Иммуноферментная тест-система для определения поверхностного антигена вируса гепатита в и способ определения поверхностного антигена вирусного гепатита в

Изобретение относится к области иммунологии, медицины и биотехнологии. Использование: выявление или подтверждение поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Иммуноферментная тест-система для идентификации HBsAg в сыворотке (плазме) и препаратах крови (альбумине, фибринолизине, иммуноглобулинах и лейкоцитарном интерфероне) содержит: твердую фазу, содержащую иммуносорбент, представляющий собой сорбированные на стрипах планшета моноклональные антитела мыши к HBsAg; конъюгат-1 - биотин с моноклональными антителами к HBsAg и конъюгат-2 - стрептавидин, меченный пероксидазой хрена, представленные в виде жидких концентратов; положительный контрольный образец; отрицательный контрольный образец; промывочный раствор; раствор для разведения конъюгатов; субстратный буферный раствор; тетраметилбензидин в качестве хромогена; серную кислоту в качестве стоп-реагента; нейтрализующий реагент, жидкий или лиофилизированный, представляющий собой иммуноглобулины козы, содержащие антитела к HBsAg; контрольный реагент, жидкий или лиофилизированный, представляющий собой иммуноглобулины козы, не содержащие антител к HBsAg; слабоположительный контрольный образец, представляющий собой сыворотку крови в лиофилизированном виде, содержащую HBsAg в концентрации 0,02-0,06 МЕ/мл. Предложен также способ определения поверхностного антигена вирусного гепатита В (HBsAg) методом иммуноферментного анализа в биологическом образце с помощью данной тест-системы. Изобретение позволяет выявлять искомый антиген с чувствительностью 0,01 МЕ/мл при сохранении высокой специфичности. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 8 табл.

 

Изобретение относится к области медицины, иммунологии и биотехнологии.

Использование: выявление поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) или подтверждение специфичности результатов выявления.

Сущность: получение иммуноферментной тест-системы для идентификации HBsAg в сыворотке (плазме) и препаратах крови (альбумине, фибринолизине, иммуноглобулинах и лейкоцитарном интерфероне), позволяющей выявлять искомый антиген с чувствительностью не менее 0,01 МЕ/мл.

Для диагностики гепатита В с помощью специфических тестов решающее значение имеет обнаружение в сыворотке крови поверхностного антигена вируса гепатита В - HBsAg, являющегося основным маркером заболевания, который регистрируется задолго до появления клинических признаков болезни. На ранних стадиях инфекционного процесса и перед исчезновением из циркуляции концентрация HBsAg может составлять несколько пг/мл.

Всеобщая вакцинация ускорила накопление мутантных форм вируса гепатита В. Наличие мутаций в вирусном геноме вызывает изменение структуры антигенных эпигонов HBsAg или биологических свойств вируса, например снижение секреции вируса из клеток. Вследствие этого снижается выявляемость HBsAg с помощью сертифицированных диагностических тестов [Weinberger K.M. et al., 2000].

Установлено, что при сочетанном инфицировании вирусами гепатитов В и С или вирусом гепатита В и ВИЧ происходит подавление репликации вируса гепатита В. Это приводит к тому, что количество HBsAg в сыворотке крови ниже предела чувствительности большинства используемых тест-систем, разрешенных к применению [Berger A. et al., 2000; Hofer M. et al., 1998; Schuttler C.G. et al., 2002].

Современные методы выявления HBsAg позволяют обнаруживать его в низких концентрациях. Существуют национальные критерии чувствительности и специфичности отечественных препаратов. Так, с 2003 года для тест-систем на HBsAg регламентируется чувствительность 0,1 МЕ/мл.

Однако выявление случаев возникновения гепатита В после переливания «серонегативной» по HBsAg крови свидетельствует о необходимости дальнейших работ по созданию и внедрению в практическое здравоохранение тест-систем, обладающих высокой чувствительностью с сохранением высокой специфичности. Поэтому создание иммуноферментной тест-системы для определения HBsAg в сыворотке крови в концентрации 0,01 МЕ/мл позволит уменьшить риск посттрансфузионного заражения вирусным гепатитом В, повысит качество скрининга донорской крови.

