Способ диагностики заболеваний роговицы

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной и клинической офтальмологии. Способ характеризуется тем, что проводится анализ инфракрасного спектра сухого остатка слезной жидкости на кремниевой подложке в диапазоне волновых чисел 500-3500 см^-1 до и после лечения пациентов с различной патологией роговицы, сравнивается с анализом в контрольной группе здоровых лиц, определяются характеристичные полосы ИК-спектра при различной патологии, количественно оценивается площадь пиков полос поглощения с определенными длинами волн и их соотношение при различной патологии роговицы в зависимости от этиологии и тяжести течения заболевания. Способ прост в использовании, не требует длительного анализа и трудоемкой обработки полученных результатов. 4 табл., 4 ил.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной и клинической офтальмологии, химии и используется для диагностики заболеваний роговицы, прогнозирования их течения.

Основными методами диагностики этиологии воспалительного или трофического заболевания роговицы являются исследование мазков с конъюнктивы на флору, бактериологический посев с поверхности роговицы на питательные среды, иммунологические - иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР).

В последние годы резко возросло число публикаций по биохимии слезы, что связано с выявлением диагностической ценности анализа слезы при многих общих и глазных болезнях (Габдрахманова А.Ф., Валишина Н.Р., 2000; Сомов Е.Е., Бржевский В.В., 1994).

В практической медицине возникла необходимость разработки наряду со сложными тонкими методами химического анализа СЖ простых методов исследования, поэтому достаточно широкое применение нашло кристаллографическое исследование СЖ при различной глазной патологии (Ченцова О.Б. и соавт., 1990; Чухман Т.П., Свердлин С.М., 1996; Шабалин В.Н. и соавт., 2004; Назарова Л.О., Прокофьева Г.Л., 2005).

Недостатками вышеописанных методов диагностики являются:

- значительное количество времени, дорогостоящее оборудование и реактивы;

- низкая информативность при предварительном лечении («стерильность» отделяемого конъюнктивальной полости).

Наиболее близким к заявленному изобретению является диагностика сосудистых заболеваний органа зрения (Дженгурова А.В. и соавт., 2006) с помощью инфракрасной спектроскопии слезы (ИКС), определяя критерий Бартлетта и расстояние Махаланобиса в контрольной группе и у больных с передней ишемической нейропатией.

Недостатками ИКС с определением критерия Бартлетта и расстояния Махаланобиса является необходимость проведения сложного статистического анализа многочисленных экспериментальных точек в многомерном пространстве с использованием специализированных пакетов статистико-математических программ, дополнительное обучение оператора хемометрическим приемам анализа баз данных.

Техническим результатом является:

- своевременная диагностика и прогнозирование течения патологического процесса в роговице;

- повышение качества лечения больных с воспалительными и трофическими заболеваниями роговицы.

Технический результат достигается тем, что проводится анализ ИК-спектра СЖ до и после лечения пациентов с различной патологией роговицы, сравнивается с анализом в контрольной группе здоровых лиц.

Для получения ИК-спектров образцов слезы в качестве подложки использовали пластины из монокристаллического кремния прозрачного в ИК-области (фиг.1).

Слезную жидкость микрошприцом объемом 50 мкл наносили на пластинки кремния, оптически прозрачного в области ИК-поглощения, характерной для белковых веществ. После испарения жидкой фазы и кристаллизации компонентов СЖ на поверхности кремния регистрировали ИК-спектры образцов на ИК-спектрометре ИнфраЛЮМ ФТ-02 в диапазоне 500-3500 см^-1. Полученные ИК-спектры количественно обрабатывали методом базовой линии с помощью типовой программы редактирования спектров (программа Grams/32 R Version 4.02 Spectral Notebase), которая позволила выделить анализируемую область спектра, точно зафиксировать волновые числа максимумов поглощения, построить автоматически базовую линию и рассчитать площади выделенных пиков.

