Молочно-кислые бактерии в качестве агентов для лечения и предотвращения аллергии

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена трансформированная клетка молочно-кислой бактерии. Клетка экспрессирует поверхностный полипептид, который содержит пептидную последовательность, имитирующую часть конформационного эпитопа молекулы IgE. При этом поверхностным полипептидом является заякоренная на клеточной поверхности протеаза L. bulgaricus. Предложены также пищевая композиция и фармацевтическая композиция, содержащие такую клетку. Предложенная группа изобретений может быть использована для лечения аллергии и/или предотвращения появления аллергических реакций. 6 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к новым штаммам молочно-кислых бактерий, способных снижать склонность индивидуума к развитию аллергических реакций. В частности, настоящее изобретение относится к рекомбинантным штаммам молочно-кислых бактерий, экспрессирующих на своей поверхности полипептиды, которые включают в себя малый и большой пептиды, действующие в качестве миметиков, по меньшей мере, части Fc - области молекул IgE. Изобретение относится также к пищевым или фармацевтическим композициям, содержащим указанные микроорганизмы или их активные фракции.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Иммунная система является сложной и многофакторной защитной системой, которая защищает организм от любого инвазивного биологического или химического агента, такого как вирусы, бактерии, паразиты, грибки или просто более крупные химические вещества. Будучи обязательной для поддержания целостности организма иммунная система может в некоторых случаях быть причиной самого заболевания, например, как в случае аутоиммунных заболеваний, воспаления или аллергий.

Аллергии представляют собой неадекватные реакции иммунной системы на разнообразные вещества (аллергены). Обычно индивидуумы не генерируют значительную иммунную реакцию против веществ, систематически встречающихся в окружающей среде, таких как пыльца или пищевые материалы, и предполагается, что иммунологическая толерантность обусловлена в основном супрессирующим механизмом самой иммунной системы. Однако в ослабленном состоянии иммунная система не проявляет указанную супрессирующую (подавляющую) активность, приводя к специфической иммунной реакции против этого аллергена - аллергической реакции.

Общепринятый механизм аллергической реакции включает последовательность событий, начинающуюся с поглощения аллергена, которому требуется проникнуть через эпителиальный барьер для достижения и активации эффекторных клеток, расположенных в lamina propria или эпителии ниже уровня тесного контакта. Клинические симптомы, связанные с аллергическими реакциями, являются, в основном, результатом немедленной специфической гиперчувствительности и поздней воспалительной реакции. Во время ранней фазы иммунная система хозяина продуцирует иммуноглобулины Е (IgE) против аллергенного вещества, которые в последующем связываются рецепторным белком, например, тучных клеток или базофилов. При связывании или перекрестном сшивании молекул IgE на их поверхности эти клетки выделяют гистамин и цитокины, которые затем опосредуют позднюю фазу рекрутингом воспалительных клеток в носоглотке и верхних дыхательных путях. Вхождение эозинофилов, макрофагов, лимфоцитов, нейтрофилов и тромбоцитов начинает воспалительный цикл, усиливая первоначальную иммунную реакцию, что, в свою очередь, запускает высвобождение еще большего количества воспалительных клеток.

В прошлом количество индивидуумов, страдающих от аллергии, увеличивалось, что часто связывают с увеличением загрязнения атмосферы, вызываемого, например, выхлопными газами. Увеличенное потребление белковых продуктов также, предположительно, вносит вклад в этот прирост, в частности, в отношении растущей встречаемости пищевой аллергии. В дополнение к этому, снижение встречаемости микробных инфекций в развитых странах также было другой возможной причиной увеличения атонических заболеваний.

Таким образом, в данной области существует потребность в лечении аллергии, для чего до сих пор предлагались различные подходы.

Что касается лечения пищевой аллергии, некоторые способы основываются на модификации самого пищевого материала таким образом, что его аллергенный потенциал снижается. Это может быть достигнуто изменением его химической структуры, ограничением или запрещением пищевого продукта или его компонентов соответственно, которые могли бы быть причиной такого беспокойства. Кроме того, рассматриваемая проблема часто заключается в том, что специфическое аллергенное вещество в соответствующем пищевом продукте часто является неизвестным, поэтому в большинстве случаев не ясно, какой компонент должен быть избирательно удален или изменен.