Одним из путей повышения чувствительности детекции HBsAg в иммуноферментном анализе может быть использование иммунохимического комплекса биотин-стрептавидин. При синтезе конъюгата антитело-биотин с одной молекулой антитела может быть связано до 90 молекул биотина. Молекула стрептавидина имеет 4 центра связывания биотина, поэтому каждый специфический иммунохимический комплекс на конечной стадии будет содержать не одну молекулу фермента, а несколько десятков. Использование для биотинилирования длинного спейсера значительно снижает стерические препятствия при взаимодействии меченных биотином антител со стрептавидином.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) к заявленному изобретению по совокупности признаков является диагностический набор «Enzygnost HBsAg 5.0» (Dade Behring, Германия), основанный на двухстадийной постановке, в составе которого имеются биотиновый и стрептавидиновый конъюгаты (Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency, 06/2003, Evaluation Report MHRA num-ber 03044). На первом этапе HBsAg, содержащийся в тестируемом образце, одновременно связывается с овечьими поликлональными антителами к HBsAg, сорбированными в лунки планшета, и с конъюгатом-1, являющимся мышиными моноклональными антителами к HBsAg, связанными с биотином. На втором этапе после отмывки не связавшихся реагентов конъюгат-2 (стрептавидин, меченный пероксидазой хрена) взаимодействует с конъюгатом-1. После отмывки не прореагировавших реагентов ферментативная активность связавшегося конъюгата-2 детектируется окрашенным продуктом взаимодействия фермента со смесью субстрата и хромогена. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации HBsAg в исследуемом образце. Общее время реакции составляет 120 мин. Недостатком данного набора является то, что его чувствительность не превышает 0,1 МЕ/мл, что и является причиной, препятствующей достижению требуемого технического результата.

Задачей настоящего изобретения является получение тест-системы, с помощью которой достигается возможность выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) в сыворотке (плазме) крови человека с чувствительностью 0,01 МЕ/мл при сохранении высокой специфичности.

Сущность предлагаемого технического решения состоит в том, что выявление HBsAg с чувствительностью 0,01 МЕ/мл проводят с помощью диагностической иммуноферментной тест-системы, построенной на основе использования пары конъюгатов, один из которых - моноклональные антитела к HBsAg, связанные с биотином, второй - стрептавидин, меченный пероксидазой хрена, причем в ходе постановки иммуноферментного анализа присутствует стадия совместного выдерживания в лунке исследуемого образца одновременно с двумя конъюгатами.

Тест-система для определения поверхностного антигена вирусного гепатита В (HBsAg) методом иммуноферментного анализа в биологическом образце содержит:

- в качестве твердой фазы иммуносорбент, представляющий собой сорбированные на стрипах полистиролового планшета моноклональные антитела мыши к HBsAg,

- первый конъюгат - (11-кратный концентрат), прозрачная или слегка опалесцирующая, фиолетового цвета жидкость, моноклональные антитела к HBsAg, связанные с биотином,

- второй конъюгат - прозрачная или слегка опалесцирующая, голубого цвета жидкость, стрептавидин, меченный пероксидазой хрена,

- положительный контрольный образец, инактивированный, прозрачная или слегка опалесцирующая, малиново-красного цвета жидкость, сыворотка крови человека, содержащая HBsAg, не содержащая антитела к ВИЧ-1,2 и вирусу гепатита С и антитела к HBsAg,

- отрицательный контрольный образец, инактивированный, прозрачная или слегка опалесцирующая, светло-зеленого цвета жидкость, сыворотка крови человека, не содержащая HBsAg, антитела к ВИЧ-1,2 и вирусу гепатита С,

- слабоположительный контрольный образец, лиофилизированный, сухая пористая аморфная масса, гигроскопичная, белого или светло-желтого цвета, представляет собой сыворотку крови человека, содержащую HBsAg в концентрации 0,02-0,06 МЕ/мл и не содержащую антитела к ВИЧ-1,2 и вирусу гепатита С и антитела к HBsAg,

- промывочный раствор - прозрачная или слегка опалесцирующая, бесцветная или светло-желтого цвета жидкость, 25-кратный концентрат фосфатно-солевого раствора, содержащий 2,5% твина-20,

- раствор для разведения конъюгата-1, непрозрачная зеленого цвета жидкость,

- раствор для разведения конъюгата-2, прозрачная желтого цвета жидкость,

растворы для разведения конъюгатов представляют собой белково-солевые растворы,

- субстратный буферный раствор, содержащий перекись водорода, прозрачная бесцветная жидкость,

- 3,3'5,5'-тетраметилбензидин в качестве хромогена, прозрачная бесцветная жидкость,

- стоп-реагент - раствор серной кислоты 0,75 моль/л, прозрачная бесцветная жидкость.

