Штамм haemophilus parasuis ил-1 - возбудитель гемофилезного полисерозита свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии. Штамм депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ФГУ ВГНКИ под регистрационным номером Haemophilus parasuis ИЛ-1-ДЕП. Штамм является вирулентным в нативном виде и обладает антигенной и иммуногенной активностью после инактивации. При выращивании на жидкой питательной среде на основе бульона PPLO в течение 12 часов штамм накапливается в титре 9,3-9,7 Ig КОЕ/см³. Штамм сохраняет свои свойства при хранении в полужидком агаре при 4-6°С в течение месяца, а в лиофилизированном состоянии при 4-6°С в течение 1 года. Штамм обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняет свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодные для изготовления высокоэффективных диагностических и вакцинных препаратов. 4 табл.

 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств диагностики и специфической профилактики гемофилезного полисерозита свиней (ГПС).

В настоящее время под влиянием массовой вакцинации животных, применения химиопрепаратов, антибиотиков и других веществ, приведших к нарушению биоценоза, существенно изменилась не только этиологическая структура инфекционных заболеваний, но и роль различных серовариантов в их возникновении и развитии. В результате все более широкое распространение получают условно-патогенные микроорганизмы, болезнетворное действие которых ранее игнорировалось или рассматривалось как эксвизитное. Среди этих болезней определенное место занимает ГПС (болезнь Глессера), который регистрируется преимущественно у поросят отъемного возраста.

ГПС - инфекционная болезнь, характеризующаяся серозно-фибринозным воспалением перикарда, плевры, брюшины, суставов и мозговых оболочек. Возбудителем этого заболевания являются гемофильные бактерии Haemophilus parasuis (H.parasuis), представляющие собой мелкие 0,5×0,2-0,3 мкм полиморфные грамотрицательные не образующие спор палочки. Они являются постоянными обитателями слизистых оболочек верхних дыхательных путей многих видов животных. Вирулентные штаммы H.parasuis образуют капсулу. В мазках H.parasuis располагаются в виде палочек и коротких цепочек. Растут в аэробных условиях на питательных средах с добавлением дрожжевого экстракта, сыворотки крови или лизата цельной крови, а также на шоколадном агаре. Серологически различают 15 сероваров по соматическому антигену и 5 серогрупп (А, В, С, D, N) по капсульному. Самыми вирулентными и распространенными в Европе и Северной Америке являются серовары №№1, 2, 4, 5 и 7. Несколько реже встречаются серовары №№3, 12, 13 и 14.

Источником ГПС служат больные и переболевшие поросята, а также свиноматки-бактерионосители. Заражение ГПС происходит в основном аэрогенным путем. Важную роль в возникновении ГПС играют иммунологический фон у поросят, предшествующее переболевание вирусными болезнями, а также различные факторы, снижающие общую резистентность организма животных. Часто ГПС протекает в виде смешанной инфекции с энзоотической пневмонией и другими микоплазмозами.

Диагноз на ГПС ставят на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований (1-13).

ГПС имеет широкое распространение во многих странах с развитым свиноводством и наносит отрасли значительный экономический ущерб.

С 2000 по 2003 гг. выполнена работа по мониторингу бактериальных инфекций поросят на территории Российской Федерации. Проведено обследование 19 хозяйств в 11 регионах России. Бактериологически обследовали 2346 образцов патологического материала от 391 головы павших и вынужденно убитых поросят в возрасте от 1 сут. до 5 мес. H.parasuis и Actinobacillus pleuropneumonie изолировали из 1,35% проб патологического материала. Несмотря на незначительный процент выделения возбудителей ГПС и актинобациллезной плевропневмонии, в некоторых обследованных хозяйствах отход поросят отъемного возраста от этих заболеваний достигал 22,8% к общему числу павших отъемышей. Лечение больных гемофилезным полисерозитом поросят с помощью лекарственных средств экономически себя не оправдало, поскольку переболевшие животные резко отставали в росте и погибали в более поздние сроки от образования фибринозных спаек между серозными оболочками внутренних органов (14).

По этой причине вакцинопрофилактика ГПС занимает ведущее место в комплексе противоэпизоотических мер, направленных на борьбу с этим заболеванием. Для профилактики ГПС используют инактивированные вакцины, полученные из вирулентных штаммов гемофил, подвергнутых инактивации с помощью различных химических препаратов.

Известен штамм H.parasuis неустановленного серотипа - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (15).

Известен штамм H.parasuis неустановленного серотипа - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (16).

Известен штамм H.parasuis неустановленного серотипа - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (17).

Известен штамм H.parasuis серотипа А - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (18).

Известен штамм H.parasuis серотипа D - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (18).

Известен штамм H.parasuis НТ серотипа D - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (19).

Известен штамм H.parasuis серотипа А - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (20).

Известен штамм H.parasuis серотипа С - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (20).

Известен штамм H.parasuis серотипа «DB-28» - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (21).

Известен штамм H.parasuis серотипа «DB-30» - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (21).

Общим недостатком известных штаммов является низкая противоэпизоотическая эффективность изготовленных на их основе вакцинных препаратов.

В связи с этим задача отбора и изучения эпизоотических изолятов возбудителя ГПС в целях получения новых производственных штаммов H.parasuis для изготовления диагностических и вакцинных препаратов остается актуальной.

В задачу создания настоящего изобретения входило получить новый производственный штамм H.parasuis - возбудитель ГПС, обладающий высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющий свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодный для изготовления чувствительных и высокоспецифических диагностикумов и высокоиммуногенных вакцинных препаратов, способных защитить свиное поголовье от эпизоотического возбудителя ГПС, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала штаммов H.parasuis - возбудителей ГПС, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющих свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодных для изготовления высокоэффективных диагностических и вакцинных препаратов.

Указанный технический результат достигнут получением штамма H.parasuis ИЛ-1 (авторское наименование «штамм «ИЛ-1») - возбудителя ГПС. Штамм является новым, ранее неизвестным.

Исходная культура для получения штамма «ИЛ-1» была выделена из патологического материала вынужденно убитых поросят в возрасте 48 суток с признаками ГПС, поступивших из ОАО «Ильиногорское» Нижегородской области.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ) МСХ РФ 6 января 2004 года под регистрационным номером Haemophilus parasuis ИЛ-1-ДЕП.

Штамм «ИЛ-1» обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ГПС, создающей напряженный и продолжительный иммунитет у вакцинированных животных.

Штамм «ИЛ-1» характеризуется следующими признаками и свойствами.

Происхождение штамма

Штамм «ИЛ-1» относится к виду Haemophilus parasuis (семейство Pasteurellaceae, род Haemophilus).

Выделен в лаборатории микробиологии ФГУ ВНИИЗЖ в октябре 2002 г. от больных гемофилезным полисерозитом поросят в возрасте 48 суток.

Морфологические свойства

Штамм «ИЛ-1» обладает морфологическими признаками, характерными для данных микроорганизмов. Клетки штамма «ИЛ-1» овальные, сферические или палочковидные, по размеру обычно менее 1 мкм в ширину и различные по длине, иногда образуют нити, обнаруживают заметный плеоморфизм, образуют капсулу, неподвижные.

При окраске по Граму клетки штамма «ИЛ-1» окрашиваются отрицательно.

Культуральные свойства

Штамм «ИЛ-1» растет на средах сложного состава только в присутствии фактора роста V (NAD - никотинамидадениндинуклеотид или NADP - никотинамидадениндинуклеотид-фосфат). Оптимальная температура 35-37°С.

При росте на жидкой питательной среде на основе бульона PPLO (для плевропневмониеподобных организмов) фирмы Difco, содержащей 10% свежеприготовленного дрожжевого экстракта (фактора роста V), в течение 24 часов штамм «ИЛ-1» образует незначительное равномерное помутнение среды.

При росте на плотных питательных средах, изготовленных на основе бульона PPLO (фирма Difco) и содержащих 1,5% агара (фирма Difco) и 10% свежеприготовленного дрожжевого экстракта, штамм «ИЛ-1» формирует характерный рост колоний H.parasuis: мелкие, диаметром 0,5-2 мм, круглые, выпуклые, с гладкой блестящей поверхностью колонии в «S» форме.

Ферментативные (биохимические) свойства

Штамм «ИЛ-1» обладает биохимическими свойствами, характерными для вида H.parasuis, образует каталазу, оксидазу, не образует уреазу, сероводород и индол. Ферментирует без образования газа углеводы: глюкозу, сахарозу; не ферментирует лактозу, маннит, сорбит, лизин и орнитин.

Биотехнологическая характеристика

Штамм «ИЛ-1» является вирулентным в нативном виде и обладает антигенной и иммуногенной активностью после инактивации.

