4,6). Продукт с концентрацией живых бифидобактерий Bifidobacterium lactis 668 не менее 10⁶ КОЕ/мл охлаждают до 22°С, разливают в тару и доохлаждают до 6°С. Количество пассажей может быть увеличено в зависимости от объема производства.

Пример 4. Использование штамма бифидобактерий Bifidobacterium lactis 668 для получения бактериальных препаратов.

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную бифидум среду, культивируют при температуре 37-38°С до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10⁸ КОЕ/мл. К полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко). Полученную суспензию разливают в ампулы, или флаконы, или другие емкости, замораживают при температуре минус 40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 10⁸ живых клеток бифидобактерий Bifidobacterium lactis 668 в 1 г. Формируя дозы адекватного уровня потребления пробиотических микроорганизмов в сутки, равные не менее 5×10⁸-5×10¹⁰ КОЕ (для бифидобактерий), можно использовать полученный препарат в качестве бактериального препарата пробиотика.

Пример 5. Использование штамма бифидобактерий Bifidobacterium lactis 668 для получения косметических средств.

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную бифидум среду, культивируют при температуре 37-38°С до получения биомассы бифидобактерий Bifidobacterium lactis 668 с содержанием живых клеток не менее 10⁸ КОЕ/мл. Получение косметических средств: выросшую биомассу (при необходимости концентрат) штамма 668 бифидобактерий вводят в состав косметического средства.

Пример 6. Использование штамма бифидобактерий Bifidobacterium lactis 668 для получения ферментированной пищевой добавки.

Морковь, капусту и предварительно замоченные в воде пшеничные отруби в соотношении 2:1:1 измельчают в гомогенизаторе и полученный растительный субстрат пастеризуют при 80°С в течение 10 минут, вносят в него смесь Lactobacillus acidophilus и Bifidobacterium lactis 668 в соотношении 1:1 и концентрацией 10⁹ КОЕ/см³ и осуществляют ферментацию субстрата при 37°С в течение 24 ч. Полученная добавка обеспечивает становление экосистемы пищеварительного тракта человека.

ТАБЛИЦА 1 Антагонистическая активность штаммов 668 (заявляемый) и 420 (прототип) в отношении патогенных микроорганизмов
№	Численность патогенных микроорганизмов, Ig (KOE/мл)
штамма	Escherichia coli	Staphilococcus aureus ATCC 6538 P	Candida albicans	Proteus mirabilis 46	Proteus vulgaris	Klebsiella pneumoniae 5057	Shigella sonnei 5063	Citrobacter freundii 101/57	Bacillus subtilis ATCC
контроль	8,48	8,30	8,76	8,48	8,90	8,38	8,41	8,70	8,78
668	7,94	8,28	6,30	4,30	6,54	4,30	2,60	2,30	2,00
420	7,01	5,13	5,30	5,46	7,41	7,60	2.57	7,18	6,78

ТАБЛИЦА 2
№	Падение численности патогенных микроорганизмов при совместном культивировании с бифидобактериями, lg (KOE/мл)
штамма	Escherichia coli	Staphilococcus aureus ATCC 6538 P	Candida albicans	Proteus mirabilis 46	Proteus vulgaris	Klebsiella pneumoniae 5057	Shigella sonnei 5063	Citrobacter freundii 101/57	Bacillus subtilis ATCC
контроль	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
668	0,54	0,02	2,46	4,18	2,36	4,08	5,81	6,40	6,78
420	1,47	3,17	3,46	3,02	1,49	0,78	5.84	1,52	2,00
Заливка ячейки	Падение численности, Ig (КОЕ/мл)
	<1,00 (менее чем в 10 раз)
	1,00-1,99 (в 10-100 раз)
	2,00-2,99 (в 100-1000 раз)
	≥3,00 (более чем в 1000 раз)

Штамм бифидобактерий Bifidobacterium lactis 668 ВКПМ Ac-1673, используемый для приготовления кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, бактериальных препаратов и косметических средств.