В набор включены нейтрализующий реагент, жидкий или лиофилизированный, представляющий собой иммуноглобулины козы, содержащие антитела к HBs-антигену; контрольный реагент, жидкий или лиофилизированный, представляющий собой иммуноглобулины козы, не содержащие антитела к HBs-антигену для подтверждения поверхностного антигена HBsAg.

В качестве биологического материала может быть исследована сыворотка или плазма крови, препарат крови, например, выбранный из группы: альбумин, фибролизин, иммуноглобулин, лейкоцитарный интерферон.

Технический результат, достигаемый настоящим изобретением, заключается в улучшении чувствительности детекции HBsAg до 0,01 МЕ/мл за счет выдерживания в лунке исследуемого образца непосредственно с биотинилированными антителами, а затем без стадии отмывки инкубационная смесь выдерживается с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена, что ведет к усилению специфического сигнала.

Данное техническое решение отличается от известных наличием фазы одновременного совместного выдерживания в лунке исследуемого образца с конъюгатами-1 и -2.

Иммуноферментная тест-система для определения (выявления или подтверждения) поверхностного антигена вируса гепатита В («ДС-ИФА-HBsAg-0,01») может быть выполнена в виде 2 наборов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Для выявления поверхностного антигена гепатита В в сыворотке (плазме) и препаратах крови (альбумине, фибринолизине, иммуноглобулинах и лейкоцитарном интерфероне) предназначен набор 1 ("ДС-ИФА-HBsAg-0,01").

Реагенты, включенные в состав набора 1:

иммуносорбент - моноклональные антитела мыши к HBsAg, сорбированные на стрипах полистиролового планшета; конъюгат-1 - жидкий (концентрат x11) - антитела к HBsAg, конъюгированные с биотином; конъюгат-2 - (концентрат х11) жидкий - стрептавидин, меченный пероксидазой хрена; положительный контрольный образец (К+1), жидкий - сыворотка крови человека, содержащая HBsAg, не содержащая антитела к ВИЧ-1,2 и вирусу гепатита С, инактивированная; слабоположительный контрольный образец (К+2), лиофилизированный - HBsAg с концентрацией 0,04±0,02 МЕ/мл в сыворотке крови человека, не содержащий антитела к ВИЧ-1,2 и вирусу гепатита С, инактивированный; отрицательный контрольный образец (К-), жидкий - сыворотка крови человека, не содержащая HBsAg, не содержащая антитела к ВИЧ-1,2 и вирусу гепатита С, инактивированная; промывочный раствор (ПР, концентрат х25), жидкий; раствор для разведения концентрата конъюгата-1 (РРК-1), жидкий; раствор для разведения концентрата конъюгата-2 (РРК-2), жидкий; субстратный буферный раствор (СБ), жидкий; хромоген - тетраметилбензидин (ТМБ), жидкий; стоп-реагент - серная кислота, раствор, 0,75 моль/л.

Набор 1 рассчитан.

Комплект 1 с увеличенным объемом компонентов - на одновременное проведение 192 (96×2) определений, включая контрольные (комплект 1 может быть использован на автоматизированном ИФА-анализаторе).

Комплект 2 - на одновременное проведение 192 (96×2) определений, включая контрольные.

Комплект 3 с увеличенным объемом компонентов - на одновременное проведение 96 (8×12) определений, включая контрольные (комплект 3 может быть использован на автоматизированном ИФА-анализаторе).

Комплект 4 - на одновременное проведение 96 (8×12) определений, включая контрольные.

Приготовление растворов.

Слабоположительный контрольный образец. Готовят перед использованием. Содержимое флакона растворить физиологическим раствором в объеме, указанном на этикетке флакона, осторожно перемешать и выдержать до использования 5-10 мин.

Промывочный рабочий раствор - для промывания иммуносорбента. Содержимое флакона с концентратом ПР разводят в 25 раз дистиллированной водой. Полученный раствор тщательно перемешивают. Приготовленный промывочный раствор хранят не более 3-х суток при температуре от 2°С до 8°С.

Конъюгат-1, рабочий раствор. Готовят перед использованием. При использовании целого планшета к 5,0 мл раствора для разведения концентрата конъюгата-1 добавляют 0,5 мл концентрата конъюгата-1 и осторожно перемешивают.

