Способ и набор для определения индуцированной аллергеном активации базофилов для определения гиперчувствительности к некоторым веществам

Изобретение относится к области аллергологии. Сущность: изложен способ определения активации базофилов после стимуляции аллергеном для определения гиперчувствительности к некоторым веществам, при котором образец крови с добавлением интерлейкина-3 в количестве от 0,05 до 50 нг/мл, в зависимости от объема образца, и соответственно разведенный аллерген в количестве от 0,5 до 100 единиц/мл инкубируют при температуре, соответствующей температуре живого организма, в течение 15-45 минут, после чего добавляют окрашивание анти-СD63-антителом в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови и антителом против поверхностного рецептора базофилов в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови при температуре от 0 до +10°С, и образец после встряхивания инкубируют в ледяной бане в течение 15-30 минут, а затем лизируют и подвергают проточной цитометрии. Второй объект: набор для такого определения. Технический результат - повышение эффективности аллергодиагностики. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 24 табл., 4 ил.

 

Область изобретения

Изобретение касается способа определения ответа базофилов в крови пациента после стимуляции аллергеном с целью определения гиперчувствительности к некоторым веществам с помощью двойного мечения.

Предпосылки изобретения

Для определения гиперчувствительности организма к некоторым веществам используются либо тесты in vivo (кожные тесты, двойное спелое испытание), либо тесты in vitro. В настоящее время преобладают тесты in vitro, таким образом избегают аллергенной нагрузки на пациента. Другими аргументами в пользу тестов in vitro являются возраст пациента, вероятность возникновения реакции гиперчувствительности, комфортное состояние пациента (в отличие от кожных уколов, где один укол соответствует определению одного аллергена, тесты in vitro делают возможным определение нескольких аллергенов после однократного взятия крови).

В настоящее время наиболее широко используемым тестом in vitro является измерение уровня специфических IgE-антител (sIgE) в крови пациента, т.е. конечного продукта специфического ответа клеток. Наиболее широко распространенным принципом этого теста является твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA от англ. enzyme-linked immunosorbent assay) в различных модификациях. Определение может быть выполнено с некоторой задержкой после взятия крови у пациента. Из одной порции крови могут быть определены антитела против многих аллергенов. Однако эти результаты могут иногда отличаться от кожных тестов. Например, антитела к аллергену могут исчезать, когда пациент не контактирует с этим аллергеном в течение некоторого времени, даже если речь идет о реакции гиперчувствительности. Часто обнаруживают также перекрестно-реагирующие антитела, и способ в принципе может быть плохо стандартизован.

Поэтому в последнее время стали разрабатываться способы, которые контролируют непосредственный ответ клеток на стимуляцию. Особое внимание было уделено базофилам. Они представляют собой специализированные эффекторные клетки иммунной системы, играющие важную роль в аллергической реакции. Сенсибилизированные клетки активируются специфическим аллергеном. Об активации можно судить, с одной стороны, по экспрессии некоторых рецепторов на поверхности этих клеток (CD63), а с другой стороны, по продукции цитокинов, которые поддерживают продукцию sIgE, и медиаторов, таких как гистамин, лейкотриены и т.д. Они ответственны за некоторые клинические проявления аллергии.

Эти способы все еще далеки от широкого применения. В настоящее время гистамин и сульфидолейкотриены могут быть определены в супернатанте после стимуляции клеток аллергеном с помощью ELISA-тестов. Недостаток заключается в необходимости разделения клеток. В процессе разделения может иметь место неспецифическая активация. Кроме того, пациент не должен принимать никаких противогистаминных средств в течение по крайней мере 48 часов.

Определение экспрессии антигена активации CD63 на базофилах имеет следующие преимущества: 1) работа с цельной кровью, 2) применение тех же растворимых аллергенов, что и для кожных тестов, 3) возможность определить 1-й тип реакций гиперчувствительности к аллергену, даже если в периферической крови не присутствуют sIgE. Кроме того, клетки не активируются перекрестно-реагирующими антителами к аллергену из-за их низкой аффинности. Но определение базофилов путем окрашивания анти-IgE-антителами имеет некоторые ограничения.

При очень низком уровне общих IgE (<80 МЕ/мл) базофилы могут быть окрашены с большим трудом (слабая флуоресценция), а при высоком уровне IgE добавленные антитела (анти-IgE) могут связываться сывороточными IgE.

Введение проточной цитометрии, т.е. способа, который позволяет метить клетки при помощи поверхностных рецепторов, сделает возможным развитие способов, которые основаны на мониторинге клеточного ответа. Таким образом, этот способ сделает возможным определение непосредственного ответа базофилов на аллерген in vitro. В периферической крови содержится очень низкий процент базофилов (около 1%). Они принадлежат к группе гранулоцитов, с которыми они разделяют большинство поверхностных антигенов. В настоящее время известно, что они в отличие от других клеток несут на своей поверхности FcεRI-рецепторы и связывают IgE. Этот факт используется для их окрашивания анти-IgE-антителами. Поэтому базофилы метят флуоресцентными антителами против IgE (ср. Basotest, производимый фирмой Orpegen Pharma).

