Дифференцирующий и специфический олигонуклеотиды для идентификации последовательностей днк инфекционных агентов в биологических материалах, способ видовой идентификации инфекционных агентов, биочип и набор для осуществления этого способа
Владельцы патента RU 2348695:
Закрытое акционерное общество "Молекулярно-медицинские технологии" (RU)
Изобретение относится к области микробиологии, вирусологии и молекулярной биологии и может быть использовано в медицине. В способе видовой идентификации инфекционных агентов проводят мультиплексную полимеразную цепную реакцию в присутствии специфических олигонуклеотидов в качестве праймеров с последующей гибридизацией ПЦР-продуктов с дифференцирующими олигонуклеотидами на микрочипе и определяют урогенитальную инфекцию по наличию гибридизационных комплексов. Отдельные специфические олигонуклеотиды и дифференцирующие олигонуклеотиды формируют композиции для идентификации Human herpesvirus 5, Human herpesvirus 4, herpesvirus 1 и/или Human herpesvirus 2, Human Streptococcus agalactiae и/или Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Candida albicans, Ureaplasma urealyticum и/или Ureaplasma parvum, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis. Указанные специфические олигонуклеотиды и микрочип с дифференцирующими олигонуклеотидами входят в набор для видовой идентификации урогенитальной инфекции. Предложенное изобретение позволяет ускорить проведение анализа урогенитальной инфекции и повысить его точность. 18 н. и 31 з.п. ф-лы, 15 ил., 4 табл.
Текст описания приведен в факсимильном виде.
1. Способ идентификации урогенитальной инфекции, включающий обеспечение образца ДНК, одного или более инфекционных агентов в урогенитальной области, прямых и обратных праймеров, специфичных к ДНК, и биологического микрочипа, проведение ПЦР в присутствии образца ДНК, инкубацию ПЦР-продукта с дифференцирующими олигонуклеотидами, иммобилизованными на поверхности биологического микрочипа, в условиях гибридизации, определение урогенитальной инфекции детекцией образованных гибридизационных комплексов на микрочипе, отличающийся тем, что биологический микрочип содержит дифференцирующие олигонуклеотиды с последовательностями, представленными в SEQ ID NO:59-87, в качестве специфичных праймеров используют праймеры, последовательность которых выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-58, в качестве ПЦР используют мультипраймерную ассиметричную ПЦР, причем, в паре прямого и обратного праймеров один праймер содержит метку, которую после гибридизации ДНК детектируют, регистрируют и используют для идентификации инфекционных агентов в урогенитальной области.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что проводят детекцию образцов на наличие в них, по крайней мере, одной ДНК, принадлежащей гену, входящему в перечень патогенных организмов приведенных в таблице 1.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что образец исследуемой ДНК выделяют, по крайней мере, из одного образца биологического материала человека, входящего в группу, состоящую из крови, биопсийного материала, слюны, слезных выделений, мочи, бронхо-авеолярного лаважа, ликвора или их комбинаций.
4. Способ по п.1, где биологический микрочип получают модификацией несущей поверхности микрочипа и иммобилизацией на нее дифференциальных олигонуклеотидов.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что модификацию поверхности несущего элемента микрочипа осуществляют с применением раствора 3-аминопропилтриэтоксисилана.
6. Способ по п.1, где гибридизацию проводят при температуре от 35 до 50°С в буфере, содержащем от 0,5 × до 5 × SSC; 0,1% SDS; до 25% формамида и/или до 10 мМ ЭДТА.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что определяемую метку выбирают из группы, состоящей из каталитических, лигандных, флуоресцентных или радиоактивных молекул.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что каталитическую молекулу выбирают из группы, включающей гемин, цианкобаламин или флавин.
9. Способ по п.7, отличающийся тем, что лигандная молекула выбрана из группы, включающей биотин, диоксигенин или динитробензол.
10. Способ по п.7, отличающийся тем, что флуоресцентная молекула выбрана из группы, включающей FAM, TAMRA, Cy3, Cy5, Cy7, R6G, R110, ROX или JOE.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что детектирование и/или идентификацию инфекционных агентов осуществляют путем сравнительного анализа уровня сигналов исследуемого образца, положительного и отрицательного контролей.
12. Специфический олигонуклеотид для использования в способе идентификации урогенитальной инфекции по пп.1-11, который выбирают в качестве праймера ассиметричной мультипраймерной ПЦР и который характеризуется нуклеотидной последовательностью, выбранной из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:1-58.
13. Дифференцирующий олигонуклеотид, в качестве зонда для видовой идентификации инфекционного агента для использования в способе идентификации урогенитальной инфекции по пп.1-11, который характеризуется нуклеотидной последовательностью, выбранной из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:59-87.
14. Композиция олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Chlamydia trachomatis, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO:59 и SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 либо SEQ ID NO:60 и SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4.