Конъюгат-2, рабочий раствор. Готовят перед использованием. При использовании целого планшета к 5,0 мл раствора для разведения концентрата конъюгата-2 добавляют 0,5 мл концентрата конъюгата-2 и осторожно перемешивают.

Срок годности рабочих растворов конъюгатов - не более 30 мин в защищенном от света месте.

Субстратная смесь. Готовят перед использованием. 1,2 мл тетраметилбензидина перенести в 18,0 мл субстратного буферного раствора и содержимое флакона тщательно перемешать. Хранению не подлежит.

Оставшиеся неиспользованными реагенты хранить во флаконах, укупоренных пробками, на протяжении срока годности тест-системы при температуре от 2°С до 8°С.

Проведение ИФА.

Во избежание конденсации влаги внутри лунок необходимо выдержать иммуносорбент при комнатной температуре в закрытом пакете не менее 30 минут.

Перед использованием комплектов 3 и 4 необходимо вскрыть фольгированный пакет с иммуносорбентом. Вынуть из пакета рамку и необходимое количество стрипов. Пакет с неиспользованными стрипами тщательно герметизировать, не удаляя осушитель. После первого вскрытия пакета иммуносорбент стабилен в течение 1 месяца при температуре от 2°С до 8°С.

Перед использованием иммуносорбент любого комплекта промыть 3 раза рабочим раствором ПР, заливая его до краев лунок (от 380 до 400 мкл в лунку), не допуская при этом переливания промывочного раствора через края лунок, выдержать 40 с и удалить промывочный раствор в емкость для сбора инфицированного материала.

Затем в лунки планшета с сорбированными моноклональными антителами к HBsAg вносят по 100 мкл контрольных и исследуемых образцов. Покрытый крышкой планшет выдерживают 30 мин при температуре (42±0,5)°С в условиях влажной камеры. Затем, не удаляя содержимое лунок и не промывая планшет, во все лунки стрипов вносят по 50 мкл рабочего раствора конъюгата-1, окрашенного в зеленый цвет. При этом содержимое лунок изменяет свой цвет на серый. В случае тестирования плазмы или сыворотки, имеющих кислый рН, раствор в лунках становится ярко-желтым. При добавлении конъюгата-1 не следует допускать случайного заноса образца из одного стрипа в другой через наконечники. Содержимое лунок тщательно перемешивают осторожным постукиванием по краям планшета, после чего покрытый крышкой планшет выдерживают в течение 45 мин при температуре (42±0,5)°С в условиях влажной камеры. Затем, не удаляя содержимое лунок и не промывая планшет, во все лунки стрипов вносят по 50 мкл рабочего раствора конъюгата-2, окрашенного в желтый цвет. При добавлении конъюгата-2 не следует допускать случайного заноса образца из одного стрипа в другой через наконечники. Содержимое лунок тщательно перемешивают осторожным постукиванием по краям планшета, после чего покрытый крышкой планшет выдерживают в течение 45 мин при температуре (42±0,5)°С в условиях влажной камеры. Далее содержимое лунок удаляют в емкость для сбора инфицированного материала и планшет промывают 7 раз рабочим промывочным раствором. Во все лунки планшета вносят по 150 мкл субстратной смеси и выдерживают в течение 25 мин в защищенном от света месте при температуре от 20°С до 24°С. Реакцию останавливают добавлением во все лунки планшета по 50 мкл стоп-реагента и через 2-3 мин проводят учет результатов ИФА.

Учет результатов.

Учет результатов проводят спектрофотометрически при двух длинах волн: 450/620-680 нм с настройкой прибора "по воздуху". Допустим учет результатов при одной длине волны 450 нм. Реакцию следует учитывать, если средние значения оптической плотности (ОП) в лунках с К- не более 0,120, в лунках с К+1 - не менее 0,6. Значения ОП в лунках с К- не должны отличаться от среднего значения ОП К- более чем на 30%. Если одно из значений ОП К- выходит за этот предел, его следует исключить из расчета среднего значения. Если исключению подлежат более одного значения ОП К-, анализ следует повторить. Реакцию считают положительной, если значение ОП в лунке с образцом равно или превышает значение ОП критическое (ОП крит.). ОП крит. рассчитывают по формуле:

ОП крит. = ОП К- ср. + 0,060, где 0,060 - коэффициент, определяемый методом статистической обработки на предприятии-изготовителе.

Слабоположительный контрольный образец, содержащий HBsAg в концентрации 0,04±0,02 МЕ/мл, должен давать положительную реакцию. Общее время постановки ИФА составляет 145 мин.

