Способ получения додекапептида и трипептид для его осуществления

Изобретение относится к способу получения додекапептида формулы I: H-Asp-His-Leu-Asp-Lys-Gln-Thr-Gln-Thr-Pro-Lys-Thr-OH и к трипептиду формулы II: X-Asp(Y)-His-Leu-OH, являющемуся промежуточным соединением в его синтезе. Сущность изобретения заключается в том, что твердофазный синтез додекапептида I осуществляют путем последовательного наращивания пептидной цепи, начиная с С-концевого дипептидилполимера до получения С-концевого нонапептидилполимера, который конденсируют с защищенным N-концевым трипептидом формулы II: X-Asp(Y)-His-Leu-OH, где X, Y, - защитные группы, и полученный додекапептидилполимер обрабатывают деблокирующим агентом для отщепления защитных групп и полимерной матрицы и в 1 стадию выделяют конечный продукт с помощью ВЭЖХ. Способ позволяет повысить выход целевого продукта и упростить процесс. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил.

 

Изобретение относится к области физиологически активных пептидов, конкретно к способу получения додекапептида формулы I:

H-Asp-His-Leu-Asp-Lys-Gln-Thr-Gln-Thr-Pro-Lys-Thr-OH (I), а также к трипептиду Boc-As(OBu^t)-His-Leu-OH формулы (II), являющемуся промежуточным соединением в его синтезе.

Додекапептид формулы I обладает способностью ингибировать миграцию промоноцитарных клеток ТНР-1 и выделенных из крови человека моноцитов в условиях клеточного культивирования, а также миграцию моноцитов и гранулоцитов в очаги воспаления у животных и может найти применение в качестве средства для предупреждения развития острых коронарных состояний и профилактики рестенозов после ангиопластики и стентирования, а также при острых воспалительных процессах и обострении различных хронических заболеваний, в частности при подагре и ревматоидном артрите [1].

Известен способ получения додекапептида формулы I твердофазным методом путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с С-концевой аминокислоты, ковалентно связанной с полимерной матрицей, с использованием соответствующих Fmoc-аминокислот в присутствии конденсирующего агента с последующим деблокированием конечного додекапептидилполимера в 2 стадии: обработкой раствором пиперидина и затем трифторуксусной кислотой с последующей очисткой полученного продукта с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [2]. При этом получают додекапептид формулы I с выходом 46% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимеру (см. Фиг.1, прототип).

Недостатками известного способа являются низкий выход целевого продукта и многостадийность процесса. Недостатком является также использование дорогих и труднодоступных производных аминокислот на стадиях наращивания пептидной цепи, начиная с С-концевого нонапептилполимера (V).

Вышеуказанные недостатки делают известный способ малопригодным для крупномасштабного синтеза додекапептида формулы I.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и упрощение процесса.

Поставленная цель достигается заявленным способом, согласно которому твердофазный синтез додекапептида формулы:

осуществляют путем последовательного наращивания пептидной цепи, начиная с С-концевой аминокислоты, ковалентно связанной с полимерной матрицей, до получения С-концевого нонапептидилполимера (V), который затем конденсируют с защищенным N-концевым трипептидом формулы II:

где X, Y, - защитные группы, после чего полученный додекапептидилполимер обрабатывают деблокирующим агентом и в 1 стадию отщепляют все защитные группы и полимерную матрицу и выделяют конечный продукт с помощью ВЭЖХ (см. Приложение 2, заявляемый способ).

Полупродукты синтеза, используемые в заявленном способе, могут быть получены обычными методами пептидного синтеза, в частности, путем ступенчатого наращивания пептидной цепи в растворе с использованием активированных эфиров соответствующих защищенных аминокислот [3].

Список сокращений:

АсОН - уксусная кислота;

Boc - трет-бутилоксикарбонил;

Bu^t - трет-бутил;

DIC - N,N¹-диизопропилкарбодиимид;

DCM - дихлорметан;

DMF - N,N-диметилформамид;

DMSO - d6 - дейтерированный диметилсульфоксид;

Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил;

HONSu - N-гидроксисукцинимид;

НОВТ - 1-гидроксибензотриазол;

HONp - пара-нитрофенол;

NMP - N-метилпирролидон;

NMM - N-метилморфолин;

Pip - пиперидин;

TIBS - триизобутилсилан;

TFA - трифторуксусная кислота;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

ТСХ - тонкослойная хроматография;

«комплекс F» - комплекс пентафторфенола с дициклогексилкарбодиимидом в соотношении 3:1.