Сущность изобретения

Авторы изобретения считают, что определение активации базофилов представляет собой способ, который наиболее приближен к условиям in vivo, при этом авторы попытались преодолеть недостатки окрашивания базофилов с помощью анти-IgE-антител. Авторы обнаружили, что более предпочтительно метить базофилы антителом, направленным против поверхностного рецептора, специфичного для них. Таким образом, недостатки, связанные в основном с низким уровнем IgE, могут быть преодолены, поскольку это мечение не зависит от указанного выше уровня. В настоящее время известно, что на базофилах экспрессируется рецептор для интерлейкина-3 (IL-3), который обозначается как CD123. Поэтому для окрашивания базофилов можно выбрать флуоресцентно меченое антитело, которое было получено против этого рецептора. Другим поверхностным маркером для окрашивания базофилов может быть CD203c, так что можно использовать анти-СD203с-антитело.

Определение осуществляют в цельной крови. В том случае, если клетки чувствительны к аллергену, то после его добавления и в течение последующей инкубации аллерген свяжется с IgE-антителами, которые специфичны к данному аллергену. Связь антиген-антитело станет для клеток сигналом к началу активации и последующему запуску процессов, которые завершатся дегрануляцией базофилов и высвобождением медиаторов, ответственных за аллергическую реакцию in vivo. Ответ базофилов контролируют путем определения экспрессии СD63-антигена. Базофилы окрашивают антителами против рецептора, который они несут на своей поверхности, предпочтительно антителом против CD123 (рецептора для IL-3) или против CD203c-рецептора. Если в организме нет антител против добавленного аллергена, связанных с базофилами пациента, то реакция антиген-антитело не возникнет, и таким образом не будет иметь место активация клеток, а следовательно, и экспрессия CD63.

Краткое описание Фигур

Приложенные Фигуры демонстрируют серии гистограмм, полученных при помощи проточного цитометра Coulter Epics XL для каждого тестируемого пациента.

Значения отдельных гистограмм:

Гистограмма 1 - Распределение клеток в соответствии с прямым (FS от англ. forward scattering) и боковым (SS от англ. side scattering) светорассеянием. Окно (Гейт) N очерчивает область, где находятся базофилы.

Гистограмма 2 - Определяет базофильную область на основе бокового светорассеяния (SS) и связывания анти-IgE/FITC-антител (окно F).

Гистограмма 3 - Определяет базофильную область на основе бокового светорассеяния (SS) и связывания анти-СD123 (или анти-CD203с/РЕ)-антител (окно А).

Гистограмма 4 - Распределение клеток по интенсивности их флуоресценции, т.е. связывания с анти-IgE/FITC.

Гистограмма 5 - Распределение клеток по интенсивности их флуоресценции, т.е. связывания с анти-СD123/РЕ (или анти-СD203с/РЕ).

Гистограмма 6 - Процентное распределение базофилов, которые окрашены анти-IgE/FITC (окно F, Гистограмма 2).

Квадрант 1 (В1) - Клетки, окрашенные анти-IgE/FITC-антителами - другие клетки, не базофилы, присутствующие в окне F.

Квадрант 2 (В2) - Клетки, меченые как анти-СD123/РЕ (или анти-СD203с/РЕ)-антителами, так и анти-IgE/FITC-антителами.

Квадрант 3 (В3) - Неокрашенные клетки.

Квадрант 4 (В4) - Клетки, окрашенные анти-СD123/РЕ (или анти-СD203с/РЕ)-антителами.

Гистограмма 7 - Процентное распределение базофилов, которые окрашены анти-CD123/PE (окно А, Гистограмма 3).

Квадрант 1 (G1) - Клетки, окрашенные анти-IgE/FITC-антителами - другие клетки, не базофилы, присутствующие в окне F.

Квадрант 2 (G2) - Клетки, окрашенные как анти-СD123/РЕ (или анти-СD203с/РЕ)-антителами, так и анти-IgE/FITC-антителами.

Квадрант 3 (G3) - Неокрашенные клетки.

Квадрант 4 (G4) - Клетки, меченые анти-СD23/РЕ (или анти-СD203с/РЕ)-антителами.

Гистограмма 8 - Распределение базофилов, которые мечены анти-CD123/PE (или анти-СD203с/РЕ), на основе бокового светорассеяния (SS) и связывания анти-IgE/FITC-антител.

Фигуры 1-1 - 1-8 иллюстрируют общую экспрессию CD123⁺/IgE⁺ на базофилах, как функцию концентрации общего IgE в сыворотке, приведенную в Таблице 1.

Фигуры 2-1 - 2-5 иллюстрируют общую экспрессию CD203c⁺/IgE⁺ на базофилах, как функцию концентрации общего IgE в сыворотке, приведенную в Таблице 2.

