Применение производных эфиров янтарной кислоты для лечения деменции

Настоящее изобретение относится к области лекарственных средств, в частности к применению этанольного экстракта, полученного из высушенного корневища Пололепестника зеленого (Wangla, Coeloglossum viride (L) Hartm. Var. Bracteatum (Wild.) Richter), производных эфиров янтарной кислоты формулы:

где R₁ и R₄ выбраны из -ОСН₃, -ОН, -OGlu,

и R₂ и R₃ выбраны из H, -OH, -OGlu, и

R₅ выбран из неразветвленных или разветвленных C_1-6 алкилов, для лечения деменции, в частности, для лечения болезни Альцгеймера и сосудистой деменции. Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим указанный экстракт или соединения. Указанные экстракт и композиция обладают высокой активностью, низкой токсичностью. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 4 ил., 9 табл.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к использованию экстракта корневища Пололепестника зеленого (Wangla, Coeloglossum viride (L) Hartm. Var. Bracteatum (Willd.) Richter), который содержит производные эфиров янтарной кислоты, а также синтетических производных эфиров янтарной кислоты и их фармацевтически приемлемых солей в производстве фармацевтических препаратов для лечения деменции, в частности для лечения болезни Альцгеймера и сосудистой деменции.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В настоящее время средняя продолжительность жизни в Китае превышает 70 лет. Согласно прогнозам зарубежных научных исследований, к 2025 году 18,8% населения будет старше 65 лет. Эти данные показывают, что через 20 лет на каждые 5 человек будет приходиться один пожилой человек. Болезнь Альцгеймера, как правило, развивается у людей старше 50 лет. Мультиинфарктная деменция или старческая деменция, возникающая из-за патологических изменений сосудов головного мозга, появляется у людей старше 60 лет. Поскольку население в мире становится старше, доля больных болезнью Альцгеймера и старческой деменцией, как ожидается, будет возрастать. Старение и специфические дегенеративные неврологические заболевания, т.е. различные виды деменции, приводят человека к смерти двух видов: вначале духовной и затем физической. Это не только приносит страдания пациентам, но и возлагает бремя на их семьи и общество. Полагают, что старение народонаселения является неблагоприятным фактором, которое наносит удар по общественному развитию и стабильности, и уступает в этом отношении только войнам, эпидемиям, голоду и сокращению природных ресурсов.

Деменция представляет собой приобретенный и прогрессирующий синдром затрудненности мышления, вызванный затрудненностью деятельности мозга, который включает уменьшение познавательной способности, нарушения памяти, речи, мышления, поведения, а также аномалии личности. Основными разновидностями деменции являются болезнь Альцгеймера, сосудистая деменция и т.д. Патологические изменения, связанные с болезнью Альцгеймера, включают образование старческих бляшек, в основном состоящих из компонента, называемого Aβ (β-амилоидного пептида), гибель холинергических нейронов, отложение Aβ эндотелиоцитах кровеносных сосудов и т.д. Сосудистая деменция вызывается заболеваниями сосудов мозга, в основном ишемией. Патологические изменения включают синдром множественных провалов сознания или широкомасштабные инфарктные и атеросклеротические изменения. Исследования последнего времени показывают, что сосудистые факторы принимают участие в процессе старческой деменции, причем недостаток кровотока в головном мозге является фактором наибольшего риска.

Существует много разновидностей лекарств для профилактики, замедления развития и лечения старческой деменции. В настоящее время наиболее распространенными из клинически применяемых лечебных средств являются холинергические препараты и ингибиторы холинэстеразы (ChEI), сопровождаемые вспомогательным лечением, нацеленным на улучшение циркуляции в сосудах мозга и защиту мозга, тем не менее, результативность является ограниченной. Из лекарств, улучшающих работу холинергической системы, только предшественник Ach демонстрирует умеренный терапевтический эффект. Хотя агонисты рецептора Ach и ChEI оказывают определенное воздействие, его продолжительность слишком коротка и побочные эффекты относительно велики. Лекарства, вызывающие расширение сосудов головного мозга, способствуют поступлению энергии и улучшению интеллектуального состояния за счет улучшения кровоснабжения мозга, но действительно эффективные препараты для расширения сосудов головного мозга должны иметь высокую селективность, в то же время они не должны влиять на обменные процессы в головном мозге и «воровать кровь», кроме этого они должны обладать антиагрегирующим воздействием на тромбоциты крови и препятствуют образованию тромбов. Нимодипин, являющийся антагонистом кальция, удовлетворяет некоторым из перечисленных критериев, но он действует только на открываемый напряжением канал Ca²⁺ L-типа и не воздействует на каналы Ca²⁺ N-типа и T-типа. Полагали, что некоторые нейропептиды и NGF являются перспективными для лечения деменции, но результаты их клинических испытаний оказались удручающими, в первую очередь в отношении того, что они с трудом проникают через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что влияет на их активность в головном мозге. С тех пор как началось применение 2-пирролидон ацетамида (торговое название Пирацетам) в первоначальных сообщениях не было сомнения, что он представляет собой новое ноотропное средство. Как сообщается в последнее время в нашей стране и за рубежом, он обладает умеренным воздействием или не действует на все виды ухудшения памяти и старческой деменции. Он является водорастворимым веществом, плохо проникает через BBB, и ему сложно сконцентрироваться в целевой области, чтобы оказать должное воздействие.

Пололепестник зеленый (Coeloglossum viride (L) Hartm. Var. Bracteatum (Willd.) Richter) широко распространен на западе Китая, в таких районах как Тибет, Внутренняя Монголия, Шанкси, Гансу, Квингхай и т.д. Сушеное корневище Пололепестника зеленого (Coeloglossum viride (L) Hartm. Var. Bracteatum) представляет собой известное Тибетское лекарственное средство, именуемое Вангла и имеющее продолжительную историю использования в небольшой части западных районов Китая. Показания к употреблению были многочисленными, как, например, придание жизненной энергии, содействие выработке жидкостей тела, успокоение и улучшение интеллекта.

