Питательная среда для выделения бактерий рода salmonella из водных объектов

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к санитарной микробиологии, и может быть использовано учреждениями государственной санитарно-эпидемиологической службы, осуществляющими надзор и контроль за качеством воды поверхностных водоемов, зон рекреации, сточных и питьевых вод. Питательная среда содержит калий фосфорнокислый однозамещенный, едкий натр, экстракт кормовых дрожжей, 0,1%-ый водный раствор бриллиантового зеленого, 0,01%-ный водный раствор кристаллического фиолетового, дистиллированную воду. Изобретение позволяет повысить накопительные свойства питательной среды и упростить ее состав. 6 табл.

 

Изобретение относится к санитарной бактериологии и может быть использовано учреждениями государственной санитарно-эпидемической службы, осуществляющими надзор и контроль за качеством воды поверхностных водоемов, зон рекреации, сточных и питьевых вод.

Известны способы выделения сальмонелл из воды с использованием высокоингибиторных селективных сред накопления: магниевой, селенитовой и тетратионатной.

Недостатком вышеуказанных сред является то, что наряду с угнетением сопутствующей микрофлоры ингибиторами, входящими в их состав, происходит одновременно угнетение и ряда сероваров сальмонелл, что затрудняет их высеваемость из воды и снижает оценку эпидемической безопасности водоисточника.

В качестве прототипа выбрана магниевая среда, которая является наиболее эффективной и в настоящее время широко используется в практических лабораториях при исследовании водной среды (МУК 4.2.1884-04 Санитарно-микробиологический и санитарно-паразитологический анализ воды поверхностных водных объектов. М., 2005). Готовят магниевую среду по нижеследующей прописи, раздельно растворы А, Б, В:

Растворы	Ингредиенты	Концентрация
А	Пептон ферментативный	0,42 г
	Натрий хлористый	0,7 г
	Калий фосфорнокислый однозамещенный	0,15 г
	Дрожжевой экстракт	2,0 мл
	Вода дистиллированная	89,0 мл
Б	Магний хлористый кристаллический	3,6 г
	Вода дистиллированная	9,0
В	Бриллиантовый зеленый 0,1% водный раствор	0,5 мл

Ингредиенты растворяют, кипятят в течение 10 мин, затем растворы А, Б, В сливают в одну емкость.

рН магниевой среды - 5,6-5,8 (Г.П.Калина. Сальмонеллы в окружающей среде. М., 1978, с.117).

Недостатком магниевой среды является ее высокая ингибиторная способность не только по отношению к сопутствующей микрофлоре, но и целому ряду сероваров сальмонелл, а также токсичность действия хлористого магния на сальмонеллы, находящиеся в водной среде в сублетальном состоянии (Гипп Е.К. Экспериментальные и натурные исследования по разработке методов обнаружения сальмонелл в воде водоемов. Автореф. дисс. к.м.н. М., 1975).

Целью предлагаемого изобретения явилась жидкая слабоингибиторная питательная среда для выделения сальмонелл из воды (среда накопления). В качестве питательной основы используют экстракт кормовых дрожжей и минеральные соли. Ингибиторами сопутствующей микрофлоры являются бриллиантовый зеленый и кристаллический фиолетовый.

Предлагаемая питательная среда состоит из следующих компонентов:

Калий фосфорнокислый однозамещенный
(ГОСТ 4198-75; ЧДА)	8,6-8,8 г
Едкий натр (ГОСТ 4328 - 77; ХЧ)	1,3-1,4 г
Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД)	4,5-5,0 г
(ФГУП НПО «Питательные среды» г.Махачкала)

0,1% водного раствора бриллиантового

зеленого (ТУ 6-09-4278-76)	4,5-5,0 мл
0,01% водного раствора кристаллического
фиолетового (ТУ 6-09-4119-75)	9,5-10,0 мл
Вода дистиллированная	1000,0 мл
рН 6,4-6,5

Приготовление среды: в 1000,0 мл дистиллированной воды последовательно растворяют все навески. Нагревают раствор до полного растворения ингредиентов, затем вносят водные растворы бриллиантового зеленого и кристаллического фиолетового. Стерилизуют при 112°С (0,5 кгс/м²) в течение 30 мин.

Данный способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример №1.

