Способ прогнозирования нагноения однокамерной эхинококковой кисты у инвазированных детей

Изобретение относится к медицине и касается способа прогнозирования нагноения однокамерной эхинококковой кисты и унвазированных детей. Сущность изобретения включает выделение из лимфоцитов периферической венозной крови ДНК, проведение HLA-типирования и при обнаружении в генотипе аллеля DQB1*02 прогнозируют риск развития осложнений эхинококкоза, связанных с нагноением кисты у обследуемого. Преимущество изобретения заключается в возможности прогнозирования нагноения однокамерной эхинококковой кисты с высокой точностью.

 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к детской хирургии, и может быть использовано для выявления групп риска к развитию осложнения однокамерного эхинококкоза, связанного с нагноением кист у инвазированных детей.

При эхинококкозе, одном из самых тяжелых и широко распространенных паразитарных заболеваний, до сих пор остаются не до конца изученными вопросы клинической реализации инвазии, возникновения осложнений и рецидивов. Частота летальных исходов при эхинококкозе составляет 0,9-8%. Наиболее частой причиной смертности являются осложнения, связанные с нагноением и последующим прорывом кисты.

Несоответствие между уровнем инвазии эхинококком у различных видов потенциальных хозяев позволило предположить генетическую детерминированность в развитии инвазии (Озерецковская Н.Н. Цестодозы-зоонозы - неотложная глобальная проблема. // Мед. паразитол. и пар. болезни. 2001. С. 52-59). Исследование в Европе показало ассоциацию HLA В8, DR3, DQ2 гаплотипов, а в Китае - HLA DR4 с тяжелым течением альвеолярного эхинококкоза (Godot V, Harraga S, Beurton I., et al. Resistance/susceptibility to Echinococcus multilocularis infection and cytokine profile in humans. II. Influence of the HLA В8, DR3, DQ2 haplotype. Clin Exp Immunol 2000. V.121. P.491-98). Определение частоты распространения антигенов HLA, 1 класса показало большую встречаемость В5 и В18 при гидатидозном (цистный, однокамерный) и A1, B35 при альвеолярном эхинококкозах (Щербаков A.M., Монхе-Барредо П.А. Распределение антигенов системы HLA среди больных эхинококкозами. // Мед. паразитол. 1989. №6. С.75).

Таким образом, на основании обнаружения ассоциаций аллелей генов главного комплекса гистосовместимости (HLA) с развитием инвазии была определена генетическая предрасположенность к развитию определенной клинической формы эхинококкоза.

Авторами в научно-медицинской и патентной литературе не обнаружено сведений об известности способа прогнозирования осложнений гидатидозного эхинококкоза, связанного с нагноением кист у инвазированных детей.

Клиническая диагностика осложненного нагноением эхинококкоза у детей представляет значительные трудности, поскольку картина заболевания чаще всего отличается полиморфизмом и не имеет четких дифференциально-диагностических признаков. Общепринятые лабораторные анализы в большинстве случаев малоспецифичны, диагноз осложненного нагноением эхинококкоза устанавливается инструментальными методами исследования (УЗИ, КТ, рентген) часто в запущенных случаях. Своевременная диагностика осложнений имеет также значение при определении характера и методики оперативного вмешательства.

При изучении характера распределения аллелей HLA у больных цистным эхинококкозом детей, проживающих в районах Южного Урала (Республике Башкортостан), выявлено, что при осложненном нагноением кисты эхинококкозе чаще, чем при не осложненном течении заболевания, встречается аллель DQB1*02 (46,1% против 21,6% при неосложненной форме заболевания; χ2=4,59; р=0,03; OR=3,10). Показатель относительного риска развития осложнений эхинококкоза для лиц, носителей данного аллеля гена, оказался равным RR=2,21. Причиной нагноения кисты считают гибель ларвоцисты Echinococcus granulosus из-за несовместимости по HLA-антигенам (феномен генетической рестрикции).

