Питательная среда для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномицетов

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, L-аспарагин, глицерин, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, агар, гумивит и дистиллированную воду. Изобретение позволяет повысить ростовые свойства питательной среды. 7 табл.

 

Изобретение относится к микробиологическим исследованиям, касается питательной среды для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномицетов и может быть использовано для изучения культурально-биохимических, хемотаксономических и генотипических свойств культур.

Для роста микобактерий из-за их неспособности синтезировать различные химические вещества самостоятельно необходимы полноценные, богатые белком, углеводом, минеральными веществами и стимуляторами роста питательные среды. В медицинской и ветеринарной практике используют преимущественно плотные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-2, содержащие солевую основу (среда Левенштейна-Йенсена - однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, лимоннокислый магний, аспарагин, глицерин химически чистый; среда Финн-2 - магний сернокислый, натрий лимоннокислый, квасцы железоаммиачные, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий глютаминовокислый однозамещенный глицерин, яйца и малахитовую зелень (в качестве деконтаминанта) [1]. Для научных целей предпочтительными являются питательные среды, содержащие солевую основу и агар с добавлением в них в качестве стимуляторов роста сывороток крови человека или животных (кроличья или бычья - среда Kirchner, лошадиная сыворотка - модифицированная среда Sauton), крови (венозная кровь - среда Pryce, цитратная кровь - среда Школьниковой), олеиновой кислоты (среда Dubos и Middlebrook) или комплексов, включающих витамины, жирные кислоты и др. (среда Bacto-Middlbrook) [2]. Многообразие питательных сред (плотных, жидких, полужидких), разнообразных по сложности составов и способам изготовления, свидетельствует об отсутствии универсальной питательной среды, что обусловливает актуальность поиска новых питательных средств, обеспечивающих хороший рост культур, включая культуры первой генерации, и визуализацию начального роста колоний.

В качестве аналогов нами рассматриваются жидкая питательная среда Sauton, содержащая L-аспарагин, двузамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, глицерин и дистиллированную воду [3], и модифицированная жидкая питательная среда Sauton, содержащая дополнительно питательный агар (до 0,35%) и лошадиную сыворотку (25%) [4]. Известную модификацию питательной среды Sauton применяют для ускоренного определения лекарственной устойчивости клинических штаммов микобактерий туберкулеза к изониациду, стрептомицину, рифампицину, однако наличие в ней компонентов крови и жидкая консистенция не позволяют применять ее для научных целей, в частности для изучения ферментативной активности.

Техническим результатом является повышение ростовых свойств питательной среды.

Технический результат достигается тем, что питательная среда, содержащая L-аспарагин, двузамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, глицерин и дистиллированную воду, содержит 3,0% агара и дополнительно 9,0-9,5% гумивита.

Гумивит - щелочной гидролизат низинных сортов торфа (выпускается ООО Агропром), представляет собой высокодисперсный золь натриевых солей комплекса гумусных кислот - гуминовых, гуматомелановых и фульвокислот [5]. Раствор солей гуминовых кислот состоит из длинных фрагментарных цепочек с различными функциональными группами, важнейшими из которых являются карбоксильные (СООН) и фенольные (ОН), способные образовывать хелатные комплексы с микроэлементами, что обеспечивает их высокую обменную емкость и транспорт в клетку микроорганизмов [6, 7]. Гумивит - жидкость темно-коричневого до черного цвета со специфическим сладковатым запахом, благодаря чему готовая среда имеет интенсивно коричневый цвет, на фоне которого хорошо видны даже мелкие колонии в начальной фазе роста.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 2,0 л наливали 300,0 мл дистиллированной воды, прогревали на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяли последовательно 2,0 г лимонной кислоты, 4,0 г L-аспарагина, 0,5 г сернокислого магния, 0,5 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, 40,0 г глицерина, 90,0 мл гумивита и 30,0 г агара. Каждый компонент добавляли после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов общий объем доводили до 1000,0 мл стерильной дистиллированной водой. Устанавливали рН 7,1-7,2 добавлением 1н. NaOH или 1н. HCl. Раствор автоклавировали в течение 30 минут при 1 атм. Горячую среду разливали по пробиркам по 3 мл и скашивали.

Пример 2. В таблице 1 приведены варианты питательной среды в соответствии с изобретением.