В заявляемом способе использованы производные L-аминокислот фирмы Bachem (Швейцария), DIC, HONSu, HONp, NMP, TFA фирмы Fluka (Швейцария). DMF очищали перегонкой над нингидрином и окисью бария. Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографе фирмы Gilson (Франция), использовали колонку Ultrasphere ODS, 5 мкм (4,6×250 мм) Beckman (США), в качестве элюентов использовали буфер А - 0,05 М КН₂PO₄, рН 3.0, буфер Б - 70% ацетонитрила в буфере А, элюция градиентом концентрации от 0% до 60% буфера Б в буфере А за 40 мин. Скорость потока 1 мл/мин, детекция при 220 нм. Индивидуальность полученных соединений подтверждали с помощью ТСХ на хроматографических пластинках Kiselgel 60 (Merck, ФРГ) в системах растворителей: хлороформ - метанол - уксусная кислота 9:1:0.5 (система 1), хлороформ - метанол - 32%-ная уксусная кислота 15:4:1 (система 2), хлороформ - метанол - 32%-ная уксусная кислота 5:3:1 (система 3), хлороформ - метанол - 32%-ная уксусная кислота 60:45:20 (система 4), н. бутанол - уксусная кислота - вода 3:1:1 (система 5). Вещества на хроматограммах проявляли хлор - бензидином и нингидрином. Температуры плавления (нескорректированные) определяли на приборе Boetius (ФРГ). Аминокислотный анализ пептидов, гидролизованных 6 н. соляной кислотой, содержащей 2% фенола, при 110°С в течение 24 ч, проводили на приборе Biotronik LC 5001 (ФРГ). ¹Н-ЯМР - спектры снимали на спектрометре WH-500 Broker 500МГц (ФРГ) в DMSO-d при 300К, концентрация пептидов составляла 2-3 мг/мл. Химические сдвиги измерялись относительно тетраметилсилана. Масс-спектры регистрировали на приборе PC-Kompact MALDI (Kratos, Англия).

Синтез полупродуктов

Пример 1. Boc-Asp(OBu^t)-His-Leu-OH (II):

9.52 г (20 ммоль) Boc-His(Boc)-ONp растворяют в 100 мл DMF, охлаждают до -10°С и прибавляют 2.6 г (20 ммоль) лейцина в 10 мл 2н. NaOH и перемешивают при 20°С в течение 4 ч. Завершение реакции контролируют с помощью ТСХ в системе 1. Реакционную смесь упаривают, маслообразный остаток растворяют в 200 мл воды и экстрагируют эфиром (3×50 мл). Водную фазу подкисляют лимонной кислотой до рН 4, экстрагируют этилацетататом (3×100 мл), объединенный этилацетатный экстракт промывают водой (3×50 мл), растворитель удаляют в вакууме, маслообразный продукт растирают с гексаном. В итоге получают 7.5 г (80%) соединения III. R_f 0.48 (1), 0.83 (2). Полученное вещество кристаллизуют из смеси эфир-гексан в виде соответствующей дициклогексиламмониевой соли. Т. пл. 118-122°С.

Для отщепления Вос-защиты 6.0 г (12.8 ммоль) соединения (III) растворяют в 30 мл TFA и выдерживают 1 ч при 20°С. Трифторуксусную кислоту упаривают и трифторацетат H-His-Leu-OH осаждают эфиром. В итоге получают 6.0 г (95%) соединения IV. R_f 0.27(3), 0.32 (4), 0.13 (5).

6.0 г (12.2 ммоль) H-His-Leu-OH·TFA (IV) растворяют в 100 мл DMF, к полученному раствору добавляют 2.7 мл (24.4 ммоль) NMM и 4.71 г (12.2 ммоль) Boc-Asp(OBu^t)-ONSu. Реакционную смесь выдерживают 18 часов, окончание реакции контролируют методом ТСХ в системе 2. После окончания реакции раствор упаривают, остаток растворяют в 250 мл смеси этилацетата и н.-бутанола (4:1), добавляют 1 эквивалент (12.2 ммоль) соляной кислоты, промывают водой (3×70 мл) и упаривают. К остатку добавляют 100 мл эфира, выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром (3×50 мл) и сушат. В итоге получают 5.4 г (82%) соединения II. R_f 0.45 (2), 0.75 (3), 0.82 (4). Т.пл. 145-147°С. В ¹Н-ЯМР-спектре присутствуют сигналы (м.д.):

1. Аспарагиновой кислоты - 7.11 (NH₂, 2Н), 4.26 (α-СН, 1Н), 2.60, 2.38 (β-CH₂, 2Н)

2. Гистидина - 8.04 (NH, 1Н), 4.59(α-CH, 1Н), 3.12, 2.96 (β-СН₂, 2Н), 8.96 (C₂H, 1Н, имидазол), 7.31 (С₄Н, 1Н, имидазол)

3. Лейцина - 8.16 (NH, 1Н), 4.21 (α-СН, 1Н), 1.53 (β-СН₂, 2Н), 1.62 (γ-СН, 1Н), 0.88, 0.83 (δ',δ"-СН₃, 6Н), а также 1.37 (Вос, Bu^t, 18H)

Пример 2.

