Способ получения смеси аминокислот и низших пептидов

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения смеси аминокислот и низших пептидов из дрожжевых автолизатов. Способ включает автолиз дрожжей, отделение клеточных оболочек центрифугированием и очистку автолизата на ионитах, при этом в качестве ионита используют гелевый сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола. Предлагаемый способ позволяет получить высокоочищенную смесь аминокислот с низким содержанием пептидов. 2 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения смеси аминокислот и низших пептидов из дрожжевых автолизатов.

В современных технологических процессах дрожжи используют в качестве сырья для получения различных продуктов, биологически активных веществ, аминокислот, нуклеиновых компонентов, витаминов и т.д. К числу известных способов переработки дрожжевой биомассы относится автолиз, осуществляемый собственными гидролитическими ферментами дрожжей.

Известны способы получения смеси аминокислот и низших пептидов путем автолиза дрожжей с последующей очисткой целевого продукта на ионитах (например, патент США №2272982, патент Великобритании №952713, авт. свидетельства СССР №602543, 957835, 1369300, 1731806).

В известных способах для извлечения, концентрирования и очистки аминокислотных смесей и низших пептидов из дрожжевых автолизатов используют сульфокатиониты и аниониты.

В известном способе по авторскому свидетельству №1731806 процесс выделения из дрожжевого автолизата смеси аминокислот и низших пептидов, аденина и тирозина строится исходя из расчетных режимов сорбции и десорбции этих продуктов на ионитах. Способ реализуется только в условиях точно воспроизводимого расчетного процесса с использованием 2-х ионитов: сульфокатионита КУ-2×8 и сильноосновного анионита типа АРА с получением целевого продукта, содержащего в аминокислотной смеси не менее 20-27% низших пептидов. Поскольку в условиях, реализуемых в известном изобретении, аминокислоты и пептиды не сорбируются анионитом АРА, наличие в целевом продукте большого количества пептидов обусловлено сорбционными свойствами сульфокатионита КУ-2×8.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения смесей амонокислот и низших пептидов из дрожжевого автолизата путем фильтрации автолизата через слабоосновный анионит ИА-1р с последующей сорбцией из фильтрата аминокислот и низших пептидов на сульфокатионите КУ-2×8, упариванием элюата и сушкой готового продукта (авт. свидетельство СССР №602543 - прототип заявляемого способа).

Существенными недостатками известного способа являются:

- высокое содержание в целевом продукте биологически активных пептидов, составляющих 24-30% от общего количества аминокислот, что обусловливает ограничение сферы использования продукта в качестве средства пищевого и фармакологического назначения, а также в виде аминокислотного компонента при создании микробиологических питательных сред и парфюмерных композиций;

- низкая объемная нагрузка автолизата V_(авт) на объем сульфокатионита КУ-2×8 V_{(катионита)} при максимальной объемной скорости сорбции V_{(авт/час)} аминокислот и низших пептидов сульфокатионитом после окончания автолиза, отделения клеточных оболочек, составляющих 45-50% от общего объема автолизата, и очистки автолизата на анионите ИА-1р:

V_(авт):V_{(катионита)}=0,8-1,0:1;

V_{(авт/час)}:V_{(катионита)}=0,3:1;

- значительный расход дистиллированной воды на промывку ионита КУ-2×8 после сорбции аминокислот и пептидов:

V_(воды):V_{(катионита)}=7,5-8,0:1,

- сульфокатионит КУ-2×8 одновременно с сорбцией аминокислот и пептидов практически полностью поглощает оставшиеся в автолизате после фильтрации через анионит ИА-1р растворимые балластные вещества, ответственные за пигментацию автолизатов, и при проведении десорбции аминокислот и пептидов с ионита КУ-2×8 1-3% раствором аммиака сорбированные балластные и красящие вещества попадают в элюат, что препятствует получению качественного целевого продукта.

Целью настоящего изобретения является создание эффективного и экономичного способа получения из дрожжевого автолизата высокоочищенной смеси аминокислот с низким содержанием пептидов.

Сущность предложенного способа получения смеси аминокислот и низших пептидов заключается в следующем.

Способ включает автолиз дрожжей, отделение клеточных оболочек центрифугированием и очистку автолизата на ионитах, при этом в качестве ионита используют гелевый сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола.

