Способ культивирования зиготы и/или эмбриона и композиция для добавления в среду культивирования зигот и/или эмбрионов

Изобретение относится к области эмбриологии и касается способа культивирования зиготы и/или эмбриона и композиции для добавления в среду культивирования зигот и/или эмбрионов. Изобретение включает способ культивирования зиготы и/или эмбриона, заключающийся в помещении зиготы или эмбриона в культуральную среду и культивировании, при этом в культуральную среду добавляют эффективное количество, по меньшей мере, одного антисмыслового олигонуклеотида длиной 17-30 нк, каждый из которых комплементарен мРНК, по меньшей мере, одного из следующих генов: генов индукторов апоптоза, таких как HRK, FAS, FASL, ВАХ, Caspasa-3, генов ростовых факторов, таких как IGF1, генов рецепторов ростовых факторов, таких как IGF1R, генов, регулирующих темпы дробления эмбрионов, таких как HLA-Е, HLA-F, HLA-G, генов клеточного стресса, таких как HSF1 и HSF2. Композиция для добавления в среду культивирования зигот и/или эмбрионов включает один или более описанный выше антисмысловой олигонуклеотид и приемлемый растворитель. Преимущество изобретения заключается в уменьшении степени фрагментации эмбрионов, повышении выхода эмбрионов и зигот нормальной морфологии, а также в повышении терапевтической эффективности лечения бесплодия. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

 

Изобретения относится к области эмбриологии и медицины, а именно к гинекологии и репродуктологии, и может быть использовано для генной терапии в молекулярной медицине в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Наиболее перспективным методом лечения тяжелых форм бесплодия следует признать вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ).

Эмбриональное развитие - сложный комплексный процесс формирования полноценного организма из оплодотворенной зиготы. В доимплантационный и постимплантационный периоды эмбриогенеза возможны нарушения и/или остановки развития. После ЭКО 70% эмбрионов человека проходят первые три деления дробления за 3 дня, менее половины эмбрионов вступает в процесс кавитации, и лишь треть формирует морфологически нормальные бластоцисты. На протяжении первых 27-28 ч (до середины двухклеточной стадии) эмбрионы во многом зависят от цитоплазматических факторов ооцита, используют белки и мРНК, накопившиеся в цитоплазме в оогенезе. Регуляция макромолекулярных синтезов в этот период идет на посттранскрипционном и посттрансляционном уровнях. В программах лечения бесплодия методами ВРТ пациенты часто получают повышенные дозы гонадотропных гормонов, что зачастую приводит к различным нарушениям в эндокринной системе, к появлению синдрома поликистозных яичников.

По данным разных центров ЭКО частота наступления беременности после применения метода ЭКО находится в пределах 20-40%. Поэтому очень актуален поиск новых путей, которые бы привели к повышению эффективности программы ВРТ. Одно из направлений по решению данной проблемы состоит в культивировании эмбриона в период после оплодотворения и до пяти дней.

Наиболее близким аналогом, принятым за прототип заявленного изобретения, является повышение эффективности оплодотворения по изобретению US 5693534, опубликованное 02.12.1997. Указанное изобретение раскрывает способ культивирования эмбриона в композиции и эмбриотрансплантацию. В указанном выше изобретении применяли композицию с добавлением пептидов, содержащую, по меньшей мере, 0,01 нг/мл активина и, по меньшей мере, 0,01 нг/мл ингибина, т.е. композиция включает только последовательности аминокислот.

С существенными признаками первого объекта заявляемого изобретения совпадают такие признаки прототипа, как помещение зиготы или эмбриона в культуральную среду, с последующим культивированием. С существенными признаками второго объекта заявляемого изобретения совпадают такие признаки прототипа, как наличие эффективного действующего вещества и назначение в виде эффективного вещества для добавления в культуральную среду для культивирования зиготы или эмбриона при процедуре оплодотворения in vitro.

