Способ отбора растений конопли по содержанию в них каннабиноидных соединений
Владельцы патента RU 2324334:
Государственное научное учреждение Чувашский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ Чувашский НИИСХ Россельхозакадемии) (RU)
Изобретение предназначено для использования в сельском хозяйстве. Отбор растений на содержание каннабиноидных соединений проводят по антоциановой окраске вегетативных органов. Установлено, что чем интенсивнее антоциановая окраска растений, тем ниже содержание в них каннабиноидных соединений. Поэтому в качестве селекционной элиты используют растения только с темно-красной и красной окраской вегетативных органов. Это позволяет упростить процесс отбора, существенно сократить затраты труда, времени и материальных средств. 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 6 табл.
Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано при выращивании конопли.
Известен способ отбора растений конопли по содержанию в них каннабиноидных соединений, включающий анализ органов растений (Авторское свидетельство СССР №784838, кл. А01Н 1/4, 1979) [1]. Однако данный известный способ трудоемок. Известен способ отбора растений конопли по содержанию в них каннабиноидных соединений, включающий анализ органов растений (Авторское свидетельство СССР №1380687, кл. А01Н 1/4, 1988) [2]. Однако данный известный способ очень сложен, требует значительных затрат труда, времени и материальных средств.
Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является упрощение и ускорение процесса отбора, снижение трудозатрат и затрат материальных средств.
Достигается это тем, что в способе отбора растений конопли по содержанию в них каннабиноидных соединений, включающем анализ признаков органов растений и отбор по этим признакам, отличающемся тем, что анализируют вегетативные органы растений путем их визуального осмотра, определяют признак интенсивности их антоциановой окраски и в качестве растений с минимальным содержанием каннабиноидных соединений отбирают растения с максимально интенсивной окраской вегетативных органов.
Рекомендуется в качестве селекционной элиты отбирать растения с красной или темно-красной окраской их вегетативных органов.
Для определения признака интенсивности окраски вегетативных органов используют эталоны окраски.
Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.
Пример 1. В 1999-2005 годах в селекционном питомнике однодомной желтостебельной конопли, пространственно изолированном от других посевов, изучали влияние многократного методического отбора на частоту появления особей с антоциановой окраской вегетативных органов. Высокий агрофон на данном участке создавали внесением под предпосевную обработку почвы минеральных удобрений из расчета N120P90K90 кг/га действующего вещества. Посев семян - ручной, под маркер, площадь питания растений - 5×45 см. Для уничтожения сорняков, а также улучшения водно-воздушного режима почвы проводили рыхление междурядий: первый раз на глубину 5-6 см в период 1-2 пар листьев; второй - на глубину 7-8 см при появлении 3-х пар листьев; третий - через 5-7 дней на глубину 5 см. Проводили также тщательную восьмикратную видовую прополку от зеленостебельных растений и от растений обычной поскони: первую - в фазе начала бутонизации, каждую последующую - через 4-5 дней после предыдущей. Структурный анализ селекционной элиты по признаку «антоциановая окраска вегетативных органов» выполняли в период созревания 75% семян в соцветиях большинства растений.
Результаты исследований приведены в таблице 1. На фиг.1 показаны фенотипические классы однодомных желтостебельных растений конопли по признаку «антоциановая окраска стеблей».
Впервые в практике отечественного коноплеводства зафиксирован факт, что в естественных условиях в популяциях однодомных сортов желтостебельной конопли могут появляться растения с разной интенсивностью антоциановой окраски на вегетативных органах с частотой до 1,7%. И этот признак, как любой другой жизненно важный, в процессе отбора может приобрести положительное, нужное для селекционера, значение: в наших экспериментах, например, в результате непрерывного шестикратного отбора доля растений с антоциановой окраской увеличилась в 48 раз.
Пример 2. В 2003-2005 годах провели вегетационные опыты по установлению генетико-селекционных особенностей растений с антоциановой окраской вегетативных органов. С этой целью выделили четыре типа растений по интенсивности антоциановой окраски:
- с темно-красной окраской;
- с красной окраской;
- со светло-красной окраской;
- с бледно-красной окраской.