Калия фосфорнокислого однозамещенного - 8,1 г, едкого натра- 0,1 г, ЭКД - 4,5 г, 0,1% раствора бриллиантового зеленого - 4,0 мл, 0,01% раствора кристаллического фиолетового - 8,0 мл, воды дистиллированной - 1000,0 мл, рН - 4,8.

Далее способ осуществляется, как описано выше. Данные по накопительным свойствам среды представлены в таблице 1.

Пример №2.

Калия фосфорнокислого однозамещенного - 8,6 г, едкого натра - 1,3 г, ЭКД - 4,5 г, 0,1% раствора бриллиантового зеленого - 4,5 мл, 0,01% раствора кристаллического фиолетового - 9,5 мл, воды дистиллированной - 1000,0 мл, рН - 6,4.

Далее способ осуществляется, как описано выше. Данные по накопительным свойствам среды представлены в таблице 1.

Призер №3.

Калия фосфорнокислого однозамещенного - 8,8 г, едкого натра- 1,4 г, ЭКД - 5,0 г, 0,1% раствора бриллиантового зеленого - 5,0 мл, 0,01% раствора кристаллического фиолетового - 10,0 мл, воды дистиллированной - 1000,0 мл, рН - 6,5.

Далее способ осуществляется, как описано выше. Данные по накопительным свойствам среды представлены в таблице 1.

Пример №4.

Калия фосфорнокислого однозамещенного - 9,5 г, едкого натра- 1,6 г, ЭКД - 5,5 г, 0,1% раствора бриллиантового зеленого - 10,0 мл, 0,01% раствора кристаллического фиолетового - 20,0 мл, воды дистиллированной - 1000,0 мл, рН - 6,9. Далее способ осуществляется, как описано выше.

Данные по накопительным свойствам среды представлены в таблице 1, из которой видно, что рост S.typhimurium №9640 зарегистрирован до разведения 10^-8 на среде с минимальным и оптимальным содержанием компонентов среды. Тогда как на среде с максимальным содержанием ингредиентов рост данного тест-штамма отсутствовал в разведениях от 10^-6 до 10^-8. Рост S.enteritidis отсутствовал в разведении 10^-6 на средах с минимальным и максимальным содержанием ингредиентов, в то время как на среде с оптимальным содержанием компонентов рост отмечен из разведения 10^-7.

Рост К.pneumoniae (предполагаемая сопутствующая микрофлора) отмечен до разведения 10^-8 на среде с минимальной концентрацией компонентов, на среде с максимальным содержанием - рост отсутствовал в разведении 10^-6. На среде с оптимальным соотношением ингредиентов рост К.pneumoniae зарегистрирован лишь до разведения 10^-7.

Таким образом, самым оптимальным количественным соотношением ингредиентов для роста бактерий рода Salmonella и подавления сопутствующей микрофлоры является:

Калий фосфорнокислый однозамещенный	8,6-8,8 г
Едкий натр	1,3-1,4 г
Экстракт кормовых дрожжей	4,5-5,0 г
0,1% водного раствора бриллиантового зеленого	4,5-5,0 мл
0,01% водного раствора кристаллического фиолетового	9,5-10,0 мл
Вода дистиллированная	-1000,0 мл
рН 6,4-6,5

т.к. увеличение количества ингибирующих веществ по сравнению с указанными параметрами приводит к снижению накопления сальмонелл.

Пример №5.

Чувствительность среды определяли по наибольшему разведению, из которого при пересеве на твердые питательные среды наблюдался рост тест-штаммов: S.typhi №1196, S.paratyphi В №8006, S.typhimurium №9640 (получены из коллекции ГИСК им. Л.А.Тарасевича), S. typhimurium, S.anatum, S.enteritidis, выделены из речной воды.

Сравнительная характеристика чувствительности двух сред накопления представлена в табл.2.

Приведенные данные свидетельствуют, что опытная среда является более чувствительной, чем магниевая (прототип), так как рост тест-штаммов в ней наблюдался вплоть до разведения 10^-8 (за исключением S.typhi №1196, рост которой зарегистрирован до 10^-6 и S.enteritidis до 10^-7), в то же время на магниевой среде рост S.typhi №1196 и S.enteritidis в изучаемых разведениях отсутствовал, a S.paratyphi В росла только лишь до разведения 10^-7.