Получению требуемого технического результата препятствует выбор эффективных веществ в качестве добавки к культуральной среде, которые не обеспечивают полного компенсирования интенсивного накопления некоторых факторов роста, а также экспрессии генов программируемой клеточной гибели.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является создание способа культивирования зиготы и/или эмбриона на основе применения новой композиции, вводимой в культуральную среду.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, выражается в уменьшении степени фрагментации эмбрионов, уменьшении аномалий, повышении выхода эмбрионов и зигот нормальной морфологии, а также в повышении терапевтической эффективности лечения бесплодия. Дополнительный технический результат выражается в расширении функционального применения антисмысловых олигонуклеотидов в эмбриологии и медицине.

Для достижения вышеуказанного технического результата по первому объекту изобретения в способе культивирования зиготы и/или эмбриона, включающем помещение зиготы и/или эмбриона в культуральную среду и культивирование, в культуральную среду добавляют эффективное количество, по меньшей мере, одного антисмыслового олигонуклеотида длиной 17-30 нк, каждый из которых комплементарен мРНК, по меньшей мере, одного из следующих генов: генов индукторов апоптоза, таких как HRK, FAS, FASL, ВАХ, Caspasa-3, генов ростовых факторов, таких как IGF1, генов рецепторов ростовых факторов, таких как IGF1R, генов, регулирующих темпы дробления эмбрионов, таких как HLA-E, HLA-F, HLA-G, генов клеточного стресса, таких как HSF1 HHSF2.

В частном случае выполнения изобретения по первому объекту зигота или эмбрион могут быть предварительно подвергнуты криоконсервации.

В частном случае выполнения изобретения по первому объекту зигота или эмбрион после культивирования могут быть подвергнуты криоконсервации.

В частном случае выполнения изобретения по первому объекту культуральная среда содержит, по меньшей мере, одну из следующих солей: хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, гидрокарбонат натрия, пируват натрия, лактат натрия.

В частном случае выполнения изобретения по первому объекту, по меньшей мере, один из антисмысловых олигонуклеотидов, добавляемых в культуральную среду, модифицирован.

В частном случае выполнения изобретения по первому объекту антисмысловой олигонуклеотид выбрают из группы, включающей дуплекс-ДНК, синтетические олигонуклеотиды, антисмысловые РНК.

В частном случае выполнения изобретения по первому объекту оптимальная длина антисмыслового олигонуклеотида составляет 18-21 нк.

В частных случаях выполнения изобретения по первому объекту антисмысловые олигонуклеотиды/олигонуклеотид добавляют в культуральную среду перед помещением зиготы и/или эмбриона в нее или после помещения зиготы или эмбриона в нее.

В частном случае выполнения изобретения по первому объекту различные антисмысловые олигонуклеотиды последовательно добавляют в культуральную среду после помещения зиготы и/или эмбриона в нее.

Культивирование проводят в период после оплодотворения in vitro и до истечения 5 дней. В данный период эмбрион должен быть либо трансплантирован, либо подвергнут криоконсервации.

В частных случаях, если способ осуществляется сразу в период после оплодотворения, то в культуральной среде могут находиться и зиготы, и эмбрионы одновременно.

В заявленном способе для культивирования пригодны зиготы или эмбрионы человека и других млекопитающих.

Для достижения вышеуказанного технического результата в качестве второго объекта предложена композиция для добавления в среду культивирования зигот и/или эмбрионов, включающая один или более антисмысловой олигонуклеотид длиной 17-30 нк, каждый из которых комплементарен мРНК, по меньшей мере, одного из следующих генов: генов индукторов апоптоза, таких как HRK, FAS, FASL, ВАХ, Caspasa-3, генов ростовых факторов, таких как IGF1, генов рецепторов ростовых факторов, таких как IGF1R, генов, регулирующих темпы дробления эмбрионов, таких как HLA-E, HLA-F, HLA-G, генов клеточного стресса, таких как HSF1 и HSF2 и приемлемый растворитель.