В ходе предварительного наблюдения за биологической активностью данного растения авторы обнаружили, что этанольный экстракт корневища растения обладает предпочтительной активностью с точки зрения улучшения интеллекта, успокоения и борьбы с усталостью, причем он устойчиво воздействует на эти симптомы. На основании этих результатов авторы систематически исследовали химический состав и биологическую активность этого растения, причем были выделены и идентифицированы несколько производных моно- и диэфиров янтарной кислоты. Химические вещества, входящие в состав Пололепестника зеленого были описаны авторами изобретения, но данные о биологической активности экстракта и очищенных соединений не публиковались (см.: Huang Sheng-Yang, Shi Jian-Gong, Yang Yun-Chun, Hu Shi-lin, Studies on the Chemical Constituents of Coeloglossu viride (L.) Harm. var. bracteatum (Willd.) Richter., Acta Pharmaceutica Sinica, 2002, 37(3), 199-203; Sheng Yang HUANG, Jian Gong SHI, Yong Chun YANG, Shi Lin HU. Two new isobutyltartrate monoesters from Coeloglossum viride (L.) Hartm. var. bracteatum (Willd.) Richter. Chinese Chemical Letters, 2002, 13(6):551-554.)

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для преодоления недостатков уровня техники цель настоящего изобретения заключается в разработке способа лечения деменции, в частности лечения болезни Альцгеймера и сосудистой деменции путем применения экстракта корневища Пололепестника зеленого, содержащего производные эфиров янтарной кислоты, а также синтетических производных эфиров янтарной кислоты, определенных формулой I.

Другая цель настоящего изобретения состоит в разработке фармацевтической композиции, которая содержит производные эфиров янтарной кислоты формулы (I) в качестве активного ингредиента, а также фармацевтически приемлемый носитель.

Соединения по настоящему изобретению включают производные упомянутых эфиров, их стереоизомеры и фармацевтически приемлемые соли.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способа применения экстракта Пололепестника зеленого в производстве лекарственного средства для лечения деменции, в особенности, для лечения болезни Альцгеймера и сосудистой деменции.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в разработке фармацевтической композиции, содержащей экстракт Пололепестника зеленого в качестве активного ингредиента, а также фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение в особенности относится к соединениям формулы (I).

в которых

R₁ и R₄ выбраны из -OCH₃, -OH, -OGlu, и

R₂ и R₃ выбраны из H, -OH, -OGlu, и

R₅ выбран из неразветвленных или разветвленных C_1-6 алкилов, предпочтительно из метила, этила, пропила, изопропила, н-бутила, изопропила, трет-бутила, более предпочтительно, из изопропила трет-бутила и изобутила.

Хиральные центры C-2 и C-3 имеют следующую конфигурацию 2R3S, 2R3R, 2S3S и 2S3R соответственно.

Предпочтительные структуры для достижения целей настоящего изобретения включают, не ограничиваясь перечисленными,

1-(4-β-D-глюкопиранозилоксибензил)-2-изобутилтартрат (целоверин А) (W1)

4-(4-β-D-глюкопиранозилоксибензил)-2-изобутилтартрат (целоверин B) (W2)

1-(4-β-D-глюкопиранозилоксибензил)-2-β-D-глюкопиранозил-2-изобутилтартрат (целоверин С) (W3)

4-(4-β-D-глюкопиранозилоксибензил)-2-β-D-глюкопиранозил-2-изобутилтартрат (целоверин D) (W4)

2-β-D-глюкопиранозил-2-изобутилтартрат (W5)

1,4-бис(β-D-глюкопиранозилоксибензил)-2-β-D-глюкопиранозил-2-изобутилтартрат (дактилорин B) (W6)

1,4-бис(β-D-глюкопиранозилоксибензил)-2-изобутилтартрат (лороглоссин) (W7)

1,4-бис(β-D-глюкопиранозилоксибензил)-2-β-D-глюкопиранозил-2-изобутилмалат (дактилорин A) (W8)

1,4-бис(β-D-глюкопиранозилоксибензил)-2-гидрокси-2-изобутилмалат (милитарин) (W9)

1,4-бис(β-D-глюкопиранозилоксибензил)-2-гидрокси-2-(бутан-2-ил)малат (W10)

1-(β-D-глюкопиранозилоксибензил)-2-гидрокси-2-изопропилмалат метиловый эфир (W11)

1,4-бис(β-D-глюкопиранозилоксибензил)-2-β-D-глюкопиранозил-2-изопропилмалат (W12)

1-β-D-глюкопиранозилоксибензил-2-β-D-глюкопиранозил-2-изобутилмалат (W13)

1,4-бис(β-D-глюкопиранозилоксибензил)-2-β-D-глюкопиранозил-2-изобутилмалат (W14)

При тестировании на животных в отношении вызванного скополамином понижения познавательных способностей, лечение экстрактом и соединениями по настоящему изобретению в очень низкой дозировке способно значительно продлить время ожидания в тесте на спуск с безопасной платформы и уменьшить число ошибок за сеанс испытаний. Эти результаты показывают, что экстракт и соединения по настоящему изобретению могут эффективно улучшать ситуацию при вызванном скополамином понижении познавательной способности у мышей.

ICV инъекция Aβ (1-42) ослабила способность к обучению и функции памяти, но лечение мышей и крыс экстрактом и соединениями по настоящему изобретению в значительной степени блокировало вызванное Aβ (1-42) ухудшение действий по пассивному избеганию опасности, а также значительно улучшило вызванное Aβ (1-42) ухудшение пространственной памяти. Эти данные наводят на мысль, что экстракт и соединения по настоящему изобретению могут иметь профилактический эффект в отношении связанного с Aβ ухудшения памяти при болезни Альцгеймера.

