Биокатализатор, способ его приготовления и способ получения глюкозо-фруктозных сиропов

Изобретение относится к области биотехнологии. Биокатализатор для получения глюкозо-фруктозных сиропов в процессе изомеризации глюкозы или фруктозы, который содержит бактериальные клетки с глюкозоизомеразной активностью, диоксид кремния и соли магния и двухвалентного кобальта, при чем соотношение бактериальных клеток и диоксида кремния составляет от 1:6 до 1:10 в весовых частях по сухим веществам. Диоксид кремния используют в виде гидрогеля со следующим набором свойств: влажность 60-95%, величина удельной поверхности продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равна 30-550 м²/г, насыпная плотность продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равна 0.1-0.7 г/см³. Изобретение позволяет ускорить и упростить процесс иммобилизации бактериальных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью, а также сохранить на высоком уровне ферментативную активность клеток после иммобилизации. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 3 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и способам приготовления биокатализаторов, которые могут использоваться в реакциях биоконверсии природных субстратов, например в процессах получения сладких сиропов из возобновляемого крахмалосодержащего растительного сырья.

Известно, что сладкие сиропы - глюкозно-фруктозный, инвертный и другие, широко применяются в пищевой промышленности в качестве натуральных заменителей белого сахара при производстве безалкогольных напитков, кондитерских изделий и продуктов диетического питания, а также при консервировании. Использование этих сиропов в рецептурах приготовления различных изделий существенно улучшает их потребительские свойства, замедляет процессы высыхания и затвердевания (черствения).

Одним из путей проведения реакций биоконверсии природных субстратов является использование гетерогенных биокатализаторов, представляющих собой ферментативно-активную субстанцию (индивидуальный фермент или целую бактериальную клетку), иммобилизованную в инертную твердую или гелеобразную нерастворимую матрицу.

Усовершенствование состава биокатализаторов и разработка новых способов иммобилизации является актуальной задачей.

Известен способ иммобилизации бактериальных клеток актиномицетов Streptomyces albogriseolus 28-3, обладающих глюкозоизомеразной активностью и катализирующих ферментативную реакцию изомеризации глюкозы во фруктозу, путем включения биомассы в нерастворимый носитель [SU 1731815, C12N 11/04, 07.05.1992.]. Для этого биомассу Streptomyces albogriseolus 28-3 смешивают с раствором хитозана. В полученную суспензию сначала добавляют раствор соли трехвалентного ацетата кобальта Co(III), который получают окислением двухвалентного кобальта Со(II) перекисью водорода. Затем в полученную смесь вводят по каплям водный раствор аммиака для формирования гранул биокатализатора. Активность биокатализатора составляет 190 мкмоль/мин/г влажного биокатализатора при 60°С. При иммобилизации бактериальные клетки сохраняют не более 66% от исходной активности в суспензии. Недостатками данного способа являются следующие: 1) в состав биокатализатора входит кобальт в неустойчивом трехвалентном состоянии, 2) при приготовлении биокатализатора используют агрессивные (перекись водорода) и сильно пахнущие (аммиак) реагенты.

Известен способ иммобилизации глюкозоизомеразы путем адсорбции на сополимере стирола и дивинилбензола, активированном хлорметилированием и обработанным триалкилфосфином и гидроксидом щелочного металла [пат. RU 2031124, С12Р 19/24, C12N 11/06, 20.03.1995]. Продолжительность стадии приготовления носителя и адсорбции составляют 19 ч и 5 ч, соответственно. При иммобилизации глюкозоизомераза сохраняет не более 69% от исходной активности фермента в растворе. Биокатализаторы теряют 30-50% начальной активности свежеприготовленного катализатора через 31 сут эксплуатации при 60°С. Максимальная продуктивность составляет 1,04 кг сухих веществ глюкозо-фруктозного сиропа с 1 г биокатализатора. Недостатками данного способа является использование органических полимеров, токсичных органических соединений, агрессивных реагентов (щелочь), а также многостадийность процесса иммобилизации (активация, обработка носителя, адсорбция фермента) и его большая продолжительность.