Фигуры 3-1 - 3-4 иллюстрируют:

Фигура 3-1 - Образец без стимуляции (отрицательный контроль КО).

Фигура 3-2 - Образец, стимулированный FMLP (неспецифический контроль).

Фигура 3-3 - Образец, стимулированный аллергенами осы.

Фигура 3-4 - Образец, стимулированный аллергенами пчелы.

Значения гистограмм на Фигурах 3-1 - 3-4:

Гистограмма 1 - Распределение клеток в соответствии с прямым (FS) и боковым (SS) светорассеянием. Окно N очерчивает область, где находятся базофилы.

Гистограмма 2 - Определяет базофильную область на основе бокового светорассеяния (SS) и связывания анти-IgE/FITC-антител (окно В).

Гистограмма 3 - Процентное распределение базофилов в соответствии со связыванием антител:

Квадрант 1 (С1) - Клетки, окрашенные СD63/РЕ-антителами - другие активированные клетки, не базофилы, присутствующие в окне В (Гистограмма 2).

Квадрант 2 (С2) - Клетки, окрашенные как анти-СD63/РЕ-антителами, так и анти-IgE/FITC-антителами, т.е. активированные клетки.

Квадрант 3 (С3) - Неокрашенные клетки.

Квадрант 4 (С4) - Клетки, окрашенные анти-IgE/FITC-антителами - неактивированные базофилы.

Гистограмма 4 - Распределение клеток в соответствии с интенсивностью их флуоресценции, т.е. со связыванием анти-IgE/FITC.

Гистограмма 5 - Распределение клеток по интенсивности их флуоресценции, т.е. по связыванию CD63/PE.

Фигуры 4-1 - 4-8 иллюстрируют сравнение результатов анти-IgE /FITC-CD63/PE и анти-CD123/PE-CD63/FITC.

Примеры

Пример 1

Анализ выполняют на образце цельной крови, собранной в гепарине. Для каждого теста 100 мкл цельной крови и 10 мкл раствора IL-3 в PBS (забуференный физиологический раствор) в концентрации 0,05 мкг/мл переносят с помощью пипетки в тест-пробирку. Для отрицательного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл PBS, для положительного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл FMLP (хемотаксического пептида N-формил-L-метионил-L-лейцил-L-фенилаланина) в концентрации 0,433 мкг/мл, и в тест-пробирку с анализируемым образцом добавляют 100 мкл соответственно разведенного аллергена. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 30 минут, затем переносят в ледяную баню. Затем в каждую тест-пробирку вносят 20 мкл моноклональных анти-CD123-антител, меченых РЕ (от англ. phycoerythrine - фикоэритрин; от фирмы Becton Dickinson), и 5 мкл моноклональных анти-СD63-антител, меченых FITC (от фирмы Caltag). Образцы тщательно перемешивают и инкубируют в ледяной бане в течение 15-20 минут. Дальнейшую обработку осуществляют при комнатной температуре. Эритроциты в образцах лизируют путем добавления лизирующего агента, например, 2 мл NH₄Cl. После лизиса образцы центрифугируют при 1000 об/мин. Образцы декантируют и к осадку добавляют 0,5 мл PBS. Измерение на цитометре осуществляют с образцом, приготовленным таким способом.

Пример 2

Тест выполняют на образце цельной крови, собранной в гепарине. Для каждого теста 100 мкл крови и 10 мкл раствора IL-3 в PBS в концентрации 0,05 мкг/мл переносят с помощью пипетки в тест-пробирку. Для отрицательного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл PBS, для положительного контроля - 100 мкл FMLP в концентрации 0,433 мкг/мл. В тест-пробирку с анализируемым образцом добавляют 100 мкл соответственно разведенного аллергена. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 30 минут, затем переносят в ледяную баню. Затем в каждую тест-пробирку вносят 20 мкл моноклональных анти-СD203с-антител, меченых РЕ (от фирмы Immunotech), и 5 мкл моноклональных анти-СD63-антител, меченых FITC (от фирмы Caltag). Образцы тщательно перемешивают и инкубируют в ледяной бане в течение 15-20 минут. Дальнейшую обработку осуществляют при комнатной температуре. Эритроциты в образцах лизируют путем добавления лизирующего агента, например, 2 мл NH₄Cl. После лизиса образцы центрифугируют при 1000 об/мин. Образцы декантируют и к осадку добавляют 0,5 мл PBS. Измерение на цитометре осуществляют с образцом, приготовленным таким способом.