Хорошо известно, что хроническая церебральная гипоперфузия у животных, вызванная постоянной непроходимостью двусторонних общих сонных артерий, связана с изменениями в поведении и гистопатологическими изменениями. Церебральная гипоперфузия у мышей и крыс вызывает недостаточную память и способность к обучению. Долговременное лечение экстрактом и соединениями по настоящему изобретению в значительной степени смягчает эти изменения в поведенческих тестах (тест на спуск с безопасной платформы и тест в водном лабиринте). Наши данные говорят о благотворной роли экстракта и соединений по настоящему изобретению при состояниях цереброваскулярной недостаточности и деменции.

Тест с циклогексимидом (ингибитором синтеза белка) моделирует деменцию у мышей, причем экстракт и соединения по настоящему изобретению в значительной степени обращают вызванное циклогексимидом понижение времени ожидания в тесте на спуск с безопасной платформы и понижают число ошибок в сеансе тестирования. Эти результаты показывают, что экстракт и соединения по настоящему изобретению могут улучшить вызванное циклогексимидом ухудшение пассивного избегания опасности, и повышают способность к обучению и характеристики памяти у мышей.

При исследовании влияния экстракта по настоящему изобретению на память обыкновенной мыши, авторы обнаружили, что лечение данным экстрактом сокращает время ожидания спасения мыши в тесте с водным лабиринтом и значительно снижает количество ошибок. Этот результат показывает, что экстракт по настоящему изобретению может улучшать способность к обучению и память у обычных мышей.

В эксперименте по определению активности ацетилхолинэстеразы (AChE) in vivo авторы обнаружили, что введение мышам и крысам однократной дозы или многократных доз экстракта и соединений по настоящему изобретению не производит ингибирующего воздействия на активность AChE в головном мозге животного. Это показывает, что механизм позитивного воздействия экстракта и соединений по настоящему изобретению на познавательную деятельность животного не опосредуется антихолинэстеразным путем.

Результат исследования кратковременного токсического воздействия на мышей показал, что не наблюдалось существенной разницы в поведении, и не было зафиксировано смертельных случаев и случаев роста массы тела у нормальных мышей после перорального однократного введения экстракта или соединений по настоящему изобретению в количестве 5 г/кг. Это означает, что экстракт или соединения по настоящему изобретению обладают очень низкой токсичностью в отношении мышей.

Фармакологические исследования показывают, что экстракт или соединения по настоящему изобретению обладают эффективностью при лечении деменции, в частности болезни Альцгеймера и сосудистой деменции, а также умеренного снижения познавательной способности на ранней стадии деменции, снижения умственных способностей, амнезии и т.п. Помимо этого экстракт и соединения по настоящему изобретению обладают очень низкой токсичностью, высокой безопасностью и не оказывают ингибирующего действия на активность AChE в головном мозге животного.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, полученной путем смешения любого из экстрактов и соединений по настоящему изобретению, которые используются в качестве активного ингредиента, а также обычно используемых лекарственных наполнителей и/или добавок. Как правило, фармацевтическая композиция содержит от 0,1% до 95% экстракта или соединений по настоящему изобретению.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть изготовлена в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники. Для данной цели, если это необходимо, экстракт или любое из соединений по настоящему изобретению могут быть смешаны с одним или несколькими обычно используемыми лекарственными наполнителями и/или добавками в форме жидких или твердых веществ. Композиция может быть разработана в форме, пригодной для введения человеку и для ветеринарного применения.

Экстракт или соединения по настоящему изобретению или фармацевтические композиции на их основе могут быть представлены в виде разовых дозированных форм. Соединения могут вводиться различными путями, в т.ч. перорально, ректально, чрескожно, внутрибрюшинно, подкожно, внутривенно, внутримышечно, через слизистую оболочку ротовой полости и интраназально. Предпочтительным является пероральное введение.

Экстракт или соединения по настоящему изобретению, или фармацевтические композиции на их основе могут вводиться с помощью инъекции, как, например, внутривенной, внутримышечной, подкожной и внутрикожной инъекции.

Экстракт и соединения по настоящему изобретению могут быть представлены в виде жидкой или твердой лекарственной формы. Что касается жидкой формы, то она может представлять собой истинный раствор, коллоидный раствор, микрочастицы, эмульсию или суспензию. Другие лекарственные формы могут представлять собой таблетки, капсулы, капли, пилюли, аэрозоли, порошки, растворы, суспензии, эмульсии, частицы, суппозитории, а также порошки для инъекций, высушенные заморозкой. Экстракт или композиции по настоящему изобретению могут быть включены в обычные фармацевтические составы, составы замедленного высвобождения, составы регулируемого высвобождения, целевые составы или различные системы на основе микрочастиц.

Для получения твердых лекарственных форм, таких как таблетки, могут применяться различные носители, хорошо известные из уровня техники. Отдельные примеры подходящих носителей включают: разбавители и абсорбенты, такие как крахмал, декстрин, сульфат кальция, лактоза, маннит, сахароза, хлорид натрия, глюкоза, мочевина, карбонат кальция, каолин, микрокристаллическая целлюлоза, силикат алюминия; средства для смачивания и связующие средства, такие как вода, глицерин, полиэтиленгликоль, этанол, пропанол, крахмальный клейстер, декстрин, сироп, мед, раствор глюкозы, гуммиарабик, желатиновый клей, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, lakh, метилцеллюлоза, фосфат калия и поливинилпирролидон; разрыхлители, такие как сухой крахмал, альгинаты, агароза, ламинария, бикарбонат натрия, лимонная кислота, карбонат кальция, эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, додецилсульфат натрия, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза; средства для затруднения дезинтеграции, такие как сахароза, тристеарин, масло какао, гидрогенизированное растительное масло; ускорители всасывания, такие как четвертичные аммониевые соли, лаурилсульфат натрия; смазывающие средства, такие как тальк, силикагель, кукурузный крахмал, стеараты, борная кислота, жидкий вазелин, полиэтиленгликоль. Таблетки по настоящему изобретению могут иметь покрытие, такое как покрытие из сахара, покрытие в виде пленки, покрытие, растворимое в кишечнике, кроме этого таблетки могут иметь двухслойное или многослойное покрытие.