При постановке иммуноферментного анализа на шейкере контрольные и исследуемые образцы вносят по 100 мкл вместе с рабочим раствором конъюгата-1 в количестве 50 мкл. Планшет выдерживают 40 мин на шейкере при скорости 500 об/мин и температуре (42±0,5)°С. Затем, не удаляя содержимое лунок и не промывая планшет, во все лунки стрипов вносят по 50 мкл рабочего раствора конъюгата-2. Планшет выдерживают 20 мин при 42°С на шейкере при скорости 500 об/мин и температуре (42±0,5)°С. Далее содержимое лунок удаляют в емкость для сбора инфицированного материала и планшет промывают 7 раз рабочим промывочным раствором. Во все лунки планшета вносят по 150 мкл субстратной смеси и выдерживают в течение 25 мин в защищенном от света месте при температуре от 20°С до 24°С. Реакцию останавливают добавлением во все лунки планшета по 50 мкл стоп-реагента и через 2-3 мин проводят учет результатов ИФА.

Общее время постановки ИФА при использовании шейкера составляет 85 мин.

В качестве еще одного варианта осуществления изобретения может быть подтверждение специфичности результатов выявления поверхностного антигена вируса гепатита В в сыворотке (плазме) и препаратах крови (альбумине, фибринолизине, иммуноглобулинах и лейкоцитарном интерфероне) с использованием набора 2 «ДС-ИФА-HBsAg-0,01-подтверждающая».

В дополнение к реагентам, включенным в состав набора 1, в состав набора 2 включены АНТИ-HBs-ПЛЮС (нейтрализующий реагент) - жидкий или лиофилизированный, иммуноглобулины козы, содержащие антитела к HBs-антигену; АНТИ-HBs-МИНУС (контрольный реагент) - жидкий или лиофилизированный, иммуноглобулины козы, не содержащие антитела к HBs-антигену. Лиофилизированное содержимое флаконов растворяют дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке.

Набор 2 рассчитан.

Комплект 5 с увеличенным объемом компонентов - на одновременное проведение 48 (4×12) подтверждающих определений, включая контрольные (комплект 1 может быть использован на автоматизированном ИФА-анализаторе).

Комплект 6 - на одновременное проведение 48 (4×12) подтверждающих определений, включая контрольные.

При постановке ИФА контрольные образцы и образцы, подлежащие подтверждению, внести каждый в две лунки по 100 мкл. В первые лунки с контрольными и подтверждаемыми образцами добавить по 25 мкл контрольного реагента - АНТИ-HBs-МИНУС, во вторые - по 25 мкл нейтрализующего реагента - АНТИ-HBs-ПЛЮС. Покрытый крышкой планшет выдержать в течение 30 мин при температуре (42,0±0,5)°С в условиях влажной камеры. Дальнейшее проведение ИФА, а также постановка на шейкере осуществляется аналогично, как описано выше при использовании набора 1.

Учет результатов проводить спектрофотометрически при двух длинах волн - 450 нм и 620-680 нм с настройкой прибора «по воздуху». Допустим учет результатов при одной длине волны - 450 нм. Реакцию следует учитывать, если среднее значение ОП в лунках с К- (без добавления контрольного или нейтрализующего реагентов) (ОП К- ср.) не более 0,12, а в лунке с К+1 (без добавления контрольного или нейтрализующего реагентов) (ОП К+) - не менее 0,6. Значение ОП в лунке с К+1 после добавления нейтрализующего реагента (ОПн К+1) должно быть равным или меньше половины суммы ОП в лунке с К+1 после добавления контрольного реагента (ОПк К+1) и ОП К- ср., т.е. ОПн К+1≤0,5×(ОПк К+1+ОП К- ср.). Значения ОП К- после добавления нейтрализующего и контрольного реагентов должны быть ниже значения ОП критического (ОП крит.), т.е. ОПн К- и ОПк К-<ОП крит. ОП крит. рассчитывают по формуле:

ОП крит. = ОП К- ср. + 0,06, где 0,06 - коэффициент, определяемый методом статистической обработки результатов постановки ИФА на предприятии-изготовителе.

Реакцию считают положительной, если значение ОП в лунке с образцом равно или превышает ОП крит.

Слабоположительный контрольный образец, содержащий HBsAg в концентрации 0,04±0,02 МЕ/мл, должен давать положительную реакцию.