По предлагаемому способу дрожжевой автолизат после отделения клеточных оболочек подкисляют до рН=2,0-3,0, пропускают через сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола (далее ДВБ), промывают сульфокатионит подкисленной водой с рН=2-3 и сорбированную аминокислотную смесь элюируют 2-3% раствором аммиака, а элюат известным способом фильтруют через анионит, упаривают и сушат с получением целевого продукта.

В основу предлагаемого способа по разделению аминокислот и низших пептидов, содержащихся в дрожжевом автолизате, заложены современные представления о кинетико-диффузионных особенностях сорбции органических ионов на гелевых ионитах различной "плотности" (или проницаемости).

В предлагаемом изобретении использование слабо набухающих (К_(наб)=1,1-1,3) "плотных" сульфокатионитов с 12-16% ДВБ, позволило практически полностью отделить индивидуальные (свободные) аминокислоты от низших пептидов в одноактном процессе сорбции из автолизата. В условиях динамического колоночного процесса на таких сульфокатионитах происходит преимущественная сорбция индивидуальных аминокислот до исчерпания полной обменной емкости ионита. При этом поглощение низших пептидов существенно затруднено из-за кинетико-диффузионных ограничений, обусловленных пониженной проницаемостью "плотной" матрицы сорбента для органических ионов большего размера - в нашем случае пептидов. В то же время, поскольку в многокомпонентном по составу автолизате физико-химические свойства низших пептидов, в частности некоторых три- и дипептидов, мало отличаются от свойств отдельных аминокислот, имеет место незначительная сорбция пептидов на ионитах с 12-16% ДВБ.

В отличие от предлагаемого способа в прототипе, как и в известном способе по авт. свидетельству 1731806, при использовании гелевого сульфокатионита КУ-2×8 с 8% ДВБ, имеющего существенно менее "плотную" матрицу и К_(наб)=3,0, диффузия к сорбционным центрам катионита свободных аминокислот и низших пептидов, состоящих из 2-х, 3-х, 4-х или 5 аминокислот, проходит без видимых затруднений, и при десорбции эти пептиды вместе с индивидуальными аминокислотами попадают в целевой продукт, составляя 24-30% от общего количества аминокислотной смеси.

В этом принципиальное отличие предлагаемого способа от известного.

Существенными преимуществами предлагаемого способа по сравнению с известными являются:

- конечный продукт содержит не более 5-9% низших пептидов против 24-30% в известном способе;

- содержание свободных аминокислот в конечном продукте составляет не менее 90% по сравнению с 65-75% в известном способе;

- расширение сферы использования целевого продукта вследствие низкого содержания биологически активных пептидов в продукте;

- полученная смесь индивидуальных аминокислот и низших пептидов является высокоочищенным препаратом, так как использование сильно "сшитых" сульфокатионитов с 12-16% ДВБ существенно препятствует сорбции балластных веществ вследствие стерических и кинетико-диффузионных ограничений, в то время как сульфокатионит КУ-2х8 одновременно с сорбцией аминокислот практически полностью поглощает из автолизата растворимые балластные вещества, которые при десорбции попадают в готовый продукт;

- упрощение проведения технологического процесса, так как объемная нагрузка автолизата V_(авт) на объем сульфокатионита V_{(катионита)} с 12-16% ДВБ и объемная скорость сорбции V_{(авт/час)} смеси аминокислот и низших пептидов сульфокатионитом непосредственно из автолизата после отделения клеточных оболочек по сравнению с сульфокатионитом КУ-2х8 возрастают соответственно в 2,3-2,6 и в 3 раза;

V_(авт):V_{(катионита)}=2,3-2,6:1;

V_{(авт/час)}:V_{(катионита)}=1,0-1,2:1;

- уменьшение в 12-15 раз расхода дистиллированной воды на промывку сульфокатионита с 12-16% ДВБ по сравнению с промывкой ионита КУ-2×8 после сорбции аминокислот и пептидов в известном способе:

V_(воды):V_{(катионита)}=0,5-0,7:1.

Пример.

В простерилизованный реактор заливают 400 мл дистиллированной воды и загружают 2,0 кг свежих дрожжей влажностью 75%. Смесь нагревают до 48°С и при работающей мешалке выдерживают 30 часов. Полученную суспензию автолизата центрифугируют и после отделения нерастворимых клеточных оболочек супернатант подкисляют 5N раствором серной кислоты до рН=2,9 и подают на колонку (5×25 см) с сульфокатионитом в водородной форме с 12-16% ДВБ для сорбции аминокислот и пептидов. Оптическая плотность (ОП) "проскока" после колонки при 420 нм составляет 79-92% от оптической плотности исходного автолизата. После окончания сорбции ионит промывают 250-350 мл 0,002 N раствором серной кислоты и смесь аминокислот и низших пептидов десорбируют 2,5%-ным раствором аммиака. Далее известным способом элюат фильтруют через ионит, упаривают и сушат.