Таблица 1
Состав разных вариантов питательных сред
Состав	Вариант новой среды
1-й	2-й	3-й	4-й
L-аспарагин, г	4,0	4,0	4,0	4,0
Двузамещенный фосфорнокислый калий, г	0,5	0,5	0,5	0,5
Сернокислый магний, г	0,5	0,5	0,5	0,5
Лимонная кислота, г	2,0	2,0	2,0	2,0
Лимоннокислое аммиачное железо, г	0,05	0,05	0,05	0,05
Глицерин, г	40,0	40,0	40,0	40,0
Агар, г	30,0	30,0	30,0	30,0
Гумивит, мл	85,0	90,0	95,0	100,0
Дистиллированная вода, мл	до 1000,0	до 1000,0	до 1000,0	до 1000,0

Пример 3. Для определения эффективности среды для культивирования микобактерий использовали референс-штаммы микобактерий M.bovis (шт.Valle и BCG), M.tuberculosis (шт.Academia), Н₃₇Ra, М.avium (шт.ГИСК, 44, 659), M.smegmatis (шт.53), М.phlei. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур производили нанесением 10 мкл суспензии микобактерий, содержавшей 30-60 КОЕ при посеве на среду Левенштейна-Иенсена, на все сравниваемые варианты среды в соответствии с изобретением. Посев каждого штамма проводили на 3-5 пробирок. При оценке роста культур учитывали сроки появления первичных колоний, интенсивность роста (±слабый, +средний, ++обильный) и изучали культурально-морфологические свойства. Контроль - традиционно применяемая среда Левенштейна-Йенсена. Полученные результаты (таблица 2 и 3) показали, что оптимальными являются варианты 2 и 3 питательной среды в соответствии с изобретением, обеспечивавшие более ранние сроки появления и более высокую интенсивность роста относительно варианта 1 питательной среды в соответствии с изобретением и сравнимые с таковыми на среде Левенштейна-Йенсена. Повышение количества гумивита (вариант 4 питательной среды в соответствии с изобретением) не сокращало срок появления роста и не влияло на интенсивность роста. Культурально-морфологические свойства и цвет выросших колоний штаммов не отличались от таковых на исходной среде.

Таблица 2
Сроки появления первичного роста микобактерий на средах разных вариантов
Штаммы	Сроки появления роста, дней
	Среда в соответствии с изобретением	Среда Левенштейна-Йенсена
Вариант 1	Вариант 2	Вариант 3	Вариант 4
M.bovis (шт.Vallee)	15	13	12	12	14
М.bovis (BCG)	15	15	15	15	15
М.tuberculosis (шт.Academia)	13	11	10	10	10
М.tuberculosis (шт.H37Ra)	13	11	10	10	10
М.avium (шт.ГИСК)	9	7	7	7	7
М.avium шт.44	12	10	9	9	7
М.avium шт.659	11	10	10	10	8
М.phlei	4	3	2	2	2
М.smegmatis, 53	4	3	2	2	2

Таблица 3
Массивность роста микобактерий на средах разных вариантов:
Среда	Штаммы микобактерий
	М.bovis Vallee	М.bovis BCG	M.tub. Academia	M.tub. Н37Ra	М.avium ГИСК	М.avium 44	М.avium 659	М.phlei	М.smegmatis 53
	Массивность роста
3 недели роста	1 неделя роста
Вариант 1	±	±	±	+	±	±	±	4-	+
Вариант 2	±	+	+	++	+	+	+	++	++--
Вариант 3	±	+	+	++	++	+	++	++	++
Вариант 4	±	+	+	++	++	+	++	++	++
Среда Левен-штейна-Йенсена	±	+	+	++	++	+	++	++	++

Пример 4. Для определения эффективности среды для культивирования нокардиоформных актиномицетов использовали референс-штамм Nocardia asteroids и четыре штамма родококков, выделенные от свиней и идентифицированные в лабораторных условиях. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур и учет результатов проводили как в примере 3. Контроль - традиционно применяемая среда Левенштейна-Йенсена. Результаты представлены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4
Сроки появления первичного роста нокардиоформных актиномицетов на средах разных вариантов
Штаммы	Сроки появления роста, дней
	Среда в соответствии с изобретением	Среда Левенштейна-Йенсена
Вариант 1	Вариант 2	Вариант 3	Вариант 4
Rhodococcus equi, шт.12	3	2	2	2	2
Rhodococcus equi, шт.13	4	2	2	2	2
Rhodococcus equi, шт.5	3	2	2	2	2
Rhodococcus equi, шт.6	3	3	2	2	2
Nocardia asteroids	3	2	2	2	2

Таблица 5
Массивность роста нокардиоформных актиномицетов на средах разных вариантов
Среда	Штаммы нокардиоформных актиномицетов
	Rhodococcus equi 12	Rhodococcus equi 13	Rhodococcus equi 14	Rhodococcus equi 15	Nocardia asteroids
Массивность роста
Вариант 1	±	+	+	+	±
Вариант 2	+	++	++	++	+
Вариант 3	++	++	++	++	+
Вариант 4	++	++	++	++	+
Контроль	++	++	++	++	+

Пример 5. Для сравнительного изучения информативности среды в соответствии с изобретением (вариант 3) и сред Левенштейна-Йенсена, Финн-2, Гельберга, ФАСТ-ЗЛ и Петраньяни использовали референс-штаммы микобактерий M.bovis (шт.Vallee, Ravenal БЦЖ), M.tuberculosis (шт.Academia), М.avium (шт.ГИСК и 659), M.smegmatis (шт.4), М.fortuitum и биологический материал от положительно реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота неблагополучных по туберкулезу хозяйств с характерными поражениями в органах и лимфатических узлах. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Биологический материал предварительно обрабатывали по методу Аликаевой. Посевы культур производили нанесением одной капли суспензии микобактерий, содержавшей 30-60 КОЕ при посеве на известные среды и на среду в соответствии с изобретением. Посев каждого штамма проводили на 3-5 пробирок. При оценке роста культур учитывали сроки появления первичных колоний и изучали культурально-морфологические свойства. Интенсивность роста изучали при посеве культуры М.bovis (шт.Vallee) на все анализируемые среды. Результаты представлены в таблицах 6 и 7.

