Способ определения водорастворимых витаминов
Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано при определении методом ВЭЖХ водорастворимых витаминов в кормах и поливитаминных смесях (блендах) для животных, а также в пищевых продуктах, витаминосодержащих лекарственных препаратах, биологических жидкостях (сыворотка крови) и других биологических объектах. В способе определения водорастворимых витаминов осуществляют экстракцию определяемого витамина из навески анализируемого продукта, фильтрацию, центрифугирование экстракта, а также хроматографирование пробы методом ВЭЖХ с применением предколонки, дегазатора и термостата для колонки, где в качестве элюента используют смесь метанола с ацетатным буферным раствором, имеющим водородный показатель рН, выбранный из заранее заданного диапазона, причем соотношение метанола и ацетатного буферного раствора выбирают в зависимости от типа колонки, при этом выбранная рабочая длина волны для витаминов группы В составляет 275 нм, а для витамина С 295 нм. Изобретение позволяет расширить диапазон содержаний определяемых витаминов, устраняет необходимость анализа витаминов в различных продуктах различными методами. 7 з.п. ф-лы, 1 табл., 12 ил.
Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в медицинских, ветеринарных и других биологических исследованиях при хроматографическом определении водорастворимых витаминов в кормах и поливитаминных смесях (блендах) для животных, а также в пищевых продуктах, витаминосодержащих лекарственных препаратах, биологических жидкостях (сыворотка крови) и других биологических объектах.
Известен из патента RU №2082170 (опубл. 1997.06.20) способ определения витамина B5 в биологическом материале, включающий выделение витамина B5 из исследуемого материала путем кислотного гидролиза при 121°С, фильтрование гидролизата, хроматографирования на сорбенте с последующей спектрофотометрией, причем гидролиз проводят 12 н. H2SO4 в течение 30-60 мин, гидролизат депротеинизируют, в качестве сорбента используют Силасорб SPH С 18, а элюцию витамина B5 проводят смесью уксусная кислота: 25%-ный водный раствор триметиламина: вода при объемном соотношении 3: 2: 95. Измерения проводят с применением УФ-детектора на длине волны 260 нм. Объем пробы для анализа составляет 6 мкл, скорость подачи элюента на колонку 100 мкл/мин. Время, затраченное на анализ, включая гидролиз, составляет 1,5 ч. Недостатком данного способа является ограниченный круг анализируемых объектов (материалов) и определяемых в них витаминов.
Известен из патента РФ №2134883 (опубл. 1999.08.20) способ определения состава лекарственной формы, содержащей витамины, при котором разделение проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), причем хроматографирование проводят на ′′Лихросорбе RP-18′′ в градиентном режиме с использованием метанола в фосфатном буфере при рН 7 в следующих соотношениях: 3%-ный метанол -1000 мкл, из которых 200 мкл идут на регенерацию колонки, затем 10, 30 и 40% по 400 мкл. Все водорастворимые витамины определяют при 260 нм, только кальция пантотенат (витамин В3) при 210 нм. Последовательность выхода пиков витаминов из колонки составляет: для кислоты аскорбиновой (витамин С)=1,33 мин, для кальция пантотената (витамина В3)=2,17 мин, пиридоксина гидрохлорида (витамина B6=7,67 мин, никотинамида (витамина РР)=10,78 мин, тиамина гидрохлорида (витамина B1)=17,67 мин, рибофлавина (витамина В2)=19,33 мин.
Недостатком является узкий диапазон определяемых концентраций и использование при анализе фосфатного буферного раствора, что ведет к увеличению вязкости подвижной фазы. Кроме того, фосфатный буферный раствор является прекрасной средой для быстрого размножения микроорганизмов, образованию их колоний, что отрицательно сказывается на работе аналитической колонки и существенно сокращает срок ее службы.