Другой подход лечения пищевой аллергии и пищевой непереносимости направлен на восстановление и поддержание целостности кишечника таким образом, чтобы пищевые аллергены по существу не могли проникать. В этом отношении патент США 5192750 описывает использование N-ацетилглюкозамина, способного вызывать образование слизистой оболочкой необходимого барьера для прохождения пищевых аллергенов и поддержания нормального функционирования.

Наиболее общим подходом для лечения аллергии является иммунотерапия, которая включает в себя периодические инъекции аллергена на протяжении нескольких лет для десенсибилизации пациента к аллергену. Однако соответствующие этому подходы занимают много времени, охватывают годы лечения и часто безрезультатны для достижения цели десенсибилизации пациента.

Согласно более недавним подходам, предлагается вакцинация индивидуумов против молекул IgE, которая ингибирует активацию тучных клеток и базофилов. Для этой цели заявка WO 97/31948 предлагает специфические пептиды для вакцинации, которые сходны в их трехмерной конформации частям молекулы IgE, т.е. иммуноглобулинов, участвующих в высвобождении медиаторов, которые играют роль в регуляции аллергических и воспалительных реакций. Предполагается, что собственная иммунная система индивидуума будет со временем образовывать антитела против указанных молекул IgE, так что указанные иммуноглобулины IgE утилизуются.

Однако указанный способ включает недостаток, присущий обычным процедурам вакцинации, заключающийся в том, что биологически активное вещество должно вводиться инвазивными способами, такими как, например, внутривенная инъекция, способ введения которой характерным образом никогда не нравится пациентам. С другой стороны, когда выбирается пероральный путь, должны быть разработаны подходящие галеновые препараты, позволяющие биологически активному веществу проходить через желудочно-кишечный тракт без разрушения. Другая проблема, встречающаяся в этом способе, состоит в том, что мимотопы, в большинстве случаев, являются пептидами короткой длины, которые сами по себе не будут индуцировать существенный иммунный ответ, так что в композицию наряду с носителями и наполнителями должны быть включены адъюванты.

Таким образом, в данной области имеется необходимость в разработке улучшенного способа для лечения аллергии. В частности, целью настоящего изобретения является разработка способа, который позволяет лечить аллергию действенным, легким и экономичным образом, предпочтительно, без необходимости обращения к врачу и без негативных ассоциаций, связанных с таким лечением.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вышеназванная цель была достигнута обеспечением новых штаммов молочно-кислых бактерий, которые экспрессируют на их поверхности полипептид, содержащий, по меньшей мере, одну пептидную последовательность, имитирующую, по меньшей мере, часть конформационного эпитопа (мимотопа) молекулы IgE.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 показывает окрашивание белка и анализ иммуноблота рекомбинантов Lactobacillus johnsonii. А) Окрашивание белка La1 дикого типа (дорожка 1), La1, несущего pMD112TT (La1TT, дорожка 2) или pMD112ε4 (La1ε4, дорожка 3). В) Экспрессия протеиназы PrtB на La1TT (дорожка 2) и La1ε4 (дорожка 3). Методом иммуноблоттинга с использованием анти-PrtB сыворотки, разведенной 1:2000, анализировали приблизительно 10⁸ бактерий. La1 дикого типа наносили в качестве отрицательного контроля (дорожка 1). Связывающие антитела определяли при помощи конъюгированных с пероксидазой хрена козьих антител против кроличьего IgG (Fc). С) Экспрессия столбнячного мимотопа на поверхности La1TT (дорожка 2). Приблизительно 10⁸ бактерий на слот анализировали при помощи иммуноблота с использованием сыворотки против La1TT, разведенной 1:1000. В качестве отрицательного контроля использовали La1 (дорожка 1) и La1ε4 (дорожка 3). Связывающие антитела определяли при помощи конъюгированных с пероксидазой хрена козьих антител против кроличьего IgG (Fc). D) Экспрессия мимотопа ε4 на поверхности La1ε4 (дорожка 3). Приблизительно 10⁸ бактерий на слот анализировали при помощи иммуноблота с использованием анти-ε4-сыворотки (SDS280) в концентрации 10 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля использовали La1 (дорожка 1) и La1TT (дорожка 2). Связывающие антитела детектировали при помощи конъюгированных с пероксидазой хрена козьих антител против кроличьего IgG (Fc). Стрелка указывает высоту полосы протеиназы, наблюдаемой в А-D.