Пример 3

Тест выполняют на образце цельной крови, собранной в гепарине. Для каждого теста 100 мкл крови и 10 мкл раствора IL-3 в PBS в концентрации 0,5 мкг/мл переносят с помощью пипетки в тест-пробирку. Для отрицательного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл PBS, для положительного контроля - 100 мкл FMLP в концентрации 0,433 мкг/мл. В тест-пробирку с анализируемым образцом добавляют 100 мкл соответственно разведенного аллергена. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 30 минут. Затем образцы переносят в ледяную баню. В каждую тест-пробирку вносят 20 мкл моноклональных анти-СD203с-антител, меченых РЕ (от фирмы Immunotech), и 5 мкл моноклональных анти-СD63-антител, меченых FITC (от фирмы Caltag). Образцы тщательно перемешивают и инкубируют в ледяной бане в течение 15-20 минут. Дальнейшую обработку осуществляют при комнатной температуре. Эритроциты в образцах лизируют путем добавления лизирующего агента, например, 2 мл NH₄Cl. После лизиса образцы центрифугируют при 1000 об/мин. Образцы декантируют и к осадку добавляют 0,5 мл PBS. Измерение на цитометре осуществляют с образцом, приготовленным таким способом.

Пример 4

Анализ осуществляют с помощью набора, который содержит 1 мл раствора IL-3 (Sigma) в концентрации 0,05 мкг/мл, 200 мл PBS, 2 мл анти-СD63 -антител, меченых FITC (Beckman-Coulter), 2 мл анти-СD203с-антител, меченых РЕ (Beckman-Coulter), 10 мл раствора FMLP в концентрации 4,33 мкг/мл и 200 мл лизирующего раствора NH₄Cl. Анализ выполняют на образце цельной крови, собранной в гепарине. Для каждого теста 100 мкл цельной крови и 10 мкл раствора IL-3 в PBS в концентрации 0,05 мкг/мл переносят с помощью пипетки в тест-пробирку. Для отрицательного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл PBS, для положительного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл FMLP в концентрации 4,33 мкг/мл, и в тест-пробирку с анализируемым образцом добавляют 100 мкл соответственно разведенного аллергена. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 30 минут. Затем образцы переносят в ледяную баню. В каждую пробирку вносят 20 мкл моноклональных анти-СD203с-антител и 20 мкл моноклональных анти-СD63-антител. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют в ледяной бане в течение 15-20 минут. Дальнейшую обработку осуществляют при комнатной температуре. Эритроциты в образцах лизируют путем добавления лизирующего агента, например, 2 мл NH₄Cl. После лизиса образцы центрифугируют при 1000 об/мин. Образцы декантируют и к осадку добавляют 0,5 мл PBS. Измерение на цитометре осуществляют с образцом, приготовленным таким способом.

Пример 5

Анализ осуществляют с помощью набора, который содержит 1 мл раствора IL-3 (Sigma) в концентрации 1 мкг/мл, 200 мл PBS, 2 мл анти-СD63-антител, меченых FITC (Beckman-Coulter), 2 мл анти-СD203с-антител, меченых РЕ (Beckman-Coulter), 10 мл раствора FMLP в концентрации 4,33 мкг/мл и 200 мл лизирующего раствора NH₄Cl. Анализ выполняют на образце цельной крови, собранной в гепарине. Для каждого теста 100 мкл цельной крови и 10 мкл раствора IL-3 в PBS в концентрации 0,05 мкг/мл переносят с помощью пипетки в тест-пробирку. Для отрицательного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл PBS, для положительного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл FMLP в концентрации 4,33 мкг/мл, и в тест-пробирку с анализируемым образцом добавляют 100 мкл соответственно разведенного аллергена. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 30 минут. Затем образцы переносят в ледяную баню. В каждую пробирку вносят 20 мкл моноклональных анти-СD203с-антител и 20 мкл моноклональных анти-СD63-антител. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют в ледяной бане в течение 15-20 минут. Дальнейшую обработку осуществляют при комнатной температуре. Эритроциты в образцах лизируют путем добавления лизирующего агента, например, 2 мл NH₄Cl. После лизиса образцы центрифугируют при 1000 об/мин. Образцы декантируют и к осадку добавляют 0,5 мл PBS. Измерение на цитометре осуществляют с образцом, приготовленным таким способом.

Результаты измерений на проточном цитометре Coulter Epics XL (Beckman-Coulter) приведены в следующих Таблицах и проиллюстрированы на приложенных Фигурах.

Ключ к сокращениям и терминологии:

IL-3 - интерлейкин-3

PBS - забуференный физиологический раствор

FMLP - N-формил-L-метионил-L-лейцил-L-фенилаланин

FITC - флуоресцеинизотиоцианат

РЕ - фикоэритрин

DF - Dermathophagoides farinae (акарид)

DP - Dermathophagoides pteronyssinus (акарид)

окно (gate), установка (селекция) окна (gating) - в области цитометрии: определение области, где будут анализироваться клетки, например клетки, окрашенные моноклональными антителами.