Пример 6. Изучали жирнокислотный состав клеток колоний штаммов микобактерий туберкулеза BCG и Academia, снятых со сред Левенштейна-Йенсена, Павловского (оптимальной для получения бактериальной массы микобактерий и нокардиоформных актиномицетов для газохроматографического анализа) и питательной среды в соответствии с изобретением на газовом хроматографе Цвет-500. На хроматограммах эфиров жирных кислот клеток, снятых со среды Левенштейна-Йенсена, установлены следы жирных кислот яичной среды. Хроматограммы эфиров жирных кислот клеток, снятых со среды в соответствии с изобретением, отличались от хроматограмм эфиров жирных кислот клеток, снятых со среды Павловского, более четкими пиками.

Таблица 6
Скорость роста микобактерий разных видов на плотных питательных средах
Питательная среда	Скорость роста, сут.
М.bovis шт Vallee	М.bovis шт.Ravenal	М.bovis шт.БЦЖ	М.tuberculosis шт.Academia	М.avium шт.ГИСК	M.avium шт.659	М.smegmatis шт.4	М.fortuitum	Биоматериал от крупного рогатого скота
Левенштейна-Йенсена	13-15	14-16	16-17	13-15	10-12	11-13	3-4	6-7	29-33
Финн-2	13-15	14-16	16-17	13-15	10-11	11-12	3-4	5-8	29-33
Гельберга	17-19	17-19	20-21	17-19	11-12	13-13	2-3	7	33-37
ФАСТ-ЗЛ	16-18	16-18	18-19	15-17	10	11	3	6	30-34
Петраньяни	19-21	19-21	19-21	16-18	10-12	11-13	4-5	9-10	36-40
Заявленная среда	11-12	12-14	16-17	12-13	10-11	10-11	2	5	26-28

Таблица 7
Интенсивность роста М.bovis (шт.Vallee) на плотных питательных средах
Питательная среда	Сутки
7	9	10	11	12	13	14	15	16	24
Левенштейна-Йенсена	-	-	-	-	-	+	+	++	++	+++
Финн-2	-	-	-	-	-	+	+	++	++	+++
Гельберга	-	-	-	-	-	-	++	++	++	+++
ФАСТ-ЗЛ	-	-	-	-	-	-	+	++	+++	+++
Петраньяни	-	-	=	=	-	-	+	++	+++	+++
Заявленная среда	-	-	-	+	++	++	++	+++	+++	++++
Примечание: + - единичные колонии; ++ - 10-20 колоний: +++ - 21-50 колоний; ++++ - сплошной рост

Проведенные исследования подтвердили эффективность питательной среды в соответствии с изобретением для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномицетов (сроки появления первичного роста и массивность роста сравнимы с таковыми на традиционно применяемых средах). Заявленная питательная среда отличается дешевизной и технологичностью приготовления, а ее использование упрощает проведение бактериологических исследований благодаря визуализации начального роста колоний.

Источники информации

1. Туберкулез сельскохозяйственных животных / Под ред. Шишкова В.П., Урбана В.П. - М.: Агропромиздат, 1991. - С.120-121.

2. Васильев В.Н. Микобактериозы и микозы легких. - Софрия, 1971. - С.146-175.

3. Там же, С.156.

4. RU 2226398 C2, 2004.04.10.

5. Гришин Г.И., Слинина К.Н. Дар природы - гумивит // Практик. - 2004. - №3-4. - С.80-82.

6.Левинский Б.В. Все о гуматах. - Иркутск: ИП Макаров С.Е., 1999. - 198 с.

7. Сорокина Н.Ф. Физиология активности продуктов окисления торфа // Новые процессы и продукты переработки торфа. - Минск: Наука, 1982. - С.109-115.

Питательная среда для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномицетов, содержащая калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, L-аспарагин, глицерин, лимонную кислоту, лимонно-кислое аммиачное железо и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит агар и гумивит при следующем соотношении компонентов:

L-аспарагин	4,0 г
калий фосфорнокислый двузамещенный	0,5 г
сернокислый магний	0,5 г
лимонная кислота	2,0 г
лимонно-кислое аммиачное железо	0,05 г
глицерин	40,0 г
агар	30,0 г
гумивит	90,0-95,0 мл
дистиллированная вода	до 1000,0 мл