Отличительными от наиболее близкого аналога являются такие признаки, как использование в качестве эффективного вещества, по меньшей мере, одного вышеописанного антисмыслового олигонуклеотида с длиной 17-30 оснований.

В частных случаях выполнения изобретения по второму объекту, по меньшей мере, один из антисмысловых олигонуклеотидов, добавляемых в культуральную среду, модифицирован.

В частных случаях выполнения изобретения по второму объекту антисмысловой олигонуклеотид выбран из группы, включающей дуплекс-ДНК, синтетические олигонуклеотиды, антисмысловые РНК.

В частных случаях выполнения изобретения по второму объекту длина антисмыслового олигонуклеотида составляет 18-21 нк.

Достижение указанного технического результата обусловлено следующими причинно-следственными связями.

Использование антисмысловых олигонуклеотидных последовательностей в генной терапии для лечения наследственных и вирусных заболеваний обсуждается с конца семидесятых годов прошлого века. Природные олигонуклеотиды обладают идеальными для терапевтического агента свойствами: способностью комплементарно связываться со специфическими последовательностями и индуцировать активность РНК-азы Н, отсутствием токсичности, водорастворимостью, простотой искусственного синтеза. Но нуклеазная лабильность, деградация в биологических жидкостях, низкая проникающая способность через плазматические мембраны (следствие полианионного характера молекул) и трудности, связанные с целенаправленной доставкой олигонуклеотидов во все клетки организма, накладывают большие ограничения на практическое использование олигонуклеотидных последовательностей в медицине. Все эти ограничения относятся к сформированному человеческому организму, но не к доимплантационным эмбрионам. Проникающая способность олигонуклеотидов в бластомеры значительно выше, чем в дифференцированные клетки различных тканей и органов. Доступ олигонуклеотидов в бластомеры не ограничен биологическими жидкостями и барьерами и лимитирован только концентрацией вещества в культуральной среде. Присутствие олигонуклеотидной последовательности в культуральной среде обеспечивает ее непрерывное поступление в зиготу или эмбрион. Возможность контролируемого доступа олигонуклеотидов в зиготы и эмбрионы позволяет избежать использования токсичных химических модификаций в целях повышения нуклеазной устойчивости соединения. Фолликулогенез и оогенез в цикле гормональной индукции суперовуляции по биохимическим и физиологическим параметрам достоверно отличаются от фолликулогенеза и оогенеза в естественном цикле: равновесие смещается в сторону более интенсивного накопления некоторых факторов роста и, как следствие, экспрессии генов программируемой клеточной гибели. Материнские мРНК этих генов синтезируются и накапливаются в цитоплазме на стадии гормонально-зависимого периода роста ооцита и функционируют на стадии зиготы и/или эмбриона. Сверхэкспрессия этих генов у пациенток клиник экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) в результате гормональной стимуляции, а также у женщин, страдающих синдромом поликистозных яичников, приводит к фрагментации эмбрионов и их остановке в развитии. Преимущество подхода антисмыслового ингибирования на посттранскрипционном уровне заключается в том, что в результате воздействия терапевтического агента не затрагивается целостность генома, так как все биохимические процессы протекают вне ядра: в клетку вводится олигонуклеотидная последовательность, идентичная кодирующей части гена-мишени, которая комплементарно связывается с мРНК данного гена в цитоплазме, образуя двуцепочечный комплекс, что препятствует синтезу белка. При культивировании зиготы или эмбриона человека при ЭКО в среде с добавками антисмысловых олигонуклеотидов к м-РНК генов происходит запускание процесса апоптоза в зиготе или эмбрионе. В результате это воздействие компенсирует те апоптоз-индуцирующие воздействия, которые накапливаются в период гормональной стимуляции пациентки (приводящих к фрагментации бластомеров и гибели эмбрионов из-за процесса апоптоза в его клетках).

На фиг.1 представлены диаграммы, отражающие влияние добавления антисмысловых олигонуклеотидов на повышение качества эмбрионов; на фиг.2 представлены графики по средним значениям и стандартным отклонениям эмбрионов отличного и хорошего качества.