Таблица 1: Общая экспрессия CD123+/IgE+ на базофилах, как функция общей концентрации IgE в сыворотке
№ пациента	IgE	CD123+IgE+
	Ед/мл	окно IgE+	окно CD 123+
МН	48	79%	56%
18455	41,9	21%	19%
15931	>17800	32%	80%
17669	169	92%	91%
18394	428	38,6%	84,5%
18483	53	85%	100%
18539	251	72%	87%
18535	12,5	12%	2,5%
18507	11,1	6,2%	3%
18517	>2000	62,7%	65,3%
18765	66,5	81,4%	73%
12529	22	93%	71%
12580	395	88%	80%
12560	10,3	небольшое кол-во клеток	4,8%
12530	95	68%	69%
19864	91	82,7%	84.1%
JK	200	91%	85%

Таблица и Фигуры 1-1 - 1-8 дают несколько примеров двухцветного окрашивания базофилов. Определили процентное содержание базофилов, окрашенных анти-IgE-антителами, которые несут также CD123-рецептор, и наоборот, процентное содержание базофилов, окрашенных анти-CD123, которые являются также анти-IgE-положительными.

Из таблицы следует, что окрашивание базофилов анти-IgE-антителами соответствует сывороточным уровням IgE 100-400 Ед/мл. При низком уровне IgE (пациенты МН, 18535,18455,18507,12560) базофилы, окрашенные анти-IgE, не могут быть определены, поскольку антитела не связываются с ними. С другой стороны, при высоком уровне IgE (пациент 15931) наблюдается либо неспецифическое связывание антител с моноцитами, либо замещение добавленных антител сывороточным IgE.

Таблица 2: Общая экспрессия CD203c+/IgE+ на базофилах, как функция общей концентрации IgE в сыворотке
№ пациента	IgE	CD203c+IgE+
	Ед/мл	окно IgE+	окно CD123c+
19894	91	77,4%	82,3%
19397	42,9	77,9%	67,7%
20156	42,5	92,7%	90,7%
МН	48	91,5%	45,4%
JK	200	87,1%	97,3%

Таблица и приложенные Фигуры 2-1 - 2-5 дают несколько примеров двухцветного окрашивания базофилов. Определили процентное содержание базофилов, окрашенных анти-IgE-антителами, которые несут также СD203с-рецептор, и наоборот, процентное содержание базофилов, окрашенных анти-СD203с, которые являются также анти-IgE-положительными.

Активация базофилов, как функция концентрации IL-3

Таблица 3
Концентрация IL-3, нг/мл	Отрицательный контроль, КО	Неспецифический контроль, KN	Спец. стимуляция, смесь из 3 видов трав
5	1,6%	37,5%	38,4%
2,5	5,9%	34,1%	28,7%
1,25	1,6%	27,8%	29,2%
0,062	1,6%	30,6%	28,2%
0 (PBS)	1,0%	15,2%	3,9%
Таблица 4
Концентрация IL-3, нг/мл	Отрицательный контроль, КО	Спец. стимуляция, эпителий собаки
5	3,3%	56,9%
2,5	6,3%	53,4%
1,25	-	51,6%
0,625	-	49,4%
0,312	3,1%	49,2%
0,156	-	51,8%
0,078	2,8%	44,3%
0,039	-	42,5%
0 (PBS)	6,4%	40,7%
Таблица 5
Концентрация IL-3, нг/мл	Отрицательный контроль, КО	Спец. стимуляция, DF (акарид)	Неспец, стимуляция, KN
5	1,6%	82,1%	18,5%
2,5	2,5%	83,3%	16,4%
1,25	2,5%	83,2%	15,0%
0,625	3,1%	85,5%	16,2%
0,312	3,7%	81,1%	17,1%
0,156	3,9%	81,1%	14,5%
0 (PBS)	2,6%	17,0%	10,9%
Таблица 6
Конц. IL-3 в образце, нг/мл	Отрицательный контроль, КО	Спец. стимуляция, DF (акарид)
41,3	2,8%	81,9%
20,6	4,3%	85,7%
10,3	-	87.7%
5,16	-	82,8%
2,58	5,1%	78,5%
1,29	-	67,2%
0,65	3,8%	51,3%
0 (PBS)	6,3%	6,2%
Таблица 7
Конц. IL-3 в образце, нг/мл	Отрицательный контроль, КО	Спец. стимуляция, смесь из 3 видов трав
41,3	3,4%	86,6%
20,6	5,3%	86,7%
10,3	-	86,0%
5,16	-	80,9%
2,58	5,1%	78,6%
1,29	-	66,1%
0,65	4,5%	62,0%
0 (PBS)	4,3%	39,0%

