Способ индивидуального выбора эффективного химиотерапевтического средства для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии
Владельцы патента RU 2273854:
Автономная некоммерческая организация "Центр инноваций и наукоемких технологий" (RU)
Изобретение относится к области медицины. Способ характеризуется тем, что берут исследуемый материал, высевают его на селективную питательную среду, выделяют чистую культуру патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов. Готовят их микробные взвеси, добавляют химиотерапевтическое средство, в контроль - физиологический раствор. Опытные и контрольные пробы инкубируют, делают микробные взвеси с физиологическим раствором, добавляют сыворотку человека, инкубируют, добавляют жидкую питательную среду, вновь инкубируют, определяют оптическую плотность культур и при угнетении роста в опытной пробе более чем на 20% по отношению к контрольной характеризуют химиотерапевтическое средство как эффективное. Изобретение позволяет просто и быстро определить эффективность химиотерапевтического препарата. 2 табл.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для индивидуального выбора химиотерапевтического средства с целью повышения эффективности лечения различных воспалительных заболеваний микробной этиологии.
Известен способ определения эффективности антибиотика для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии, заключающийся в том, что из микрофлоры экологической ниши тела человека, являющейся очагом воспаления, выделяют чистые культуры возбудителя и условно-патогенных микроорганизмов, готовят их микробные взвеси, проводят штампом перекрестный посев микробных взвесей возбудителя с каждым из выделенных представителей условно-патогенных микроорганизмов на плотную питательную среду, контрольные посевы этих же культур проводят полосой, на место перекреста в опыте и на центр посева в контроле наносят индикаторный диск, пропитанный антибиотиком, инкубируют и измеряют диаметр зон задержки роста культур вокруг диска в опыте и контроле, при увеличении его у возбудителя в опыте по сравнению с контролем на 1 мм и более и одновременно уменьшении на 1 мм и более или неизменении у каждого из условно-патогенных микроорганизмов в опыте по сравнению с контролем считают антибиотик эффективным [1].
Существенным недостатком данного способа является необходимость дифференциации возбудителя воспалительного заболевания от нормальной микрофлоры или контаминантов, поскольку в настоящее время большинство воспалительных заболеваний вызываются условно-патогенными микроорганизмами [2, 3, 4], что довольно затруднительно в условиях стандартной лаборатории [5].
Известен способ определения эффективной дозы антисептического препарата, электролизного раствора гипохлорита натрия для лечения и профилактики гнойно-воспалительных заболеваний путем инкубирования возбудителя в среде с различными концентрациями препарата и выявлением минимальной бактериостатической концентрации препарата, дополнительным определением суббактериостатической концентрации препарата, параллельным высевом исследуемого материала из проб с суббактериостатической концентрацией препарата и контрольной пробы на питательную среду, содержащую интерферон, инкубированием посевом, стерилизацией выросших колоний возбудителя парами хлороформа, заливанием поверхности среды слоем питательного агара с индикаторным штаммом тест-культуры, повторным инкубированием и суждении об эффективности дозы препарата по отсутствию роста тест-культуры вокруг исследуемого штамма в опытной пробе по сравнению с контролем [6].
Однако указанный способ имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, данный способ предназначен лишь для определения эффективной дозы лишь одного антисептического препарата - электролизного раствора гипохлорита натрия - и неприменим для других химиотерапевтических средств. Во-вторых, антисептики не обладают избирательностью действия [7] и их терапевтические концентрации могут оказывать бактерицидное влияние на представителей нормальной микрофлоры [8].
Наиболее близким по совокупности признаков к заявляемому способу является способ выбора эффективного химиотерапевтического средства, основанный на оценке влияния химиотерапевтических препаратов на биологические характеристики бактерий, в частности на факторы персистенции [9].
Недостатками данного способа являются его сложность и длительность (необходимость определения субингибиторных концентраций химиотерапевтических препаратов по отношению к патогенным и/или условно-патогенным микроорганизмам, тестирование выраженности персистентных характеристик патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов до и после воздействия на них субингибиторных концентраций химиотерапевтических препаратов). Также недостатком данного способа является то, что одни и те же препараты снижают лишь некоторые факторы персистенции, не оказывая влияния на другие, что недостаточно для элиминации патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов и санации организма больного, либо оказывают разнонаправленное действие на различные факторы персистенции.
Заявляемый способ решает задачу повышения эффективности при индивидуальном выборе химиотерапевтического средства для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии.