Аминокислотный состав целевого продукта и рабочие параметры осуществления предлагаемого изобретения представлены в таблицах 1 и 2 в примерах №№1, 2, 3. Для сравнения в примере №4 приведены соответствующие данные при использовании ионита КУ-2×8 для сорбции смеси аминокислот и пептидов из автолизата.

Таблица 1
№		Пример №1	Пример №2	Пример №3	Пример №4
		ионит с 12% ДВЕ	ионит с 13% ДВБ	ионит с 16% ДВБ	ИОНИТ КУ-2×8
	Аминокислота (АК)	целевой продукт	целевой продукт	целевой продукт	целевой продукт
		гидролизов.*	не гидролизов.**	гидролизов.*	не гидролизов.**	гидролизов.*	не гидролизов.**	гидролизов.*	не гидролизов.**
		мг/г	мг/г	мг/г	мг/г
1	Аргинин	39,0	34,6	37,4	33,3	31,4	30,1	12,2	6,4
2	Лизин	98,1	89,2	100,2	91,6	75,8	74,3	52,6	30.2
3	Тирозин	38,6	34,7	50,5	50,0	15,2	14,8	27,5	19,6
4	Фенилаланин	33,2	31,8	25,8	24,6	35,4	34,3	39,2	29,6
5	Гистидин	21,6	20,3	19,4	16,3	20,6	20,2	14,0	5,2
6	Лейцин	81,8	71,4	93,2	83,2	64,2	61,2	69,3	58,9
7	Изолейцин	52,3	50,9	58,5	58,2	50,0	45,5	45,9	33,5
8	Метионин	17,1	16,3	11,2	11,0	17,2	16,9	15,5	13,6
9	Валин	53,3	51,7	52,2	51,9	51.5	51,9	58,8	42,3
10	Пролин	29,2	27,2	30,0	29,2	25,7	25,3	42,8	21,4
11	Треонин	108,6	98,5	133,0	132,6	77,1	76,1	35,5	27,4
12	Серин	33,7	30,9	35,3	34,1	39,7	32,0	33,6	35,9
13	Аланин	88,2	86,4	107,4	102,6	78,4	77,5	73,4	63,5
14	Глицин	39,3	35,7	41.7	41,1	36,4	37,1	36,8	14,1
15	Цистеин	5,6	4,2	5,3	5,3	3,9	2,9	27,9	14,9
16	Глютаминовая кислота	67,2	61,6	65,6	60,5	60,9	52,5	76,0	56,1
17	Аспарагиновая кислота	50,6	37,6	49,4	32,2	45,8	42,8	63,6	61,2
18	Триптофан	5,3	2,9	0.1	0,1	5,4	4,9	0	0
Всего в продукте	862,7	785,9	916,2	857,8	734,2	700,1	724,6	533,8
Содержание в смеси АК и низших пептидов:
- свободные АК	91,1		93,6		95,3		73,7
- низшие пептиды	8,9		6,4		4,7		26,3
* - полное содержание аминокислот в гидролизованном продукте ** - содержание индивидуальных (свободных) аминокислот в продукте без гидролиза.

Таблица 2
Параметры	Пример №1	Пример №2	Пример №3	Пример №4
	Ионит с 12% ДВБ	Ионит с 13% ДВБ	Ионит с 16% ДВБ	Ионит КУ-2×8
Объемная нагрузка, л/л	2,6:1	2,5:1	2.3:1	0,9:1
V(автол):V(катионита)
Объемная скорость сорбции, л/час:л	1,2:1	1,1:1	1,0: 1,0	0,3:1
V(автол):V(катионита)
ОП* "проскока" после сорбции по отношению к ОП автолизата, 420 нм, %	79	84	92	19
Расход воды на промыв. ионита после сорбции, л/л	0,7:1	0,6: 1	0,5:1	7,5:1
V(воды):V(катионита)

Способ получения смеси аминокислот и низших пептидов, включающий автолиз дрожжей, отделение клеточных оболочек центрифугированием и очистку автолизата на ионитах, отличающийся тем, что в качестве ионита используют гелевый сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола.