Способ определения устойчивых к коккомикозу форм вишни и черешни

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к плодоводству. Получают СВЧ-экстракт фенольных соединений из листьев вишни и черешни. Разделяют его методом капиллярного электрофореза. Об устойчивости форм к коккомикозу судят по наличию на электрофореграмме пика производного галловой кислоты со временем выхода 11,0-12,3 мин. Изобретение позволяет значительно сократить продолжительность определения устойчивых форм вишни и черешни, а также существенно увеличить его достоверность 20 ил.

 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к плодоводству, и может быть использовано для определения иммунных и высокоустойчивых к коккомикозу форм черешни, вишни и подвоев для этих культур.

За последние два десятилетия в нашей стране значительно уменьшились площади выращивания вишни и черешни (род Вишня (Cerasus Juss.)). Одной из причин этого является сильное поражение сортов и подвоев коккомикозом (возбудитель - Coccomuces ′hiemalis Higg. sun. Blumeriella jaapii Rehm.v.Arx. - сумчатая стадия, Cylindosporium hiemalle Higg - конидиальная стадия), поэтому создание и внедрение устойчивых к данной инфекции форм является одним из главных направлений в плодоводстве.

Известен способ отбора иммунных сортов на естественном инфекционном фоне, требующий не менее 3-5 лет наблюдений, причем хотя бы 1 год должен быть эпифитотийным (Жданов В.В., Огольцова Т.П. Селекция на устойчивость к болезням и вредителям // Программа и методика селекции плодовых ягодных и орехоплодных культур. - Орел: Изд-во Всероссийского научно-исследовательского института селекции плодовых культур, 1995. - С.58-67).

Известен также способ отбора иммунных сортов на искусственном инфекционном фоне, рекомендующий использовать сборный инокулюм, состоящий из большого количества моноспоровых клонов или биотипов гриба с различных сортов и из разных географических зон. Учет поражения в камерах проводят через 8-11 дней (Изучение устойчивости черешни и вишни к коккомикозу: Методические указания / Сост.: М.С.Чеботарева. - Л.: Изд-во ВНИИР имени Н.И.Вавилова, 1985, 29 с.). Выделение и культивирование на искусственных средах клонов патогена или даже простой сбор большого количества пораженных образцов (популяций) значительно осложняют процедуру искусственного заражения. В тех случаях, когда степень устойчивости в молодом возрасте не адекватна устойчивости растений в период плодоношения, отбор на искусственном фоне используют с большой осторожностью, иногда как предварительный, окончательная оценка дается позже, через 2-3 года в саду (Жданов В.В., Огольцова Т.П. Селекция на устойчивость к болезням и вредителям // Программа и методика селекции плодовых ягодных и орехоплодных культур. - Орел: Изд-во Всероссийского научно-исследовательского института селекции плодовых культур, 1995. - С.58-67).

Наиболее близким к заявленному является способ определения иммунных и высокоустойчивых к коккомикозу форм черешни и вишни в полевых условиях при изучении одного и того же набора сортов в течение не менее 3 лет, причем хотя бы 1 год должен быть эпифитотийным. Сначала проводят листовую диагностику путем отбора у каждого сорта 3-4 одновозрастных деревьев нормального развития. Листья просматривают по 100 шт. на приростах текущего года с разных сторон деревьев на высоте 1,5-2 м в течение вегетации растения, начиная с мая, подсчитывают число листьев, пораженных болезнью, а затем по шестибалльной шкале учета поражения дают оценку устойчивости (Жуков О.С., Харитонова Е.Н. Селекция вишни. - М.: Изд-во ВО «Агропромиздат», 1988 - С.142).

Недостатками вышеперечисленных способов являются: значительная продолжительность и трудоемкость процесса, а также неточность определения степени устойчивости форм из-за того, что развитие болезни и поражаемость изученных образцов во многом зависят от складывающихся погодных условий, субъективных факторов, например от степени подготовки специалиста фитопатолога.

Техническим результатом при использовании предлагаемого способа является значительное сокращение продолжительности процесса определения устойчивых форм, а также существенное увеличение его достоверности за счет учета объективных данных о физиологическом состоянии исследуемого образца.