Наиболее близким является способ иммобилизации частично очищенного препарата глюкозоизомеразы из Actinomyces olivocinereus 154 на макропористых носителях на основе высушенных и прокаленных форм диоксида кремния (силикагелях и силохромах) путем ковалентного связывания с помощью γ-аминопропилтриэтоксисилана и глутарового диальдегида [Ворошилова О.И., Киселев А.В., Никитин Ю.С., Хохлова Т.Д., Ананичев А.И., Угоров A.M., Улезло И.В. Иммобилизация глюкозоизомеразы из Actinomyces olivocinereus 154 на макропористых кремнеземных носителях. //Прикладн. Биохим. Микробиол. 1984. Т.20. Вып.2. С.223-229]. Продолжительность стадий приготовления носителя и иммобилизации на нем фермента составляют не менее 2 ч и 6 ч, соответственно. Следует отметить, что поверхность высушенных и прокаленных форм диоксида кремния с уже сформированной текстурой носителя является достаточно инертной, и для иммобилизации ферментов требуется дополнительная активация поверхности γ-аминопропилтриэтоксисиланом, при помощи которого на поверхность вводятся аминогруппы, а также использование бифункциональных сшивающих реагентов таких как глутаровый диальдегид. При иммобилизации глюкозоизомераза сохраняет 10-40% от исходной активности фермента в растворе. Биокатализатор на основе иммобилизованной глюкозоизомеразы сохраняет 75% начальной активности свежеприготовленного образца через 40 ч работы при 70°С.

Существенными недостатками данного способа являются следующие: 1) использование токсичных сшивающих реагентов (глутарового диальдегида), приводящих к потере ферментативной активности, 2) низкая ферментативная активность биокатализатора, составляющая 5,3 мкмоль/мин/г биокатализатора при 60°С; 3) потеря при иммобилизации 60-90% от исходной активности фермента в растворе, 4) применение для приготовления биокатализатора очищенного фермента, что приводит к существенному удорожанию ферментного препарата с глюкозоизомеразной активностью из-за наличия стадий выделения и очистки, 5) сравнительно большая продолжительность процесса иммобилизации (не менее 8 ч).

Изобретение решает задачу разработки эффективного способа получения глюкозо-фруктозных сиропов.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в ускорении и упрощении процесса иммобилизации бактериальных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью (БКГИА), а также в сохранении на высоком уровне ферментативной активности клеток после иммобилизации.

Задача решается использованием биокатализатора - иммобилизованных БКГИА, в процессе изомеризации глюкозы или фруктозы. Биокатализатор содержит биомассу, диоксид кремния, используемый в виде гидрогеля; при этом соотношение основных компонентов биокатализатора - биомассы бактериальных клеток и диоксида кремния, составляет от 1:6 до 1:10 в весовых частях по сухим веществам. Биокатализатор дополнительно содержит соединения магния и двухвалентного кобальта, которые используются для активации и стабилизации внутриклеточного фермента глюкозоизомеразы.

В качестве БКГИА используют биомассу бактерий в виде пасты с влажностью 75-80%.

Диоксид кремния используют в виде гидрогеля со следующим набором свойств: влажностью 60-95%, величиной удельной поверхности продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равной 30-550 м²/г, насыпной плотностью продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равной 0.1-0.7 г/см³.

В качестве дополнительных компонентов биокатализатора используют растворимые соли магния Mg (II) и двухвалентного кобальта Со (II) в виде сульфатов, или нитратов, или хлоридов, в количестве 1-1.2 мкмоль на 1 г сухого биокатализатора.

Биокатализатор имеет величину удельной поверхности 50-300 м²/г, объем пор 0.3-1.0 см³ и диаметр пор 10-15 нм.

Задача решается также способом приготовления биокатализатора для получения глюкозо-фруктозных сиропов, по которому иммобилизацию бактериальных клеток с глюкозоизомеразной активностью в диоксид кремния проводят путем смешения биомассы бактериальных клеток в виде влажной пасты, диоксида кремния в виде гидрогеля, и солей магния и двухвалентного кобальта в виде водных растворов солей (сульфатов, или нитратов, или хлоридов), с последующей сушкой полученной смеси на воздухе при температуре 50-70°С в течение не более 2 ч, прессованием и грануляцией в частицы размером 0.4-3.0 мм.

Диоксид кремния используют в виде гидрогеля со следующим набором свойств: влажностью 60-95%, величиной удельной поверхности продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равной 30-550 м²/г, насыпной плотностью продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равной 0.1-0.7 г/см³.