Способ культивирования зиготы и/или эмбриона осуществляется следующим образом. Зиготу/ы и/или эмбрион/ы помещают в стандартно-разработанную культуральную среду для культивирования с добавлением композиции антисмысловых олигонуклеотидов.

Перед помещением зиготы и/или эмбриона в культуральную среду в зиготу и/или эмбрион предварительно могут быть введены генетические конструкции, также зиготы и/или эмбрионы могут быть подвергнуты микрохирургическим процедурам, например полярное тельце зиготы и/или эмбриона и/или бластомер эмбриона могут быть изъяты микрохирургическими методами.

Используемые зиготы и/или эмбрионы могут быть как зиготами и/или эмбрионами человека, так и зиготами и/или эмбрионами других млекопитающих.

Антисмысловые олигонуклеотиды добавляют в среду перед помещением зиготы и/или эмбриона в среду и/или после помещения зиготы и/или эмбриона в среду.

В способе могут быть использованы зиготы и/или эмбрионы, подвергнутые криоконсервации перед культивированием в среде с добавлением антисмысловых олигонуклеотидов и/или после культивирования в среде с добавлением антисмысловых олигонуклеотидов.

Специфическое связывание экзогенной олигонуклеотидной последовательности с мРНК гена-мишени (ген-индуктор апоптоза, ген ростовых факторов, ген рецепторов ростовых факторов, ген транскрипционных факторов, ген, регулирующий темпы дробления эмбрионов, ген клеточного стресса) снижает уровень его экспрессии на посттранскрипционном уровне, не затрагивая целостности генома. В результате снижения уровня экспрессии равновесие смещается в сторону повышения экспрессии в зиготе или эмбрионе генов-антогонистов. Таким образом, происходит компенсирование неблагоприятного воздействия на зиготу или эмбрион в результате гормональной стимуляции овуляции и/или вследствие имеющегося у пациентки заболевания. Для обеспечения специфического связывания с мРНК гена-мишени экзогенная олигонуклеотидная последовательность должна иметь длину не менее 17 нуклеотидов, но и не более 30, поскольку при большей длине последовательности возможно формирование вторичных структур, препятствующих связыванию олигонуклеотида с мРНК гена-мишени.

Заявленный способ подтверждается следующими примерами его осуществления.

Зиготы и эмбрионы были получены следующим способом: ооциты получали методом трансвагинальной пункции яичников и немедленно помещали в планшеты для культивирования (Nunc, Дания), заполненные 500 мкл среды для культивирования (например Blast-Assist Medium (MediCult, Дания), IVF Medium (FertiPro, Бельгия), В2 Menezo (Laboratoire C.C.D., Франция) с добавленными антисмысловыми олигонуклеотидами в концентрации 0,1 нмол/мл. Используемые среды для оплодотворения культивирования содержат, по меньшей мере, следующие компоненты: хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, гидрокарбонат натрия, пируват натрия, лактат натрия. Планшеты для культивирования помещали в СО₂ инкубатор (37°С, 6% СО₂). Через 2-3 ч осуществляли оплодотворение in vitro выделенной фракцией прогрессивно подвижных сперматозоидов. Выделение подвижных сперматозоидов осуществляли методом простого центрифугирования в среде Flashing (FertiPro, Бельгия) или Sperm Preparation (MediCult, Дания) (дважды по 6 мин, 300×G) или центрифугирования в градиенте плотности (Supra Sperm (MediCult, Дания), однократно в течение 20 мин (300×G). Сперматозоиды добавляли к ооцитам в концентрации 200 млн/мл. Далее планшеты снова помещали в СО₂ инкубатор. Через 4 ч после оплодотворения зиготы методом пипетирования отмывали от сперматозоидов и помещали в чистую среду для культивирования с добавленными в нее антисмысловыми олигонуклеотидами. Через 17 ч после оплодотворения оценивали оплодотворение зигот по наличию в цитоплазме двух пронуклеусов, а через сутки по появлению двух бластомеров регистрировали формирование эмбриона. Культивирование зигот и/или эмбрионов осуществляли также в планшетах для культивирования, помещенных в СО₂ инкубатор, смену среды производили каждые сутки. Трансплантацию эмбрионов осуществляли на 3-5 сутки культивирования.

