Способ количественного определения тимола и карвакрола в лекарственном растительном сырье

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способу количественного определения тимола и карвакрола при совместном присутствии в лекарственном растительном сырье, в экстрактах и настойках растительного сырья высокоэффективной жидкостной хроматографией. Результат достигается тем, что в способе количественного определения тимола и карвакрола при совместном присутствии использовали колонку размером 250×4.6 мм, заполненную силикагелем с привитыми прямыми алкильными группами, число атомов в которых равно шестнадцати (С16), с размером частиц 7 мкм. В качестве подвижной фазы использовали раствор метанол - вода в соотношении 62:38, скорость подвижной фазы 1 мл/мин. Детектирование осуществляли на УФ-детекторе при длине волны 277 нм, с последующим расчетом концентрации тимола и карвакрола по отношению площадей пиков анализируемого и стандартного вещества, в качестве которого используют стандартные растворы тимола карвакрола. Способ позволяет разделить и определить количественное содержание индивидуальных веществ тимола и карвакрола в лекарственном растительном сырье, в экстрактах и настойках растительного сырья, упростить процесс пробоподготовки, уменьшить время анализа и упростить идентификацию веществ. 1 табл.

 

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для количественного определения тимола и карвакрола при их совместном присутствии в лекарственном растительном сырье, в экстрактах и настойках растительного сырья.

Известен способ количественного определения тимола в этанольных экстрактах лекарственного сырья спектрофотометрически (Патент 2025717, Россия, C15 G01N 21/33. Способ количественного определения тимола в лекарственном растительном сырье. / Мазулин А.В., Петренко В.В., Калошина Н.А.; Мазулин А.В.; 4906687/25; Заявл. 31.01.1991; Опубл. 1994.12.30). Недостатком указанного способа является наличие в экстракте растительного сырья сопутствующих веществ, мешающих спектрофотометрическому определению, невозможность определения тимола, минуя стадию осаждения мешающих веществ 10%-ным раствором ацетата свинца.

Известен способ количественного определения в эфирном масле тимола и карвакрола спектрофотометрически (Маркова О.М., Клочков С. В. Охрана окружающей среды, вопросы экологии и контроль качества продукции. М.: НИИТЭХИМ, 1994, вып.2, с.6-7). Недостатком указанного способа является необходимость выделения из растительного материала или экстрактов растений эфирного масла методом перегонки с водяным паром и возможность определения только суммарного содержания тимола и карвакрола.

Известен способ качественного определения тимола с помощью тонкослойной хроматографии (Маркова О.М., Карпенко В.А., Саушкина А.С., Лихота Т.Т. Использование физико-химических методов в анализе лекарственных средств растительного происхождения // Вестник ВГУ. Серия химия, биология, фармация. 2003. №1. С.99-100). Недостатком указанного способа является невозможность количественного определения тимола, громоздкость и длительность эксперимента.

Известны способы определения тимола и карвакрола методом хромато-масс-спектрометрии и газовой хроматографии (Банаева Ю.А., Покровский Л.М., Ткачев А.В. Исследование химического состава эфирного масла представителей рода Thymus L., произрастающих на Алтае // Химия растительного сырья. 1999. №3. С.41-48). Недостатком указанного способа является необходимость большого количества растительного материала, необходимость выделения из растительного материала или их экстрактов эфирного масла методом перегонки с водяным паром, длительность перегонки с водяным паром, длительность анализа, большое количество сопутствующих компонентов эфирного масла и их близкие времена удерживания и вследствие этого трудность идентификации.

Известен способ определения суммарного содержания тимола и карвакрола высокоэффективной жидкостной хроматографией с использованием колонки Силасорб SPH и элюента ацетонитрил - фосфатный буфер (Зенкевич И.Г., Косман В.М., Ткачев К.Г. Некоторые особенности количественного анализа компонентов эфирных масел в высокоэффективной жидкостной хроматографии // Растительные ресурсы. 1999. №1. С.128-137), выбранный в качестве наиболее близкого аналога определения тимола и карвакрола в растительном сырье. Силасорб SPH является немодифицированным силикагелем производства «Lachema» (Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии / Рудаков О.Б., Востров И.А., Федоров С.В. и др. Воронеж: Изд. Водолей, 2004, стр.156). Недостатком указанного способа является невозможность разделения тимола и карвакрола.