Для изготовления пилюль могут применяться различные носители, очень хорошо известные из уровня техники. Примерами таких носителей являются разбавители и абсорбенты, такие как глюкоза, лактоза, крахмал, масло какао, гидрогенизированное растительное масло, поливинилпирролидон, Gelucire, каолин, тальк; связующие вещества, такие как гуммиарабик, смола трагаканта, желатин, этанол, мед, жидкий сахар, рисовый клей или мучной клей; разрыхлители, такие как порошок агарозы, сухой крахмал, альгинаты, додецилсульфат натрия, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза.

Для изготовления капсул экстракт или соединение по настоящему изобретению смешивают с различными носителями, упомянутыми выше, и помещают полученную смесь в твердую или мягкую желатиновую капсулу. Кроме этого, соединения по настоящему изобретению могут быть получены в виде микрокапсул, которые взвешены в водной среде в виде суспензии, заключены в твердые капсулы или могут применяться в инъекциях.

Например, экстракт или соединение по настоящему изобретению могут быть получены в виде состава, пригодного для инъекции, такого как раствор, суспензия, эмульсия и порошок, высушенный при замораживании. Такие составы могут быть водными или не водными, и могут содержать один и/или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей, связующих веществ, смазывающих средств, консервантов, поверхностно-активных веществ или средств для облегчения диспергирования. Разбавитель может быть выбран из воды, этанола, полиэтиленгликоля, 1,3-пропанола, этоксипроизводных стеарилового спирта, полиоксиизостеарилового спирта, полиоксиэтиленсорбитановой жирной кислоты и т.п.

Кроме этого, для приготовления изотонических инъекций, в состав, пригодный для инъекции, может быть добавлено соответствующее количество NaCl, глюкозы или глицерина. Также могут быть добавлены стандартные дополнительные растворители, буферные растворы, средства для регулирования pH и т.п. Эти добавки часто используются в данной области техники.

Для специалиста в данной области очевидно, что терапевтически эффективная доза действующих соединений по настоящему изобретению или фармацевтических композиций на их основе будет зависеть от различных факторов, таких как, например, характер и тяжесть заболевания, которое подвергается лечению, пол, возраст, вес, индивидуальные характеристики и индивидуальная реакция пациента или животного, способ и частота введения лекарственного средства и цели лечения. Следовательно, терапевтическая доза по настоящему изобретению может существенно изменяться. В целом, специалист в данной области техники может легко определить дозы, которые следует вводить. При применении растворимого экстракта или соединений по настоящему изобретению терапевтически эффективные дозы охватывают диапазон от, приблизительно от 0,001 приблизительно до 150 мг активного ингредиента /кг/день, предпочтительно, от 0,01 приблизительно до 100 мг/кг/день, в особенности приблизительно от 0,01 приблизительно до 60 мг/кг/день и, еще более предпочтительно, приблизительно от 0,1 приблизительно до 10 мг/кг/день.

Общая суточная доза может быть введена за один прием, или в виде отдельных доз два, три или четыре раза в течение суток. Однако следует понимать, что количество в действительности вводимого соединения будет определяться врачом в соответствии с его клиническим опытом, а также другими видами терапии, которые применяются одновременно.

Общая доза каждого из медикаментов может быть введена за один прием или разделена на несколько раз. Экстракт, соединения, а также любые фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут применяться индивидуально или в сочетании с другими терапевтическими средствами в измененной соответствующим образом дозировке.

Соединения по настоящему изобретению присутствуют в следующих 6 родах семейства орхидных Coeloglossum, Galeola, Gastrodia, Loroglossum, Orchis, Vanda (см. таблицу).

Соединения, выделенные из растений семейства орхидных и включенные в настоящее изобретение

№	Соединения	Молекулярная формула	Молекулярная масса	Растительный источник*
1	W1	C21H30O12	474	a
2	W2	C21H30O12	474	a
3	W3	C27H40O17	636	a
4	W4	C27H40O17	636	a
5	W7	C34H46O18	742	a, f, g, h
6	W6	C40H56O23	904	a, f
7	W13	C27H40O16	620	a, f
8	W11	C21H30O11	458	c
9	W12	C33H44O17	712	b, c
10	W10	C34H46O17	726	b
11	W9	C34H46O17	726	f, g
12	W14	C40H56O25	888	f
* a: Coeloglossum viride; b: Galeola faberi; c: Galeola septentrionalis; d: Gastrodia elata; e:Loroglossum hircinum; f:Orchis latifolia; g:Orchis militaris; h: Orchis papilionacea

ПОЯСНЕНИЯ К ЧЕРТЕЖАМ

Фиг.1а и 1б: Схема экстракции и выделения из Пололепестника зеленого (Wangla).

Фиг.2: Посуточное отображение времени, которое необходимо мыши для достижения целевой области.

Фиг.3: Посуточное отображение количества ошибок мыши.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры служат для иллюстрации настоящего изобретения, но они не означают какого бы то ни было ограничения изобретения.

CE: Эффективно действующая фракция, экстрагированная из Пололепестника зеленого (Wangla);

W6, W7, W8, W9: эффективные компоненты, выделенные из CE.

Пример получения. Получение экстракта и соединения по настоящему изобретению.