При проведении анализа СЖ с использованием метода ИКС наиболее информативной областью спектра является диапазон волновых чисел 1300-2000 см^-1, где проявляются валентные колебания карбоксильных групп -С(O)O- и деформационные колебания групп -NH- и -ОН, входящих в состав молекул физиологически активных веществ слезы полипептидного типа (Гордон А. и Форд Р. 1976). Основной составляющей СЖ, которую можно контролировать, анализируя ИК-спектры образцов, являются белковые молекулы (полипептиды). Появление в ИК-области полос амид I и амид II позволило использовать ИК-спектры СЖ для диагностики заболеваний.

Амидные группы дают несколько сильных инфракрасных полос, большинство из которых отражают колебания водородных связей, в которых участвуют белковые молекулы, а также скелетные конформации.

Из колебаний амидных групп полоса амид I привлекает наибольшее внимание. Одним из факторов, оказывающих наибольшее влияние на отклик конформационной чувствительности, является образование белковыми молекулами Н-связей и взаимодействие дипольных частей молекул. Сдвиг полос обусловлен зависимостью образования Н-связей от ориентации и расстояния между взаимодействующими амидными диполями.

Анализ ИК-спектров показал, что для всех полученных образцов присутствуют колебания при 1645-1660 см^-1, 1415-1390 см^-1, соответствующие деформационным колебаниям -NH- группы первичных амидов белка и 1545 см^-1, 1260 см^-1, соответствующие деформационным колебаниям -NH- группы во вторичных амидах. Полосы поглощения при 738, 796, 887 см^-1 относятся к неплоскостным колебаниям групп -NH-.

Широкая полоса в области 1450-1350 см^-1 представляет собой ряд перекрывающихся максимумов поглощения, соответствующих симметричным и асимметричным деформационным колебаниям С-Н связей, интенсивность которых практически не зависит от межмолекулярного взаимодействия белковых молекул. Последний факт обуславливает возможность выбора полосы при 1445-1452 см^-1 в качестве полосы сравнения.

Различия в ИК-спектрах проявились в общей и относительной интенсивности соответствующих полос. Чем больше интенсивность полосы 1652 см^-1, тем выше содержание белковых веществ в СЖ. При наличии нарушений в обмене веществ или заболеваниях органов зрения происходит более интенсивная секреция белка, направленного на восстановление обмена веществ. Интенсивность характеристичной полосы наиболее адекватно характеризуется площадью (S) соответствующего пика в ИК-спектре. При изменении структуры и соотношения количеств различных белковых веществ, обусловленных динамикой биохимических процессов, сопровождающих разные стадии заболевания, интенсивность поглощения характеристичных полос, а значит, и соотношение площадей характеристичных пиков изменяется в различной степени. Из-за того, что концентрация компонентов и количество СЖ, нанесенной на подложку, могут варьировать, строить абсолютную градуировку не целесообразно. Не представляется целесообразным также исчерпывающая расшифровка полос поглощения, требующая наличие дорогостоящих стандартных образцов компонентов СЖ. Для тестирования пробы СЖ достаточно использовать подход «расшифровки отпечатков пальцев», в котором сопоставляется несколько характеристичных аналитических сигналов.

Нами предложено оценивать в качестве аналитического сигнала величины относительных оптических плотностей (S_i/S₃), взяв площадь одной из полос в качестве полосы сравнения (S₃). В этом качестве выбрали полосу со средней интенсивностью при 1446-1452 см^-1. Ее интенсивность и сдвиг по шкале волновых чисел сравнительно слабо зависел от состояния СЖ.

Для количественного сравнения спектральных данных СЖ пациента с усредненной контрольной пробой использовали нормализованные соотношения (S_i/S₃)_j/(S_i/S₃)_k, где (S_i/S₃)_j - результат измерения i-той спектральной полосы для j-го пациента, (S_i/S₃)_k - усредненная относительная интенсивность для i-той спектральной полосы в контрольной пробе. Получен типичный ИК-спектр слезной жидкости в контрольной группе здоровых лиц (фиг.2).