Технический результат достигается за счет того, что в способе определения устойчивых к коккомикозу форм черешни и вишни, который предусматривает листовую диагностику изучаемого образца, с последующим определением его устойчивости к инфекции, предусмотрено проводить листовую диагностику в период активного роста листьев путем получения из них СВЧ-экстракта фенольных соединений, разделения его методом капиллярного электрофореза, при этом об устойчивости форм к коккомикозу судят по наличию на электрофореграмме пика производного галловой кислоты со временем выхода 11,0-12,3 мин.

Анализ известных методов экстракции листового материала, содержащего подвижные формы физиологически активных веществ, например фенолкарбоновых кислот, показал, что СВЧ-экстракция ускоряет процесс экстрагирования необходимых веществ и сводит на нет операции, выполнимые вручную, тем самым увеличивая в дальнейшем достоверность и воспроизводимость анализа экстракта.

Применение высокоэффективного капиллярного электрофореза для определения содержания фенолкарбоновых кислот в вегетативных частях растений имеет явное преимущество перед другими известными методами. Например, не требует наличия специфических и часто опасных для здоровья реактивов (химические методы) или высоких эксплуатационных расходов (жидкостная хромотография), нетрудоемок и недлителен (время анализа составляет 15 мин).

Вытяжку из листового материала (экстракцию) в предлагаемом способе осуществляли на СВЧ-минерализаторе «Минотавр-1», а его количественный анализ - на приборе капиллярного электрофореза «Капель-103Р», методом, разработанным на базе СКЗНИИСиВ (Ю.Ф.Якуба. Применение СВЧ-экстракции и высокоэффективного капиллярного электрофореза для анализа вегетативных органов растений // Международная конференция «Современное приборное обеспечение и методы анализа почв, кормов, растений и сельскохозяйственного сырья». - М.: Из-во РАСХН, 2004. - С.71-74). Разделение фенольных соединений на приборе капиллярного электрофореза «Капель-103Р» проходило на основе миграции (движении) в потоке буферного раствора соединений под воздействием постоянного электрического поля. За счет изменения светопропускания в капилляре при достижении исследуемым веществом фотометрического детектора на регистрирующем устройстве вырисовывалась графическая информация (электрофореграмма). При этом было обнаружено, что у форм, которые в дальнейшем не поражались коккомикозом, в экстракте листового материала присутствует определенное фенолкарбоновое соединение - производное галловой кислоты, сопровождающееся выходом на электрофореграмме характерного пика на 11,0-12,3 мин.

Кроме этого анализ электрофореграмм, полученных в разные периоды вегетации, показал их значительное различие. Причем достоверность оценки устойчивости повышается при анализе листового материала, отобранного в период активного роста листа, т.е. до момента, когда признаки поражения коккомикозом еще не проявляются. Так все формы вишни и черешни, с заранее известными иммунными к коккомикозу свойствами и имеющими в СВЧ-экстракте, полученном из листьев в период активного роста, производную галловой кислоты с выходом пика в 11,0-12,3 мин на электрофореграмме, характеризовались отсутствием данного пика в другие периоды вегетации, например в июле или в сентябре.

Предлагаемым способом были исследованы более сотни высокоустойчивых иммунных и поражаемых коккомикозом форм рода Вишня (Cerasus Juss.). В примерах конкретного выполнения и в графическом материале отражены наиболее характерные электрофореграммы, характеризующие предлагаемый способ. На фиг.1-20 изображены электрофореграммы фенольных соединений экстрактов, полученных из листового материала, взятого в различные периоды вегетации различных форм рода Вишни (Cerasus Juss.), выращенных в различных зонах Северного Кавказа.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Исследовали экстракты листьев форм иммунных к коккомикозу: C.lannesiana №2, С. serrulata Halle Tolivetto, ВСЛ-2 от 1 года до 10 лет (род Вишня (Cerasus Juss.)), которые взяты как контроль с заранее известными иммунными к коккомикозу свойствами.

Образцы брались с разных участков Краснодарского края в мае, июле, сентябре.

Для получения из листьев экстрактов фенольных соединений использовали СВЧ-минерализатор «Минотавр-1», для анализа фенольных соединений и получения электрофореграмм - систему капиллярного электрофореза «Капель-103Р».