Наиболее близким по технической сущности является известный из ГОСТа Р 50929 - 96 («Премиксы. Методы определения витаминов группы В», УДК 636.085.3:006.354, Госстандарт России, ИПК Издательство стандартов, Москва, 1996 г.) способ определения методом ВЭЖХ витаминов группы В в премиксах, согласно которому осуществляют экстракцию витаминов B1, В2 и B5 из навески раствором соляной кислоты с последующим центрифугированием в течение 3 мин при 5000-6000 об/мин и определением их на жидкостном хроматографе со спектрофотометрическим детектором. Для хроматографии используют колонку высотой 150 мм и диаметром 4 мм, заполненную сорбентом «Силасорб С-18» или «Сепарон С-18». Состав элюента для B1, B2: 120 см3 ацетонитрил, 880 см3 дистиллированная вода, 2,5 см3 триэтиламин, 0,5 г октилсульфонат натрия, ортофосфорная кислота до рН 7,6. Скорость элюирования для B1, В2 1,2 мл/мин, а рабочая длина волны 254 нм.
Состав элюента для B5: уксусная кислота, дистиллированная вода и триэтиламин в объемном соотношении 3:95:2. Скорость элюирования для B5 80-100 мкл/мин, а рабочая длина волны 260 нм.
Диапазон определения содержания витаминов:
Для B1 50-500 мг/кг
Для B2 100-2000 мг/кг
Для B5 200-4000 мг/кг
Данными способами предусмотрено определение узкого круга водорастворимых витаминов в незначительном диапазоне их содержания.
Кроме того, недостатком существующего ГОСТа является то, что для определения различных водорастворимых витаминов используют различные методы подготовки пробы к хроматографическому определению и различные условия хроматографирования.
В основу изобретения поставлена задача разработки способа эффективного определения содержания комплекса водорастворимых витаминов хроматографическим методом, обеспечивающим высокую чувствительность, точность, степень разделения и селективность определения при одновременном сокращении длительности анализа и подборе универсальных условий для его проведения. Задачей изобретения является также увеличение количества определяемых витаминов в пробе и расширение группы анализируемых объектов.
Поставленная задача решается тем, что в способе определения водорастворимых витаминов, при котором осуществляют экстракцию определяемого витамина из навески анализируемого продукта, фильтрацию и центрифугирование экстракта, а также хроматографирование пробы методом высокоэффективной жидкостной хромотографии с разделением на колонке выбранного типа и спектрофотометрией на выбранной рабочей длине волны, новым является то, что используют метод ион-парной обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хромотографии, при хроматографировании применяют предколонку, дегазатор и термостат для колонки, в качестве навески используют измельченный анализируемый продукт, для определения различных водорастворимых витаминов в качестве элюента используют смесь метанола с ацетатным буферным раствором, имеющим водородный показатель рН, выбранный из заранее заданного диапазона, причем соотношение метанола и ацетатного буферного раствора выбирают в зависимости от типа колонки, при этом выбранная рабочая длина волны для витаминов группы В составляет 275 нм, а для витамина С 295 нм.
Целесообразно, чтобы в состав ацетатного буферного раствора входили деионизованная вода, уксусная кислота, триэтиламин и октилсульфонат натрия предпочтительно в процентном соотношении соответственно 98,13:1,00-1,15:0,13:0,64-1
Желательно рН ацетатного буферного раствора выбирать из диапазона 2,8-3.
Целесообразно анализируемый продукт измельчать и отбирать для навески фракции с размером не более 0,2 мм.
Предпочтительно экстракцию проводить при нагревании до температуры 70-80°С с последующим охлаждением на встряхивающем устройстве.
Желательно центрифугирование осуществлять в течение 4-5 мин при 7000-8000 об/мин, причем возможно осуществлять однократное промывание центрифугированием.
Целесообразно фильтрацию осуществлять с использованием мембранного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм.
Предпочтительно в качестве колонки использовать колонку РЕ reduced activity С-8, длиной 83 мм, диаметром 4,6 мм, заполненную октодецилсиланом зернением 3 мкм, причем объемное соотношение метанола и буферного раствора составляет соответственно 15:85, а скорость элюирования составляет 1,5 мл/мин.