Таблица 1 Площади пиков S, характеристичных полос поглощения СЖ, контрольный образец (к фиг.2)
Характеристичная полоса, см-1	1259	1403	1452	1548	1649
Si	S1	S2	S3	S4	S5
1,47	1,31	2,03	3,8	8,2
отношение Si/S3	0,72	0,65	1,00	1,87	4,04

Клинический пример 1. Пациент, 68 лет. История болезни №9212. На стац. лечении в ГУЗ «ВОКОБ» с 24.10.2005 по 12.11.2005. С диагнозом: оба глаза: гнойная язва роговицы. Анализ слезной жидкости взят на 2-й день госпитализации. Тяжесть клинического течения и результаты анализа слезной жидкости, отображенные в графическом виде в фиг.3 и таблице 2 в числовом варианте (изменения соотношений характеристичных полос Si/S₃ характеристичной полосы 1548=3,7), обусловили проведение хирургического лечения - лечебного покрытия роговицы на 3-й день стационарного лечения и привели к выздоровлению.

Таблица 2 (к фиг.3)
Характеристичная полоса, см-1	1259	1403	1452	1548	1649
Si	S1	S2	S3	S4	S5
1,73	2,74	2,92	10,81	18,72
отношение Si/S3	0,59	0,94	1,0	3,70	6,41
Нормализованные по контрольной пробе отношения Si/S3	0,8	1,5	1,0	2,0	1,59

Клинический пример 2. Пациентка, 78 лет. История болезни №1221. На стац. лечении в ГУЗ «ВОКОБ» с 21.02.2006 по 18.03.2006. С диагнозом: правый глаз: абсолютная болящая глаукома, осложненная язвой роговицы. Несмотря на консервативное лечение через 23 день при отсутствии положительной динамики проведено удаление глазного яблока. Отмечаются выраженные изменения ИК-спектра СЖ (отображенные в фиг.4 и таблице 3: отношение Si/S₃ характеристичной полосы 1548=4,0) с первых дней, прогноз неблагоприятный.

Таблица 3 (к фиг.4)
Характеристичная полоса, см-1	1259	1403	1452	1548	1649
Si	S1	S2	S3	S4	S5
2,16	4,03	3,32	13,32	18,06
отношение Si/S3	0,65	1,21	1,00	4,01	5,44
Нормализованные по контрольной пробе отношения	0,8	1,9	1,00	2,14	1,35

Клинический пример 3. Больная Ш., 43 лет. История болезни №911. На лечении в ГУЗ «ВОКОБ» с 23.02.07 по 07.03.07 с диагнозом: правый глаз: кератит неясной этиологии. Бактериологическое обследование отделяемого конъюнктивальной полости результатов не дало. Из анамнеза известно, что амбулаторно пациентка получала противовоспалительное лечение, которое не принесло результата. На 4-й день лечения сделан анализ ИК-спектра слезной жидкости по предложенной авторами методике. Результаты представлены в табл.4. Отмечаются незначительные изменения ИК-спектра слезной жидкости. Изменения соотношений характеристичных полос S₄/S₃, S₂/S₃, S₁/S₃ близки к 1,0 (1,05-1,3), т.е. данных за острый воспалительный процесс нет. Пациентке назначено лечение, улучшающее трофику, и достигнут клинический результат. Дальнейшее обследование позволило выявить предпосылки для нейротрофической этиологии кератита - невралгия первой ветви тройничного нерва.

Таблица 4
Характеристичная полоса, см-1	1259	1403	1452	1548	1649
Si	S1	S2	S3	S4	S5
1,6	1,64	2,1	5,1	9,24
отношение Si/S3	0,76	0,78	1	2,43	4,44
нормализованные по контрольной пробе отношения	1,05	1,2	1	1,3	1,1

Было обследовано 20 больных с патологией роговицы. Выявлены особенности ИК-спектров СЖ при различной патологии роговицы (воспалительной, трофической) и корреляция между тяжестью клинического течения и характером ИК-спектров СЖ. При острых воспалительных заболеваниях соотношения площадей пиков S₄/S₃ возрастает в 2-2,2 раза, S₂/S₃ - в 1,5-2 раза, а соотношение S₁/S₃, напротив, уменьшаются на 20-25%. По мере выздоровления пациентов ИК-спектр СЖ приближается к контрольной группе - что использовалось нами как субклинический метод прогнозирования течения заболевания и выбора того или иного метода лечения. При трофических заболеваниях ИК-спектр существенно не меняется по отношению к контрольной группе здоровых лиц, что и является дифференциально-диагностическим признаком.