Гидрогель диоксида кремния получают путем взаимодействия силиката натрия или калия с минеральной кислотой, выбранной из ряда - серная, азотная или угольная, или путем взаимодействия с аммонийными солями серной, или азотной, или угольной кислот, при значении рН 6.5-9, температуре 20-90°С, скорости осаждения 30-300 г SiO₂/л_сусп/ч с последующей отмывкой и фильтрацией гидрогеля.

Задача решается также способом получения глюкозо-фруктозных сиропов в процессе изомеризации глюкозы или фруктозы, в котором используют описанный выше биокатализатор. Процесс проводят в реакторе с неподвижным слоем при температуре 60-70°С и при скорости потока реакционной среды, содержащей глюкозу или фруктозу, через слой биокатализатора, равной 0.02-0.04 л/ч. Биокатализатор используют в виде частиц размером 0.4-3.0 мм.

Технический результат достигается вследствие реализации следующих групп отличительных признаков: 1) оптимизацией состава биокатализатора, 2) методом приготовления биокатализатора путем смешения биомассы БКГИА с диоксидом кремния в виде гидрогеля, а не в виде сформировавшего текстуру высушенного и прокаленного диоксида кремния (силикагеля), 3) методом получения гидрогеля диоксида кремния, обеспечивающим набор заявляемых свойств, 4) определенным набором свойств гидрогеля диоксида кремния и готового биокатализатора с глюкозоизомеразной активностью, 5) методом проведения каталитической реакции изомеризации моносахаридов (глюкозы или фруктозы). Следует отметить, что использование диоксида кремния в виде гидрогеля, а не силикагеля приводит к равномерному распределению всех компонентов в объеме биокатализатора, обеспечивает прочное закрепление и отсутствие вымывания БКГИА. Метод приготовления биокатализатора отличается меньшим по сравнению с прототипом количеством стадий, а также сравнительной простотой и доступностью всех компонентов биокатализатора.

Биокатализатор для изомеризации глюкозы имеет следующий состав по основным компонентам: бактериальные клетки, обладающие глюкозоизомеразной активностью (БКГИА), - 1 весовая часть, и диоксид кремния в виде гидрогеля - от 6 до 10 весовых частей по сухому веществу. Гидрогель диоксида кремния получают путем взаимодействия силиката натрия или калия с минеральной кислотой, выбранной из ряда - серная, или азотная, или угольная, или путем взаимодействия с аммонийными солями серной, или азотной, или угольной кислот, при значении рН 7-9, температуре 20-90°С, скорости осаждения 30-300 г SiO₂/л_сусп/ч с последующей отмывкой и фильтрацией гидрогеля. Полученный в заявляемых условиях гидрогель имеет следующий набор свойств: влажность гидрогеля 60-95%, величина удельной поверхности продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, составляет 30-550 м²/г, насыпная плотность продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, составляет 0.1-0.7 г/см³. Гидрогель диоксида кремния инертен, отличается высокой химической и микробиологической устойчивостью. Дополнительными компонентами биокатализатора являются Mg(II) и Со(II) в виде растворимых солей серной, или, азотной, или соляной кислот в количестве 1-1,2 мкмоль на 1 г сухого биокатализатора. Как отмечалось выше, присутствие двухвалентных ионов магния и кобальта является необходимым, так как ионы этих металлов значительно увеличивают термостабильность внутриклеточной глюкозоизомеразы при термообработке биомассы при 50-70°С.

Биокатализатор изомеризации глюкозы готовят путем тщательного смешения БКГИА, гидрогеля диоксида кремния и растворимых солей Mg(II) и Со(II) до однородной массы. Затем полученную смесь высушивают при температуре 50-70°С. Высушивание смеси при температуре ниже 50°С существенно увеличивает продолжительность сушки и приготовления биокатализатора, тогда как высушивание смеси при температуре выше 70°С приводит к потере ферментативной активности. Высушенную смесь прессуют при давлении 150 атм и механически измельчают до частиц размером 0.4-3.0 мм. В результате получают гранулированный твердый биокатализатор, обладающий глюкозоизомеразной активностью, превышающей 20 мкмоль/мин/г сухого биокатализатора (в прототипе 5.3 мкмоль/мин/г). Как отмечалось выше, для его приготовления используют бактериальные клетки без предварительного выделения и очистки индивидуального фермента (в отличие от прототипа). Заявляемый состав, способ приготовления и свойства используемого гидрогеля диоксида кремния обеспечивают высокую активность и стабильность биокатализатора. Так, при иммобилизации предложенным способом сохраняется более 70% от исходной активности клеток в суспензии (в прототипе - 10-40%). Продолжительность процесса иммобилизации и приготовления биокатализатора для изомеризации глюкозы не превышает 4 ч (в прототипе - более 8 ч).