Целесообразно в качестве колонки использовать колонку РЕ Pecosphere 3CR С8, длиной 83 мм, диаметром 4,6 мм, заполненную monofunctional base deactivated 3 мкм 80Å; при этом объемное соотношение метанола и буферного раствора составляет соответственно 16:84, а скорость элюирования составляет 1,5 мл/мин с увеличением после 8 минуты до 2 мл/мин.
Возможно в качестве анализируемых продуктов выбирать продукты из ряда, содержащего премиксы, комбикорма, поливитаминные смеси, лекарственные витаминосодержащие препараты, биологические материалы, пищевые продукты.
Целесообразно для снижения вязкости подвижной фазы и ускорения сорбционных процессов на аналитической колонке поддерживать температуру термостата приблизительно 35°С.
Целесообразно в качестве предколонки использовать Scavenger C18, длиной 33 мм, диаметром 4,6 мм и зернением 10 мкм.
Нижеследующие примеры иллюстрируют осуществление данного изобретения.
Пример 1.
Для приготовления стандартных растворов витаминов при анализе используют следующие витамины:
Тиамина гидрохлорид (витамин B1), Sigma-Aldrich CAS.No. 67-03-8;
Рибофлавин (витамин 82), Sigma-Aldrich CAS. No. 83-88-5;
Никотиновая кислота или никотинамид (витамин B5), Sigma-Aldrich CAS. No. 59-67-6,98-92-0;
Пиридоксина гидрохлорид (витамин B6), Sigma-Aldrich CAS. No. 58-56-0;
Фолиевая кислота (витамин B9), Sigma-Aldrich CAS. No. 75708-92-8.
Цианокобаламин (витамин B12), Sigma-Aldrich CAS. No. 68-19-9.
Аскорбиновая кислота (витамин С), Sigma-Aldrich CAS. No. 50-81-7.
Для приготовления стандартных растворов витаминов при анализе комбикормов и премиксов навески витаминов (B1 - 0,1 г, В2 - 0,25 г, B5 - 1 г, B6 - 0,2 г) с точностью 0,0005 г помещают в мерную колбу на 100 мл, а затем добавляют деионизованную воду удельным сопротивлением 18 МОм/см3 и после растворения доводят той же водой до метки. Каждый раствор готовят в отдельной мерной колбе (соответственно растворы №1, 2, 3,4). Из полученных растворов готовят рабочий стандартный раствор витаминов. Из каждой колбы берут аликвоту объемом 1 мл и переносят в отдельную колбу на 100 мл и доводят деионизованной водой до метки. 1 мл полученного раствора содержит 0,01 мг витамина B1, 0,025 мг витамина В2, 0,1 мг витамина В5 и 0,02 мг витамина B6 (раствор №5).
Витамин В9 готовят в отдельной колбе. Берут навеску 0,05 г с точностью 0,0005 г, переносят в мерную колбу на 100 мл и приливают 0,1 М раствор гидрокарбоната натрия в воде, после растворения доводят тем же раствором до метки (раствор №6). Из полученного раствора аликвоту объемом 1 мл переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки раствором гидрокарбоната натрия. 1 мл полученного рабочего стандартного раствора содержит 0,005 мг/мл фолиевой кислоты (раствор №7).
Для приготовления стандартных растворов витаминов при анализе поливитаминных смесей (блендов) из основного раствора №1 берут аликвоту 5 мл, из раствора №2 - 8 мл, №3 - 5 мл и №4 - 5 мл. Переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки деионизованной водой. 1 мл полученного рабочего стандартного раствора содержит 0,05 мг витамина B1, 0,2 мг витамина В2, 0,5 мг витамина B5 и 0,1 мг витамина B6 (раствор №8).
Для приготовления рабочего раствора фолиевой кислоты из раствора №6 в мерную колбу на 100 мл переносят аликвоту объемом 4 мл и доводят до метки 0,1 М раствором гидрокарбоната натрия в воде (раствор №9).
Основные растворы (№1, 2, 3, 4 и 6) хранят в холодильнике не более 2 недель. Рабочие стандартные растворы (№5,7,8 и 9) готовят в день проведения анализа.
Количество взятого образца для анализа и конечный фактор разбавления зависят от теоретического содержания витаминов и от природы образца. Поэтому навеску образца подбирают исходя из рецептуры его приготовления, поскольку содержание витаминов в комбикормах, премиксах и витаминных концентратах находится в очень широком концентрационном диапазоне.
Точную массу рассчитывают таким образом, чтобы значение концентраций витаминов в конечном экстракте было как можно ближе к значению их концентраций в стандартных растворах. Приблизительная масса навески для комбикорма и растительного премикса составляет 1 г, для поливитаминных блендов - 0,1 г.
Анализируемый продукт измельчают в роторной мельнице Pulverisette 14 до пылеобразного состояния и взвешивают навеску с погрешностью не более 0,0005 г. Для взвешивания берут фракцию, прошедшую через сито 0,2 мм.
Экстракцию витаминов B1 B2 В5 B6 ведут 15 мл 0,01 моль/дм3 HCl.
Экстракциию витамина В9 ведут 15 мл 0,1 М раствором гидрокарбоната натрия в воде.
Экстрагирование проводят в конической колбе на 100 мл, разогрев ее до 70-80°С и последующим охлаждением в течение15 минут на перемешивающем устройстве модель 6410 М «Экрос» (возможно применение магнитной мешалки).
Центрифугирование осуществляют на аппарате центрифуга ОПН-8 в течение 4-5 мин при 7000-8000 об/мин, после чего центрифугат сливают в мерную колбу на 25 мл. Промывание центрифугированием проводят 1 раз 10 мл экстрагента. Объединенный центрифугат доводят до метки деионизованной водой и фильтруют для очищения от механических примесей.
При выполнении качественного анализа продукта возможно осуществление экстракции витамина В9 в условиях экстракции витаминов B1 В2 B5 B6 и совместного их центрифугирования.
Хроматографический анализ проводят методом ион-парной обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хромотографии в следующих условиях.
Ацетатный буферный раствор подвижной фазы для элюирования готовят на основе деионизованной воды удельным сопротивлением 18 МОм/см3, полученной на аппарате для получения деионизованной воды Simplisity (Millipore). В мерную колбу на 1000 мл вносят навеску октилсульфоната натрия массой 0,432 г, добавляют 950 мл деионизованной воды, перемешивают, добавляют 10 мл уксусной кислоты и 1,32 мл триэтиламина и затем измеряют рН раствора. Если значение рН выходит за рамки диапазона 2,8-3,0, то доведение осуществляют уксусной кислотой и доливают деионизованную воду до V=1000 мл. Полученный раствор (раствор №10) фильтруют с помощью аппарата для фильтрования Supelco через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
Хроматограф жидкостный Series 200 (Perkin Elmer) с фотометрическим детектором (диапазон длин волн от 190 до 700 нм, точность установки длины волны ±1 нм, относительное СКО выходного сигнала - не более 1,5%) и автодозатором (точность не хуже 0,5% СКО по площади пика). Колонку для хроматографии (РЕ reduced activity C-8, длина 83 мм, диаметр 4,6 мм), заполненную октодецилсиланом зернением 3 мкм, размещают в термостате.
Для защиты аналитической колонки от макрочастиц, содержащихся в пробах сложного многокомпонентного состава, используют предколонку Scavenger C18, длиной 33 мм, диаметром 4,6 мм, зернением 10 мкм
Подвижная фаза (элюент) - метанол марки HPLC grade (для ВЭЖХ) с раствором №10 в объемном соотношении 15:85.