Ген, контролирующий антоциановую окраску, обозначили символом R (естественно, отсутствие антоциановой окраски - r).
Для вегетационных опытов использовали пахотный слой почвы. Опыты закладывали в металлических сосудах высотой 22 см и диаметром 20 см, которые предварительно взвешивали с точностью до 10 г. Для нормального роста и развития растений вносили удобрения из расчета N200P100K150 мг на 1 кг сухой почвы. В каждый сосуд высевали по 10 семян, повторность - пятикратная. Полив проводили по массе сосуда, исходя из оптимальной для конопли влажности - 70% от полной полевой влагоемкости. Процесс опыления в пределах семьи в одном сосуде контролировали с помощью пергаментных изоляторов (длина 216 см, ширина 24 см), которыми накрывали растения вместе с сосудом перед началом цветения. Верхний конец изоляторов привязывали шпагатом к туго натянутой проволоке в верхней части вегетационного домика. Такой изолятор при необходимости легко приподнимался и снимался.
Результаты исследований приведены в таблицах 2 и 3. На фиг.2-5 показано хромосомное объяснение наследования антоциановой окраски у однодомной желтостебельной конопли при инбридинге растений с разным цветом вегетативных органов.
Экспериментальные данные позволяют констатировать, что антоциановая окраска на растениях конопли является аллеломорфным признаком и зависит от двух пар генов - усилителей окраски. При наличии четырех генов вегетативные органы приобретают наиболее густой тон окраски, при трех генах-усилителях окраска становится немного светлее, при двух - еще светлее, при одном - наиболее светлая.
По фенотипу в инбредной популяции расщепление происходит в следующих соотношениях: 1 растение темно-красной окраски, 4 - красной, 6 - светло-красной, 4 - бледно-красной и 1 растение без антоциановой окраски, то есть получается типичный биномиальный ряд.
Таким образом, при размножении растений с антоциановой окраской путем инбридинга в потомстве получаются все переходы от темно-красных к соломенно-желтым. Отношение всех окрашенных к соломенно-желтым (без антоциановой окраски) 15:1. Поскольку вероятность (Р) значительно выше табличного значения χ квадрат (0,05), то имеющиеся некоторые отклонения следует рассматривать как случайные.
Пример 3. В 1999-2005 годах на материале, отобранном в селекционном питомнике, установили степень изменчивости содержания тетрагидроканнабинола (ТГК) в растениях в зависимости от интенсивности антоциановой окраски вегетативных органов и вычислили коэффициент корреляции между признаками «антоциановая окраска вегетативных органов» и «содержание ТГК в растениях», а также, учитывая выявленные закономерности, начали селекционный процесс по созданию первого в мировой практике безгашишного сорта однодомной конопли среднерусского типа с антоциановой окраской вегетативных органов.
Для анализа содержания тетрагидроканнабинола (ТГК) образцы отбирали в период созревания 75% семян в соцветиях. Содержание ТГК определяли на хроматографе «Кристалл 2000 М» с программированием температуры. Разделение каннабиноидов проводили на капиллярной колонке. Пики идентифицировали по времени удерживания. Содержание рассчитывали по методу внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта использовали метилстеарит.
Фенотипическую корреляцию между изучаемыми признаками рассчитывали по П.Ф.Рокицкому (1973).
Результаты исследований представлены в таблицах 4-6.
Табличный материал показывает, что чем больше доминантных аллелей полигенов содержится в генотипе, тем ниже содержание ТГК в растениях. Следовательно, для селекционной практики наибольший интерес будут представлять растения с темно-красной и красной окраской вегетативных органов. Это хорошо подтверждается результатами расчетов корреляционной зависимости между признаками «антоциановая окраска вегетативных органов» и «содержание ТГК в растениях»: чем интенсивнее антоциановая окраска растений, тем ниже содержание в них вредных наркотических веществ (=-0,66-0,98).