Высушенные на воздухе корневища Пололепестника зеленого (Coeloglossum viride (L) Hartm. Var. Bracteatum (Willd.) Richter) (5 кг) три раза экстрагируют восьмикратным объемом 95% EtOH при нагревании, фильтруют, фильтраты объединяют, затем растворитель удаляют при пониженном давлении и получают остаток (220 г). Остаток суспендируют в воде и затем распределяют между водой и EtOAc. Водную фазу подвергают колоночной хроматографии на крупнопористой смоле последовательно элюируя водой, 20%, 40% и 80% EtOH в H₂O. Элюат, образованный 20% и 40% растворами EtOH, концентрируют и получают остаток (29 г), который затем подвергают хроматографической очистке над силикагелем с обращенной фазой RP-18, причем осуществляют элюирование с постепенным увеличением содержания MeOH в H₂O (0-60%), и получают несколько фракций, как показывает анализ с помощью TLC (тонкослойная хроматография). В дальнейшем эти фракции очищают перекристаллизацией, хроматографией на силикагеле, Sephadex LH 20, препаративной обращено-фазовой ВЭЖХ и получают соединения W1 (70 мг), W2 (95 мг), W3 (85 мг), W4 (173 мг), W5 (65 мг), W6 (4,2 г), W7 (4,8 г), W8 (3,4 г) и W9 (1,2 г). Схема методики выделения изображена на фиг.1.

Фармакологические эксперименты:

Пример 1: Влияние CE и соединений W6, W7, W8, W9 на вызванное скополамином ухудшение выполнения задачи по пассивному избеганию.

Цели исследования:

Было показано, что скополамин, т.е. антагонист мускаринового холинергического рецептора, снижает способность к запоминанию, если дать его мыши вскоре после обучения в задаче по пассивному избеганию опасности, причем тест, основанный на скополаминовой амнезии, широко используется в качестве способа первичного отбора для т.н. лекарственных средств против болезни Альцгеймера. Настоящее исследование было разработано для того, чтобы с помощью задачи на пассивное избегание (теста на спуск с безопасной платформы) выяснить, могут ли CE и W6-W9 корректировать вызванное скополамином ухудшение памяти у мышей.

Методика:

Используют самцов мыши ICR весом 24-28 г. Перед экспериментом мышей расселяют для привыкания на срок 2 дня. Мышей случайным образом разбивают на группы (n=20).

С помощью принудительного питания мышам вводят физиологический солевой раствор или лекарства в различных дозах, соответственно, в отрицательной контрольной группе, скополаминовой группе и группах для тестирования лекарственных средств, дважды в день в течение 2 дней.

На третий день, через 30 минут после введения тестовых препаратов, мышам, за исключением контрольной группы, вводят скополамин (1 мг/кг в/б).

Через 30 минут каждую мышь по отдельности помещают на безопасную платформу в ящик аппарата для теста на спуск. Когда мышь спускается с платформы и касается сетчатого пола, она получает электрический удар напряжением 36 вольт и прыгает обратно на резиновую платформу. Каждую особь тренируют в течение 5 минут и возвращают в ее клетку.

Через 24 часа после обучающего испытания животное вновь помещают на платформу и измеряют время ожидания до спуска с платформы и количество зафиксированных спусков (число ошибок) в течение 5 минут. Результаты показаны в таблице 1.

Результат:

Тест на спуск показывает, что время ожидания в группе мышей, которым введен скополамин, значительно снижается по сравнению с контрольной группой, а число ошибок в течение 5 минут значительно увеличивается. Было показано, что при дозе 1 мг/кг скополамин может ухудшить способность к обучению и память у животных. Лечение CE, W6, W7, W8 и W9 сдерживает снижение времени ожидания спуска и уменьшает число ошибок в течение времени тестирования, т.е. параметров, ухудшившихся за счет вызванного скополамином ослабления поведения в отношении пассивного избегания. Эти данные показывают, что все испытанные препараты CE, W6, W7, W8 и W9 могут улучшить вызванное скополамином снижение результатов по пассивному избеганию.

Таблица 1
Воздействие CE и W6-W9 на вызванное скополамином ухудшение выполнения мышами задач по пассивному избеганию
Группа	Доза (мг/кг)	Время ожидания (c)	Число ошибок
Контрольная		266±20	0,2±0,1
Скополаминовая		147±32#	1,7±0,4##
CE	2,5	218±19*	0,2±0,1**
	5	245±22*	0,4±0,2*
10	280±27**	0,6±0,2*
W6	0,03	283±38**	0,2±0,1**
	0,3	259±34*	0,4±0,2*
3	258±17*	0,3±0,1*
W7	0,25	205±142	0,4±0,7*
1	237±125*	0,2±0,4**
W8	0,25	197±144	0,7±0,9
1	218±127*	0,3±0,5*
W9	0,25	140±129	0,8±0,7
1	210±134*	0,4±0,5*

Данные представлены в виде: среднее значение ± стандартная ошибка среднего для каждой группы n=20. #: P (функция распределения) <0,05, ##: P<0,01 по сравнению с контрольной группой; *: P<0,05, **: P<0,01 по сравнению с группой, которой вводят только скополамин.

Пример 2: Воздействие CE и W6 на вызванное циклогексимидом (CHX) ухудшение выполнения задач по пассивному избеганию.

Цель исследования:

Циклогексимид является ингибитором синтеза белка. Он может ухудшать выполнение подопытными животными большого количества задач на обучение и память, включая пассивное избегание опасности. В данном эксперименте проводят исследование влияния W6 и CE на вызванное циклогексимидом ухудшение памяти в задаче на пассивное избегание.

Методика:

Случайный отбор особей и введение лекарственных препаратов проводят аналогично предыдущему. Мышам, за исключением контрольной группы, вводят циклогексимид (120 мг/кг в/б). Через 30 минут каждую мышь по отдельности помещают на платформу прибора для теста на спуск и тренируют в течение 5 минут. Тест на запоминание проводят спустя 24 часа, причем фиксируют время ожидания спуска и количество спусков (число ошибок) в течение 5 минут.

Результаты:

При введении циклогексимида (120 мг/кг в/б) перед тренировочным периодом приобретение навыков существенно затрудняется. CE и W6 в значительной степени обращают вызванное циклогексимидом снижение времени ожидания в тесте на спуск с безопасной платформы, а также уменьшают число ошибок. Этот результат показывает, что CE и W6 могут улучшать итоги тестов на пассивное избегание, ухудшение которых было вызвано циклогексимидом, а также повышать обучаемость и улучшать работу памяти у мыши. Результаты показаны в таблице 2.