Интерпретация результатов

Образец считают содержащим HBsAg, если

а) ОПк ≥ ОП крит.,

б) ОПн ≤ 0,5×(ОПк+ОП К- ср.),

где ОПк - ОП образца с контрольным реагентом, а ОПн - ОП образца с нейтрализующим реагентом. В этом случае присутствие в образце HBsAg следует считать доказанным и дальнейшая проверка не требуется.

Определение аналитической чувствительности тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» проводилось с использованием Отраслевого Стандартного Образца HBsAg вируса гепатита В ОСО 42-28-311-03П (ООО НПО «Диагностические системы»), откалиброванного по Международному Стандарту - Second International Standard for HBsAg, subtype adw2, genotype A, NIBSC code number: 00/588, в сравнении с тест-системой «ДС-ИФА-HBsAg» и «Hepanostika HBsAg ULTRA» (Biomerieux). Были приготовлены 10 последовательных разведений ОСО от 1 МЕ/мл до 0,01 МЕ/мл, с нормальной донорской плазмой, не содержащей антител к HBsAg. Полученные данные представлены в таблице 1.

Аналитическая чувствительность тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» составила 0,01 МЕ/мл.

Оценка клинической чувствительности тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» проводилась с использованием стандартных панелей сывороток, содержащих и не содержащих HBsAg.

В таблице 2 представлены результаты сравнительного тестирования стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих HBsAg (ЗАО «Вектор-Бест»), серия 001.

Была проведена сравнительная характеристика чувствительности и специфичности четырех тест-систем с использованием референс-панели сывороток крови человека, содержащих и не содержащих поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg) субтипы ау и ad OCO 42-28-364-04П (Медицинский центр «Авиценна», Бостон Биомедика), серия №1. Полученные данные приведены в таблице 3.

Таблица 3
Результаты тестирования референс-панели сывороток крови человека, содержащих и не содержащих поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg) субтипы ay и ad (ОП/ОП крит.)
№	Субтип HBsAg	Концентрация HBsAg нг/мл	«ДС-ИФА-HBsAg-0,01»	Abbott Auszyme EIA	ИФА-HBsAg/м (ООО НПО «Диагностические системы», Россия)	BIO-RAD Genetic systems HBsAg EIA
01	-	-	0,68	0,1	0,26	Отр
02	-	-	0,53	0,1	0,33	Отр
03	-	-	0,49	0,1	0,13	Отр
04	-	-	0,38	0,1	0,29	Отр
05	ad	1	40,11	3,4	21,50	Поз
06	ad	0,6	39,73	2,2	12,50	Поз
07	ad	0,2	17,22	1,0	3,22	Поз
08	ay	0,9	39,62	3,5	12,70	Поз
09	ay	0,8	39,94	3,1	13,10	Поз
10	ay	0,6	38,31	2,1	12,20	Поз
11	ay	0,4	30,35	1,4	4,37	Поз
12	ay	0,2	17,76	0,7	3,51	Поз
13	ay	0,1	7,31	0,4	1,21	Поз
14	Неразв. образец	2-3	42,26	8,2	23,98	Поз
15	Неразв. образец	2-3	40,85	10,1	22,17	Поз
16	Неразв. образец	1-1,5	42,51	4,0	28,23	Поз
17	Неразв. образец	0,5-0,7	40,87	2,0	19,52	Поз
18	Неразв. образец	0,5-0,7	40,03	2,5	15,10	Поз
19	Неразв. образец	0,1-0,25	25,27	1,2	5,33	Поз
20	Неразв. образец	0,1-0,25	19,54	0,6	3,62	Поз

В таблице 4 представлены результаты сравнительного исследования клинической чувствительности тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» с использованием панелей производства BBI Diagnostics (Boston Biomedica Inc. (BBI), West Bridgewater, Mass., USA) и Zeptometrix Corporation.

Новый тест с идентичной чувствительностью выявляет HBsAg субтипов ad и ay со значительным преимуществом относительно теста сравнения - системы Abbott Auszyme EIA HBsAg (V2). Из данных таблиц видно, что тест-система «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» с идентичной чувствительностью определяет HBsAg субтипов ay и ad во всех позитивных образцах, представленных в панелях. Коэффициенты позитивности многих HBsAg-положительных образцов в тест-системе «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» существенно превышают коэффициенты позитивности этих же образцов, протестированных на альтернативных тестах. В образцах низкотитражной панели (от 0,05 до 0,6 IU/ml) новая тест-система позволяет также детектировать HBsAg с более высокими коэффициентами позитивности в сравнении с альтернативными тестами.