Пример №6.

Эффективность накопления сальмонелл на двух средах исследовали на примере следующих тест-штаммов: S.typhi №1196, S.paratyphi В №8006, S.typhimurium №9640, S.typhimurium, S.anatum, S.enteritidis. Посев микроорганизмов проводился в магниевую и опытную среды в виде микробной взвеси, приготовленной по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85 П 2005 года выпуска, из разведении от 10^-3 до 10^-8 с последующим пересевом на мясопептонный агар.

Сравнение эффективности накопления сальмонелл, выросших при инкубации на опытной и магниевой средах, представлены в табл.3.

Полученные данные свидетельствуют, что эффективность накопления тест-штамма S.paratyphi В №8006 на опытной среде в 10³ раза, S.enteritidis в 10⁴ раза, S.typhi №1196, S.typhimurium №9640, S.anatum, S.typhimurium в 10 раз выше, чем на магниевой.

Пример №7.

Была изучена возможность практического использования среды накопления для выделения сальмонелл из воды поверхностных водоемов с различной степенью загрязнения. Количественное определение сальмонелл проводили путем посева воды в двух параллельных рядах в объемах: 100 мл, 10 мл, 1 мл, 0,1 мл и т.д., в зависимости от степени биологического загрязнения изучаемого водного объекта.

Результаты представлены в табл.4.

Всего было исследовано 35 проб воды р. Дон. С помощью опытной среды сальмонеллы обнаружены в 88,6% (31 проба) со средним индексом 447,0±107,0 микр. кл./л и в 65,7% (23 пробы) - при посеве в магниевую среду, при этом средний индекс составил 17,5±3,6 микр. кл./л. Различия между количественным содержанием сальмонелл существенны и достоверны (t=4,01; р<0,001).

На изучаемом участке водоема с помощью опытной среды выделено 135 культур сальмонелл 36-ти сероваров, из них группы В - 105 культур, группы C - 11, D - 5, E - 14. Из магниевой среды выделено всего лишь 49 культур 18-ти сероваров, из которых сальмонеллы группы В представлены 40 культурами, группы С, D, Е - 5, 0,4 культурами, соответственно. Результаты представлены в табл.5.

Пример №8.

При исследовании хозяйственно-бытовых сточных вод (табл.4) изучены 22 пробы. Сальмонеллы обнаружены в 100% проб со средним индексом 1162,8±263,0 микр. кл./л при использовании опытной среды, в то время на магниевой - в 81,8% (18) проб со средним индексом 66,9±16,7 микр. кл./л. Различия между количественным содержанием сальмонелл существенны и статистически достоверны (t=4,16; р<0,001).

При использовании опытной и магниевой сред выделено 126 и 57 культур 26-ти и 16-ти сероваров сальмонелл, соответственно. При этом с использованием опытной среды было выделено 92 культуры сальмонелл группы В и 46 - с применением магниевой среды, тогда как группы С - 16 и 4, группы D - 3 и 4, группы Е - 15 и 3, соответственно. Результаты представлены в табл.6.

Натурные исследования показали преимущество использования предлагаемой жидкой слабоингибиторной питательной среды накопления при выделении сальмонелл из воды различной степени биологического загрязнения, что позволяет адекватно оценивать степень потенциальной эпидемической опасности водных объектов.