Штамм «ИЛ-1» предназначен для изготовления инактивированной вакцины против ГПС. При выращивании на жидкой питательной среде на основе бульона PPLO (фирма Difco), содержащей 10% свежеприготовленного дрожжевого экстракта (фактор роста V), в течение 12 часов штамм «ИЛ-1» накапливается в титре 9,3-9,7 lg колониеобразующих единиц в 1 см³ (КОЕ/см³).

Штамм «ИЛ-1» сохраняет свои свойства при хранении в полужидком агаре при температуре 4-6°С в течение месяца, а в лиофилизированном состоянии при температуре 4-6°С в течение 1 года.

Патогенность

Штамм «ИЛ-1» является патогенным для лабораторных и естественно-восприимчивых животных.

Внутрибрюшинное заражение морских свинок массой 300-350 г суспензией штамма «ИЛ-1», содержащей 2 млрд. КОЕ/см³, вызывает заболевание животных через 2 суток, а через 3-5 суток - их гибель.

При заражении белых мышей массой 16-18 г разведениями суточных бульонных культур ЛД₅₀ для штамма «ИЛ-1» составила 5 млрд. микробных клеток (м.к.).

Серологические свойства

Штамм «ИЛ-1» обладает агглютинирующей активностью в отношении антител переболевших или иммунизированных животных в реакции агглютинации (РА). При иммунизации лабораторных и естественно-восприимчивых животных формалинизированный цельноклеточный антиген штамма «ИЛ-1» индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РА, в разведении 1:200-1:1600.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - 100%.

Патогенность - выражена.

Вирулентность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Свободен от контаминации грибной микрофлорой, бактериями других видов и вирусами.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм «ИЛ-1» по биохимическим, антигенным и иммуногенным свойствам является оригинальным, ранее неизвестным штаммом. Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная профилактика вновь возникающих очагов болезни, а для этого необходима высокоактивная и безвредная вакцина.

По мнению заявителя, предлагаемый штамм обладает признаками патентоспособности «новизна» и «изобретательский уровень».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают его объем.

Пример 1.

Исходная культура для получения штамма «ИЛ-1» была выделена из патологического материала (легкое, эксудат грудной полости, заглоточные и средостенные лимфоузлы, селезенка, сердце, кровь из сердца) вынужденно убитых поросят в возрасте 48 суток с признаками гемофилезного полисерозита, поступивших из ОАО «Ильиногорское» Нижегородской области.

Штамм «ИЛ-1» был выделен в лаборатории ФГУ ВНИИЗЖ с использованием плотных питательных сред, изготовленных на основе бульона PPLO (фирма Difco), содержащих 1,5% агара (фирма Difco), 10% свежеприготовленного дрожжевого экстракта и 1% гемина.

Выделенная чистая культура изолята была идентифицирована по культуральным и биохимическим свойствам и в полимеразной цепной реакции как H.parasius (таблица 1) и заложена на хранение в виде супсензии бактериальных клеток с концентрацией 10 млрд. м.к./см³ в желатин-сахарозной среде, лиофильно высушенной под вакуумом. Штамм хранится при температуре -40°С.

Штамм освежают 1-2 раза в год (12 мес.). Концентрация культуры за 12 мес. хранения снижалась менее чем на 0,5 lg КОЕ/см³, при этом стабильно сохраняется активность в РА и иммуногенная активность.

Полученному штамму бактерий H.parasuis присвоено авторское наименование «ИЛ-1».

Пример 2.

Для изготовления диагностического антигена H.parasuis используют штамм «ИЛ-1». Лиофилизированную культуру штамма «ИЛ-1» суспендируют в 1 см³ PPLO бульона, содержащего ростовые факторы (раствор NADP - 1%, раствор гемина - 1%) и засевают во флаконы с 20 см³ PPLO бульона. Флаконы инкубируют в термостате при 37°С в течение 24 часов.

24-часовую бульонную культуру штамма «ИЛ-1» высевают на чашки с PPLO агаром, содержащим ростовые факторы (раствор NADP - 1%, раствор гемина - 1%). Посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 24 часов.

Выросшую на каждой чашке культуру смывают стерильным 0,9% физиологическим раствором в объеме 5 см³, затем трижды отмывают, центрифугируя суспензию при 1000 g. Осевшие клетки ресуспендируют в стерильном физ. растворе и доводят концентрацию клеток до 10 млрд. м.к./см³ по стандарту мутности. В полученную суспензию вносят формалин до конечной концентрации 0,2% и инкубируют смесь в термостате при 37°С в течение 24 часов. Суспензию проверяют на полноту инактивации высевом на чашку с PPLO агаром.