Анализ сероконверсионных панелей показал, что тест-система «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» позволяет детектировать HBsAg в положительных образцах на более раннем сроке его появления, по сравнению с зарубежными тест-системами, данные по которым приведены в паспортах к панелям. По результатам анализа двух панелей образцов, полученных от одного донора в динамике в период сероконверсии (от момента появления до момента исчезновения HBsAg) (РНМ935А (М) и РНМ935 В), следует, что новая система в сравнении с альтернативными тестами импортного производства начинает выявлять HBsAg на более раннем сроке его появления и продолжает определять на более позднем сроке по мере его исчезновения, в результате чего позитивный по HBsAg период увеличивается на 28 дней в сравнении с системой Abbott Prism HBsAg^*.

Было установлено, что использование тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» для анализа образцов сероконверсионных панелей позволяет выявлять HBsAg одновременно с вирусной ДНК (BBI-PHM933, BBI-PHM934, BBI-РНМ935А (М), ZeptoMetrix Corporation Cat. No. HBV6281), а в двух случаях (ZeptoMetrix Corporation Cat. No. HBV6277 и Cat. No. HBV6279) опережает время 1-ой детекции ДНК.

Известно, что существует проблема выявления HBsAg при коинфицировании. Было проанализировано 473 образца сыворотки крови анти-ВИЧ-позитивных лиц. Среди них в 66 был выявлен HBsAg в тесте «ДС-ИФА-HBsAg». Дополнительно выявлено 16 образцов, содержащих HBsAg в концентрации ниже 0,1 МЕ/мл. Причем 7 из них содержали антитела к HBcore-антигену, а 9 образцов не имели никаких других маркеров, кроме HBsAg, детектируемого только в системе с высокой чувствительностью (таблица 5). Следовательно, повышение чувствительности тестов для выявления HBsAg позволит снизить количество случаев скрытого гепатита В как с наличием дополнительного маркера анти-НВс, так и при отсутствии любых маркеров.

При тестировании 3348 образцов сыворотки крови доноров и 381 образца сыворотки крови беременных женщин в тест-системе «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» было выявлено 6 и 1 образец, соответственно, содержащих HBsAg в концентрации ниже 0,1 МЕ/мл.

За счет повышенной чувствительности нового теста мутантные варианты HBsAg показывают более высокую реактивность в сравнении с другими системами (таблица 6).

Таблица 6
Сравнительное определение мутантных форм рекомбинатного HBsAg (ОПm/ОП крит.)
adw2	ДС-ИФА-HBsAg	ДС-ИФА-HBsAg-0,01	"Hepanostika" (Biomerieux)	«Рекоматгеп-В-стрип» (Эколаб)	«Вектогеп-HBsAg-стрип» компл. №4
K141Е	1,6	10,4	8,6	1,3	2,2
Q129H	1,2	13,0	16,6	1,4	2,3
Q129L	1,5	14,1	11,0	1,7	1,2
M133L	2,8	16,9	13,6	1,6	2,2
T126N	2,9	17,7	8,1	1,6	1,4
G145RI	1,4	9,1	5,8	1,2	1,7
G145RII	1,6	15,7	18,8	1,2	0,8
K142S	2,0	5,6	44,1	1,5	1,3
P142S	1,5	11,8	54,8	1,5	1,4
Т143К	1,5	11,7	2,9	1,2	0,6
K141BI	3,6	2,5	54,6	0,9	0,9
ayw1 G145R	2,5	27,4	45,1	2,1	3,3

Для оценки специфичности тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» были использованы образцы сыворотки крови доноров; образцы сыворотки крови больных с различными инфекционными заболеваниями, не связанными с HBV-пневмонией, ангиной, бронхитом, вирусным гепатитом С; образцы сыворотки крови больных с различными неинфекционными заболеваниями - с патологией сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, онкозаболеваниями и др.; образцы сыворотки крови беременных женщин; образцы сыворотки крови ВИЧ-инфицированных лиц. Всего протестировано 4710 образцов. Данные по числу ложноположительных результатов в тест-системе «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» в группе здоровых и различных группах больных представлены в таблице 7.