Фиг.2 показывает результат анализа связывания анти-TT-IgG с расположенными на поверхности эпсилон-мимотопами на молочно-кислых бактериях в ELISA.

Фиг.3 показывает результат анализа связывания анти-ε4-IgG с расположенными на поверхности эпсилон-мимотопами на молочно-кислых бактериях в ELISA.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В исследованиях, приведших к настоящему изобретению, было обнаружено, что посредством обеспечения молочно-кислой бактерии, содержащей рекомбинантный полипептид на поверхности, включающий в себя пептидную последовательность, как определено выше, может быть получена специфическая иммунизация индивидуумов против IgE с тем результатом, что аллергические реакции указанных индивидуумов по существу ко всем аллергенам подавляются.

Не желая быть привязанными к какой-либо теории, авторы изобретения считают, что молочно-кислые бактерии после проглатывания сохраняются в желудочно-кишечном тракте в течение определенного периода времени и способны представлять такой антиген иммунной системе индивидуума, так что может иметь место эффективная иммунная реакция, приводящая к образованию антител анти-IgE в этом индивидууме. Этот факт является более чем неожиданным, поскольку нельзя предсказать, будет ли введение бактерии, содержащей такой поверхностный белок, индивидууму, которое выполняется через желудочно-кишечный тракт, в конце концов представлять соответствующий антиген - мимотоп - иммунной системе индивидуума, так что иммунная система будет способна узнавать этот антиген и индуцировать иммунную реакцию к нему. Более того, очевидно, биологическая среда, в которой этот мимотоп представляется иммунной системе, является такой, что не требуется применение адъювантов для индуцирования иммунной реакции против этого антигена.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, молочно-кислая бактерия, содержащая поверхностный полипептид, включающий в себя мимотоп, принадлежит к группе Lactobacillus или группе Bifidobacterium, или группе Lactococcus и, более предпочтительно, произведена из групп L. acidophilus, L. johnsonii, L. gasseri, L. casei, L. paracasei или L. reuteri, происходящих из человека или животных. Согласно более предпочтительному варианту осуществления, молочно-кислая бактерия является пробиотической молочно-кислой бактерией. Должно быть понятно, что как пробиотические микроорганизмы они будут способны проходить через желудочно-кишечный тракт по существу в жизнеспособном виде и живой форме и также, необязательно, будут способны к стимуляции иммунной системы хозяина. Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления, молочно-кислая бактерия является Lactobacillus johnsonii.

Природа поверхностного полипептида не является критической при условии, что "пептидная последовательность мимотопа" может быть встроена таким образом, что она будет доступной для иммунной системы. Согласно предпочтительному варианту осуществления, поверхностный полипептид/белок, в который встраивают последовательность, имитирующую конформационный эпитоп иммуноглобулина IgE, является заякоренной на клеточной поверхности протеазой Lactobacillus bulgaricus, последовательность которой была опубликована Gilbert et al., (1996) J. Bacteriol, 178, 3059-3065. Этот белок является белком из 2000 аминокислот, состоящим из лидерного пептида из 33 аминокислот (пре-района), ответственного за клеточный экспорт фермента, за которым следует ряд из 154 аминокислот (про-район), который ответственен после отщепления за активацию протеолитической активности фермента, и 700-800 аминокислот активного центра. Последующий район (около 1000 аминокислот) предположительно играет роль в специфическом расщеплении и транспорте в клетке продуцируемых пептидов, а также покрывает клеточную стенку. Протеаза является заякоренной в клеточной стенке посредством ее карбоксильного конца, причем 200 последних аминокислот являются ответственными за специфическое ковалентное связывание с пептидогликановой структурой клеточной стенки.