Листья брали на приростах текущего года с разных сторон деревьев на высоте 1,5-2 м в мае, июле (начало августа), в сентябре (начало октября). Процесс экстракции проводили следующим образом: из средней пробы свежих листьев получали высечку в количестве 1,00 г (допускалось хранение исходных листьев в холодильнике, упакованными в полиэтиленовый пакет, не более 3-х суток), затем пробы помещали в контейнер СВЧ-минерализатора «Минотавр-1», добавляли 25 см³ 10%-ного водного раствора спирта-ректификата «Экстра» и устанавливали контейнер в магнетрон минерализатора. Выбирали режим «разложение без давления» в течение 10 мин. В указанных условиях происходила количественная СВЧ-экстракция ионов фенолкарбоновых кислот. По истечении указанного времени контейнер извлекали из СВЧ-минерализатора, охлаждали в естественных условиях в течение 3-5 мин и переносили в мерную колбу для количественного анализа.

Прямое определение фенолкарбоновых кислот в экстракте и запись электрофореграмм всех имеющихся в образце фенольных соединений выполнялись на приборе капиллярного электрофореза «Капель-103Р» с использованием буферного раствора на основе борной кислоты.

Режим анализа на приборе следующий: напряжение - «плюс» 16 кВ, при этом ток должен составить 24±2 мкА. Пробоподготовка: образец СВЧ-экстракта отбирали мерной пипеткой в количестве 1,0 см³ в пробирку Эппендорфа и центрифугировали 4 мин при 6000 об^-1. Пневматическим методом под давлением 30 мбар в течение 10 с дозировали пробу в капилляр. Время анализа - 15 мин.

На всех электрофореграммах, полученных в мае, имеется характерный пик производного галловой кислоты со временем выхода 11,0-12,3 мин для C.lannesiana, C.serrulata Halle Tolivetto, ВСЛ-2. В другие периоды вегетации, например июле, сентябре, в СВЧ-экстрактах у иммунных к коккомикозу форм на электрофореграммах характерный пик в данный период времени отсутствует (фиг.1-5).

Пример 2. Исследовали экстракт листьев поражаемых коккомикозом форм: вишни Любская, вишни Краснодарская сладкая, черешни Франц Иосиф (род Вишня (Cerasus Juss.)). Измерения выполнены аналогично примеру 1.

Образцы брались с разных участков Краснодарского края в мае, июле, сентябре.

На всех электрофореграммах, полученных в мае, характерный пик производной галловой кислоты со временем выхода 11,0-12,3 мин отсутствовал (фиг.6-11), так же как и в июле, и сентябре.

Пример 3. Исследовали экстракт листьев гибридов вишни и черешни (род Вишня (Cerasus Juss.)) селекции СКЗНИИСиВ: АИ1, АИ3, А5, И88, И87, И89 (от 1 года до 10 лет).

Образцы брались с разных участков Краснодарского края в мае, июле, сентябре. Измерения выполняли аналогично примеру 1.

На всех электрофореграммах, полученных в мае, у устойчивых к коккомикозу гибридов имеется характерный пик производного галловой кислоты со временем выхода 11,0-12,3 мин. В другие периоды вегетации, например июле, сентябре, в СВЧ-экстрактах у устойчивых к коккомикозу форм на электрофореграммах характерный пик в данный период времени отсутствует (фиг.12-17).

Параллельно изучалась поражаемость растений полевым методом в течение 2003, 2004, 2005 гг. (2004 год - эпифитотийный).

На всех электрофореграммах сильнопоражаемых коккомикозом форм характерный пик производного галловой кислоты со временем выхода 11,0-12,3 мин отсутствовал (фиг.18-20).

Таким образом, предлагаемый способ позволил достоверно и воспроизводимо в течение мая (сам анализ длится 15 мин) определить устойчивые к коккомикозу формы вишни и черешни вне зависимости от возраста растений, погодных условий, текущего года наблюдений и наличия года с эпифитотийным развитием коккомикоза.

Способ определения устойчивых к коккомикозу форм вишни и черешни, предусматривающий листовую диагностику изучаемого образца с последующим определением устойчивости форм к инфекции, отличающийся тем, что листовую диагностику проводят в период активного роста листьев путем получения из них СВЧ-экстракта фенольных соединений, разделения его методом капиллярного электрофореза, при этом об устойчивости форм к коккомикозу судят по наличию на электрофореграмме пика производного галловой кислоты со временем выхода 11,0-12,3 мин.