2a. H-Asp(OBu^t)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Thr(Bu^t)-Gln(Trt)-Thr(Bu^t)-Pro-Lys(Boc)-Thr(Bu^t)-полимер (V)

Для твердофазного синтеза используют сополимер стирола с 1% дивинилбензола с гидроксиметилфеноксиметильной якорной группой, содержащий 0.67 ммоль/г Fmoc-Thr (Bu^t) с размером частиц 200-400 меш фирмы Bachem (Швейцария). Синтез нонапептидилполимера проводят исходя из 0.37 г (0.25 ммоль) Fmoc-Thr(Bu^t)-полимера в автоматическом режиме на пептидном синтезаторе Applied Biosystems 431 А по стандартной программе для однократной конденсации Fmoc-аминокислот.

Для блокирования функциональных групп боковых цепей аминокислот применяют следующие защиты: трет-бутильную для карбоксильных групп аспарагиновой кислоты и гидроксильной функции треонина; трет-бутилоксикарбонильную (Вос) - защиту для ε-аминогруппы лизина; тритильную (Trt) - группу для карбоксамидной функции глутамина.

Протокол твердофазного синтеза
№	Операция	Реагент	Время обработки
1	Промывка	5×NMP	3 мин
2	Деблокирование α-аминогрупп	20% Pip/NMP	10 мин
3	Промывка	5×NMP	3 мин
	Активация	1 ммоль Fmoc-аминокислоты +1 ммоль HOBt+1 ммоль DIC в NMP	20 мин
6	Конденсация	1 ммоль активированного производного Fmoc-аминокислоты в NMP	90 мин
7	Промывка	5×NMP	3 мин

Для оценки качества полупродукта V - С-концевого нонапептидилполимера - проводят деблокирование и отщепление соответствующего нонапептида от полимерного носителя, используя образец (50 мг) полупродукта V. Образец V обрабатывают 5 мл раствора TFA, содержащего 0.1 мл деионизованной воды и 0.1 мл триизобутилсилана в течение 1 ч, полимер отфильтровывают, фильтрат упаривают, к остатку прибавляют эфир и осадок отфильтровывают, промывают дихлорметаном (3×1 мл), эфиром (3 раза по 1 мл), сушат в вакуум-эксикаторе. Получают 10 мг сырого продукта, анализируют содержание в нем целевого нонапептида, которое составляет 95% (по данным ВЭЖХ). Аминокислотный состав: Asp 0.97 (1), Glx 2.10 (2), Thr 2.80 (3), Lys 2.00 (2), Pro не определяли.

К нонапептидилполимеру (V) прибавляют раствор 0.54 г (1 ммоль) трипептида (II) (4-кратный избыток по отношению к аминогруппам на полимере) в 4 мл NMP и 0.76 г (1 ммоль) "комплекса F". Через 8 часов пептидилполимер отфильтровывают, промывают NMP и DCM и сушат. Полноту присоединения карбоксильного компонента определяют при помощи теста с нингидрином [4].

Заключительное деблокирование и отщепление додекапептида от полимера проводят в 1 стадию путем обработки соответствующего додекапептидилполимера смесью 10 мл TFA, 0.25 мл Н₂О и 0.25 мл TIBS в течение 1 ч. Затем полимер отфильтровывают, промывают 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривают и к остатку прибавляют сухой эфир. Осадок отфильтровывают, промывают дихлорметаном (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушат в вакуум-эксикаторе. Получают 0.6 г сырого продукта I, содержащего по данным ВЭЖХ 90% целевого пептида.

После этого проводят очистку пептида с помощью препаративной ВЭЖХ на приборе Beckman (США), используют колонку Диасорб-С16 130Т (2.5×250 мм), размер частиц сорбента - 10 мкм. В качестве элюентов используют: буфер А - 0,01М раствор ацетата аммония и буфер Б - 80% ацетонитрила в воде, элюцию проводят градиентом 0.5% в минуту буфера Б от 100% буфера А, скорость потока 10 мл/мин. Пептиды детектируют при длине волны 220 нм. Фракции, содержащие целевой продукт объединяют и лиофилизуют. В итоге получают 0.29 г (75% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю) ацетата додекапептида I. Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляет 98%. Аминокислотный состав: Thr 2.88 (3), Asp 2.03 (2), Glx 2.02 (2), Leu 1.02(1), His 1.00 (1), Lys 2.00 (2), Pro не определяли. ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆, δ, м.д.): В спектре присутствуют сигналы (м.д.):