Активация базофилов, как функция времени инкубации с аллергеном

Таблица 8
Время инкубации в минутах	Отрицательный контроль, КО	Спец. стимуляция, DF (акарид)	Неспец. стимуляция, KN
15	5,8%	85,0%	24,3%
30	3,1%	86,4%	19,0%
45	2,5%	77,9%	19,5%
Таблица 9
Время инкубации в минутах	Отрицательный контроль, КО	Спец. стимуляция, смесь видов трав -ST	Неспец, стимуляция, KN
15	4,3%	32,4%	40,9%
30	6,7%	31,5%	41,6%
45	11,4%	35,1%	15,0%
Таблица 10
Время инкубации в минутах	Отрицательный контроль, КО	Спец. стимуляция, оса	Спец. стимуляция, пчела	Неспец. стимуляция, KN
15	6,6%	88,1%	8,4%	23,4%
30	4,7%	89,1%	11,9%	37,3%
45	6,7%	78,5%	10,5%	28,5%
Таблица 11
Время инкубации в минутах	Отрицательный контроль, КО	Спец. стимуляция, DF (акарид)	Спец. стимуляция, яичный белок	Неспец. стимуляция, KN
15	2,4%	7,6%	6,8%	41,6%
30	2,9%	4,5%	7,4%	42,1%
45	4,8%	13,0%	4,6%	22,4%

Активация базофилов, как функция преинкубации крови с IL-3

Таблица 12
Время инкубации в минутах	Отрицательный контроль, КО	Спец. стимуляция, смесь видов трав - ST	Неспец. стимуляция, KN
0	5,3%	99,1%	28,0%
10	5,8%	96,8%	53,0%
Таблица 13
Время преинкубации в минутах	Отрицат. контроль, КО	Спец. стимуляция, береза	Спец. стимуляция, сельдерей	Спец. стимуляция, киви	Спец. стимуляция, смесь видов трав	Неспец. стимуляция, KN
0	2,7%	94%	94,7%	11,9%	98,4%	48%
10	4,1%	94%	94%	12,5%	99%	74,5%
Таблица 14
Время инкубации в минутах	Отрицательный контроль, КО	Спец. стимуляция, смесь видов трав - ST	Неспец, стимуляция, KN
0	5,3%	99,1%	28,0%
10	5,8%	96,8%	53,0%

Активация базофилов, как функция разведения аллергена

Таблица 15
Аллерген	Концентрация аллергена 100 Ед/мл
Разв. 5х	Разв. 10х	Разв. 20х
Сельдерей	50,6%	80,3%	91%
Береза	46,5%	46,2%	46,3%
Цветки пшеницы	7,7%	13,5%	8,6%
Таблица 16
Аллерген	Концентрация аллергена 100 Ед/мл
Разв. 10х	Разв. 20х	Разв. 40х	Разв. 80х	Разв. 100х
Оса	30,9%	13,2%	10,4%	-	-
Пчела	29,7%	40,8%	50,0%	41,5%	36,8%

Таблица 17
Аллерген	Концентрация аллергена 100 Ед/мл
Разв.10х	Разв. 100х	Разв. 1000х
Яблоко	52,8%	7,5%	1,0%
Грецкий орех	12,6%	57,2%	5,6%
Таблица 18
Аллерген	Концентрация аллергена 100 Ед/мл
Разв. 10х	Разв. 100х	Разв. 1000х
Райграс	31%	25%	21%
Тимофеевка	32%	32,5%	25%
Таблица 19
Аллерген	Концентрация аллергена 100 Ед/мл
Разв. 10х	Разв. 100х	Разв. 1000х
Смесь из 3 видов трав	42%	43,5%	54,3%
Таблица 20
Аллерген	Концентрация аллергена 100 Ед/мл
Разв. 10х	Разв. 100х	Разв. 1000х
Смесь из 3 видов трав	39%	10.7%	6,7%
Таблица 21
Аллерген	Концентрация аллергена 100 Ед/мл
Разв. 10х	Разв. 100х	Разв. 1000х
Оса	54,8%	58%	11,2%
Пчела	56,6%	51,8%	58,8%
Таблица 22
Аллерген	Концентрация аллергена 100 Ед/мл
Разв. 10х	Разв. 100х	Разв. 1000х
Оса	59,8%	67%	15,4%
Пчела	54,6%	56,3%	22,8
Таблица 23
Аллерген	Концентрация аллергена 100 Ед/мл
Разв. 10х	Разв. 100х
Оса	24,8%	16,8%
Пчела	6.2%	11%

Активация, как функция концентрации IL-3 и разведения аллергена

Таблица 24
Концентрация IL-3, нг/мл.	Отрицат. контроль, КО	Спец. стим., пчела 10х	Спец. стим., пчела 100х	Неспец, стим., KN
2,5	6,9%	85,2%	94,7%	41,1%
1,25	3,4%	77,1%	75,2%	39,4
0,625	2,2%	86,9%	80,2%	42,4%

Базовая концентрация аллергена составляет 100 Ед/мл

Нормальные значения:	КО <8%
	с аллергеном <15%

Сравнение результатов пациента, полученных описанным способом (базофилы, окрашенные анти-IgE, анти-CD123 или анти-203-антителами), с тестом, названным BASOTEST, доступным от фирмы ORPEGEN