По меньшей мере, один антисмысловой олигонуклеотид, комплементарный мРНК одному из представленных в таблице генов, добавлялся в среду для культивирования в концентрации 0.1 nmol/ml в течение 48 ч после оплодотворения in vitro, дальнейшее культивирование эмбриона до внутриматочной трансплантации осуществляли в среде Blast-Assist II (MediCult) без антисмысловых олигонуклеотидов.

Первичные последовательности мРНК генов были получены из открытой базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Для каждого гена был подобран, по крайней мере, один антисмысловой олигонуклеотид длиной 17-30 нк, комплементарный к одному из следующих участков мРНК: к 5' участку некодирующей области, к участкам инициации транскрипции (в том числе и к альтернативным участкам инициации транскрипции); к областям экзон-интронных границ, к последовательностям 1-3 экзонов. В качестве антисмысловых олигонуклеотидов могут быть выбраны антисмысловые олигодезоксирибонуклеотиды, олигорибонуклеотиды, модифицированные олигонуклеотиды (в том числе тиомодифицированные, алкилмодифицированные, фосфомодифицированные), дуплекс ДНК.

Ген: краткое/полное название	Идентификатор гена (по http://www.ncbi.nlm.nih.gov)	Длина олигонуклеотидов
HRK / harakiri	GeneID:8739	18-24 нт
FAS / tumor necrosis factor receptor superfamily, member 6	GeneID:335	21-26 нт
FASL / Fas ligand (TNF superfamily, member 6)	GeneID:356	20-28 нт
BAX / BCL2-associated X protein	GeneID:581	17-26 нт
Caspasa-3	GeneID: 836	17-26 нт
IGF1 / insulin-like growth factor 1	GeneID:3479	18-21 нт
IGFR1 (FCGR1A) / Fc fragment of IgG, high affinity la,receptor	GeneID:2209	21-23 нт
HSF1 / heat shock transcription factor 1	GeneID:3297	21-28 нт
HSF2 / heat shock transcription factor 1	GeneID:3298	21-28 нт
HLA-E / major histocompatibility complex, class I, E	GeneID: 3133	18-30 нт
HLA-F / major histocompatibility complex, class I, F	GeneID: 3134	18-30 нт
HLA-G / major histocompatibility complex, class I, G	GeneID: 3134	18-30 нт

Вторичные структуры мРНК генов, а также антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК каждого гена были подобраны программой «Mmfold» для 37°С. (Zuker, 2003 Специфичность подобранных антисмысловых олигонуклеотидов была проверена при помощи программы NCBI BLAST 2.2.8 (Basic Local Alignment Search Tool). Синтез олигонуклеотидов был осуществлен на автоматическом синтезаторе амидофосфитным методом, олигонуклеотиды полностью деблокированы, очищены с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и обессолены.

Пример 1.

Культивирование зигот и эмбрионов пациентки с предыдущими неэффективными попытками лечения по стандартной методике ЭКО в среде с добавлением антисмысловых олигонуклеотидов.

Зиготы и эмбрионы в течение 48 ч после оплодотворения in vitro культивировали в среде Blast-Assist I с добавлением смеси антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК гена ВАХ человека и антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК гена IGFR1 человека. Дальнейшее культивирование эмбрионов до внутриматочной трансплантации осуществляли в среде Blast-Assist II (MediCult) без антисмысловых олигонуклеотидов. Перенос эмбрионов в полость матки осуществляли на пятые сутки развития эмбрионов. В результате данного лечения наступила беременность.

Пример 2.

Культивирование зигот и эмбрионов пациентки, страдающей синдромом поликистозных яичников, в среде с добавлением антисмысловых олигонуклеотидов.