Инактивированные клетки осаждают центрифугированием при 1000 g. По стандарту мутности доводят концентрацию антигена до 20 млрд. м.к./см³ в физ. растворе.

Для получения гипериммунной сыворотки используют молодых кроликов массой 2,5-3,0 кг. Кроликов иммунизируют один раз в неделю, начиная с дозы 0,5 см³ антигена (концентрация 20 млрд. м.к./см³) с адъювантом Фрейнда (в отношении 1:1) подкожно. Все последующие инъекции делают внутривенно в возрастающих дозах: 1, 2 и 3 см³. Последнюю дозу (3 см³) повторяют 4 раза. Через 1 неделю после 8-й инъекции кроликов обескровливают.

Активность антигена определяют в количественной РА, которую проводят в полистироловых планшетах или пробирках с использованием гипериммунных сывороток крови кролика, содержащих антитела против штамма «ИЛ-1» (положительные контрольные сыворотки). Нормальную сыворотку крови кролика используют в качестве отрицательного контроля.

Антиген считают активным, если в РА с гомологичной сывороткой он образует видимые не вооруженные глазом агглютинаты при концентрации 5×10⁷ м.к./см³ (7,69 log₂) и выше. При этом с нормальной (неиммунной) сывороткой кролика реакция отсутствует.

Специфичность антигена определяют также в количественной РА, но с сыворотками, содержащими антитела к бактериям Pasteurella multocida и Actinobacillus pleuropneumoniae. Антиген HPs не дает положительной реакции с сыворотками, иммунными к названным выше видам бактерий (таблица 2).

Таким образом, результаты РА свидетельствуют о специфичности антигена, полученного из штамма «ИЛ-1».

Пример 3.

Для изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ГПС суточную бульонную культуру из штамма «ИЛ-1», выращенную в аппарате АК-210 (объем 10 л), стерильно переливают в стеклянную емкость для инактивации, в которую вносят раствор димера этиленимина (ДЭИ) в количестве, обеспечивающем его конечную концентрацию в суспензии 1% по активному веществу. Инактивацию проводят при постоянном перемешивании, рН в пределах 7,6-7,8 и температуре 36-37°С в течение 24 часов.

После окончания процесса инактивации суспензию охлаждают до 2-8°С и исследуют на полноту инактивации. Полученный антиген очищают от балластных примесей и ДЭИ известными для специалиста методами. После этого антиген соединяют с масляным адъювантом.

В качестве масляного адъюванта используют Montanide ISA-70 (фирма «SEPPIC», Франция). Масляный адъювант и инактивированный антиген смешивают в соотношении (мас.%) 70:30 на гомогенизаторе в течение 4-5 минут при скорости вращения винта 3000 об/мин, при этом получают однородную эмульсию белого цвета типа «вода-масло».

Полученная вакцина имеет оптимальный компонентный состав, мас.%:

Антигенный материал из штамма «ИЛ-1»	30,0
Масляный адъювант	70,0

Содержание антигена в вакцине в указанных выше пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.

Готовую эмульсионную вакцину собирают в одну стерильную емкость, фасуют в стеклянные флаконы и контролируют в соответствии с техническими условиями.

Вакцина представляет собой эмульсию белого цвета слегка вязкой консистенции. При хранении вакцины допускается незначительное отслоение минерального масла на поверхности эмульсии. При встряхивании вакцины однородность эмульсии восстанавливается.

Полученную вакцину контролируют на безвредность и стерильность.

Определение безвредности проводят на 10 белых мышах массой 16-18 г. Из пяти флаконов с вакциной отбирают с соблюдением правил асептики и антисептики по 5 см³ содержимого и объединяют в общий объем. Объединенную пробу (25 см³) используют для проверки на безвредность. Препарат вводят животным подкожно в область спины в объеме 0,5 см³. Наблюдение за животными производят в течение 10 сут. Вакцину считают безвредной, если все животные, взятые в опыт, остаются живыми и клинически здоровыми в течение срока наблюдения.

Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТ 280885-89 «Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности».