Следовательно, признак «антоциановая окраска вегетативных органов» вполне может служить основой для диагностики и отбора растений без психотомиметически активных каннабиноидных соединений. В отобранном новым способом селекционном материале, в сравнении с известным, содержание тетрагидроканнабинола (ТГК) оказалось в 28 раз ниже.
Таким образом, способ согласно изобретению позволяет упростить процесс отбора, сократить затраты труда, времени и материальных средств, в конечном итоге, создать совершенно новую, ранее не известную в мировой практике, форму конопли с нокаутированными генами синтеза тетрагидроканнабинола.
| Таблица 1 Влияние методического отбора на частоту появления особей с антоциановой окраской вегетативных органов в популяции однодомной желтостебельной конопли (селекционный питомник) | ||||||||||
| Год | Всего растении | В том числе | Общая численность растений с антоциановой окраской, % | |||||||
| С антоциановой окраской | Без антоциановой окраски | |||||||||
| сильной | средней | слабой | шт | % | ||||||
| шт | % | шт | % | шт | % | |||||
| 1999 | 1340 | 4 | 0.3 | 5 | 0.4 | 13 | 1.0 | 1318 | 98.3 | 1.7 |
| 2000 | 1624 | 9 | 0.6 | 11 | 0.7 | 21 | 1.3 | 1583 | 97.4 | 2.6 |
| 2001 | 1701 | 20 | 1.2 | 24 | 1.4 | 30 | 1.8 | 1627 | 95.6 | 4.4 |
| 2002 | 1963 | 53 | 2.7 | 57 | 2.9 | 88 | 4.5 | 1765 | 89.9 | 10.1 |
| 2003 | 2008 | 122 | 6.1 | 195 | 9.7 | 201 | 10.0 | 1490 | 74.2 | 25.8 |
| 2004 | 2072 | 284 | 13.7 | 385 | 18.6 | 437 | 21.1 | 966 | 46,6 | 53.4 |
| 2005 | 2100 | 563 | 26.8 | 573 | 27.3 | 579 | 27.6 | 385 | 18.3 | 81.7 |
| Таблица 2 Соотношение растений с антоциановой окраской в инбредных потомствах (в среднем за 2003-2005 годы) | |||
| Тип растения по интенсивности антоциановой окраски | Всего растений | В том числе окрашенных, % | Х2 при 15:1 |
| Темно-красная | 150 | 99,24 | 34,50 |
| Красная | 149 | 98,76 | 32,12 |
| Светло-красная | 149 | 93,20 | 29,63 |
| Бледно-красная | 150 | 74,32 | 27,15 |
| Таблица 3 Генетическая характеристика растений однодомной желтостебельной конопли антоциановой окраской вегетативных органов (селекционный питомник, 2003-2005 годы) | |||||
| № п.п. | Генетические классы | Фенотипические классы | |||
| Генная формула | Число доминантных аллелей | Окраска вегетативных органов | Число растений | Частота | |
| 1 | R1R1R2R2 | 4 | Темно-красная | 152 | 1 |
| 2 | R1R1R2r2 | 3 | Красная | 651 | 4 |
| 3 | R1r1R2R2 | 3 | Красная | ||
| 4 | R1r1R2r2 | 2 | Светло-красная | 999 | 6 |
| 5 | R1R1r2r2 | 2 | Светло-красная | ||
| 6 | r1r1R2R2 | 2 | Светло-красная | ||
| 7 | R1r1r2r2 | 1 | Бледно-красная | 675 | 4 |
| 8 | r1r1R2r2 | 1 | Бледно-красная | ||
| 9 | r1r1r2R2 | 0 | Без антоциановой окраски | 170 | 1 |
| Итого: | 2647 |
| Таблица 4 Степень изменчивости содержания тетрагидроканнабинола (ТГК) в желтостебельных растениях однодомной конопли с различной интенсивностью окраски вегетативных органов (селекционный питомник, 2003-2005 гг.) | ||||||||