В медицине и парфюмерии широко используются Thymus serpillum (тимьян ползучий, чабрец), Thymus vulgaris (тимьян обыкновенный), Origanum vulgare (душица обыкновенная), Ledum palustre (багульник болотный), Ledum decumbens (багульник стелющийся), Ledum hypoleucum (багульник-круп), Ledum macrophyllum (багульник крупнолистный), Paeonia anomala (пион уклоняющийся), Ruta graveolens (рута душистая), Mentha piperita (мята перечная), их экстракты и настойки, а также препараты на их основе (Фармакогнозия. Атлас: Учебн. пособие. М.: Медицина, 1989. 512 с.). Для этих растений и препаратов, изготовленных на их основе, показана антимикробная, противовоспалительная, антинематоцидная и антиоксидантная активность (Фармакогнозия, 1989), обусловленная высоким содержанием тимола и карвакрола (Couladis М., Tzakou О., Kujundzic S., Sokovic M., Mimica N. Chemical analysis and antifungal activity of Thymus striatus // Phytother. Research. 2004. Vol.18, №1. P.40-42; Kahkonen M.P., Hopia A.I., Vuorela H.J. Rauha J.-P, Pihiaja K., Kujala T.S, Heinonen M. Antioxidant activity of plant extracts containing phenolic // J.Agric. Food Chem. 1999. №47. P.3954-3962; Korayem M., Hasabo S., Ameen H. Effects and mode of action of some plant extracts on certain plant parasitic nematodes // J.Pest Science. 1999. Vol.66, №2. P.32-36). Растения одного и того же вида, но собранное в различное время, а также различного хемотипа могут резко отличаться содержанием тимола и карвакрола. Например, для Thymus vulgaris (тимьяна обыкновенного) было показано, что растения, где преобладает тимол и карвакрол, имеют высокую антиоксидантную активность в сравнении с растениями, где преобладает ланолоол (Jukic M., Milos M. Catalytic Oxidation and Antioxidant Properties of Thyme Essential Oils (Thymus vulgarae L.) // Croatica Chemica Acta. 2005. Vol.78, №1. P.105-110).

Задачей, на которую направлено изобретение, является определения тимола и карвакрола в растительном сырье, в экстрактах и настойках растительного сырья.

Применяемый способ позволяет расширить спектр применения, разделить и определить количественное содержание индивидуальных веществ тимола и карвакрола в лекарственном растительном сырье, в экстрактах и настойках растительного сырья, упростить процесс пробоподготовки, уменьшить время анализа и упростить идентификацию веществ.

Технический результат достигается тем, что способ количественного определения тимола и карвакрола при их совместном присутствии в лекарственном растительном сырье, которое предварительно экстрагируют, в экстрактах и настойках растительного сырья, включающий высокоэффективную жидкостную хроматографию, согласно изобретению используют колонку, заполненную силикагелем с привитыми прямыми алкильными группами, число атомов в которых равно шестнадцати (С16), с размером частиц 7 мкм, в качестве подвижной фазы используют раствор метанол - вода при соотношении 62:38 со скоростью подвижной фазы 1 мл /мин, детектирование проводят на УФ-детектере при длине волны 277 нм, с последующим расчетом концентрации тимола и карвакрола по отношению площадей пиков анализируемого и стандартного вещества, в качестве которого используют стандартные расворы тимола и карвакрола соответственно, с учетом его концентрации, объема экстракта, навески сырья или степени разведения исследуемого препарата.

Пример 1.