Таблица 2
Воздействие CE и W6 на вызванное циклогексимидом ухудшение поведения по пассивному избеганию у мышей (тест на спуск)
Группа	Доза (мг/кг)	Время ожидания (с)	Улучшение (%)	Количество ошибок
Контрольная		255±16		0,2±0,1
Циклогексимид		174±20###		1,0±0,2###
CE	2,5	183±31	11	0,7±0,2
	5	217±20	53	0,5±0,1**
10	231±33	70	0,4±0,1*
Группа	Доза (мг/кг)	Время ожидания (с)	Улучшение (%)	Количество ошибок
Контрольная		276±17		0,1±0,3
Циклогексимид		124±30###		1,6±1,9##
W6	1,25	211±31	57	0,6±1,2
	2,5	223±24*	65	0,7±0,9*
	5	182±33	53	0,4±0,5**
10	216±29*	61	0,3±0,5**

Данные представлены в виде среднее значение ± S.E.M., для каждой группы n=20. ##: P<0,01, ###: P<0,001 по сравнению с контрольной группой; *: P<0,05, **: P<0,01 по сравнению с группой, которой вводят только циклогексимид.

Пример 3: Воздействие CE и W6 на вызванное Aβ (ухудшение способности к обучению и работы памяти у мышей.

Цель исследования:

Полагают, что бета-амилоидный пептид (A бета), т.е. пептид, включающий 39-43 остатка аминокислот, вызывает окислительный стресс и воспаление в головном мозге, которое, как принято считать, играет важную роль в патогенезе болезни Альцгеймера. Многочисленные экспериментальные доказательства показывают, что внутримозговая инъекция или вливание бета-амилоидных пептидов Aβ грызунам вызывает ухудшение обучаемости и памяти, а также перерождение нервных клеток в областях мозга, связанных с познавательной функцией. В данном исследовании мы определили воздействие длительного перорального введения CE и W6 при ухудшении памяти, которое вызвано одноразовой инъекцией агрегированного бета-амилоидного пептида 1-42 (Aβ (1-42)), причем мышам проводили интрацеребровентрикулярную инъекцию (i.c.v.), а крысам инъекцию в гиппокамп.

Методика:

С помощью ICV инъекции мышам вводят Aβ (1-42) в количестве 10 мг/мышь. Имитационной группе вводят такое же количество раствора Рингера. Через неделю мышей, которым была произведена инъекция Aβ (1-42), случайным образом делят на три группы и перорально вводят солевой раствор, CE (5 мг/кг) или W6 (1 мг/кг) соответственно. Спустя две недели проводят тест на спуск с безопасной платформы и тест в водном лабиринте для оценки способности к обучению и памяти мышей.

Тест в водном лабиринте: Каждую мышь вначале помещают на лестницу, а затем выпускают в воду из точки 1 и дают возможность найти лестницу в течение 120 секунд. Мышей подвергают двум таким испытаниям в течение суток на протяжении трех дней. В течение следующих двух дней исходное положение смещают от точки 1 к точке 2 и точке 3. Каждый день увеличивают расстояние от исходной точки до лестницы и количество тупиковых ветвей в лабиринте. На четвертый день мышей помещают в воду в точке 3 и измеряют время, в течение которого мышь выбирается из воды на лестницу и число заходов в тупиковые ветви (число ошибок). Данную методику используют для оценки пространственного восприятия, способности к обучению и работы памяти животного.

Для CE данный эксперимент повторяют с мужскими особями крыс Wistar. Порядок проведения эксперимента остается почти таким же, за исключением того, что Aβ (1-42) вводят в гиппокамп (10 мг/в каждую сторону). Для оценки способности к обучению и памяти крыс проводят тест на спуск с безопасной платформы.

Результаты

Проводимые грызунам в контрольной группе интрацереброваскулярные инъекции Aβ (1-42) или инъекции в гиппокамп ухудшают выполнение теста на пассивное избегание (значительно уменьшают время ожидания спуска) и теста в водном лабиринте (значительно увеличивают время ожидания, в течение которого мышь выбирается из воды и повышает число ошибок).

Лечение мышей и крыс CE и W6 в течение 2 недель в значительной степени препятствует вызванному Aβ (1-42) ухудшению выполнения тестов на пассивное избегание, а также значительно улучшает вызванное Aβ (1-42) ухудшение работы пространственной памяти. Эти данные означают, что CE и W6 могут обладать профилактическим воздействием в отношении связанного с бета-амилоидным пептидом Aβ ухудшения памяти при болезни Альцгеймера.

Таблица 3
Воздействие CE и W6 на вызванное Aβ (1-42) ухудшение выполнения тестов на пассивное избегание у мышей (тест на спуск с безопасной платформы)
Группа	Доза (мг/кг)	Время ожидания (с)	Число ошибок
Имитация		156±35	1,3±0,3
Только Aβ		30±14##	1,6±0,2
Aβ+CE	5	118±34*	1,4±0,3
Aβ+W6	1	110±37*	0,9±0,2
Таблица 4
Воздействие CE и W6 на вызванное Aβ (1-42) ухудшение способности к обучению и памяти у мышей (тест «водный лабиринт»)
Группа	Доза (мг/кг)	Время ожидания (с)	Число ошибок
Имитация		34±8	4,3±1,1
Только Aβ		62±10#	6,4±1,1#
Aβ+CE	5	36±10*	3,1±1,4*
Aβ+W6	1	46±11*	3,1±0,8*
Таблица 5
Воздействие CE на вызванное Aβ (1-42) ухудшение выполнения тестов на пассивное избегание у крыс (тест на спуск с безопасной платформы)
Группа	Доза (мг/кг)	Время ожидания (с)	Число ошибок
Имитация		241±39	0,2±0,1
Только Aβ		107±34#	1,3±0,3#
Aβ+CE	1,25	188±69*	0,4±0,2
5,0	237±42*	0,2±0,1*

Данные представлены в виде среднее значение ± S.E.M., n=12-15. #: P<0,05, ##: P<0,01 по сравнению с имитационной группой; *: P<0,05 по сравнению с группой, которой вводят только Aβ.