Антигенную активность каждой серии вакцины проверяют на морских свинках массой 350-400 г. Вакцину вводят двукратно с интервалом 20-25 суток 10 морским свинкам внутримышечно в области бедра в объеме 0,5 см³. Через 14 суток после второй вакцинации у морских свинок отбирают пробы крови, выдерживают при температуре 37°С, отделяют сыворотку и исследуют на наличие антител к бактериям H.parasuis в РА. Серию вакцины считают прошедшей контроль на антигенную активность, если титр специфических антител в РА не ниже 1:200. Результаты исследований представлены в таблицах 4 и 3.

Вакцину применяют для профилактической иммунизации свиней против гемофилезного полисерозита. Вакцина способствует образованию активного иммунитета против гемофилезного полисерозита через 21 сутки после 2-кратного применения препарата длительностью не менее 6 месяцев.

Пример 4.

Проведена оценка качества инактивированной эмульсионной вакцины против ГПС из штамма «ИЛ-1», изготовленной так, как описано в примере 3.

Проверку вакцины проводили по следующим показателям: бактериологический контроль стерильности, определение безвредности вакцины и ее иммуногенной активности.

Бактериологический контроль стерильности

Пробы вакцины посеяли на жидкую и плотную среду Сабуро, МПА, МПБ - по 3 пробирки, на МППБ - по 2 пробирки и 2 флакона, среду Эндо - по 3 чашки.

Для выявления аэробов высевали 0,5 см³ вакцины в одну пробирку и 2 см³ в один флакон, а для выявления анаэробов - соответственно по 1 и 5 см³.

Пробирки, бактериологические чашки, флаконы с посевами на всех средах, кроме Сабуро, выдерживали в термостате при (37±0,5)°С, на среде Сабуро при (21±1,0)°С в течение 7 суток.

По истечении указанного срока делали пересев, за исключением посевов на МПА, среду Эндо, агар Сабуро.

Пересевали пробы на те же питательные среды и в тех же объемах, что и при посеве. Вторичные посевы выдерживали 7 суток.

Одновременно проводили контроль стерильности сред. Результаты первичного и повторного посевов оценивали путем макроскопического исследования посевов.

Рост микроорганизмов на питательных средах с посевами отсутствовал.

Определение безвредности вакцины

Безвредность вакцины проверяли на 10 белых мышах массой 16-18 г. Препарат вводили подкожно в области спины в объеме 0,5 см³. Наблюдение за животными вели в течение 10 суток. Все животные, взятые в опыт, остались живыми и клинически здоровыми в течение срока наблюдения.

Безвредность вакцины проверяли на 4 подсвинках 4-месячного возраста. Препарат вводили 2 животным внутримышечно за ухом в объеме 3 см³ (трехкратная доза) и 2 животным внутримышечно за ухом в объеме 5 см³ (пятикратная доза).

В течение 10 суток наблюдения отклонений со стороны общего состояния организма четырех подсвинков, взятых в опыт, не наблюдали.

Местная реакция на введение препарата отсутствовала.

Определение иммуногенности.

Иммуногенную активность вакцины проверяли на 20 морских свинках массой 300-350 г.

Вакцину вводили однократно внутримышечно в области бедра по 0,2 см³. Через 21 сутки после иммунизации 10 вакцинированных и 10 контрольных (невакцинированных) морских свинок заражали внутрибрюшинно предварительно оттитрованной смертельной дозой возбудителя ГПС, штамм «ИЛ-1», в объеме 0,5 см³ подкожно.

В течение 4 суток контрольные свинки пали, а опытные оставались живы в течение 10 суток после гибели контроля.

Исследование показали, что вакцина из штамма «ИЛ-1» стерильна, безвредна и иммуногенна.

Пример 5.

Эффективность вакцины против ГПС из штамма «ИЛ-1» проверена в составе ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза, сальмонеллеза и ГПС. Иммуногенную активность ассоциированной вакцины проверили на 10 морских свинках массой 300-350 г.

Вакцину вводили однократно внутримышечно во внутреннюю поверхность бедра по 0,2 см³. Через 21 сутки после иммунизации 5 вакцинированных и 5 контрольных (невакцинированных) морских свинок заразили внутрибрюшинно предварительно оттитрованной смертельной дозой возбудителя ГПС из штамма «ИЛ-1» в объеме 0,5 см³.

В течение 4 суток контрольные свинки пали, а опытные оставались живы в течение 10 суток после гибели контроля.

Следовательно, испытуемая вакцина иммуногенна по гемофилезному компоненту.

Пример 6.