Таблица 7
Оценка специфичности тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» на разных категориях населения
Обследуемая группа	Количество исследуемых образцов	Количество ложноположительных результатов	% специфичности в данной группе
Здоровые доноры	3348	7	99,8
Больные с различными инфекционными заболеваниями, не связанными с вирусным гепатитом В	392	5	98,7
Больные с различными неинфекционными заболеваниями	95	1	98,9
Беременные женщины	381	3	99,2
ВИЧ-инфицированные	494	4	99,2
Всего	4710	20	99,6

Таким образом, проведенные исследования показали, что специфичность тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» составляет 99,6% при исследовании образцов сыворотки крови нормальных доноров и больных с различными инфекционными и соматическими заболеваниями.

Была изучена возможность использования нового теста для детекции HBsAg в препаратах крови. В ходе исследований анализировался широкий спектр препаратов крови разных фирм-производителей: альбумин, фибринолизин, лейкоцитарный интерферон, иммуноглобулин нормальный для внутривенного введения и внутримышечного введения, иммуноглобулин противоаллергический и иммуноглобулин антистафилококковый. Жидкие препараты крови используют неразведенными; лиофильно высушенные препараты крови перед исследованием в тест-системе разводят в соответствии с инструкцией по применению данного препарата. Специфичность тест-системы по отношению к препаратам крови (были взяты пять разных серий препаратов) была исследована на трех экспериментально-производственных сериях тест-системы (таблица 8).

Таблица 8
Специфичность тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01», установленная при исследовании препаратов крови
Наименование препарата	ОП препаратов (о.е.) средняя (n=5) для каждой серии тест-системы
С.1	С.2	С.3
Альбумин	0,017	0,025	0,032
Фибринолизин	0,007	0,009	0,005
Иммуноглобулин внутривенный	0,009	0,011	0,015
Иммуноглобулин внутримышечный	0,014	0,008	0,010
Интерферон	0,005	0,007	0,008
ОП крит.(о. е.)	0,072 о.е.	0,069 о.е.	0,075 о.е.

Из данных таблицы видно, что значения ОП всех препаратов были ниже ОП крит. (о.е.), т.е. тест-система «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» показала 100% специфичность при тестировании препаратов крови.

Преимущество предлагаемой тест-системы для выявления HBsAg «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» заключается в возможности детекции HBsAg в сыворотке (плазме) и препаратах крови с чувствительностью 0,01 МЕ/мл при сохранении высокой специфичности.

1. Тест-система для определения поверхностного антигена вирусного гепатита В (HBsAg) методом иммуноферментного анализа в биологическом образце, характеризующаяся тем, что содержит твердую фазу, содержащую иммуносорбент, представляющий собой сорбированные на стрипах планшета моноклональные антитела мыши к HBsAg; конъюгат-1 - биотин с моноклональными антителами к HBsAg и конъюгат-2 - стрептавидин, меченный пероксидазой хрена, представленные в виде жидких концентратов; положительный контрольный образец; отрицательный контрольный образец; промывочный раствор; растворы для разведения конъюгатов; субстратный буферный раствор; тетраметилбензидин в качестве хромогена; серную кислоту в качестве стоп-реагента; нейтрализующий реагент, жидкий или лиофилизированный, представляющий собой иммуноглобулины козы, содержащие антитела к HBsAg; контрольный реагент, жидкий или лиофилизированный, представляющий собой иммуноглобулины козы, не содержащие антител к HBsAg; слабоположительный контрольный образец, представляющий собой сыворотку крови в лиофилизированном виде, содержащую HBsAg в концентрации 0,02-0,06 МЕ/мл.

2. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что биологический материал представляет собой сыворотку или плазму крови.

3. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что биологический материал представляет собой препарат крови, выбранный из группы альбумин, фибролизин, иммуноглобулин, лейкоцитарный интерферон.

4. Способ определения поверхностного антигена вирусного гепатита В (HBsAg) методом иммуноферментного анализа в биологическом образце с помощью тест-системы по п.1, включающий выдерживание контрольных и исследуемых биологических образцов, внесенных в лунки планшета с сорбированными моноклональными антителами мыши к HBsAg при температуре (42±0,5)°С с последующим добавлением окрашенного раствора конъюгата, который представляет собой моноклональные антитела к HBsAg, связанные с биотином, а затем без стадии отмывки инкубационную смесь тщательно смешивают и выдерживают с окрашенным раствором конъюгата, представляющего собой стрептавидин, меченный пероксидазой хрена, при температуре (42±0,5)°С, реакцию останавливают добавлением стоп-реагента и проводят учет результатов спектрофотометрическим методом.