Пример 4: Воздействие CE и W6 на ухудшение памяти, вызванное моделированием сосудистой деменции.

Цель исследования:

Хорошо известно, что хроническая церебральная гипоперфузия, вызванная постоянной непроходимостью двусторонних общих сонных артерий у животных, связана с изменениями в поведении и гистопатологическими изменениями. В данном исследовании изучают воздействие CE и W6 на ухудшение способности к обучению и работы памяти, которое вызвано постоянной непроходимостью двусторонних общих сонных артерий у мышей и крыс.

Методика:

Хирургическим путем под анестезией фенобарбиталом (40 мг/кг в/б) общие сонные артерии мышей выделяли, перетягивали нитью и зашивали окружающую кожу. Контрольной группе с имитацией операции сонные артерии выделяли, но не перетягивали. Через одну неделю выживших мышей с перетянутыми артериями случайным образом делят на 3 группы. Двум группам многократно ежедневно вводят CE (5 мг/кг, п/о) или W6 (1 мг/кг, п/о). Через четыре недели после хирургического вмешательства мышей тренируют и тестируют в водном лабиринте и устройстве для теста на спуск.

Эксперимент с CE повторяют с самцами крыс SD. Порядок проведения эксперимента остается почти таким же, за исключением того, что для крыс используют тест «водный лабиринт» Морриса.

Пирацетам представляет собой наиболее известное ноотропное лекарственное средство. Механизм его действия неизвестен, но большинство описало бы его как усилитель интеллекта и стимулятор ЦНС (центральной нервной системы), помимо этого он проявляет замечательную эффективность в противодействии церебральной гипоксии. Вследствие этого, пирацетам используют в данном эксперименте в качестве эталонного лекарственного средства.

Тест Морриса «водный лабиринт»: Животных тестируют в водном лабиринте (Morris et al., 1982). После 1-минутного испытания в первый день, животных тестируют в течение следующих трех дней на их способность выбраться из бассейна путем нахождения платформы из органического стекла 6 см в диаметре, находящейся на 1,5 см ниже уровня воды. Каждая крыса проходит четыре подобных испытания в течение суток, причем исходную точку размещают в двух фиксированных положениях. Немедленно после завершающего испытания проводят тест на предубежденность пространственного восприятия в ходе исследования, длящегося 2 минуты, причем на этот срок платформу удаляют и фиксируют, в качестве коэффициента способности к пространственному обучению и памяти, число животных, пересекающих границы исходного положения платформы, а также время, проведенное в квадранте исходного расположения платформы.

Результаты:

Четырехнедельная церебральная гипоперфузия вызывает у мышей и крыс недостаток способности к обучению и памяти (тестирование на спуск и тестирование в водном лабиринте). Долговременное лечение CE и W6 в значительной степени смягчает эти изменения в поведении. Наши данные означают благотворную роль CE и W6 при состояниях цереброваскулярной недостаточности и деменции.

Таблица 6
Воздействие CE и W6 на ухудшение способности к обучению и работы памяти, вызванное постоянной окклюзией 2 сонных артерий у мышей (тест на спуск)
Группа	Доза (мг/кг)	Время ожидания (с)	Число ошибок
Имитация		256±40	0,3±0,2
2-VO		125±38#	0,9±0,2#
2-VO+CE	5	245±30*	0,2±0,2*
2-VO+W6	1	253±31*	0,2±0,1*
Таблица 7
Воздействие CE и W6 на ухудшение способности к обучению и работы памяти, вызванное постоянной окклюзией 2 сонных артерий у мышей (тест «водный лабиринт»)
Группа	Доза (мг/кг)	Время ожидания выхода из воды (с)	Число ошибок
Имитация		25±14	4,0±0,3
2-VO		51±24##	7,5±0,7#
2-VO+CE	5	22±11***	4,3±0,5*
2-VO+W6	1	33±19*	5,4±1,4

Данные представлены в виде среднее значение ± S.E.M., n=10-15. #: P<0,05, ##: P<0,01 по сравнению с имитационной группой; *: P<0,05, **: P<0,01, ***: P<0,001 по сравнению с группой, которой только перетянули сонные артерии

Пример 5: Воздействие CE на способность к обучению и работу памяти у обычной мыши.

Цель исследования:

Данный эксперимент должен выяснить, может ли CE улучшить способность к обучению и память у обычной молодой мыши.

Методика

Используют самцов мышей ICR (24-28 г). Мышам неоднократно вводят CE (1,25 и 5 мг/кг) в течение 3 дней. Затем для каждой мыши выполняют 3-дневное обучающее испытание в водном лабиринте. От 4 до 6 дня мышь выпускают в воду из исходной точки и фиксируют время ожидания до выхода из воды и число заходов в тупиковые ветви лабиринта.

Результат

По сравнению с обычными мышами, у мышей, подвергшихся лечению CE, сократилось время ожидания выхода из воды в тесте «водный лабиринт» и значительно уменьшилось число заходов в тупиковые ветви лабиринта. Этот результат показывает, что CE может улучшить способность к обучению и память у молодой обычной мыши.

Пример 6: Исследование кратковременного токсического воздействия CE и W6 на мышей.

Методика

Для данного эксперимента используют мышей KM. В каждую группу включены 10 самцов и 10 самок. Перорально или в/б вводят CE (5 г/кг) или W6-W9 (0,5 г/кг). За животными тщательно следят и вес их тела проверяют каждые три дня в течение 2 недель.