Биокатализатор обладает следующим набором свойств. Удельная поверхность биокатализатора после высушивания при 50-70°С составляет 50-300 м²/г. По данным ртутной порометрии средний размер пор составляет 10-15 нм, то есть биокатализатор имеет мезопористую структуру. Мезопористая структура биокатализатора обеспечивает его работу в кинетической области без диффузионного торможения в реакции изомеризации глюкозы или фруктозы. Глюкозоизомеразная активность биокатализатора составляет не менее 20 мкмоль/мин/г сухого биокатализатора. Обнаружено, что гидрогель диоксида кремния проявляет защитное действие, и при включении бактериальных клеток в гидрогель существенно увеличивается термостабильность внутриклеточной глюкозоизомеразы. Например, бактериальные клетки актиномицетов, высушенные при 70°С без гидрогеля, сохраняют 44% от исходной активности клеток в суспензии, тогда как бактериальные клетки в биокатализаторе (с гидрогелем) - 74%. Биокатализатор устойчив в реакционной среде - буферном растворе со значением рН 7.8 и обладает сравнительно высокой механической прочностью, позволяющей применять его в реакторе с неподвижным слоем

Таким образом, существенными отличительными признаками заявляемого биокатализатора и способа его приготовления, по сравнению с прототипом, являются следующие: 1) использование для приготовления биокатализатора метода включения (а не ковалентного связывания) и инертных веществ (гидрогеля диоксида кремния), 2) более высокая глюкозоизомеразная активность биокатализатора (в 5 раз выше), чем в прототипе, 3) более высокий уровень сохранения исходной ферментативной активности клеток при иммобилизации, 4) применение для приготовления биокатализатора целых бактериальных клеток без предварительного выделения и очистки индивидуального фермента, 5) существенное ускорение (не менее чем в 2 раза) и упрощение процесса иммобилизации и приготовления биокатализатора.

Заявляемый набор свойств биокатализатора (состав, способ приготовления, ферментативная активность) обеспечивают высокую эффективность работы данного биокатализатора в реакции изомеризации глюкозы или фруктозы в глюкозо-фруктозные сиропы в проточных реакторах различного типа, в том числе с неподвижным слоем биокатализатора.

Для характеризации гидрогеля диоксида кремния и готового биокатализатора используют следующие физико-химические методы.

Весовым (гравиметрическим) методом по потере веса после сушки гидрогеля диоксида кремния при 105-120°С в течение 12 ч определяют влажность гидрогеля (W, вес.%). Методом БЭТ по тепловой десорбции аргона определяют величину удельной поверхности (S_уд, м²/г) высушенного гидрогеля диоксида кремния и готового биокатализатора. Весовым методом определяют насыпной вес высушенного гидрогеля диоксида кремния. Методом ртутной порометрии определяют объем (V_пор, см³/г) и диаметр пор (D_пор, нм) готового биокатализатора.

Биокаталитическую активность БКГИА определяют по скорости превращения (в мкмоль/мин) моносахарида (глюкозы или фруктозы) в глюкозо-фруктозный сироп в 0.02 М фосфатном буфере рН 7.8 при температуре реакции 60-70°С. Состав реакционной среды следующий: начальная концентрация моносахарида - 1.9-2.1 М (42-46% по сухим веществам); концентрациях ионов магния Mg (II) - 1 мМ; концентрациях кобальта Со (II) - 1 мМ. Удельную активность бактериальных клеток в суспензии и в иммобилизованном состоянии выражают в мкмоль/мин/г сухих клеток

Биокаталитическую активность приготовленных биокатализаторов определяют в аналогичных условиях - в 0.02 М фосфатном буфере рН 7.8 при температуре реакции 60-70°С. В проточный колоночный реактор загружают биокатализатор с размером гранул 0.4-3.0 мм в количестве 1 г и через неподвижный слой биокатализатора многократно прокачивают (циркулируют) реакционную среду объемом 10 мл описанного выше состава. Объемную скорость потока варьируют от 0.018 л/час до 0.42 л/ч. Активность биокатализатора выражают мкмоль/мин/г сухого биокатализатора.