Таблица 1
Зависимость роста сальмонелл от концентрации ингредиентов среды.
Состав среды	S.typhimurium №9640	S.enteritidis	К.pneumoniae
	разведения
-6	-7	-8	-6	-7	-8	-6	-7	-8
Минимальное содержание компонентов	КН2PO4 - 8,1 г NaOH - 0,1 г ЭКД - 4,5 0,1% р-р бриллиантового зеленого - 4,0 мл 0,01% р-р кристаллического фиолетового - 8,0 мл воды очищенной - 1000,0 мл рН - 4,8	Спл. рост	Спл. рост	Спл. рост	-	-	-	Спл. рост	Спл. рост	Спл. рост
Оптимальное содержание компонентов	КН2PO4 - 8,6 г	Спл.	Спл.	Спл.	Спл.	2×102	-	Спл.	3×102	-
	NaOH - 1,3 г	рост	рост	рост	рост			рост
	ЭКД - 4,5 г
	0,1% р-р бриллиантового зеленого - 4,5 мл
	0,01% р-р кристаллического фиолетового - 9,5 мл
	воды очищенной - 1000,0 мл рН - 6,4
КН2PO4 - 8,8 г NaOH - 1,4 г ЭКД - 5,0 г 0,1% р-р бриллиантового зеленого - 5,0 мл 0,01% р-р кристаллического фиолетового - 10,0 мл воды очищенной - 1000,0 мл рН - 6,5	Спл. рост	Спл. рост	Спл. рост	Спл. рост	3×102	-	Спл. рост	3×102	-
Максимальное содержание компонентов	КН2PO4 - 9,5 г	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	NaOH - 1,6 г
	ЭКД - 5,5 г
	0,1% р-р бриллиантового зеленого - 10,0 мл
	0,01% р-р кристаллического фиолетового - 20,0 мл
воды очищенной - 1000,0 мл рН - 6,9
Примечание: спл. рост - сплошной рост; - - отсутствие роста.

Таблица 2
Сравнение чувствительности сред накопления для выделения сальмонелл из водных объектов
Тест-штамм	Опытная среда	Магниевая среда
	Разведения	Разведения
	-6	-7	-8	-6	-7	-8
S.paratyphi В №8006	+	+	+	+	+	-
S.typhi №1196	+	-	-	-	-	-
S.typhimurium №9640	+	+	+	+	+	+
S.typhimurium	+	+	+	+	+	+
S.enteritidis	+	+	-	-	-	-
S.anatum	+	+	+	+	+	+
Таблица 3
Эффективность накопления сальмонелл при культивировании на опытной и магниевой средах
Штамм	Раз-я	Кол-во бак.кл./мл
		Магниевая среда	Опытная среда
S.paratyphi В №8006	-8	0	13,0
-7	1,2×105	6,2×108
S.typhi №1196	-8	0	0
	-7	0	0
	-6	0	8,0
-5	11,0	170,0
S.typhimurium №9640	-8	9,0×l07	3,0×108
	-7	Спл. рост	Спл. рост
-6	Спл. рост	Спл. рост
S.anatum	-8	5,0×107	3,2×108
-7	Спл. рост	Спл. рост
S.typhimurium	-8	3,1×106	1,3×107
-7	Спл. рост	Спл. рост
S.enteritidis	-8	0	0
	-7	0	342.0
	-6	0	Спл. рост
	-5	0	Спл. рост
-4	21,0	Спл. рост

Таблица 4
Сравнительная оценка опытной и магниевой среды при выделении сальмонелл из речной и сточной воды.
Объекты	Кол-во сальмонелл (НВЧ/л)	Т	Р
исследования	Опытная среда	Магниевая среда
	M1±m1	n	М2±m2	n
Вода р. Дон	447,0±107,0	31	17,52±3,64	31	4,01	<0,001
Сточная вода	1162,8±263,0	22	66,9±16,7	22	4,16	<0,001
Таблица 5
Серологические группы сальмонелл, выделенных из речной воды
Серологические группы сальмонелл	Кол-во выделенных культур
	Опытная среда	Магниевая среда
Группа В	105	40
Группа С	11	5
Группа D	5	0
Группа Е	14	4
Всего культур:	135	49
Таблица 6
Серологические группы сальмонелл, выделенных из сточной воды
Серологические группы сальмонелл	Количество выделенных культур
	Опытная среда	Магниевая среда
Группа В	92	46
Группа С	16	4
Группа D	3	4
Группа Е	15	3
Всего культур:	126	57

Питательная среда для выделения бактерий рода Salmonella из водных объектов, содержащая экстракт кормовых дрожжей, калий фосфорнокислый однозамещенный, бриллиантовый зеленый, воду дистиллированную, отличающаяся тем, что содержит едкий натр и кристаллический фиолетовый в следующих концентрациях:

Калий фосфорнокислый однозамещенный	8,6-8,8 г
Едкий натр	1,3-1,4 г
Экстракт кормовых дрожжей	4,5-5,0 г
0,1%-ный водный раствор
бриллиантового зеленого	4,5-5,0 мл
0,01%-ный воднй раствор
кристаллического фиолетового	9,5-10,0 мл
Вода дистиллированная	1000,0 мл
рН 6,4-6,5