Анализ ИК-спектров слезной жидкости по описанной выше методике позволяет оперативно и своевременно проводить диагностику и прогнозирование течения патологического процесса в роговице, что способствует своевременному выбору консервативной и хирургической тактики лечения с учетом этиологии и повышает качество лечения больных с воспалительными и трофическими заболеваниями роговицы.

Предложенная методика проста в использовании, не требует специальной профподготовки, длительного анализа и трудоемкой обработки полученных результатов, она позволяет оперативно прогнозировать течение заболевания и выбирать тактику лечения больных с различной патологией роговицы.

Список использованной литературы:

1. Вэндер Д.Ф., Голт Д.А. Секреты офтальмологии. Перев. с англ. Под ред. Ю.С.Астахова. - Москва, «Медпресс-информ». - 2005. - 462 с.

2. Габдрахманова А.Ф., Валишина Н.Р. Роль исследования слезной жидкости в диагностике патологических состояний (обзор). Сб. науч. тр. «Новые технологии в офтальмологии». - Уфа. - 2000. - Стр. 318-323.

3. Гордон А. Форд. Р. Спутник химика. Физико-химические свойства, методики, библиография - М.: Мир, 1976. - 542 с.

4. Дженгурова А.В., Ермакова Н.А., Зубарева Г.М., Рощина И.А. Клинические возможности спектрометрии слезной жидкости в диагностике передней ишемической нейропатии. Сб. науч. тр. «V Всероссийской школы офтальмолога». - Москва, 2006. - Стр. 345-346.

5. Иванов Д.В. Анализ гнойных кератитов и роль кератопластики в этом процессе // Матер. науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы офтальмологии», часть II. - Москва, 2000. - Стр. 24-26.

6. Майчук Ю.Ф. Современные вопросы фармакотерапии инфекционных заболеваний глаз // Матер. науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы офтальмологии», часть II. - Москва, 2000. - Стр. 5-10

7. Назарова Л.О., Прокофьева Г.Л. Морфологические методы исследования слезной жидкости в диагностике воспалительных заболеваний органа зрения // Сб. науч. тр. «IV Всероссийской школы офтальмолога». - Москва, 2005. - Стр. 369-373.

8. Сомов Е.Е., Бржевский В.В., Пирогов Ю.И. Защитные факторы слезной жидкости здоровых и больных людей // Офтальмологический журнал. - Одесса, 1991. - №2. - Стр. 113-117.

9. Ченцова О.Б., Прошина О.И., Маркушева Л.И. Кристаллографический метод исследования слезной жидкости в диагностике некоторых заболеваний глаз // Вестник офтальмологии. - 1990. - №2. - С.44-47.

10. Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., Девяткин А.А., Малов В.М., Брошевская Е.Б., Малов И.В. Морфология жидких сред глаза (новая теория инволютивного катарактогенеза). - Москва, «Медицина». - 2004. - 244 с.

11. Шаимова В.А. Клиника гнойной язвы роговицы. Тез. докл. регион, науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы клинической офтальмологии». - Челябинск. - 1999. - Стр.104-106.

Способ диагностики этиологии заболевания роговицы глаза, включающей проведение анализа инфракрасного спектра сухого остатка слезной жидкости пациентов с заболеваниями роговицы и определение площадей характеристических пиков полос поглощения с длинами волн 1259 см^-1(S₁), 1403 см^-1(S₂), 1452 см^-1(S₃), 1542 см^-1(S₄), 1649 см^-1(S₅), после чего рассчитывают соотношение площадей пиков S₄/S₃; S₂/S₃; S₁/S₃; и при возрастании S₄/S₃ в 2,0-2,2 раза, S₂/S₃ в 1,5-2 раза, уменьшении S₁/S₃ на 20-25% диагностируют острое воспалительное заболевание роговицы, при соотношении S₄/S₃; S₂/S₃; S₁/S₃, существенно неизмененных по отношению к контрольной группе здоровых лиц диагностируют трофическое заболевание роговицы глаза.