Эффективность вакцины против ГПС из штамма «ИЛ-1» проверена в составе ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза, сальмонеллеза и ГПС в условиях промкомплекса «Кузнецовский» Московской области на 580 головах свиноматок во время производственной апробации ассоциированного препарата.

Вакцину применяли согласно временному наставлению. После применения вакцины поствакцинальных осложнений и прорывов иммунитета у животных не отмечено.

Пример 7.

Эффективность вакцины против ГПС из штамма «ИЛ-1» проверена в составе ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза, сальмонеллеза и ГПС в условиях неблагополучного по ГПС ОАО «Ильиногорское» Нижегородской области на свиноматках во время производственной апробации ассоциированного препарата. Вакцину применяли согласно временному наставлению. Общее количество привитых животных составило: опытных - 292 головы, контрольных - 285 голов.

Наблюдение за привитыми животными показало:

1. Отклонений со стороны общего состояния организма опытных и контрольных животных на инъекцию биопрепарата не наблюдали.

2. Температура тела и основные физиологические показатели оставались в пределах нормы.

3. Сыворотки крови свиноматок в количестве 20 проб исследовали в ФГУ ВНИИЗЖ до иммунизации и через 25 дней после введения второй дозы вакцины.

4. Сыворотки крови свиноматок, иммунизированных против сальмонеллеза, пастереллеза и ГПС, были положительными.

Результаты испытаний показали, что вакцина безвредна, обладает достаточной иммуногенной активностью и может быть использована для специфической профилактики.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- штамм «ИЛ-1» - возбудитель ГПС, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной микробиологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- штамм «ИЛ-1», полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации, пригоден для изготовления высокоспецифичных и чувствительных диагностикумов и высокоиммуногенных и безвредных вакцинных препаратов и расширяет арсенал новых производственных штаммов H.parasuis - возбудителей ГПС.

Следовательно, предлагаемый штамм соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».

Источники информации

1. Glässer К. Untersuchungen über die Schweineseuche mit besonderer Berücksichtigung ihrer Äntiologie und Pathologie (studies on poliserositis in swine with special regard to etiology and pathology) - Deutsch. Tierärztl.W.-Schr., 1910, 18, 729-733.

2. Nicolet J., Scholl E. Haemophilus infections. In: Leman A.D., Glock R. et.al., (Eds). Diseases of swine. 5^th edn. Iowa State Univ. Press. Ames IA, 1981, pp.368-377.

3. Nicolet J., Morozumi Т., Bloch J., Proposal for a serological classification of Haemophilus parasuis. - Proc. Int. Pig. Vet. Soc., Barcelona, 1986, p.260.

4. Сидоров М.И., Скородумов Д.И. Гемофилезы животных. - М., Агропромиздат, 1986, 82-104.

5. Nielsen R. Pathogenicity and Immunity studies of Haemophilus parasuis Serotypes.-Acta Vet. scand., 1993, 34,2, 193-198.

6. Hill H., Conner J.F. et.al. Haemophilus parasuis. Part I. Agri-Practice, 1993a, 14 (3), 3, 19-23.

7. Hill H., Conner J.F. et.al. Haemophilus parasuis. Part II. Agri-Practice, 1993b, 14 (4), 34-39.

8. Hill H., Conner J.F. et.al. Haemophilus parasuis. Part III. Agri-Practice, 1993с, 14 (5), 5-9.

9. Segal J. Enfermedad de Glasser: conceptos generales de la infection por Haemophilus parasuis. - Med. Vet, 1996, V.13, N11, 595-605.

10. Определитель бактерий Берджи: В 2-х т. М.: Мир, 1997. - Т.1. - С.200-203.

11. Скородумов Д.И. Актинобациллезная (гемофилезная) плевропневмония и гемофилезный полисерозит свиней (этиология, лабораторная диагностика, основы специфической профилактики актинобациллезной плевропневмонии). - Автореф. дисс... доктора вет. наук. Москва, 1997. - 40 с.

12. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий. - М.: Мир, 1999. - С.498-500.

13. Гаффаров Х.З., Романов Е.А. Инфекционные болезни свиней и современные средства борьбы с ними. - Казань, 2003. - С.73-77.

14. Гусев В.В., Приходько С.М. и соавт. Мониторинг бактериальных инфекций в промышленном свиноводстве. - Ветеринария, 2004. - №2. - С.7-8.

