Антибактериальный препарат
Владельцы патента RU 2272646:
Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" Министерства здравохранения Российской Федерации (ФГУП "НПО "Микроген") (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к производству биопрепарата. Сущность его заключается в разработке препарата с антибактериальным спектром действия из продуктов, полученных в процессе очистки интерферона. Препарат содержит низкомолекулярные пептиды с молекулярной массой менее 3 кДа. Технический результат - более полное использование продуктов интерфероногенеза, снижение отходов производства и повышение выхода полезного продукта. 5 табл.
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к производству биопрепаратов с антибактериальным спектром действия, и может быть использовано в качестве лекарства для лечения заболеваний инфекционной природы.
Известен препарат «Локферон», где в качестве индуктора используется штамм вируса парагриппа 1 Сендай ГКВ №2339. Синтезированный таким образом интерферон подвергают очистке ультра- и диафильтрации на полых волокнах с порогом отсечения 5-15 кДа с последующей концентрацией на ультрафильтрационных мембранах с порогом отсечения 100 кДа [Патент РФ №2108804, кл. А 61 К 38/21, 1998].
Недостатком его является наличие отходов с низкомолекулярными пептидами.
Наиболее близким препаратом к предлагаемому является препарат «Лейкинферон» - очищенный человеческий лейкоцитарный интерферон (ЧЛИ) с сохранением биологически активных белков, содержащий в одной ампуле 10000 ME противовирусной активности альфа- интерферона, интерлейкин, макрофагингибирующий фактор и фактор некроза опухоли [Патент РФ №2033180, кл А 61 К 38/21, 1995]. Однако низкомолекулярные пептиды, отсеченные в процессе очистки, не используются.
Таким образом, фракция, содержащая пептиды, синтезированные в процессе интерфероногенеза, из перечисленных препаратов удаляется, так как молекулярный вес пептидов ниже 10 кДа [Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. - Биологическая химия, 1998, с.74-77] и пептиды не используются для производства антибактериальных препаратов.
Технический результат изобретения заключается в снижение отходов производства интерферона и повышение выхода полезного продукта.
Для решения поставленной технической задачи получен антибактериальный препарат, содержащий комплекс низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой менее 3 кДа, являющихся побочными продуктами интерфероногенеза, с активностью не менее 64 Усл.Ед./мл и содержанием белка в обессоленном препарате 0,015-0,96 мг/мл.
Отличительной особенностью препарата является то, что препарат содержит низкомолекулярные пептиды с молекулярной массой менее 3 кДа и активностью не менее 64 Усл.Ед./мл, с содержанием белка в обессоленном препарате 0,015-0,96 мг/мл.
Сущность изобретения заключается в использовании низкомолекулярного пептида с молекулярной массой менее 3 кДа, выделенного в процессе очистки лейкоцитарного интерферона, в качестве лекарственного препарата с антибактериальным действием.
Антибактериальный препарат, полученный в процессе очистки интерферона, содержит низкомолекулярные пептиды с молекулярной массой менее 3 кДа.
Фракция, содержащая комплекс пептидов, синтезируемых лейкоцитами в процессе интерфероногенеза, выделена. Проведено исследование ее физико-химических свойств.
Выделенный пептидный комплекс является гетерогенным по составу, что подтверждено масс-спектрометрическим анализом, результат которого приведен на фиг.1. Как видно из масс-спектрограммы, главному компоненту с молекулярной массой 1673,11 сопутствуют более 4-х соединений с близкими по размерам молекул пептидов с молекулярными массами от 1296,8 до 1673,11.
Содержание белка в обессоленных антибактериальных препаратах при определении по методу Лоури составляло 0,015-0,96 мг/мл.
Изучение влияния рН на антибактериальную активность полученных препаратов комплекса пептидов, синтезированных в процессе биосинтеза интерферона, показало, что антибактериальные препараты сохраняют свое действие в широком диапазоне рН от 2 до 8 (таблица 1).
Для изучения термостабильности водные растворы полученных препаратов комплекса пептидов с исходной антибактериальной активностью 1024 Усл.Ед./мл, выдерживали в кипящей бане в течение 5, 15, 20 и 60 минут, а также замораживали при температуре - 50°С и выдерживали в течение 60 минут (таблица 2). Как показали исследования, замораживание и выдерживание в кипящей водяной бане не отражается на антибактериальной активности пептидного комплекса.
| Таблица. 1. Влияние рН на антибактериальную активность полученных препаратов комплекса низкомолекулярных пептидов (время контакта 1 час) | |
| Показатели рН | Антибактериальная тивность, Усл.Ед./мл |
| 2 | 1024 |
| 3 | 1024 |
| 4 | 1024 |
| 5 | 1024 |
| 6 | 1024 |
| 7 | 1024 |
| 8 | 1024 |
| 9 | 512 |
| 10 | 512 |
| 12 | 256 |
| Таблица 2. Влияние термической обработки на антибактериальную активность полученных препаратов пептидного комплекса | ||
| Время контакта, мин | Условия, °С | Антибактериальная активность, Усл.Ед./мл |
| 5 | 100 | 2048 |
| 15 | 100 | 2048 |
| 20 | 100 | 2048 |
| 60 | 100 | 2048 |
| 60 | -50 | 2048 |
Образцы полученных антибактериальных препаратов были подвергнуты автоклавированию при 123°С в течение 1 часа. Активность препаратов после обработки сохранялась на уровне исходной - 2048 Усл.Ед./мл.