Операционную стабильность биокатализатора оценивают по времени полуинактивации биокатализатора (t¹/₂). Активность определяют в реакции изомеризации 2 М фруктозы в 0.02 М фосфатном буфере рН 7.8 при температуре реакции 70°С. Один реакционный цикл продолжается в течение 2 ч, затем биокатализатор промывают буферным раствором рН 7.8 и хранят в этом буферном растворе при 20-22°С. Аналогичным образом измеряют активность биокатализатора в следующих реакционных циклах. Время полуинактивации соответствует времени, при котором отношение величины активности в реакционном цикле (А_i) к начальной активности (А_о) свежеприготовленного биокатализатора составляет 0.5.

Условия получения и свойства используемых гидрогелей диоксида кремния приведены в таблице 1.

Таблица 1
Условия получения и свойства гидрогелей диоксида кремния
Шифр образца	Условия получения гидрогеля	Свойства гидрогеля
Силикат	Осадитель	Tосаж °C	pHосаж	Скорость осаждения, г/л/ч	Влажность W, %	Sуд, м2/г	Нас. вес, г/см3
I		NH4NO3	70	7.5	300	90	550	0.1
II	Na2SiO3	NH4НСО3	70	6.5	270	95	500	0.1
III		(NH4)2SO4	70	7.5	270	88	350	0.12
IV	K2SiO3	(NH4)2SO4	20	7.5	150	80	150	0.30
V	Na2SiO3	Н2СО3	70	7.0	270	80	350	0.20
VI		HNO3	50	7.0	200	85	300	0.35
VII	H2SO4	20	9.0	30	60	30	0.70

Свойства катализаторов в зависимости от состава биокатализаторов, способа их приготовления приведены в таблице 2.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Приготовление биокатализатора

В качестве биомассы бактериальных клеток с глюкозоизомеразной активностью (БКГИА) используют жизнеспособные нерастущих клетки актиномицета Arthrobacter nicotianae, выращенные на сахарозе и собранные в стационарной фазе роста путем центрифугирования при 3-5 тыс.об/мин. Биомасса представляет собой пасту желтого цвета с влажностью 75-80% и обладает ферментативной активностью в реакции изомеризации глюкозы или фруктозы, равной 300-500 мкмоль/мин/г сухих клеток.

Для приготовления биокатализатора используют биомассу с удельной глюкозоизомеразной активностью 270 мкмоль/мин/г сухих клеток.

Гидрогель диоксида кремния получают путем взаимодействия силиката натрия с нитратом аммония при температуре 70°С, рН 7.5, скорости осаждения 300 г SiO₂ /л/ч (образец под шифром I в таблице 1).

Иммобилизацию БКГИА и приготовление биокатализатора осуществляют следующим образом. 0.5 г влажной биомассы, 10.0 г влажного гидрогеля диоксида кремния, 0.05 мл раствора 0.2 М сульфата магния и 0.05 мл раствора 0.2 М сульфата кобальта тщательно перемешивают до однородной смеси. Аналогичные результаты получаются при использовании солей магния (II) и кобальта (II) в виде нитратов, или хлоридов. Затем полученную смесь высушивают при 70°С в течение 2 ч. Высушенную смесь прессуют при избыточном давлении 150 атм. Таблетки, полученные после прессования, механически размельчают и отсеивают фракции определенного гранулометрического состава на соответствующих ситах. Массовое соотношение основных компонентов (БКГИА и гидрогеля диоксида кремния) по сухим веществам составляет 1:10. Биокатализатор характеризуется следующим набором параметров: величина удельной поверхности 290 м²/г, объем пор 0.7 см³ и средний диаметр пор 10 нм.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул 0.4-3.0 мм равна 18 мкмоль/мин/г. Удельная активность иммобилизованных бактериальных клеток составляет 190 мкмоль/мин/ г сухих клеток, то есть при иммобилизации сохраняется 70% от исходной активности бактериальных клеток в суспензии. Стабильность такова, что биокатализатор сохраняет 50% первоначальной активности после 22 ч работы биокатализатора при 70°С (t¹/₂=22 ч).