Для решения указанной задачи в заявляемом способе индивидуального выбора эффективного химиотерапевтического средства для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии из очага воспаления больного человека, выделяют чистые культуры патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов готовят их микробные взвеси, добавляют к ним раствор химиотерапевтического средства, в контрольную пробу вместо химиотерапевтического средства добавляют физиологический раствор, опытные и контрольные пробы инкубируют, после инкубации отмывают микробные взвеси физиологическим раствором, добавляют сыворотку крови больного человека, инкубируют, во все пробы добавляют жидкую питательную среду, вновь инкубируют, определяют оптические плотности выросших культур в опытной и контрольной пробах, результаты сравнивают, при этом угнетение роста патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов в опытной пробе более чем на 20% по сравнению с контрольной свидетельствует об эффективности химиотерапевтического средства.
Новым в заявляемом способе индивидуального выбора эффективного химиотерапевтического средства для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии является то, что после инкубации патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов с раствором химиотерапевтического средства определяют чувствительность последних к сыворотке крови больного человека, при этом угнетение роста патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов в опытной пробе более чем на 20% по сравнению с контрольной свидетельствует об эффективности химиотерапевтического средства.
Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат состоит в том, что новый способ индивидуального выбора эффективного химиотерапевтического средства для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии позволяет сократить сроки выбора химиотерапевтического средства и повысить эффективность выбора.
Известна роль устойчивости бактерий к бактерицидному действию сыворотки крови в инициации и пролонгации инфекционно-воспалительных заболеваний различной локализации [10].
Показан незначительный вклад известных факторов персистенции бактерий в обеспечение их устойчивости к бактерицидному действию сыворотки крови [10].
Известно, что повышение чувствительности микроорганизмов к лекарственному препарату на 20% и более свидетельствует о терапевтической эффективности данного препарата [11].
Авторами экспериментально установлено изменение чувствительности микроорганизмов к бактерицидному действию сыворотки крови под действием химиотерапевтических препаратов.
Проводился следующий эксперимент.
В качестве объекта исследования были использованы коллекционные штаммы Staphylococcus aureus ATCC 6538P, S.epidermidis ATCC 14990, Esherichia coli K12. В работе применяли: мирамистин (0,01% раствор мириста-мидопропилдиметилбензиламмония хлорида) и гибитан (0,05% раствор хлоргексидина биглюконата).
Для определения влияния мирамистина и гибитана на устойчивость микроорганизмов к бактерицидному действию сыворотки крови к 0,5 мл взвеси суточных агаровых культур микроорганизмов (109 КОЕ/мл) в 0,9% растворе NaCl добавляли 0,5 мл кратных разведений препаратов (1/60; 1/80), смеси инкубировали при 37°С 60 минут, отделяли бактериальные клетки центрифугированием (3000g, 15 минут). Осажденные и отмытые клетки бактерий ресуспендировали в 0,9% растворе NaCl (ОД=0,2; при λ=591 нм). К 0,1 мл 10 КОЕ/мл взвеси обработанных препаратами и отмытых бактерий добавляли 0,9 мл сыворотки крови, инкубировали при 37°С 60 минут, после чего к 0,2 мл смеси добавляли 3 мл 2% мясо-пептонного бульона, инкубировали при 37°С 24 часа и определяли прирост биомассы бактерий на спектрофотометре СФ-46 (λ=591 нм, объем кюветы 0,2 мл).
Результаты опытов представлены в табл. 1 и 2. Как видно из таблиц 1 и 2, под действием химиотерапевтических препаратов происходит повышение чувствительности микроорганизмов к бактерицидному действию сыворотки крови.
| Таблица 1. Влияние мирамистина на чувствительность микроорганизмов к бактерицидному действию сыворотки крови (n=20) | ||||
| Штаммы микроорганизмов | Рост под действием мирамистина (1/60) | Рост под действием мирамистина (1/80) | ||
| Опыт | контроль | опыт | контроль | |
| S.aureus ATCC 6538P | 0,51±0,03 | 0,68±0,02 | 0,55+0,02 | 0,68±0,02 |
| S.epidermidis ATCC 14990 | 0,43±0,03 | 0,57±0,03 | 0,53±0,03 | 0,57±0,03 |
| E.coliK12 | 0,35±0,02 | 0,46±0,03 | 0,38±0,02 | 0,46±0,03 |
| Таблица 2. Влияние гибитана на чувствительность микроорганизмов к бактерицидному действию сыворотки крови (n=20) | ||||
| Штаммы микроорганизмов | Рост под действием гибитана (1/60) | Рост под действием гибитана (1/80) | ||
| опыт | контроль | опыт | контроль | |
| S.aureus ATCC 6538P | 0,53±0,01 | 0,68±0,02 | 0,56+0,01 | 0,68±0,02 |
| S.epidermidis ATCC 14990 | 0,45±0,01 | 0,57±0,03 | 0,54±0,03 | 0,57±0,03 |
| Е.coli К12 | 0,37±0,02 | 0,46+0,03 | 0,41±0,03 | 0,46±0,03 |
Способ осуществляется следующим образом.