Зиготы и эмбрионы в течение 48 ч после оплодотворения in vitro культивировали в среде Blast-Assist I с добавлением смеси антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК гена FAS человека и антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК гена FASL человека. Дальнейшее культивирование эмбрионов до внутриматочной трансплантации осуществляли в среде Blast-Assist II (MediCult) без антисмысловых олигонуклеотидов. Перенос эмбрионов в полость матки осуществляли на пятые сутки развития эмбрионов. В результате данного лечения наступила беременность.

Пример 3.

Культивирование зигот и эмбрионов пациентки старшей возрастной группы в среде с добавлением антисмысловых олигонуклеотидов.

Зиготы и эмбрионы пациентки 39 лет в течение 48 ч после оплодотворения in vitro культивировали в среде Blast-Assist I с добавлением смеси антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК гена ВАХ человека и антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК гена HRK человека. Дальнейшее культивирование эмбрионов до внутриматочной трансплантации осуществляли в среде Blast-Assist II (MediCult) без антисмысловых олигонуклеотидов. Перенос эмбрионов в полость матки осуществляли на пятые сутки развития эмбрионов. В результате данного лечения наступила беременность.

Пример 4.

Культивирование зигот и эмбрионов пациентки, страдающей эндометриозом, в среде с добавлением антисмысловых олигонуклеотидов.

Зиготы и эмбрионы в течение 48 ч после оплодотворения in vitro культивировали в среде Blast-Assist I с добавлением смеси антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК гена FAS человека, антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК гена HRK человека и с антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК гена Caspase3 человека. Дальнейшее культивирование эмбрионов до внутриматочной трансплантации осуществляли в среде Blast-Assist II (MediCult) без антисмысловых олигонуклеотидов. Перенос эмбрионов в полость матки осуществляли на пятые сутки развития эмбрионов. В результате данного лечения наступила беременность.

Пример 5.

Культивирование зигот и эмбрионов в среде с добавлением олигонуклеотидной композиции.

Клинические испытания проводили при культивировании зигот и эмбрионов пациенток, в рамках проведения лечения бесплодия методом ЭКО и ПЭ. В контрольную (контроль) и экспериментальную (опыт) группы были включены пациентки в возрасте от 25 до 38 лет, страдающие бесплодием, с нормоспермией у супруга. Распределение между группами производили случайным образом согласно четности/нечетности номера истории болезни.

Зиготы и эмбрионы пациенток опытной группы культивировали в среде Blast-Assist I с добавлением антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК гена HRK человека и антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК гена FASL человека в течение 48 ч после оплодотворения in vitro, дальнейшее культивирование эмбриона до внутриматочной трансплантации осуществляли в среде Blast-Assist II (MediCult) без антисмысловых олигонуклеотидов. Зиготы и эмбрионы пациенток контрольной группы культивировали с момента получения до трансплантации эмбриона в средах Blast-Assist I, II без добавления антисмысловых олигонуклеотидов. Культивирование зигот и эмбрионов осуществляли в стандартных условиях (Т 37°С, 5% СО₂ в воздухе).

Основным морфологическим критерием оценки качества развивающихся эмбрионов являлась степень фрагментации бластомеров. Эмбрионы с фрагментацией бластомеров были отнесены к четырем группам, в соответствии со степенью выраженности фрагментации: 1) <10%; 2) 10-25%; 3) 25-50%; 4) >50%. Кроме того, были подсчитаны индекс нормального оплодотворения и выход эмбрионов отличного и хорошего качества к третьим суткам развития.

Статистическую обработку результатов производили при помощи статистической программы SPSS, версии 11.5. При статистической обработке данных в первую очередь для каждой группы (опытной; контроль) был применен стандартный метод точечного оценивания и получены выборочное среднее и выборочное стандартное отклонение. Далее с помощью критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка определили, согласуется ли распределение выборочных данных с теоретическим, нормальным распределением. В соответствии с результатами этого анализа в дальнейшем использовали параметрические или непараметрические критерии.