Для обеспечения стабильности нулевой линии детектора и продления срока службы аналитической колонки осуществляют высокую степень дегазации элюента вакуумным дегазатором Series 200 (Perkin Elmer).
Перед хроматографированием пропускают через колонку несколько объемов подвижной фазы для установления равновесия в хроматографической колонке (устойчивая базовая линия). Для насыщения колонки выполняют несколько измерений стандартного рабочего раствора витаминов до получения воспроизводимых площадей пиков и времен удерживания анализируемых витаминов. Затем хроматографируют раствор анализируемого продукта в тех же условиях, при этом:
рабочая длина волны на УФ детекторе 275 нм для B1 В2 В5 B6 B9;
скорость элюирования - 1,5 мл/мин;
температура термостата колонки - 35°С;
объем инжектируемого экстракта - 10 мкл.
Время проведения хроматографического определения составляет 10 мин.
Хроматограмма экстракта премикса представлена на фиг.1.
Хроматограммы премикса П-5-1-2 (для птиц) представлены на фиг.2 и фиг.3.
Возможно приготовление стандартных растворов и проб с использованием дистиллированный воды, но для большего сродства инжектируемой пробы и элюента целесообразно использовать для всех растворов деионизованную воду.
С целью оптимизации условий анализа проводились специальные исследования влияния температуры проведения экстракции, что составило (70-80°С); времени экстракции, что составило 10-20 минут; времени центрифугирования, что составило 4-5 минут; термостатирования, что составило 34-36°С, а также количества промываний остатка после центрифугирования, скорости центрифугирования, рН эюента, процентного соотношения его компонентов, количества ион-парного реагента, влияющих на полноту извлечения.
Процентное соотношение компонентов:
деионизованная вода: уксусная кислота: триэтиламин: октилсульфонат натрия составляет соответственно 98,13:1,00-1,15: 0,13:0,64-1.
Промывание остатка после центрифугирования достаточно осуществлять один раз.
При обработке результатов построение калибровочного графика по рабочим стандартным растворам осуществляли с использованием программного обеспечения «TotalChrom Workstation», а проверку выполняли методом добавок.
Для хроматографических измерений использовали метод сравнения площадей пиков для анализируемой пробы и стандартного раствора. Содержание водорастворимых витаминов Xi, мг/г, рассчитывают по формуле:
CS - концентрация витамина в рабочем стандартном растворе, мг/мл,
VP - объем экстракта премикса, мл,
Sx, SS - площади пиков витаминов на хроматограмме пробы и стандарта, mAU·c,
m - масса навески продукта, г.
За результат измерения содержания витамина в пробе принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений (X1 и Х2).
Пример 2.
Условия подготовки пробы соответствовали условиям подготовки пробы, описанной в примере 1.
Для хромотографии использовалась колонка РЕ Pecosphere 3CR С8, длиной 83 мм, диаметром 4,6 мм, monofunctional base deactivated 3 мкм 80Å;
Объем инжектируемого экстракта - 10 мкл;
Ацетатный буферный раствор:
0,432 г октилсульфоната натрия,
1000 мл деионизованной воды,
10 мл уксусной кислоты,
1,33 мл триэтиламина,
рН раствора 3,0.
Подвижная фаза (элюент): метанол с ацетатным буферным раствором в объемном соотношении 16:84.
Рабочая длина волны на УФ детекторе 275 нм для B1 B2 B5 B6 B9.
Скорость элюирования - 1,5 мл/мин, после 8 минуты скачок до 2 мл/мин;
Температура термостата колонки 35°С;
Время выхода хроматограммы составило 10 мин.
Хроматограмма экстракта премикса представлена на фиг.4
Пример 3.
В условиях подготовки пробы (экстракция соляной кислотой), хроматографирования и детектирования сигнала, аналогичных примеру 1 (или 2), анализировали содержание в исследуемом образце витамина В12. Рабочая длина волны на УФ детекторе 275 нм.
Хроматограмма витаминной смеси «Содровит бленд З» представлена на фиг.5.