Сравнение: анти-IgE/CD63 против Basotest

Образец 1

	Отрицат. контроль, КО	Спец. стим., береза	Спец. стим., сельдерей	Спец. стим., смесь трав
IgE/CD63	6,0%	93%	95,8%	12,9%
Basotest	5,5%	87,8%	90%	13,5%

Образец 2

	Отрицат. контроль, КО	Спец. стим., пчела	Спец. стим., оса	Спец.стим., береза	Спец. стим., смесь трав
IgE/CD63	1,6%	0,9%	63,6%	2,0%	1,0%
Basotest	3,6%	1,0%	68,1%	1,6%	1,3%

Сравнение: анти-СВ123 против Basotest

Образец 3

	Отрицат. контроль, КО	Спец. стим., DF (акарид)	Спец. стим., DP (акарид)	Спец. стим., смесь трав
CD123/CD63	6,4%	11,8%	11,7%	12,3%
Basotest	2,4%	2,9%	4,2%	11,7%

Образец 4

	Отрицат. контроль, КО	Спец. стим., оса	Спец. стим., пчела	Неспец, стим., KN
CD123/CD63	2,3%	8,5%	5,2%	46,1%
Basotest	1,0%	5,2%	1,5%	42,3%

Сравнение: Basotest против анти-CD123/CD63, анти-СD203с/СD63

Образец 5.

	Отрицательный контроль, КО	Неспец. контроль, KN	Спец. стим., эпителий собаки
Basotest	3,5%	78,8%	5,1%
CD123/CD63	5,8%	68,6%	10,7%
CD203/CD63	4,2%	84,8%	6.7%

Сравнение: анти-IgE/CD63 против Basotest, анти-CD123/CD63, анти-CD203c/CD63

Образец 6

	CD 123 или CD203/IgE	Отрицательный контроль, КО	Неспец. контроль, KN	Спец. стим., DF (акарид)
IgE/CD63	-	3,1%	19,0%	86,4%
Basotest	-	5,4%	19,0%	85,9%
CD123/CD63	85%	2,4%	32,0%	85,3%
CD203/CD63	96,7%	5,9%	36,5%	92,3%

Сравнение: анти-IgE/FITC-CD63/PE, анти-CD123/PE-CD63/FITC и CD203c/PE-CD63/FITC.

Анализировали гиперчувствительность к аллергенам пчелы и осы. Результаты проиллюстрированы на Фигурах 3-1 - 3-4 и выражены в виде процентного содержания положительных базофилов, т.е. базофилов, которые чувствительны к аллергену (на Фигурах Гистограмма 3 или 6, квадрант 2 - клетки, которые несут как маркер базофилов, так и антиген активации CD63). КО - образец без стимуляции (отрицательный контроль).

Клеточное мечение	КО, %	оса, %	пчела, %
IgE/CD63	5,1	5,0	61,8
CD123/CD63	1,5	3,4	56,6
CD203c/CD63	3,5	6,2	50,3

Нормальные значения:	КО <8%
	с аллергеном <15%

Для сравнения для пациента были определены специфические IgE-антитела против следующих аллергенов:

оса	0,35 Ед/мл
пчела	1,4 Ед/мл положительными являются значения >0,35 Ед/мл

Благодаря уровню общего IgE (около 90 МЕ/мл) все три способа окрашивания базофилов согласуются со сравниваемыми результатами.

Окрашивание клеток антителами против IgE (анти-IgE/FITC) и против антигена активации CD63 (CD63/PE). Сравнение результатов: анти-IgE/FITC-CD63/PE против анти-CD123/PE-CD63/FITC

Была проанализирована гиперчувствительность к аллергенам яичного белка, коровьего молока и цветков пшеницы.

Результаты проиллюстрированы на Фигурах 4-1 - 4-8 и выражены в виде процентного содержания положительных базофилов, т.е. базофилов, которые чувствительны к аллергену (на Фигурах Гистограмма 3 или 6, квадрант 2 - клетки, которые несут как маркер базофилов, так и антиген активации CD63), КО - образец без стимуляции (отрицательный контроль).

Мечение базофилов	КО, %	яичный белок, %	коровье молоко, %	цветки пшеницы, %
IgE/CD63	6,0	57,2	62,6	5,8
CD123/CD63	6,0	57	70,7	11,1

Нормальные значения:	КО <8%
	с аллергеном <15%

Для сравнения для пациента были определены специфические IgE-антитела против следующих аллергенов:

яичный белок	>25 Ед/мл
коровье молоко	>25 Ед/мл
цветки пшеницы	1,71 Ед/мл; положительными являются значения >35 Ед/мл

Из-за высокого уровня общего IgE (>17800 МЕ/мл) более подходящим является окрашивание базофилов анти-CD123-антителами, чем анти-IgE-антителами (по-видимому, имеет место их связывание с сывороточным IgE).