У обследуемых больных лиц осуществляется взятие исследуемого материала из конкретного очага воспаления (носоглотка, уретра, влагалище, кишечник и др.) и его посев на селективные питательные среды. Количественное содержание патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов определяют по известному методу [12]. Штаммы бактерий идентифицируют общепринятыми методами [13]. Из суточных агаровых культур патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов готовят их микробные взвеси в 0,9% растворе NaCl (109 КОЕ/мл). К 0,5 мл взвеси микроорганизмов добавляют 0,5 мл кратных разведении химиотерапевтического средства (в контрольные пробы вместо химиотерапевтического средства добавляют равный объем 0,9% раствора NaCl). Смеси инкубируют при 37°С 60 минут, отделяют бактериальные клетки центрифугированием (3000g, 15 минут). Осажденные и отмытые клетки бактерий ресуспендируют в 0,9% растворе NaCl (ОД=0,2; при λ=591 нм). К 0,1 мл 109 КОЕ/мл взвеси отмытых бактерий добавляют 0,9 мл сыворотки крови больного человека, инкубируют при 37°С 60 минут, после чего к 0,2 мл смеси добавляют 3 мл жидкой питательной среды, инкубируют при 37°С 24 часа. Определяют оптические плотности выросших культур опытных и контрольных проб на спектрофотометре СФ-46 (λ=591 нм, объем кюветы 0,2 мл). Результаты сравнивают, при этом угнетение роста патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов в опытной пробе более чем на 20% по сравнению с контрольной свидетельствует об эффективности химиотерапевтического средства.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. У больного К., 35 лет с диагнозом "хронический простатит" после массажа предстательной железы был ложкой Фолькмана осуществлен забор секрета простаты. Исследуемый материал был методом секторных посевов засеян на 20% сывороточный агар. Через 48 часов инкубации в микро-аэрофильных условиях при 37°С была выделена чистая культура микроорганизмов, которая по совокупности морфологических, тинкториальных и биохимических свойств была идентифицирована как Corynebacterium genitalium (ПМО-105 КОЕ/мл). С целью индивидуального выбора эффективного химиотерапевтического средства для лечения хронического простатита из суточной агаровой культуры С. genitalium приготовили микробную взвесь в 0,9% растворе NaCl (109 КОЕ/мл). К 0,5 мл взвеси микроорганизмов добавили 0,5 мл разведении (1/10) химиотерапевтических средств (рифампицин, сумамед, таривид). В контрольные пробы вместо химиотерапевтических средств добавили равный объем 0,9% раствора NaCl. Смеси инкубировали при 37°С 60 минут, отделили бактериальные клетки центрифугированием (3000g, 15 минут). Осажденные и отмытые клетки бактерий ресуспендировали в 0,9% растворе NaCl (ОД=0,2; при λ=591 нм). К 0,1 мл 109 КОЕ/мл взвеси отмытых бактерий добавили 0,9 мл сыворотки крови больного К., инкубировали при 37°С 60 минут, после чего к 0,2 мл смеси добавили 3 мл мясо-пептонного бульона, инкубировали при 37°С 24 часа. Определили оптические плотности выросших культур опытных и контрольных проб на спектрофотометре СФ-46 (λ=591 нм, объем кюветы 0,2 мл).
Были получены следующие значения оптических плотностей:
Для рифампицина:
OD (опыт) - 0,67,
OD (контроль) - 0,78.
Для сумамеда:
OD (опыт) - 0,57,
OD (контроль) - 0,78.
Для таривида:
OD (опыт) - 0,7,
OD (контроль) - 0,78.
Таким образом, из трех химиотерапевтических препаратов только сумамед повышал чувствительность С.genitalium к сыворотке крови больного К. более чем на 20%. Больному был назначен курс лечения сумамедом в течение 10 дней. После проведенного лечения было проведено контрольное обследование, посевы секрета простаты не выявили роста микроорганизмов.