Примеры 2, 3, 4. Приготовление биокатализатора

Аналогичны примеру 1, отличаются тем, что используют гидрогели диоксида кремния, описанные в таблице 1 под шифрами III, IV, VI.

Получаемые биокатализаторы аналогичны биокатализатору по примеру 1 (таблица 2).

Пример 5. Приготовление биокатализатора

Аналогичен примеру 1, отличается тем, что используют гидрогель диоксида кремния, описанный в таблице 1 под шифрами VII.

Полученный биокатализатор отличается от биокатализатора по примеру 1 более низкой удельной поверхностью и объемом пор, а также большим размером пор (таблица 2).

Пример 6. Приготовление биокатализатора

Аналогичен примеру 1, отличается тем, что массовое соотношение основных компонентов (БКГИА и гидрогеля диоксида кремния) по сухим веществам составляет 1:6.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул 0.5-2 мм равна 25 мкмоль/мин/г. Удельная ферментативная активность иммобилизованных бактериальных клеток составляет 200 мкмоль/мин/г сухих клеток, то есть при иммобилизации сохраняется 74% от исходной активности бактериальных клеток в суспензии. Стабильность биокатализатора такова, что биокатализатор сохраняет 50% первоначальной активности после 20 ч работы биокатализатора при 70°С (t¹/₂=20 ч).

Пример 7. Приготовление биокатализатора

Аналогичен примеру 1, отличается тем, что массовое соотношение основных компонентов (БКГИА и гидрогеля диоксида кремния) по сухим веществам 1:5. Удельная исходная активность бактериальных клеток в суспензии составляет 470 мкмоль/мин/г сухих клеток.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул 0.4-3.0 мм не зависит от размера гранул и составляет 61 мкмоль/мин/г. Удельная ферментативная активность иммобилизованных бактериальных клеток составляет 300 мкмоль/мин/г сухих клеток, то есть при иммобилизации сохраняется 64% от исходной активности бактериальных клеток в суспензии. Однако из-за высокого содержания БКГИА приготовленный биокатализатор в отличие от биокатализаторов по примерам 1-6 отличается низкой устойчивостью в реакционной среде. Вероятно, высокое содержание бактериальных клеток препятствует формированию текстуры диоксида кремния, и биокатализатор быстро разрушается в реакционной среде. Стабильность биокатализатора из-за низкой устойчивости не определена.

Пример 8. Приготовление биокатализатора

Аналогичен примеру 7, отличается тем, что продолжительность сушки при 70°С составляет 4 ч.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул биокатализатора 0.4-0.5 мм составляет 21 мкмоль/мин/г. Удельная ферментативная активность иммобилизованных бактериальных клеток составляет 100 мкмоль/мин/ г сухих клеток, то есть при иммобилизации сохраняется 20% от исходной активности интактных клеток в суспензии. Биокатализатор отличается сравнительно низкой активностью (по сравнению с примерами 1-5) из-за более продолжительной сушки, в результате которой наблюдается термоинактивация внутриклеточной глюкозоизомеразы.

Пример.9. Приготовление биокатализатора

Аналогичен Примеру 1, только для приготовления биокатализатора в качестве БКГИА используют биомассу рекомбинантного штамма-продуцента, полученного методами генетической инженерии на основе Escherichia coli K12.

Активность приготовленного биокатализатора равна 0.2 мкмоль/мин/г. Удельная ферментативная активность составляет 70 мкмоль/мин/г сухих клеток, то есть при иммобилизации сохраняется ˜2% от исходной активности клеток в суспензии. Биокатализатор сохраняет начальную активность в течение 6-8 час работы в условиях непрерывного процесса изомеризации фруктозы при 35°С, затем активность резко падает. Обнаружено, что при хранении 20-22°С в буферном растворе рН 7.8 активность биокатализатора падает в ˜1,5-2 раза в течение 1-2 сут.

Пример. 10. Приготовление биокатализатора

Аналогичен Примеру 1, только для приготовления биокатализатора используют биомассу клеток пекарских дрожжей с влажностью 70-80% и удельной активностью 600 мкмоль/мин/г сухих клеток.