Пептидная природа антибактериальной активности подтвердилась и в серии ферментативных исследований - антибактериальный эффект сохранялся после обработки ДНК-азой и РНК-азой в течение четырех часов при 37°С, но полностью исчезал после обработки проназой. Антибактериальная активность падала в 2 раза после действия коллагеназы, в 4 раза под влиянием трипсина и в 128 раз после протеолиза папаином (таблица 3.).
Как показали исследования, в лиофилизированной форме антибактериальные препараты низкомолекулярных пептидов полностью сохраняли биологическую активность при хранении при 4°С в течение 1 года.
| Таблица 3. Влияние гидролитических ферментов на активность полученных антибактериальных препаратов пептидов | ||
| Исходная антибактериальная активность, Усл.Ед./мл | Ферменты | Антибактериальная активность после оброаботки, Усл.Ед./мл |
| 2048 | ДНК-аза | 2048 |
| 2048 | РНК-аза | 2048 |
| 2048 | Коллагеназа | 1024 |
| 2048 | Трипсин | 512 |
| 2048 | Папаин | 16 |
| 2048 | Проназа | 0 |
Как известно, спектр антимикробного действия и физико-химические свойства пептидов объясняются особенностями входящих в их состав аминокислот [Кокряков В.Н., 1999]. Аминокислотный состав комплекса пептидов изучали на анализаторе аминокислот Т339 (Чехия). Результаты представлены в таблице 4. На долю лизина, аргинина и гистидина, определяющих суммарный положительный заряд молекул пептидов, приходится 14,3% общего количества аминокислот пептидного комплекса. Доля изолейцина, лейцина и валина, формирующих гидрофобные свойства молекул пептидов, составляет 19,4%. Эти данные характеризуют пептиды комплекса как амфифильные соединения, для которых известна высокая антибактериальная активность.
| Таблица 4. Аминокислотный состав гидролизата препарата комплекса пептидов, продуцируемых в процессе интерфероногенеза | |
| Название аминокислот | % содержания |
| Лизин | 5,8 |
| Гистидин | 1,4 |
| Аргинин | 7,1 |
| Аспартат | 2,1 |
| Треонин | 6,1 |
| Серии | 1,6 |
| Глутамин | 48,4 |
| Пролин | 2,3 |
| Глицин | 1,2 |
| Аланин | 1,4 |
| Валин | 6,2 |
| Метионин | 1,0 |
| Изолейцин | 6,2 |
| Лейцин | 7,0 |
| Тирозин | 0,2 |
| Фенилаланин | 2,0 |
Изучена антибактериальная активность полученных препаратов пептидов в отношении тест-культуры S.epidermidis и перечисленных ниже бактерий методом двукратных разведении. Для постановки текстов использовали планшеты для иммунологических реакций с круглым дном лунок. Для каждого вида бактерий параллельно готовили контрольный ряд лунок, содержащих среду роста и соответствующий инокулюм. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 18 часов. Об антибактериальном действии выделенного комплекса пептидов судили, сопоставляя картину роста бактерий в соответствующих рядах лунок. Минимальную подавляющую рост бактерий концентрацию (МПК) полученных антибактериальных препаратов пептидов определяли по максимальному разведению их растворов, при котором отсутствовали визуальные признаки роста бактерий.
За величину антибактериальной активности принимали обратную величину этого разведения, которую выражали в условных единицах на мл (Усл.Ед./мл). Антибактериальное действие антибактериальных препаратов пептидов представлено в таблице 5.
| Таблица 5 Спектр антибактериального действия и МПК полученных препаратов пептидов, синтезируемых лейкоцитами в процессе интерфероногенеза | |
| Штамм | МПК, мкг/мл |
| Escherihia coli | 8,7 |
| Staphylococcus aureus | 2,2 |
| Proteus vulgaris et mirabilis | 35,0 |
| Klebsiella pneumoniae | 4,4 |
| Pseudomonas aeruginosae | 35,0 |
| Streptococcus faecalis | 35,0 |
| Staphylococcus epidermidis | 0,17 |
Как видно из таблицы 5, полученный антибактериальный препарат, содержащий комплекс низкомолекулярных пептидов, синтезируемых лейкоцитами в процессе интерфероногенеза, обладает антибактериальной активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
Заявляемый препарат является смесью низкомолекулярных пептидов. В лиофилизированном состоянии препарат представляет собой аморфный порошок белого цвета, без запаха и вкуса, хорошо растворимый в воде. Препарат может содержать фармацевтически приемлемые целевые добавки и применяться в виде порошка, раствора, свечей, мази и таблеток.
Препарат обладает антибактериальным действием, является полностью безопасным и не обнаруживает побочных эффектов. Препарат может применяться для профилактики и лечения широкого спектра заболеваний, обусловленных бактериальной флорой.
Антибактериальный препарат, представляющий собой комплекс пептидов, полученных в процессе очистки лейкоцитарного интерферона, отличающийся тем, что он является смесью низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой менее 3 кДа, обладающий антибактериальной активностью не менее 64 усл.ед./мл при содержании белка в обессоленных препаратах 0,015-0,96 мг/мл.