Хотя средние значения доли эмбрионов с аномалиями в опытной и контрольной группах значимо не отличались на вторые сутки развития, среднее значение доли эмбрионов с аномалиями в опытной группе было достоверно ниже, чем в контрольной группе (U=315; P<0,05, U - тестовая величина, определенная с помощью критерия Манна и Уитни, Р - уровень значимости). Кроме того, в опытной группе, в отличие от контрольной, на вторые сутки развития не было эмбрионов с фрагментацией 25-50% (U=387,5; P<0,01). Средние значения доли эмбрионов со степенью фрагментации 25-50% в опыте и контроле на третьи сутки развития статистически не отличались. В опытной и контрольной группах статистический анализ не выявил значимых различий в средних значениях доли эмбрионов с фрагментацией более 50%.

На приведенных диаграммах показаны средние значения долей эмбрионов отличного и хорошего качества (норма), с аномалиями, с различной степенью фрагментации (25-50% фрагментации; больше 50% фрагментации) на вторые и третьи сутки развития в опытной и контрольной группах (фиг.1). Для тех же групп данных представлены и гистограммы, где указаны средние значения долей эмбрионов и стандартное отклонение (фиг.2).

Из вышеприведенных результатов исследований можно сделать выводы, что применение антисмысловых олигонуклеотидов для управления качеством зигот и/или эмбрионов уменьшает фрагментацию эмбрионов, полученных при оплодотворении методом ЭКО, уменьшает количество аномалий, что в свою очередь повышает вероятность нормального развития эмбриона. Использование указанного способа и композиции в программах экстракорпорального оплодотворения существенно увеличивает эффективность лечения.

Пример 6.

Культивирование зигот и эмбрионов пациентки старшей возрастной группы, страдающей трубноперитонеальным фактором бесплодия и эндометриозом и с истощенным запасом яичников в среде с добавлением антисмысловых олигонуклеотидов.

Зиготы и эмбрионы пациентки 40 лет в течение 48 ч после оплодотворения in vitro культивировали в среде Blast-Assist I с добавлением смеси антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК гена FASL, антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК генов HLA-E/HLA-F. Дальнейшее культивирование эмбрионов до внутриматочной трансплантации осуществляли в среде Blast-Assist II (MediCult) без антисмысловых олигонуклеотидов.

Перенос эмбрионов в полость матки осуществляли на пятые сутки развития эмбрионов. В результате данного лечения наступила беременность.

Пример 7.

Культивирование зигот и эмбрионов пациентки, страдающей страдающей трубноперитонеальным фактором бесплодия и эндометриозом, в среде с добавлением антисмысловых олигонуклеотидов.

Зиготы и эмбрионы пациентки 28 лет в течение 48 ч после оплодотворения in vitro культивировали в среде Blast-Assist I с добавлением смеси антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК гена Вах, антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК гена IGF1 и антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК генов HSF1/HSF2. Дальнейшее культивирование эмбрионов до внутриматочной трансплантации осуществляли в среде Blast-Assist II (MediCult) без антисмысловых олигонуклеотидов. Перенос эмбрионов в полость матки осуществляли на пятые сутки развития эмбрионов. В результате данного лечения наступила беременность.

Пример 8.

Культивирование зигот и эмбрионов пациентки, страдающей СПКЯ и эндометриозом и имеющей в анамнезе 3 неудачные предыдущие попытки лечения по стандартной методике ЭКО, в среде с добавлением антисмысловых олигонуклеотидов.

Зиготы и эмбрионы пациентки 35 лет в течение 48 ч после оплодотворения in vitro культивировали в среде Blast-Assist I с добавлением смеси антисмысловых фосфомодифицированных олигонуклеотидов мРНК гена FASL, антисмысловых олигонуклеотидов мРНК гена IGFR1 и антисмысловых олигонуклеотидов мРНК генов HLA-G. Дальнейшее культивирование эмбрионов до внутриматочной трансплантации осуществляли в среде Blast-Assist II (MediCult) без антисмысловых олигонуклеотидов. Перенос эмбрионов в полость матки осуществляли на пятые сутки развития эмбрионов. В результате данного лечения наступила беременность.