Активность приготовленного биокатализатора равна 30 мкмоль/мин/г. При иммобилизации сохраняется ˜50% от исходной активности клеток в суспензии. Биокатализатор сохраняет более 80% начальной активности свежеприготовленного биокатализатора через 60 ч работы в условиях непрерывного процесса инверсии сахарозы в глюкозо-фруктозный сироп при 50°С.

Пример 11. Получение глюкозо-фруктозного сиропа

Используют биокатализатор по примеру 1. Приготовленный биокатализатор помещают в колоночный проточный реактор, и при 70°С через неподвижный слой с объемной скоростью циркуляции 0.042 л/час прокачивают реакционную среду следующего состава: 0.02 М фосфатный буфер рН 7.8; сульфат Mg(II) в концентрации 1 мМ; сульфат Со(II) в концентрации 1 мМ. Концентрация глюкозы составляет 44 вес.%, отличается тем, что объемную скорость потока реакционной среды варьируют от 0.018 л/ч до 0.42 л/ч. Результаты испытаний приведены в таблице 3. Как видно из таблицы 3, увеличение объемной скорости потока субстрата через неподвижный слой биокатализатора (≥0.042 л/ч) приводит к 2-кратному падению конверсии субстрата.

Таблица 3
Конверсия субстрата в зависимости от скорости потока через неподвижный слой биокатализатора
Скорость потока раствора субстрата через слой биокатализатора, л/ч	Конверсия субстрата*, % за 1 ч работы биокатализатора
0.018	12
0.042	12
0.144	6
0.42	6
* - доля прореагировавшего субстрата

Пример 12. Получение глюкозо-фруктозного сиропа

Аналогичен примеру 11, отличается тем, что используют биокатализатор по примеру 6 и проводят реакцию изомеризации 42%-ного раствора фруктозы в глюкозо-фруктозный сироп при 60°С. Результаты испытаний аналогичны приведенным в таблице 3. При увеличении объемной скорости потока субстрата через неподвижный слой биокатализатора конверсия субстрата падает в ˜2 раза.

Пример 13. Получение глюкозо-фруктозного сиропа

Биокатализатор по Примеру 10 помещают в колоночный проточный реактор, и через неподвижный слой биокатализатора (0.2 г) прокачивают раствор субстрата (0.01 л) с объемной скоростью циркуляции 1.8 л/час при 50°С. Состав реакционной смеси следующий: 0.05 М ацетатный буфер рН 4.6; 20% сахароза.

Конверсия субстрата за 20 ч работы биокатализатора составляет 100%, что соответствует получению глюкозо-фруктозного сиропа.

Как видно из приведенных примеров и таблицы 2, оптимальный состав основных компонентов (БКГИА и гидрогеля диоксида кремния по сухим веществам) составляет от 1:6 до 1:10. В этом случае биокатализатор для изомеризации глюкозы или фруктозы обладает хорошей устойчивостью в реакционной среде со значением рН 7.8 и высокой механической прочностью для использования в проточных реакторах. Повышение содержания бактериальных клеток в биокатализаторе препятствует образованию текстуры диоксида кремния, что приводит к снижению устойчивости биокатализатора в реакционной среде. Из приведенных примеров и таблицы 2 также видно, что повышение продолжительности сушки с 2 ч до 4 ч приводит в 3-кратному падению ферментативной активности биокатализатора вследствие термоинактивации внутриклеточной глюкозоизомеразы. Активность биокатализатора не зависит от размера его гранул в широком интервале от 0.4 мм до 3.0 мм, что свидетельствует о том, что биокатализатор работает с максимальной эффективностью в кинетической области и диффузионное торможение в реакции изомеризации моносахаридов отсутствует.