Полипептид может быть экспрессирован в молочно-кислой бактерии согласно хорошо известным в данной области способам. Например, для эписомной экспрессии могут быть использованы коммерчески доступные векторы pNZ124 (Platteuw et al., (1994) Appl. Env. Microbiol. 60, 587), pGK12 (Waike et al., (1996) FEMS Microbiol. 138. 233) или pG+host9 (Maguin et al., (1996) J. Bacteriol 178, 931). Кроме того, если иметь в виду превосходную стабильность хромосомной интеграции, этот путь мог бы быть предпочтительным для кодирующего соответствующий полипептид рекомбинантного гена. Для интеграции в хромосому может быть использована гомологичная рекомбинация, например, посредством применения рекомбинантного гена из молочно-кислой бактерии, содержащей толерогенный пептид, и замены эндогенного гена. Кроме того, способы для введения рекомбинантных генов в хромосомы хозяина находятся вполне в рамках компетенции опытных работников.

Пептидные последовательности (SEQ ID No.1-17) и антиидиотипические последовательности VH и VL (SEQ ID No.18-19), имитирующие конформационный эпитоп IgE, могут быть найдены скринингом библиотек случайных пептидов и библиотек фагового представления Fab антител человека с использованием антитела к Fc-части IgE. Предпочтительный мимотоп и антиидиотипические Fab-последовательности выбирают из группы, состоящей из:

Для более детальной информации в целом относительно выделения и/или получения пептида и антиидиотипических последовательностей VH и VL, имитирующих часть константной области IgE, делается ссылка на заявку WO 97/3198, описание которой включено здесь в качестве ссылки.

Настоящее изобретение относится также к пищевой и фармацевтической композиции, в частности к вакцинам, содержащим, по меньшей мере, одну такую молочно-кислую бактерию, как описано выше.

Бактериальный штамм может быть включен в композицию в количестве от 10⁵ до 10¹² кое (колониеобразующих единиц) на г материала. Пищевая композиция может быть молоком, йогуртом, творогом, сыром, кисло-молочными продуктами, продуктами ферментации на основе молока, мороженым, продуктами на основе ферментированных злаков, порошками на основе молока, детскими смесями или, в случае животных, кормом для домашних животных, а фармацевтическая композиция может быть в форме таблеток, жидких бактериальных суспензий, сухих пероральных добавок, влажных пероральных добавок, сухого продукта для зондового питания или влажного продукта для зондового питания.

Молочно-кислая бактерия и пищевая/фармацевтическая композиция данного изобретения могут быть использованы для лечения любого заболевания, связанного с аллергическими реакциями, в которых участвует иммунная реакция, в которой участвуют антитела IgE, такого как, например, ринит, атонические дерматиты, эритема и т.п. Подобным образом должно быть понятно, что бактерии/композиции данного изобретения являются удобными для использования в качестве "агента вакцинации", предотвращающего появление аллергии у индивидуума. Это может быть легко выполнено простым кормлением индивидуума, нуждающегося в лечении против аллергии, пищевой композицией или фармацевтической композицией в соответствии с данным изобретением. После принятия внутрь бактерии будут заселять кишечник в течение определенного периода времени, так что в зависимом от количества бактериальных клеток и периода времени, в течение которого вводят композиции данного изобретения, мимотоп представляется индивидууму таким образом, что он может выработать иммунный ответ против этого мимотопа (мимотопов). Должно быть также понято, что кроме молочно-кислой бактерии, содержащейся в композиции по настоящему изобретению, могут также вводиться агенты, о которых известно, что они стимулируют иммунную систему, для улучшения иммунной реакции против этого мимотопа.

Следующие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение, но не ограничивают его.

ПРИМЕР 1

Конструирование рекомбинантного полипептида

Два пептида сливали с заякоренной в клеточной поверхности протеазой L. bulgaricus для представления на поверхности бактерии La1 (CNCM I-1225), а именно пептид ε4 (SEQ ID No.1) и другой пептид (используемый в качестве контроля), произведенный из столбнячного токсина (называемый в дальнейшем ТТ; последовательность см. ниже).