Пример 9.

Культивирование эмбрионов пациентки с трубноперитонеальным фактором бесплодия и синдромом гиперстимуляции яичников в среде с добавлением антисмысловых олигонуклеотидов и пересадка эмбрионов после их криоконсервации.

Зиготы и эмбрионы пациентки 26 лет в течение 48 ч после оплодотворения культивировали в среде с добавлением смеси антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК гена HRK человека и антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК гена FASL человека. В этом цикле лечения у пациентки развился синдром гиперстимуляции яичников, перенос эмбрионов был отменен и эмбрионы были криоконсервированы. Через 2,5 месяца эмбрионы были разморожены и перенесены в полость матки пациентки в естественном цикле овуляции. В результате данного лечения наступила беременность.

1. Способ культивирования зиготы и/или эмбриона, включающий помещение зиготы и/или эмбриона в культуральную среду и их культивирование, отличающийся тем, что в культуральную среду добавляют эффективное количество, по меньшей мере, одного антисмыслового олигонуклеотида длиной 17-30 нк, каждый из которых комплементарен мРНК, по меньшей мере, одного из следующих генов: генов индукторов апоптоза, таких, как HRK, FAS, FASL, BAX, Caspasa-3, генов ростовых факторов, таких как, IGF1, генов рецепторов ростовых факторов, таких, как IGF1R, генов, регулирующих темпы дробления эмбрионов, таких, как HLA-E, HLA-F, HLA-G, генов клеточного стресса, таких, как HSF1 и HSF2.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что зигота или эмбрион предварительно подвергнуты криоконсервации.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что зигота или эмбрион после культивирования подвергнуты криоконсервации.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что культуральная среда содержит, по меньшей мере, одну из следующих солей: хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, гидрокарбонат натрия, пируват натрия, лактат натрия.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один из антисмысловых олигонуклеотидов, добавляемых в культуральную среду, модифицирован.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что антисмысловой олигонуклеотид выбран из группы, включающей дуплекс-ДНК, синтетические олигонуклеотиды, антисмысловые РНК.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что длина антисмыслового олигонуклеотида составляет 18-21 нк.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что антисмысловые олигонуклеотиды или антисмысловой олигонуклеотид добавляют в культуральную среду перед помещением зиготы и/или эмбриона в нее.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что антисмысловые олигонуклеотиды или антисмысловой олигонуклеотид добавляют в культуральную среду после помещения зиготы и/или эмбриона в нее.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что различные антисмысловые олигонуклеотиды последовательно добавляют в культуральную среду после помещения зиготы и/или эмбриона в нее.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование проводят в период после оплодотворения in vitro до истечения шести дней.

12. Композиция для добавления в среду культивирования зигот и/или эмбрионов, включающая один или более антисмысловой олигонуклеотид с длиной 17-30 нк, каждый из которых комплементарен мРНК, по меньшей мере, одного из следующих генов: генов индукторов апоптоза, таких как HRK, FAS, FASL, ВАХ, Caspasa-3, генов ростовых факторов, таких, как IGF1, генов рецепторов ростовых факторов, таких, как IGF1R, генов регулирующих темпы дробления эмбрионов, таких, как HLA-E, HLA-F, HLA-G, генов клеточного стресса, таких, как HSF1 и HSF2.

13. Композиция по п.12, отличающаяся тем, что, по меньшей мере, один из антисмысловых олигонуклеотидов модифицирован.

14. Композиция по п.12, отличающаяся тем, что антисмысловой олигонуклеотид выбран из группы, включающей дуплекс-ДНК, синтетические олигонуклеотиды, антисмысловые РНК.

15. Композиция по п.12, отличающаяся тем, что длина антисмыслового олигонуклеотида составляет 18-21 нк.