Таблица 2
Состав, способ получения и свойства биокатализаторов по примерам 1-8.
№ примера	Шифр гидрогеля	Активность БКГИА в суспензии*, мкмоль/мин/гсухих клеток	Соотношение основных компонентов БКГИА/SiO2**	Условия получения биокатализатора	Текстурные свойства биокатализатора	Биокаталитические свойства***
Tсушки, °C	Продолжительность сушки, ч	S, м2/г	Vпор, см3/г	Dпор, нм	Размер гранул, мм	Активность, мкмоль/ мин/г	t1/2, ч
1	I		1:10	70	2	290	0.8	10	0.4-3.0	18	22
2	III		1:10	70	2	290	0.8	11	0.5-2.0	18	21
3	IV		1:10	70	2	290	0.8	10	0.4-3.0	20	22
4	VI	270	1:10	70	2	290	0.8	12	0.5-2.0	19	23
5	VII		1:10	70	2	50	0.3	15	1.0-2.0	19	22
6	I		1:6	70	2	250	0.7	11	0.5-2.0	25	20
7	I	470	1:5	70	2	230	0.8	10	0.4-3.0	62	-
8	I	1:5	70	4	200	1.0	13	0.4-0.5	21	-
Обозначения:
* - бактериальные клетки с глюкозоизомеразной активностью;
- весовое соотношение основных компонентов биокатализатора: БКГИА и гидрогеля (в пересчете на сухие вещества), содержание дополнительных компонентов MgSO4 и CoSO4 составляет 1 мкмоль/г сухого биокатализатора;
*** - свойства определяют в реакторе при скорости потока через неподвижный слой биокатализатора 0.042 мл/мин.

1. Биокатализатор для получения глюкозо-фруктозных сиропов в процессе изомеризации глюкозы или фруктозы, включающий бактериальные клетки с глюкозоизомеразной активностью, растворимые соли магния и двухвалентного кобальта, диоксид кремния, при этом соотношение основных компонентов биокатализатора - биомассы бактериальных клеток и диоксида кремния, используемого в виде гидрогеля с влажностью 60-95%, составляет от 1:6 до 1:10 в весовых частях по сухим веществам.

2. Биокатализатор по п.1, отличающийся тем, что диоксид кремния содержится в виде гидрогеля со следующим набором свойств: величина удельной поверхности продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равна 30-550 м²/г, насыпная плотность продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равна 0,1-0,7 г/см³.

3. Биокатализатор по п.1, отличающийся тем, что в качестве дополнительных компонентов биокатализатора он содержит растворимые соли магния и двухвалентного кобальта в виде сульфатов, или нитратов, или хлоридов в количестве 1-1,2 мкмоль на 1 г сухого биокатализатора.

4. Биокатализатор по п.1, отличающийся тем, что он имеет величину удельной поверхности 50-300 м²/г, объем пор 0,3-1,0 см³/ и диаметр пор 10-15 нм.

5. Способ приготовления биокатализатора для получения глюкозо-фруктозных сиропов в процессе изомеризации глюкозы или фруктозы, характеризующийся тем, что иммобилизацию бактериальных клеток с глюкозоизомеразной активностью в диоксид кремния проводят путем смешения биомассы бактериальных клеток в виде влажной пасты, диоксида кремния в виде гидрогеля и солей магния и двухвалентного кобальта в виде водных растворов солей серной, или азотной, или соляной кислоты с последующей сушкой полученной смеси на воздухе при температуре 50-70°С в течение не более 2 ч, прессованием и грануляцией в частицы размером от 0,4 до 3,0 мм.

6. Способ по п.6, отличающийся тем, что диоксид кремния используют в виде гидрогеля со следующим набором свойств: влажность 60-95%, величина удельной поверхности продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равна 30-550 м²/г, насыпная плотность продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равна 0,1-0,7 г/см³.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что гидрогель диоксида кремния получают путем взаимодействия силиката натрия или калия с минеральной кислотой, выбранной из ряда серная, или азотная, или угольная, или путем взаимодействия с аммонийными солями серной, или азотной, или угольной кислот при значении рН 6,5-9, температуре 20-90°С, скорости осаждения 30-300 г SiO₂/л_сусп/ч с последующей отмывкой и фильтрацией гидрогеля.

8. Способ получения глюкозо-фруктозных сиропов в процессе изомеризации глюкозы или фруктозы, отличающийся тем, что используют биокатализатор для изомеризации глюкозы или фруктозы по пп.1-4 или приготовленный по пп.5-7.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что реакцию проводят в реакторе с неподвижным слоем при температуре 60-70°С и при скорости потока реакционной среды, содержащей глюкозу или фруктозу, через слой биокатализатора 0,02-0,04 л/ч.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что биокатализатор используют в виде частиц размером от 0,4 до 3,0 мм.