Ген мимотопа (ε4) сливали в рамке считывания с геном протеиназы клеточной поверхности (PrtB) из Lactobacillus bulgaricus (Gilbert et al., (1996) J. Bacteriol, 3059-3065).

Ген протеазы сначала был амплифицирован с его промотором с использованием двух следующих праймеров:

5'-TTTTGTGGATCCTTAACTTCATAGCACG-3'

(слева от промотора гена, несущего сайт BamHI)

5'-ATATTATCTAGAATTGAATAGATTGCC-3'

(справа от rho-независимого терминатора гена, несущего сайт XbaI)

Продукт амплификации расщепляли при помощи BamHI и XbaI и клонировали в вектор pNZ124 молочно-кислой бактерии, который был расщеплен теми же самыми рестриктазами, и, необязательно, вводили электропорацией в свободную от плазмид (отрицательную на бета-галактозидазу и протеазу) Lactococcus lactis.

Область активного центра клонированной протеазы заменяли последовательностью пептидов ТТ и ε4, фланкированных двумя остатками цистеина на обоих концах. Остатки цистеина добавляли потому, что эти два пептида выделяли из библиотек фагового представления в виде замкнутых пептидов, фланкированных двумя остатками цистеина. Поскольку эти пептиды не представляют природные эпитопы, а скорее имитируют их, они были названы мимотопами:

Для получения этого клонированную протеазу расщепляли при помощи NheI, в положении на 50 п.н. справа от последовательности сайта расщепления лидерного пептида, и PvuI, на 800 п.н. далее справа. Последовательность ДНК, кодирующую представляющий интерес пептид (выше), встраивали между двумя сайтами рестрикции в виде двух олигонуклеотидов, которые были сконструированы таким образом, чтобы генерировать два сайта рестрикции на их концах при гибридизации. Конструкция этих олигонуклеотидов учитывала то, что при лигировании с геном протеазы рамка считывания рекомбинантного белка остается открытой.

Продукт амплификации расщепляли рестриктазами. В обоих случаях фрагменты ДНК лигировали с геном протеазы и вводили электропорацией в Lactobacillus johnsonii.

ПРИМЕР 2

Трансформация Lactobacillus johnsonii.

Для целей трансформации штамм La1 Lactobacillus johnsonii (доступный в институте Пастера под номером доступа CNCM I-1225) выращивали в течение ночи в бульоне MRS при 37°С в анаэробных условиях. Аликвоту данной культуры использовали для инокуляции (1:10) другого культурального бульона (MRS), содержащего 0,5 М сахарозы. После дополнительной реинокуляции при 2% в 200 мл MRS + 0,5 М сахарозы культуру выращивали до достижения OD₅₉₅ 0,6. Клетки собирали центрифугированием при 5000 об/мин при 4°С в течение 10 мин, осадок дважды промывали ¹/₂ объема раствора, содержащего 1 М сахарозы и 2,5 мМ CaCl₂, один раз ¹/₄ объема раствора, содержащего 1 М сахарозы, 2,5 мМ CaCl₂ + 0,459 мл 87% глицерина (конечная концентрация 10%). Клетки либо сразу использовали для трансформации, либо замораживали при -80°С.

Для электропорации 40 мкл клеток смешивали с 10-100 нг ДНК (в объеме менее 5 мкл) и переносили в кювету 0,2 см во льду. К кювете 0,2 см для электропорации во льду прикладывали импульсы 200 Ом, 25 мкФ, 2,5 кВ. В кювету добавляли 1 мл MRS + 20 мМ MgCl₂, 2 мМ CaCl₂ и суспензию инкубировали в течение 2-3 часов при 37°С. На чашки с MRS агаром, содержащим подходящий антибиотик, высевали аликвоты 10 мкл и 100 мкл, соответственно. Эти чашки инкубировали анаэробно в течение 24-48 ч при указанной выше температуре. В качестве среды для отбора использовали MRS с хлорамфениколом (10 мкг/мл).