Пример 4.
В условиях хроматографического разделения, аналогичных примеру 1, выполняли на рабочей длине волны 295 нм качественный анализ содержания витамина С в лекарственных формах, биологических пробах и пищевых продуктах.
На фиг.6 представлена хроматограмма аскорутина.
На фиг.7 представлена хроматограмма таблетки аскорбиновой кислоты с глюкозой.
На фиг.8 представлена хроматограмма профильтрованной сыворотки крови свиньи.
На фиг.9 представлена хроматограмма детского питания «Пюре яблочно-персиковое».
На фиг.10 представлена хроматограмма фруктового сока J7 orang.
Полученные результаты сопоставимы с соответствующими данными, указанными в сертификатах качества или аннотациях.
Пример 5.
В условиях хроматографического разделения, аналогичных примеру 1, проводили анализ витаминного препарата Декамевит. Хроматограмма для витаминов группы В (рабочая длина волны 275 нм) представлена на фиг 11. Хроматограмма для витамина С (рабочая длина волны 295 нм) представлена на фиг.12.
Представленные в примерах хроматограммы иллюстрируют полное разделение компонентов, что касается анализируемых проб лекарственных витаминосодержащих препаратов, и достаточное, что касается проб пищевых продуктов и сложных по составу белковых биологических проб.
Диапазон определяемых витаминов согласно предлагаемому способу представлен в таблице.
| B1 | (3,0-100000) мг/кг |
| В2 | (1,5-30000) мг/кг |
| В5 | (1,5-200000) мг/кг |
| B6 | (1,25-100000) мг/кг |
| В9 | (1,5-20000) мг/кг |
| B12 | (2,0-10000) мг/кг |
| C | (1,5-200000) мг/кг |
Предлагаемый способ по сравнению с прототипом позволяет получить больше информации о составе интересующей сложной смеси, расширить диапазон содержаний определяемых витаминов, устраняет необходимость анализа витаминов различными методами, что требует дополнительных временных, трудовых и материальных затрат.
Подбор универсальных условий позволяет проводить хроматографическое разделение в узких временных рамках и сокращает продолжительность всего анализа в целом.
Предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью, селективностью определения, точностью и воспроизводимостью, позволяет достигнуть высокой степени извлечения, учитывая сложность состава анализируемых объектов.
Использование способа позволяет увеличить срок службы аналитических колонок, сокращая тем самым расходы на амортизацию дорогостоящего хроматографического оборудования.
1. Способ определения водорастворимых витаминов, при котором осуществляют экстракцию определяемого витамина из навески анализируемого продукта, фильтрацию и центрифугирование экстракта, а также хромотографирование пробы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с разделением на колонке выбранного типа и спектрофотометрией на выбранной рабочей длине волны, отличающийся тем, что при хроматографировании применяют предколонку, дегазатор и термостат для колонки, в качестве навески используют измельченный анализируемый продукт, для определения различных водорастворимых витаминов в качестве элюента используют смесь метанола с ацетатным буферным раствором, имеющим водородный показатель рН выбранный из заранее заданного диапазона, причем соотношение метанола к ацетатному буферному раствору выбирают в зависимости от типа колонки, при этом выбранная рабочая длина волны для витаминов группы В составляет 275 нм, а для витамина С 295 нм.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в состав ацетатного буферного раствора входят деионизованная вода, октилсульфонат натрия, уксусная кислота и триэтиламин.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что процентное соотношение деионизованной воды, уксусной кислоты, триэтиламина и октилсульфоната натрия составляет соответственно 98,13:1,00-1,15:0,13:0,64-1.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что рН буферного раствора выбирают из диапазона 2,8-3.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве навески используют измельченный анализируемый продукт с размером фракций не более 0,2 мм.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что фильтрацию осуществляют с использованием мембранного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что центрифугирование осуществляют в течение 4-5 мин при 7000-8000 об/мин.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что промывание центрифугированием осуществляют один раз.