Результат

После однократного перорального введения дозы CE в количестве 5 г/кг не наблюдается смерти животных и прирост веса тела животных увеличивается относительно обычных мышей.

Такие же результаты наблюдались с W6, W7, W8 или W9 при концентрации 0,5 г/кг (в/б или п/о) (интраперитонеально или перорально).

Данные результаты означают, что CE и W6-W9 обладают небольшим кратковременным токсическим воздействием на мышей или такое воздействие отсутствует.

Пример 7: Воздействие CE и W6 на активность ацетилхолинэстеразы (AchE) in vivo.

Цель исследования

Общепринято, что физиологическая роль AchE заключается в быстром гидролизе и подавлении активности Ach. Ингибиторы AchE могут оказывать благотворное влияние при лечении деменции Альцгеймера. Цель данного анализа состоит в том, чтобы определить влияние CE и W6 на активность AchE.

Методика:

Крыс Wistar случайным образом делят на 5 групп (n=6): обычную контрольную, Hup A (1 мг/кг), CE (5 мг/кг), W6 (5 мг/кг) и W6 (20 мг/кг). Крысы голодают в течение ночи и затем им дают однократную пероральную дозу препаратов. Через час крыс обезглавливают, быстро удаляют передний мозг при охлаждении на бане со льдом, взвешивают и гомогенизируют в 0,9% физиологическом растворе, используя ультразвуковой гомогенизатор, чтобы получить 10% гомогенат. Гомогенат центрифугируют (6000 об/мин) в течение 20 минут при низкой температуре и сохраняют надосадочную жидкость. Затем измеряют активность AchE с помощью аналитического комплекта.

Результат:

Данные эксперимента показывают, что однократное введение крысам CE или W6 не оказывает ингибирующего воздействия на активность AchE. Это показывает, что благотворное воздействие CE или W6 на познавательные функции животных не опосредуется антихолинэстеразным путем.

Таблица 8
Воздействие CE и W6 на активность AchE in vivo
Группа	Активность AchE	Ингибирование(%)
Контрольная	0,72±0,18	-
Hup A (1 мг/кг)	0,48±0,10*	34
CE (5 мг/кг)	0,77±0,20	0
W6 (5 мг/кг)	0,80±0,16	0
W6 (20 мг/кг)	0,72±0,16	0

1. Применение производных эфиров янтарной кислоты общей формулы (I) в производстве лекарственного препарата для профилактики или лечения деменции

где

R₁ и R₄ выбраны из -ОСН₃, -ОН, -OGlu, и ;

R₂ и R₃ выбраны из Н, -ОН, -OGlu, и ;

R₅ выбран из неразветвленных или разветвленных C_1-6 алкилов;

причем хиральные центры при С-2 и С-3 имеют конфигурацию 2R3S, 2R3R, 2S3S и 2S3R соответственно.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что упомянутое соединение формулы (I) представляет собой

где R₅ выбран из группы, состоящей из метила, этила, пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, трет-бутила; и R₁, R₂, R₃ и R₄ являются теми же заместителями, которые перечислены в п.1.

3. Применение по п.2, отличающееся тем, что указанные соединения включают

;

;

;

;

;

;

;

1,4-бис(β-D-глюкопиранозилоксибензил)-2-β-D-глюкопиранозил-2-изобутилмалат (дактилорин A) (W8)

;

;

;

;

;

4. Применение по пп.1-3, отличающееся тем, что указанные соединения включают фармацевтически приемлемые соли.

5. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанная деменция включает болезнь Альцгеймера, сосудистую деменцию, а также затрудненность обучения и памяти.

6. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения деменции, содержащая эффективное количество производного эфира янтарной кислоты общей формулы (I)

где

где

R₁ и R₄ выбраны из -ОСН₃, -ОН, -OGlu, и ;

R₂ и R₃ выбраны из Н, -ОН, -OGlu, и ;

R₅ выбран из неразветвленных или разветвленных C_1-6 алкилов;

причем хиральные центры при С-2 и С-3 имеют конфигурацию 2R3S, 2R3R, 2S3S и 2S3R соответственно,

и фармацевтически приемлемый носитель.

7. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что упомянутое соединение формулы (I) представляет собой

где R₅ выбран из группы, состоящей из метила, этила, пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, трет-бутила; и R₁, R₂, R₃ и R₄ являются теми же заместителями, которые перечислены в п.6.

8. Фармацевтическая композиция по п.7, отличающаяся тем, что указанные соединения включают

;

;

;

;

;

;

;

;

1,4-бис(β-D-глюкопиранозилоксибензил)-2-(β-D-глюкопиранозил-2-изобутилмалат (дактилорин A) (W8);

;

;

;

;

;

9. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6-8, в которой упомянутое соединение включает его фармацевтически приемлемые соли.

10. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что упомянутая фармацевтическая композиция может быть представлена в форме таблеток, капсул, пилюль, растворов для инъекций, составов замедленного высвобождения, составов регулируемого высвобождения и различных систем на основе микрочастиц.

11. Применение этанольного экстракта, полученного из высушенного корневища Пололепестника зеленого (Coeloglossum viride (L) Hartm. Var. Bracteatum (Wild.) Richter) в производстве лекарственных средств для профилактики или лечения деменции.

12. Применение по п.11, отличающееся тем, что упомянутая деменция включает болезнь Альцгеймера, сосудистую деменцию, а также затрудненность обучения и памяти.

13. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения деменции, содержащая эффективное количество этанольных экстрактов, полученных из высушенного корневища Пололепестника зеленого {Coeloglossum viride (L) Hartm. Var. Bracteatum (Wild.) Richter) и фармацевтически приемлемый носитель.

14. Фармацевтическая композиция по п.13, отличающаяся тем, что упомянутая фармацевтическая композиция может быть представлена в форме таблеток, капсул, пилюль, растворов для инъекций, составов замедленного высвобождения, составов регулируемого высвобождения и различных систем на основе микрочастиц.