Таким образом, генетическое тестирование полиморфизма HLA у инвазированных эхинококком, позволяет с большой вероятностью (OR=3,10) прогнозировать возможность нагноения кисты до появления выраженных клинических симптомов болезни.

Задачей изобретения является разработка объективного, высокоинформативного способа прогнозирования осложнения цистного эхинококкоза, связанного с нагноением кист у инвазированных детей, на основе выявления молекулярно-генетических маркеров. Метод доступен по реактивам и оборудованию.

Технический результат - получение критериев прогноза развития нагноившихся кист у больных цистным эхинококкозом.

Способ осуществляется следующим образом.

Материалом для исследования служат образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови у больных эхинококкозом детей методом фенольно-хлороформной экстракции, описанным Mathew С.С. (The isolation of high molecular weight eucariotic DNA// Methods in Molecular Biology / Ed. J.M. Walker. - New York., London. - 1984. - Vol.2. - P.31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивают и переливают в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляют 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трисHCl (рН 7,6).

2. Смесь центрифугируют 20 мин при 4000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, рН 8.0, суспензируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°С.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0.5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1 М трисHCl до рН 7,8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и не денатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной Н₂О; раствор хранят при t-20°C.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации нужного фрагмента.

Применяют стандартный набор реагентов для типирования гена HLA DQB 1 (фирмы «PROTRANS», Германия). Амплификацию специфичностей гена DQB1 проводят в реакционной смеси, содержащей 35 мкл геномной ДНК (концентрация 50-300 нг/мкл), 1,1 мкл Taq-полимеразы (5 Ед/мкл), 46 мкл буфера R, 93 мкл буфера Y. Реакционную смесь распределяют по 10 мкл в 16 эппендорфов, на дно которых нанесены олигонуклеотидные праймеры. Режим амплификации следующий: начальная денатурация при 94°С в течение 2 мин; 10 циклов, включая денатурацию при 94°С - 10 сек, отжиг праймеров и синтез ДНК при 65°С - 1 мин; 20 циклов, включая денатурацию при 94°С - 10 сек, отжиг праймеров при 61°С - 50 сек; синтез ДНК при 72°С - 30 сек. После амплификации фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле, окрашивают раствором бромида этидия и анализируют в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. В качестве электролита для электрофореза применяют 0,5Х боратный буфер (0,089 М трисHCl, рН 7,9; 0,089 М борная кислота, 0,002 ЭДТА с рН 8,0). Продукт амплификации виден в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета.

Идентифицированные аллели гена HLA DQB1 классифицируют согласно общепринятой в мире номенклатуре (Nomenclature for factors of the HLA system, 1995 / J.G.Bodmer, S.G.E.Marsh, T.D.Albert et al. // Hum. Immunol. 1995. V.43. P.149-164).

Для количественной оценки предрасположенности к развитию эхинококкоза для вышеуказанного генетического маркера вычисляют показатель соотношения шансов (odds ratio - OR). Для этого используют формулу, предложенную Бландом (Bland, J.M. The odds ratio / J.M. Bland, D.G. Altman // Br. Med. J. - 2000. - Vol.320. - P.1468):

OR=(a×d)/(b×c),

где a - число лиц с наличием, b - с отсутствием маркера (аллеля HLA) среди больных осложненным эхинококкозом; c и d- число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди индивидов с неосложненным течением заболевания. Повышенный риск развития констатировали при OR>1.