ПРИМЕР 3

Получение антисывороток против протеиназы PrtB

Для получения антисывороток против протеиназы PrtB кроликов иммунизировали путем подкожного введения штамма АТСС11842 Lactobacillus delbruekii подвида bulgaricus, экспрессирующего протеиназу В (PrtB). Бактерии выращивали в течение ночи в бульоне MRS при 42°С в анаэробной системе GasPak. Аликвоту этой культуры использовали для инокуляции другого культурального бульона (MRS), содержащего 0,5 М сахарозы, и эту культуру выращивали в течение 5 часов при 42°С до достижения OD₅₉₅ 0,6. Клетки собирали центрифугированием при 5000 об/мин при 4°С в течение 10 мин, осадок дважды промывали 10 мл ЗФР, а затем ресуспендировали в 2 мл ЗФР. Кроликов иммунизировали три раза по 1,5 мл ресуспендированных в ЗФР клеток с двухнедельными интервалами и через семь дней после последнего кормления из кроликов собирали кровь. Сыворотку очищали шесть раз на 2×10⁹ Lactobacillus johsonii (La1).

ПРИМЕР 4

Получение антисывороток против мимотопов ТТ и ε4

Для получения сыворотки против мимотопов ТТ и ε4 кроликов подкожно иммунизировали либо конструкцией мимотопа полиоксим-ТТ, либо мимотопом ε4, конъюгированным с гемоцианином keyhole limpet (фиссуреллы) (KLH). Кроликов иммунизировали 4 раза с двухнедельными интервалами и через семь дней после последней инъекции у животных брали кровь. Анти-ε4 сыворотку очищали иммуноаффинной хроматографией на колонке с CH-Sepharose 4B с пришитым мимотопом ε4.

ПРИМЕР 5

Определение слитых белков мимотоп-PrtB при помощи антител

Для того чтобы определить экспрессируют ли молочно-кислые бактерии мимотопы таким образом, что они являются доступными для антител и узнаваемыми антителами, бактерии, либо содержащие ген PrtB без какой-либо модификации, либо содержащие рекомбинантный ген (кодирующий или мимотоп ε4, или мимотоп ТТ, соответственно), выращивали в 25 мл среды, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникола. Клетки бактерий собирали центрифугированием при 3000×g в течение 15 мин при 4°С, промывали 5 мл TBS и повторно центрифугировали. Наконец, осадок бактерий ресуспендировали в 450 мкл забуференного Трисом солевого раствора (TBS: 25 мМ Трис/HCl рН 7,5, 0,8% NaCl, 0,02% KCl) и 150 мкл 4х невосстанавливающего буфера для проб (80 мМ Трис/HCl рН 6,8, 2,5% ДСН, 0,15% глицерин, 0,05% бромфеноловый синий). Аликвоты по 20 мкл разделяли электрофорезом на ДСН-полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ) (6% бисакриламид, 0,5 М Трис/HCl рН 8,8) и разделяли в 25 мМ Трисе, 192 мМ глициновом буфере (рН 8,3) при 100 В в течение 60 мин. Гели окрашивали красителем BM-Fast (Boehringer Mannheim, Германия) или переносили электрофоретически на нитроцеллюлозную мембрану (Protran ВА 83, Schleicher & Schuell, Dassel, Германия). После переноса мембраны блокировали в ЗФР/5% БСА в течение 2 часов при комнатной температуре. Иммуноблоты инкубировали либо с кроличьей анти-ТТ сывороткой (1:1000), либо с анти-PrtB сывороткой (1:2000) в течение ночи при комнатной температуре и инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре с разведением 1:1000 конъюгированных с пероксидазой хрена козьих антител против кроличьего IgG. Иммуноблоты проявляли 4-хлор-1-нафтолом в течение 2 минут.

Как показано на фиг.1, можно было наблюдать, что рекомбинант Lactobacillus johnsonii обнаруживает специфические полосы при использовании подходящих антител для детектирования, что свидетельствует о том, что рекомбинантная бактерия продуцирует мимотопы ε4 и ТТ, а также протеиназу PrtB в правильной конформации.