| Окраска вегетативных органов | Ед. изм. | Содержание ТГК, % | ||||||
| До 0,02 | 0,021-0,024 | 0,025-0,028 | 0,029-0,032 | 0,033-0,036 | 0,036-0,040 | Свыше 0,041 | ||
| Темно-красная | шт | 50 | 4 | 3 | - | - | - | - |
| Красная | шт | 36 | 6 | 180 | 23 | - | - | - |
| Светло-красная | шт | 25 | 9 | 130 | 20 | 121 | 51 | 20 |
| Бледно-красная | шт | 10 | 11 | 110 | 20 | 105 | 24 | 40 |
| Всего: | 121 | 30 | 423 | 63 | 226 | 75 | 60 |
| Таблица 5 Коэффициент корреляции между признаками «антоциановая окраска вегетативных органов» и «содержание ТГК в растениях» у однодомной желтостебельной конопли | ||||
| Год | Окраска вегетативных органов | |||
| Темно-красная | Красная | Светло-красная | Бледно-красная | |
| 1999 | -0,66+0,02 | -0,63+0,02 | -0,60+0,01 | -0,59+0,01 |
| 2000 | -0,74+0,03 | -0,07+0,03 | -0,65+0,03 | -0,60+0,01 |
| 2001 | -0,98+0,07 | -0,98+0,14 | -0,96+0,12 | -0,94+0,18 |
| 2002 | -0,86+0,07 | -0,84+0,06 | -0,81+0,07 | -0,81+0,12 |
| 2003 | -0,80+0,07 | -0,76+0,03 | -0,74+0,03 | -0,70+0,03 |
| 2004 | -0,88+0,07 | -0,84+0,06 | -0,81+0,06 | -0,78+0,03 |
| 2005 | -0,91+0,07 | -0,87+0,03 | 0,83+0,06 | -0,80+0,06 |
| Таблица 6 Характеристика перспективной селекционной элиты по содержанию тетрагидроканнабинола (ТГК) в растениях | ||
| Порядковый номер | Известный способ (прототип) | Новый способ |
| 1 | 0.003 | 0.0001 |
| 2 | 0.008 | 0.0003 |
| 3 | 0.008 | 0.0003 |
| 4 | 0.016 | 0.0005 |
| 5 | 0.016 | 0.0005 |
| 6 | 0.020 | 0.0007 |
| 7 | 0.020 | 0.0007 |
| 8 | 0.020 | 0.0007 |
| 9 | 0.020 | 0.0007 |
| 10 | 0.020 | 0.0007 |
| 11 | 0.020 | 0.0007 |
| 12 | 0.020 | 0.0007 |
| 13 | 0.020 | 0.0007 |
| 14 | 0.020 | 0.0007 |
| 15 | 0.020 | 0.0007 |
| 16 | 0.020 | 0.0007 |
| 17 | 0.020 | 0.0007 |
| 18 | 0.020 | 0.0007 |
| 19 | 0.020 | 0.0007 |
| 20 | 0.022 | 0.0007 |
| 21 | 0.022 | 0.0007 |
| 22 | 0.022 | 0.0007 |
| 23 | 0.022 | 0.0007 |
| 24 | 0.022 | 0.0007 |
| 25 | 0.022 | 0.0009 |
| 26 | 0.028 | 0.0009 |
| 27 | 0.028 | 0.0009 |
| 28 | 0.028 | 0.0009 |
| 29 | 0.030 | 0.0010 |
| 30 | 0.030 | 0.0010 |
| X | 0.020 | 0.0007 |
1. Способ отбора растений конопли по содержанию в них каннабиноидных соединений, включающий анализ признаков органов растений и отбор по этим признакам, отличающийся тем, что анализируют вегетативные органы растений путем их визуального осмотра, определяют признак интенсивности их антоциановой окраски и в качестве растений с минимальным содержанием каннабиноидных соединений отбирают растения с максимально интенсивной окраской вегетативных органов.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве селекционной элиты отбирают растения с красной или темно-красной окраской их вегетативных органов.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что для определения признака интенсивности окраски вегетативных органов используют эталоны окраски.