Расхождение между результатами спец. IgE против цветков пшеницы (1,7-положительные) и негиперчувствительностью, обнаруженной авторами изобретения, подтверждает их находку, что в процессе определения sIgE имеет место неспецифическое связывание. Одновременно определяют перекрестно-реагирующие антитела (ложно-положительные результаты), которые являются антителами с низкой аффинностью и которые не часто вызывают клинические реакции.

Сравнение результатов активации базофилов, sIgE и клинических проявлений

Аллерген: пчела

Пациент	% активированных базофилов	Специфические IgE против аллергенов пчелы	Клинические проявления
Се-I	51,8%	14,6	SSR
Ce-D	56,3%	1,4	SSR
Во	20%	<0,35	SLR
Но	5,2%	<0,35	?
En	6,2%	<0,35	?
Ben	82%	1,33	SSR
Hav	5,7%	<0,35	?
Sev	5,6%	<0,35	?
Sch	77%	>17,5	?
Fru	68,5%	>17,5	?
Bo	40,8%	>17,5	?
Vla	1,8%	0,35	?
Vl	1,7%	0,35	?
Ja	5,9%	0,35	?
Kr	2,5%	0,75	?
Pru	78,9%	0,52	?
Tu	2,0%	0,65	?
He	8,2%	0,35	?
Ha	11,9%	0,35	?
Ba	57,4%	1,4	SSR
Sko	10,3%	0,36	?

SSR - тяжелая системная реакция, SLR - тяжелая местная реакция

Положительные результаты:	>0,35 Ед/мл sIgE
	>15% активированных базофилов

Аллерген: оса

Пациент	% активированных базофилов	Специфические IgE против аллергенов осы	Клинические проявления
Va	88%	>17,5	SSR
Ce-I	58%	<0,35	SSR
Ce-D	59,9	5,9	SSR
Во	30%	<0,35	SLR
Но	7%	<0,35	?
En	24,8%	0,51	?
Ben	8,5%	<0,35	?
Hav	57,8%	7,33	SSR
Sev	58%	<0,35	SSR
Sch	86%	>17,5	SSR
Fru	74,3%	1,04	?
Bo	30,9%	1,33	?
Vla	3,2%	<0,35	?
Vl	2,1%	<0,35	?
Ja	27,6%	0,59	?
Kr	71,5%	0,75	SSR
Pru	78%	<0,35	?
Tu	7,1%	0.42	?
He	76,1%	<0,35	SSR
Ha	89%	0,87	SSR
Ba	8,1%	<0,35	?
Sko	49,7%	<0.35	SSL

SSR - тяжелая системная реакция, SLR - тяжелая местная реакция

Положительные результаты:	>0,35 Ед/мл sIgE
	>15% активированных базофилов

1. Способ измерения активации базофилов для определения гиперчувствительности к аллергенам, характеризующийся тем, что образец крови с добавлением интерлейкина-3 в количестве от 0,05 до 50 нг/мл в зависимости от объема образца и соответственно разведенный аллерген в количестве от 0,5 до 100 единиц/мл инкубируют при температуре, соответствующей температуре живого организма, в течение 15-45 мин, после чего добавляют меченое анти-СD63-антитело в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови и меченое антитело против поверхностного маркера базофилов, выбранное из анти-СD123 или анти-СD203с антител, в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови при температуре от 0 до +10°С, затем образец после встряхивания инкубируют в ледяной бане в течение 15-30 мин, лизируют и подвергают проточной цитометрии.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что образец крови с добавлением интерлейкина-3 в количестве от 0,05 до 5 нг/мл в зависимости от объема образца и соответственно разведенного аллергена в количестве от 0,5 до 100 единиц/мл инкубируют при температуре, соответствующей температуре живого организма, в течение 15-45 мин, после чего добавляют меченое анти-СD63-антитело в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови и меченое антитело, выбранное из анти-CD123 или анти-СD203с антител, в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови при температуре от 0 до +10°С, затем образец после встряхивания инкубируют в ледяной бане в течение 15-30 мин, лизируют и подвергают проточной цитометрии.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.

5. Набор для определения гиперчувствительности к аллергенам, основанного на измерении активации базофилов, с помощью способа по любому из пп.1-4, характеризующийся тем, что он содержит, из расчета на 100 анализов, от 1 нг до 2 мкг интерлейкина-3, 200 мл буфера, 0,3-3 мл меченого анти-СD63-антитела и 0,3-3 мл меченого антитела против поверхностного маркера базофилов, выбранного из анти-СD123 или анти-СD203с антител, 4,33 мкг N-формил-L-метионил-L-лейцил-L-фенилаланина и при необходимости традиционные растворители.

6. Набор по п.5, отличающийся тем, что он содержит, из расчета на 100 анализов, от 1 до 100 нг интерлейкина-3,200 мл буфера, 0,3-3 мл меченого анти-СD63-антитела и 0,3-3 мл меченого антитела, выбранного из анти-СD123 или анти-СD203с антител, 4,33 мкг N-формил-L-метионил-L-лейцил-L-фенилаланина и при необходимости традиционные растворители.