ПРИМЕР 6

Применение ELISA для детектирования экспрессии поверхностного антигена на Lactobacillus johnsonii (La1)

Трансформированные бактерии выращивали в течение ночи в 50 мл среды, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникола. Бактериальные клетки собирали центрифугированием при 3000×g в течение 15 мин при 4°С, промывали 5 мл TBS и повторно центрифугировали. Наконец, бактериальный осадок ресуспендировали в 900 мкл TBS и 100 мкл 0,5 М бикарбонатного буфера рН 9,6. Плашки Costar EIA/RIA с полулунками (Costar, Cambridge, MA) покрывали в течение ночи 50 мкл бактериального раствора на лунку при 37°С (приблизительно 10⁸ бактерий). Эффективность покрытия определяли с использованием TTd в концентрации 10 мкг/мл в качестве покрывающего антигена. Плашки интенсивно промывали в ЗФР/0,1% Твин-20 пока не оставалось бактерий. Лунки блокировали в ЗФР/5% БСА в течение 2 часов при 37°С и инкубировали с 50 мкл либо кроличьей анти-ТТ сыворотки, либо аффинно-очищенных IgG-антител кроличьей анти-ε4 сыворотки в концентрации 10 мкг/мл в течение 4 часов при 37°С. После шестикратного промывания ЗФР/0,1% Твин-20 плашки инкубировали в течение 1,5 часа при 37°С с разведенными 1:1000 конъюгированными с пероксидазой хрена козьими антителами против кроличьего IgG. Плашки промывали шесть раз ЗФР/0,1% Твин-20 и проявляли тетраметилбензимидином (ТМВ; Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland). Реакцию останавливали 1 M H₂SO₄ и измеряли величины оптической плотности при 450 нм с использованием ELISA-ридера (Molecular devices, Basel, Switzerland).

Как показано на фиг.2 и 3, анти-ТТ- и анти-ε4-антитела специфически узнавали живой рекомбинант La1, экспрессирующий мимотопы ТТ и ε4, показывая, что эти два мимотопа экспрессировались и проявлялись на клеточной поверхности бактерий.

1. Трансформированная клетка молочно-кислой бактерии, экспрессирующая поверхностный полипептид, который содержит пептидную последовательность, имитирующую, по меньшей мере, часть конформационного эпитопа молекулы IgE, где указанным поверхностным полипептидом является заякоренная на клеточной поверхности протеаза L. bulgaricus, в качестве средства для лечения или предотвращения аллергии.

2. Трансформированная клетка по п.1, выбранная из группы Lactobacillus, или группы Bifidobacterium, или группы Lactococcus, и более предпочтительно происходящая из групп L. acidofilicus, L. johnsonii, L. gasseri, L. casei, L. paracasei или L. reuteri.

3. Трансформированная клетка по любому из предыдущих пунктов, где пептидная последовательность произведена из последовательности, выбранной из SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:19.

4. Пищевая композиция, содержащая трансформированную клетку по любому из предыдущих пунктов.

5. Пищевая композиция по п.4, выбранная из группы, состоящей из молока, йогурта, творога, сыра, кисло-молочных продуктов, продуктов на основе ферментированного молока, мороженого, продуктов на основе ферментированных злаков, порошков на основе молока, детских смесей или корма для домашних животных.

6. Пищевая композиция по любому из п.4 или 5, где трансформированная клетка содержится в количестве от 10⁷ до 10¹² кое на дозированную форму.

7. Фармацевтическая композиция для лечения или предотвращения аллергии, содержащая трансформированную клетку по любому из пп.1-3.

8. Фармацевтическая композиция по п.7, где трансформированная клетка содержится в количестве от 10¹⁰ до 10¹² кое на дозированную форму.

9. Применение трансформированной клетки по любому из пп.1-3 для приготовления принимаемого внутрь носителя для лечения аллергии и/или предотвращения появления аллергических реакций.

10. Применение пищевой композиции по любому из пп.4-6 для приготовления принимаемого внутрь носителя для лечения аллергии и/или предотвращения появления аллергических реакций.

11. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.7 и 8 для приготовления принимаемого внутрь носителя для лечения аллергии и/или предотвращения появления аллергических реакций.