Пример 2. У больной С., 48 лет с диагнозом "хронический пиелонефрит, обострение" был осуществлен забор мочи. Исследуемый материал был методом секторных посевов засеян на 20% сывороточный агар. Через 48 часов инкубации в микроаэрофильных условиях при 37°С была выделена чистая культура микроорганизмов, которая по совокупности морфологических, тинкториальных и биохимических свойств была идентифицирована как E.coli (ПМО-107 КОЕ/мл). С целью индивидуального выбора эффективного химиотерапевтического средства для лечения хронического пиелонефрита был осуществлен подбор эффективного химиотерапевтического средства (ампициллин, тетрациклин, карбенициллин) вышеописанным способом.
Были получены следующие значения оптических плотностей:
Для ампициллина:
OD (опыт) - 0,55,
OD (контроль) - 0,8.
Для тетрациклина:
OD (опыт) - 0,73,
OD (контроль) - 0,8.
Для карбенициллина:
OD (опыт) - 0,71,
OD (контроль) - 0,8.
Таким образом, из трех химиотерапевтических препаратов только ампициллин повышал чувствительность E.coli к сыворотке крови больной С. более чем на 20%. Больной был назначен курс лечения ампициллина в течение 10 дней. После проведенного лечения было проведено контрольное обследование, посевы мочи не выявили роста микроорганизмов.
Таким образом, заявляемый способ позволяет более эффективно осуществлять индивидуальный выбор химиотерапевтического средства для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии, что способствует повышению эффективности лечения и позволяет сократить его сроки.
Источники информации
1. Заявка на изобретение №2002125475/13 МПК7 C 12 Q 1/04, опубликовано 20.02.2003.
2. Фадеев С.Б. Видовой состав и персистентные характеристики возбудителей хирургической инфекции мягких тканей. Автореф. дис. ...канд. мед наук. - Оренбург. - 1998.
3. Бухарин О.В., Константинова О.Д., Черкасов С.В., Кремлева Е.А. Факторы персистенции микрофлоры при воспалительных заболеваниях внутренних половых органов // Вести. Росс. Ассоциации акушеров-гинекологов. - 1998. - №3. - С.62-65.
4. Бухарин О.В., Кузьмин М.Д., Иванов Ю.Б. роль микробного фактора в патогенезе мужского бесплодия // Журн. микробиол. - 2000. - №2. - С. 106-110.
5. Kumar В., Dawn G., Sharma M., Malla N. Urethral flora in adolescent boys // Genitourin. Medicine. - 1995. - Vol. 71. - P.328-329.
6. Патент РФ 2114913 МПК7 C 12 Q 1/04 10.07.1997.
7. Кривошеин Ю.С. Противомикробные свойства новых ПАВ и обоснование их медицинского применения: Автореф. дис. ...д-ра мед. наук. - Киев, 1985.
8. Niruthisard S., Roddy R.E., Chutivongse S. The effects of frequent nonoxinol-9 use on the vaginal and cervical mucosa // Sex. Transm. Dis. - 1991. - Vol.18. - P.176-179.
9. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. - М., Медицина, 1999. - С.264-289 (прототип).
10. Бухарин О.В., Брудастов Ю.А., Гриценко В.А., Дерябин Д.Г. Роль способности бактерий к инактивации факторов естественной противоинфекционной резистентности в их устойчивости к бактерицидному действию крови (сыворотки крови) // Бюлл. экспер. биол. мед. - 1996.- №2. - С.174-176.
11. Заявка на изобретение №2001124688/14 МПК7 A 61 L 2/08 опубликовано 20.06.2002.
12. Фельдман Ю.М., Маханева Л.Г., Шапиро А.В., Кузьменко В.Д. Количественное определение бактерий в клинических материалах // Лаб. дело. - 1984. - №10. - С.616-619.
13. Bergey's Manual of Determinative Bacterilogy/Eds. J.D. Holt et al. 9-th Ed. - Vol.1-2. - Baltimore, 1986.
Способ индивидуального выбора эффективного химиотерапевтического средства для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии, включающий выделение из очага воспаления больного человека чистых культур патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов, приготовление их микробных взвесей, инкубацию взвесей патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов с раствором химиотерапевтического средства, отличающийся тем, что после инкубации с химиотерапевтическим средством определяют устойчивость выделенных патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов к сыворотке крови больного человека, при этом повышение чувствительности патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов к сыворотке крови больного человека более чем на 20% свидетельствует об эффективности химиотерапевтического средства.