15. Baehler J.R., Burgisser H. et al. Infection Haemophilus parasuis chez le pore. Schweiz. Arch. Tierheilkd., 1974. - 116. - P.183-188.

16. Nielsen R., Danielsen V. An outbreak of Glässer's disease. Studies on etiology, serology and effect of vaccination. Nord.Vet.Med., 1975. - 27. - P.20-25.

17. Сидоров М.А. и соавт. Иммуногенность вакцины против гемофилезного полисерозита поросят. - Доклады ВАСХНИЛ, 1980. - 8. - С.30.

18. Тарасенок Н.И. Изучение возбудителя гемофилезного полисерозита поросят. - Ветеринария, 1989. - 11. - С.36-39.

19. ТУ 10-09-110-91 от 29.04.91 г. «Формолвакцина гидроокись-алюминиевая против гемофилезного полисерозита поросят».

20. Толяронок Г.Е. Этиология и профилактика полисерозита свиней. - Автореф. дисс... канд. вет. наук. Минск, 1998, 20 с.

21. Гаффаров Х.З., Ефимова М.А. и соавт. Антигенная активность ассоциированной вакцины против гемофилезного полисерозита, трансмиссивного гастроэнтерита и отечной болезни поросят-отъемышей на лабораторных животных. - Ветеринарный врач, 2003. №3(15), С.41-43.

Таблица 1 Биохимические свойства штамма «ИЛ-1»
Название теста	Оценка	реакции
«ИЛ-1»	по определителю Берджи
Каталаза	+	+
Оксидаза		-
Гемин (X)	-	-
NADP (V)	+	+
β-гемолиз	-	-
Индол	-	-
Уреаза	-	-
Сероводород	-	d
Глюкоза	+	+
Лактоза	-	d
Сорбит	-	-
Маннит	-	-
Сахароза	+	+
Лизин	-	-
Орнитин	-	-
Примечание: «+» - положительная реакция «-«- отрицательная реакция «d» - вариабельная реакция
Таблица 2 Специфичность антигена H.parasuis, штамм «ИЛ-1»
Сыворотки крови кролика, специфические к изолятам	Антигены (титры антител сывороток в РА, выраженные в lg)
ИЛ-1	СК-1	Ш-1	К-1	РМ №115	РМ №656	РМ №9
ИЛ-1 (H.parasuis)	1600*	400	-	-	-	-	-
СК-1 (H.parasuis)	400	3200	-	-	-	-	-
Ш-1 (A.pleuropneumoniae)	-	-	1600	-	-	-	-
К-1 (A.pleuropneumoniae)	-	-	-	1600	-	-	-
P.multocida N115	-	-	-	-	3200	400	200
P.multocida N656	-	-	-	-	400	3200	200
P.multocida N9	-	-	-	-	400	200	3200
Контроль **	-	-	-	-	-	-	-
Примечание: * - величина, обратная разведению сыворотки; **- неиммунная сыворотка крови кролика; «-«- негативная реакция.

Таблица 3 Результаты исследований в PA сывороток крови морских свинок, иммунизированных инактивированной эмульсионной вакциной из штамма «ИЛ-1»
№ пробы	Титры специфических антител в РА
До вакцинации	После первой вакцинации	После второй вакцинации
1	-	400*	800
2	-	150	400
3	-	100	400
4	-	50	400
5	-	50	400
Примечание: «*» - величина, обратная разведению сыворотки; «-«- негативная реакция.
Таблица 4 Результаты исследований в РА сывороток крови свиней разного возраста, иммунизированных инактивированной эмульсионной вакциной из штамма «ИЛ-1»
Группа животных	Возраст живого	Титр антител до вакцинации	Титр агглютинирующих антител после вакцинации (21 сут.).
Супоросные свиноматки		25*	1600
		50	800
		50	800
		50	800
		25	400
		100	800
		50	1600
		100	1600
		25	800
	100	800
Отъемыши		25	400
		25	400
		25	400
		50	800
	70 сут.	50	800
		100	800
		50	200
		100	400
		25	400
	50	400
Контрольные животные	невакцинированные	-	-
25	25
Примечание: «*» - величина, обратная разведению сыворотки, «-«- негативная реакция.

Штамм Haemophilus parasuis ИЛ-1 - возбудитель гемофилезного полисерозита свиней семейства Pasteurellaceae, рода Haemophilus, вида Haemophilus parasuis, коллекция ФГУ ВГНКИ Haemophilus parasuis ИЛ-1-ДЕП, для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.