Были исследованы дети (N=100), больные цистным эхинококкозом, поступившие на хирургическое лечение в Республиканскую детскую клиническую больницу (г.Уфа). Возраст пациентов - от 3 до 16 лет. Основную долю обследованных лиц составили дети школьного (71%) возраста. По половому составу распределение было следующим: 57% мальчики, 43% девочки. Поражение печени наблюдалось у 47% пациентов, легкого - 30%, сочетанное поражение легкого и печени - 23%. Диагноз был установлен на основании клинических, инструментальных (УЗИ, КТ, рентгенографии) методов и подтвержден после оперативного вмешательства гистологическим исследованием оболочки кисты. Контрольную группу составили 95 практически здоровых лиц, жителей районов Южного Урала. Возраст индивидов контрольной группы варьировал от 5 до 16 лет. Группы обследованных пациентов и контроля были сопоставимы по возрасту, полу и местожительству.

Изучение характера распределения аллелей HLA DQB 1 у больных в зависимости от клинической формы и тяжести течения заболевания показало на статистически значимые отличия. Установлено, что наиболее часто (46,1%) в группе больных с осложненным (нагноением кисты) течением эхинококкоза встречается аллель DQB1*02; в группе больных с неосложненным течением эта аллель выявлена в 21,6% случаев, то есть более чем в 2 раза реже (χ2=4,59; р=0,03; OR=3,10). Наиболее редко встречается при нагноившемся эхинококкозе аллель DQB1*07 (3,8% против 18,9% при неосложненной форме заболевания; р=0,12).

Полученные результаты показывают, что наличие аллеля HLA DQB1*02 в генотипе является предрасполагающим фактором к развитию осложненного нагноением кисты цистного эхинококкоза у детей, поэтому его можно использовать в качестве генетического маркера риска. Определение прогностических маркеров имеет большое практическое значение, поскольку нагноившийся эхинококкоз характеризуется распространением воспалительной реакции с кисты на прилежащую ткань пораженного органа, и возникает необходимость проведения интенсивной пред- и послеоперационной консервативной терапии для предупреждения цирротических изменений.

Пример 1. Девочка З., 9 лет, поступила в хирургическое отделение с жалобами на общую слабость, похудание, температуру до 38°С, боли в правом подреберье.

Объективно: состояние удовлетворительное; кожа и видимые слизистые бледны. В правом подреберье определяется болезненность, живот не вздут, мягкий. Печень выступает из-под края реберной дуги на 2 см. В легких везикулярное дыхание. Сердечные тоны ритмичные, приглушены, пульс 98 в минуту. Анализ крови: эр - 3,4×10¹²/л, л - 10,5×10⁹/л, э - 3%, с - 48%, лф - 32%, м - 9%, СОЭ - 29 мм/час. УЗИ органов брюшной полости выявило жидкостное объемное образование округлой формы, расположенное в III сегменте печени, размером 39×34 мм с четкими ровными контурами, гиперэхогенными включениями внутри и взвесью.

Проведено исследование по предложенной методике. Установлено: является носителем аллеля HLA DQB1*02. В отношении нагноения эхинококковой кисты прогноз неблагоприятный. Рекомендовано экстренное оперативное вмешательство и проведение интенсивной пред- и послеоперационной консервативной терапии для предупреждения цирротических изменений.

Произведена лапароскопическая эхинококкэктомия. В полости кисты выявлена мутная паразитарная жидкость. Гистологическое исследование хитиновой оболочки показало на воспалительные изменения.

Пример 2. Мальчик Р., 11 лет, поступил в хирургическое отделение с жалобами на боли в животе. После госпитализации и обследования выставлен диагноз: эхинококковая киста правой доли печени. Данные ультразвукового исследования выявили в правой доле (6-7 сегментах) жидкостное образование овальной формы с четкими ровными контурами, размерами 78×53 мм. Перед операцией проведено исследование по предложенной методике. Установлено: является носителем аллеля HLA DQB1*07. В отношении развития нагноения кисты прогноз благоприятный. Послеоперационная ревизия кисты признаков нагноения не выявила.

Способ прогнозирования нагноения однокамерной эхинококковой кисты у инвазированных детей, характеризующийся тем, что из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят HLA-типирование и при обнаружении аллеля DQB1*02 прогнозируют риск развития нагноения кисты у обследуемого.