Контроль. Стандартные растворы тимола и карвакрола с концентрацией 0.001 мг/мл анализировали на колонке размером 250×4.6 мм, заполненной силикагелем с привитыми прямыми алкильными группами, число атомов в которых равно шестнадцати (С16), с размером частиц 7 мкм. В качестве подвижной фазы использовали раствор метанол - вода в различных соотношениях, скорость подвижной фазы 1 мл /мин. Детектирование осуществляли на УФ-детекторе при длине волны 277 нм.

Таблица 1
Элюент	Время удерживания карвакрола, мин	Время удерживания тимола, мин
метанол 100	2.5	2.5
метанол - вода 90:10	3.2	3.2
метанол - вода 70:30	6.8	7.1
метанол - вода 65: 35	8.3	8.9
метанол - вода 62:38	11.0	12.7

Пример 2.

Навеску травы чабреца (ООО «Медицинская компания «Народная медицина»») 0.15 г экстрагировали 10 мл 96%-ного метанола при нагревании на водяной бане при 60°С 30 мин. Экстракт анализировали на колонке размером 250×4.6 мм, заполненной силикагелем с привитыми прямыми алкильными группами, число атомов в которых равно шестнадцати (С16), с размером частиц 7 мкм. В качестве подвижной фазы использовали раствор метанол - вода в соотношении 62:38 (по объему), скорость подвижной фазы 1 мл /мин. Детектирование осуществляли на УФ-детекторе при длине волны 277 нм. Карвакрол в экстракте травы чабреца не детектировался. Время удерживания тимола составляет 12.7 мин. Количественного содержание тимола в траве чабреца (мг/г) рассчитывали по формуле:

где S₁ - значение площади пика тимола в экстракте исследуемого образца травы чабреца;

c₀ - концентрация стандартного раствора карвакрола, мг/мл;

V - объем 96%-ного метанола, в котором экстрагировали навеску травы чабреца, в данном примере равен 10 мл;

S₀ - значение площади пика тимола стандартного раствора;

m - навеска травы чабреца, в данном примере равна 0.15 г.

Содержание тимола в траве чабреца составляет 0.08 мг/г.

Пример 3.

Навеску травы чабреца (ООО «Медицинская компания «Народная медицина»») 0.15 г экстрагировали 10 мл 96%-ного метанола при нагревании на водяной бане при 60°С 30 мин. Экстракт травы чабреца перед анализом предварительно очищали на концентрирующем патроне Диапак С16 (АО «Биохиммак», Россия). К 1 мл экстракта добавляли 3 мл воды, отбирали аликвоту 1 мл и пропускали через концентрирующий патрон Диапак С16 (АО «Биохиммак», Россия), предварительно активированный метанолом и промытый дистиллированной водой. Затем патрон промывали последовательно 1 мл воды и 1 мл метанола. Фракцию, полученную при элюировании метанолом, анализировали на колонке размером 250×4.6 мм, заполненной силикагелем с привитыми прямьми алкильными группами, число атомов в которых равно шестнадцати (С16), с размером частиц 7 мкм. В качестве подвижной фазы использовали раствор метанол - вода в соотношении 62:38 (по объему), скорость подвижной фазы 1 мл/мин. Детектирование осуществляли на УФ-детекторе при длине волны 277 нм. Карвакрол в экстракте травы тимьяна ползучего не детектировался. Количественного содержание тимола в траве чабреца (мг/г) рассчитывали по формуле:

где S₁ - значение площади пика тимола в экстракте исследуемого образца травы чабреца;

с₀ - концентрация стандартного раствора карвакрола, мг/мл;

V - объем 96%-ного метанола, в котором экстрагировали навеску травы чабреца, в данном примере равен 10 мл;

n - разбавление экстракта перед очисткой на концентрирующем патроне, равно 4;

S₀ - значение площади пика тимола стандартного раствора;

m - навеска травы чабреца, в данном примере равна 0.15 г.

Содержание тимола в траве чабреца составляет 0.08 мг/г.

Пример 4.

Препарат «Пиносол» (Zentiva, Словацкая Республика) - комбинированный препарат растительного происхождения, содержащий 0.0032 г тимола в 10 мл препарата (0.32 мг/мл), а также масло сосны обыкновенной, масло мяты перечной и масло эвкалипта. К 0.1 мл пиносола добавляли 9.9 мл метанола и нагревали на водяной бане при 60°С 30 мин. Отбирали 1 мл пробы и добавляли 3 мл воды. Аликвоту 1 мл пропускали через концентрирующий патрон Диапак С16 (АО «Биохиммак», Россия), предварительно активированный метанолом и промытый дистиллированной водой. Затем патрон промывали последовательно 1 мл воды и 1 мл метанола. Фракцию, полученную при элюировании метанолом, анализировали на колонке размером 250×4.6 мм, заполненной силикагелем с привитыми прямыми алкильными группами, число атомов в которых равно шестнадцати (С16), с размером частиц 7 мкм. В качестве подвижной фазы использовали раствор метанол - вода в соотношении 62:38 (по объему), скорость подвижной фазы 1 мл/мин. Детектирование осуществляли на УФ-детекторе при длине волны 277 нм. Время удерживания карвакрола составляет 11.0 мин, тимола - 12.7 мин. Концентрацию карвакрола (мг/мл) в препарате «Пиносол» рассчитывали по формуле:

где S₁ - значение площади пика карвакрола исследуемого раствора;

c₀ - концентрация стандартного раствора карвакрола, мг/мл;

n₁ - разбавление препарата, в данном примере равно 10;

n₂ - разбавление перед очисткой на концентрирующем патроне, равно 4;

S₀ - значение площади пика карвакрола стандартного раствора.

Концентрация карвакрола в препарате «Пиносол» составляет 0.029 мг/мл.

Концентрацию тимола (мг/мл) в препарате «Пиносол» рассчитывали по формуле:

где S₁ - значение площади пика тимола исследуемого раствора;

c₀ - концентрация стандартного раствора тимола, мг/мл;

n₁ - разбавление препарата, в данном примере равно 10;

n₂ - разбавление перед очисткой на концентрирующем патроне, равно 4;

S₀ - значение площадей пиков тимола стандартного раствора.

Содержание тимола в препарате «Пиносол» составляет 0.420 мг/мл.

Пример 5.

Препарат «Пертуссин» (ЗАО «Эколаб») - препарат растительного происхождения, содержащий 12 г экстракта чабреца жидкого или экстракт тимьяна жидкого в 100 мл препарата. К 1 мл препарата «Пертуссин» добавляли 3 мл воды, отбирали аликвоту 1 мл и пропускали через концентрирующий патрон с Диапак С 16 (АО «Биохиммак», Россия), предварительно активированный метанолом и промытый дистиллированной водой. Затем патрон промывали последовательно 1 мл воды и 1 мл метанола. Фракцию, полученную при элюировании метанолом, анализировали на колонке размером 250×4.6 мм, заполненной силикагелем с привитыми прямыми алкильными группами, число атомов в которых равно шестнадцати (С16), с размером частиц 7 мкм. В качестве подвижной фазы использовали раствор метанол - вода в соотношении 62:38 (по объему), скорость подвижной фазы 1 мл/мин. Детектирование осуществляли на УФ-детекторе при длине волны 277 нм. Время удерживания карвакрола составляет 11.0 мин. Тимол не детектировался. Концентрацию карвакрола (мг/мл) в препарате «Пертуссин» рассчитывали по формуле:

,

где S₁ - значение площади пика карвакрола исследуемого раствора;

c₀ - концентрация стандартного раствора карвакрола, мг/мл;

n - разбавление перед очисткой на концентрирующем патроне, равно 4;

S₀ - значение площади пика карвакрола стандартного раствора.

Концентрация карвакрола (мг/мл) в препарате «Пертуссин» составляет 0.0015 мг/мл.

Пример 6.

Навеску побегов багульника болотного (ЗАО «Фирма «Здоровье»») 0.15 г экстрагировали 10 мл 96%-ного метанола при нагревании на водяной бане при 60°С 30 мин. Экстракт фильтровали и анализировали на колонке размером 250×4.6 мм, заполненной силикагелем с привитыми прямыми алкильными группами, число атомов в которых равно шестнадцати (С-16), с размером частиц 7 мкм. В качестве подвижной фазы использовали раствор метанол - вода в соотношении 62:38 (по объему), скорость подвижной фазы 1 мл /мин. Детектирование осуществляли на УФ-детекторе при длине волны 277 нм. Карвакрол не детектировался. Время удерживания тимола составляет 12.7 мин. Количественное содержание тимола в побегах багульника болотного рассчитывали аналогично примеру 2. Содержание тимола в побегах багульника болотного составляет 0.156 мг/г.

Пример 7.

Навеску травы душицы (OOO «Медицинская компания «Народная медицина»») 0.15 г экстрагировали 10 мл 96%-ного метанола при нагревании на водяной бане при 60°С 30 мин. Экстракт фильтровали и анализировали на колонке размером 250×4.6 мм, заполненной силикагелем с привитыми прямыми алкильными группами, число атомов в которых равно шестнадцати (С16), с размером частиц 7 мкм. В качестве подвижной фазы использовали раствор метанол - вода в соотношении 62:38 (по объему), скорость подвижной фазы 1 мл/мин. Детектирование осуществляли на УФ-детекторе при длине волны 277 нм. Время удерживания карвакрола составляет 11.0 мин, тимола - 12.7 мин. Количественное содержание карвакрола и тимола в траве душицы рассчитывали аналогично примеру 2. Содержание карвакрола в траве душицы составляет 0.035 мг/г. Содержание тимола в траве душицы составляет 0.132 мг/г.

Пример 8.

Навеску листьев мяты перечной (000 «Медицинская компания «Народная медицина»») 0.15 г экстрагировали 10 мл 96%-ного метанола при нагревании на водяной бане при 60°С 30 мин. Экстракт фильтровали и анализировали на колонке размером 250×4.6 мм, заполненной силикагелем с привитыми прямыми алкильными группами, число атомов в которых равно шестнадцати (С16), с размером частиц 7 мкм. В качестве подвижной фазы использовали раствор метанол - вода в соотношении 62:38 (по объему), скорость подвижной фазы 1 мл /мин. Детектирование осуществляли на УФ-детекторе при длине волны 277 нм. Время удерживания карвакрола составляет 11.0 мин, тимола - 12.7 мин. Количественное содержание карвакрола и тимола в листьях мяты перечной рассчитывали аналогично примеру 2. Содержание карвакрола в листьях мяты перечной составляет 0.093 мг/г. Содержание тимола в листьях мяты перечной составляет 0.110 мг/г.

Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет определить количественно содержание тимола и карвакрола в лекарственном растительном сырье, в экстрактах и настойках растительного сырья.

Способ количественного определения тимола и карвакрола при их совместном присутствии в лекарственном растительном сырье, которое предварительно экстрагируют, в экстрактах и настойках растительного сырья, включающий высокоэффективную жидкостную хроматографию, отличающийся тем, что используют колонку, заполненную силикагелем с привитыми прямыми алкильными группами, число атомов в которых равно шестнадцати (С16), с размером частиц 7 мкм, в качестве подвижной фазы используют раствор метанол - вода при соотношении 62:38 со скоростью подвижной фазы 1 мл/мин, детектированием на УФ-детекторе при длине волны 277 нм, с последующим расчетом концентрации тимола и карвакрола по отношению площадей пиков анализируемого и стандартного вещества, в качестве которого используют стандартные растворы тимола и карвакрола соответственно, с учетом его концентрации, объема экстракта, навески сырья или степени разведения исследуемого препарата.