1. Аспарагиновой кислоты - 8.18 (NH₂, 2Н), 4.13 (α-СН, 1Н), 2.68, 2.80 (β-СН₂, 2Н)

2. Гистидина - 8.73 (NH, 1Н), 4.67 (α-CH, 1Н), 3.0, 3.09 (β-CH₂, 2Н), 8.97 (C₂H, 1Н, имидазол), 7.35 (С₄Н, 1Н, имидазол)

3. Лейцина - 8.18 (NH, 1H), 4.32 (α-CH, 1H), 1.45 (β-CH₂, 2H), 1.58 (γ-CH, 1H), 0.87, 0.84 (δ',δ"-СН₃, 6Н)

4. Аспарагиновой кислоты - 8.43 (NH, 1H), 4.58 (α-CH, 1H), 2.72, 2.51 (β-CH₂, 2Н)

5. Лизина - 7.79 (NH, 1H), 4.25 (α-CH, 1H), 1.64,1.50 (γ-СН₂, 2Н), 1.28 (γ-СН₂, 2Н), 1.51 (δ-СН₂, 2Н), 2.74 (ε-СН₂, 2Н)

6. Глутамина - 8.14 (NH, 1H), 4.31 (α-CH, 1H), 1.90, 1.78 (β-CH₂, 2Н), 2.13 (γ-CH₂, 2H)

7. Треонина - 7.81 (NH, 1H), 4.22 (α-CH, 1H), 4.01 (β-CH, 1H), 1.02 (γ-СН₃, 3Н)

8. Глутамина - 7.87 (NH, 1H), 4.38 (α-CH, 1H), 1.87, 1.72 (β-СН₂, 2Н), 2.11 (γ-СН₂, 2Н)

9. Треонина - 8.05 (NH, 1H), 4.37 (α-CH, 1H), 3.84 (β-CH, 1H), 1.13 (γ-СН₃, 3Н)

10. Пролина - 4.37 (α-CH, 1H), 2.03 (β-СН₂, 2Н), 1.93, 1.84 (Y-CH₂, 2Н), 3.72, 3.64 (δ-СН₂, 2Н)

11. Лизина - 8.06 (NH, 1H), 4.32 (α-CH, 1H), 1.70 (β-СН₂, 2Н), 1.36 (γ-СН₂, 2Н), 1.52 (δ-СН₂, 2Н), 2.75 (ε-СН₂, 2Н)

12. Треонина - 7.65 (NH, 1H), 4.18 (α-CH, 1H), 4.14 (β-CH, 1H), 1.04 (γ-СН₃, 3Н)

Масс-спектр, m/z: 1411.9 [М+Н]⁺, брутто-формула: C₅₉H₉₈N₁₈O₂₂, вычислено 1411.5.

Как видно из приведенных примеров, заявленный способ позволяет значительно повысить выход целевого продукта и упростить технологию его получения за счет сокращения стадий процесса.

Источники информации

1. ДАН, 2005, том 404, №4, с.251-255.

2. Патент Российской Федерации №2260598, опублик. 2005 г. (прототип).

3. Гершкович А.А., Киберев В.К. Химический синтез пептидов. Киев: Наукова Думка, 1992, с.4-10.

4. J.M.Stewart, J.D.Yang Solid Phase Peptide Synthesis Sec. Ed. Rockford USA: Pierce Chem.Com. 1984, p.105.

1. Способ получения додекапептида формулы I

H-Asp-His-Leu-Asp-Lys-Gln-Thr-Gln-Thr-Pro-Lys-Thr-OH твердофазным методом путем последовательного наращивания пептидной цепи, начиная с С-концевой аминокислоты, ковалентно связанной с полимерной матрицей, последующей обработки полученного додекапептидилполимера деблокирующим агентом для отщепления защитных групп и полимерной матрицы и выделения конечного продукта с помощью ВЭЖХ, отличающийся тем, что С-концевой нонапептидилполимер V конденсируют с защищенным трипептидом формулы II X-Asp(Y)-His-Leu-OH, где X, Y - защитные группы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой трет-бутилоксикарбонильную группу (Boc), Y - трет-бутильную группу (Bu^t).

3. Трипептид формулы II Boc-Asp(OBu^t)-His-Leu-OH, где Boc - трет-бутилоксикарбонил, Bu^t-трет-бутил в качестве промежуточного соединения для получения додекапептида формулы I H-Asp-His-Leu-Asp-Lys-Gln-Thr-Gln-Thr-Pro-Lys-Thr-OH.