15. Композиция олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Neisseria gonorrhoeae, отличающаяся тем, включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO:61 и SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6, либо SEQ ID NO:62 и SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:84, либо SEQ ID NO:63 и SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10.
16. Композиция олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Trichomonas vaginalis, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO:64 и SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12 либо SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14.
17. Композиция олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Ureaplasma urealyticum и/или Ureaplasma parvum, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO:66 и SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16 либо SEQ ID NO:67 и SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:18.
18. Композиция олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Candida albicans, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO:68 и SEQ ID NO:19 и SEQ ID NO:20 либо SEQ ID NO:69 и SEQ ID NO:21 и SEQ ID NO:22.
19. Композиция олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Mycoplasma genitalium, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO:70 и SEQ ID NO:23 и SEQ ID NO:24, либо SEQ ID NO:71 и SEQ ID NO:25 и SEQ ID NO:26, либо SEQ ID NO:72 и SEQ ID NO:27 и SEQ ID NO:28.
20. Композиция олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Mycoplasma hominis, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:29 и SEQ ID NO:30, либо SEQ ID NO:74 и SEQ ID NO:31 и SEQ ID NO:32, либо SEQ ID NO:75 и SEQ ID NO:33 и SEQ ID NO:34.
21. Композиция олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Gardnerella vaginalis, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO:76 и SEQ ID NO:35 и SEQ ID NO:36, либо SEQ ID NO:77 и SEQ ID NO:37 и SEQ ID NO:38, либо SEQ ID NO:78 и SEQ ID NO:39 и SEQ ID NO:40.
22. Композиция олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Streptococcus agalactiae, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:79 и SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:42.
23. Композиция олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Streptococcus agalactiae и/или Streptococcus pyogenes, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:80 и SEQ ID NO:43 и SEQ ID NO:44.
24. Композиция олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Human herpesvirus 1 и/или Human herpesvirus 2, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO:81 и SEQ ID NO:45 и SEQ ID NO:46, либо SEQ ID NO:82 и SEQ ID NO:47 и SEQ ID NO:48.
25. Композиция олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Human herpesvirus 4, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO:83 и SEQ ID NO:49 и SEQ ID NO:50, либо SEQ ID NO:84 и SEQ ID NO:51 и SEQ ID NO:52, либо SEQ ID NO:85 и SEQ ID NO:53 и SEQ ID NO:54.
26. Композиция олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Human herpesvirus 5, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO:86 и SEQ ID NO:55 и SEQ ID NO:56, либо SEQ ID NO:87 и SEQ ID NO:57 и SEQ ID NO:58.
27. Биологический микрочип для видовой идентификации урогенитальной инфекции, представляющий собой несущий элемент, на котором иммобилизованы дифференцирующие олигонуклеотиды с последовательностями, представленными в SEQ ID NO:59-87
28. Микрочип по п.27, отличающийся тем, что несущий элемент чипа выполнен из материалов входящих в группу, состоящую из: полимеров, стекла, металлов, керамики или их комбинаций.
29. Микрочип по п.28, отличающийся тем, что полимеры выбирают из группы состоящей из: полиметилметакрилата, полибутилметакрилата, поливинилхлорида, поликарбоната, сополимеров метилметакрилата и/или сополимеров бутилметакрилата с другими мономерами, такими, как стирол, акрилонитрил.
30. Микрочип по п.29, отличающийся тем, что в качестве полимера используют полиметилметакрилат.
31. Микрочип по п.29, отличающийся тем, что в качестве полимера используют поливинилхлорид.
32. Микрочип по п.27, отличающийся тем, что несущий элемент чипа выполнен в виде плоских платформ, пленок.
33. Микрочип по п.27, отличающийся тем, что форма несущего элемента, выполненного в виде плоских платформ или пленки, представляет собой прямоугольник, квадрат, многоугольник или круг.
34. Микрочип по п.33, отличающийся тем, что толщина несущего элемента составляет от 0,5 до 5,0 мм.
35. Микрочип по п.27, отличающийся тем, что несущий элемент выполнен в форме индивидуального чипа или мультичипа.
36. Микрочип по п.35, отличающийся тем, что несущий элемент выполнен в форме мультичипа, состоящего из N отделяемых от несущего элемента индивидуальных чипов.
37. Микрочип по п.27, отличающийся тем, что дифференцирующие олигонуклеотиды иммобилизованы на несущей поверхности в форме кластеров.
38. Микрочип по п.37, отличающийся тем, что количество кластеров, размещенных в рабочей зоне каждого индивидуального чипа, составляет от 2 до 1000.
39. Микрочип по п.37, отличающийся тем, что количество кластеров, размещенных в рабочей зоне каждого индивидуального чипа, составляет 15.
40. Микрочип по п.37, отличающийся тем, что состав кластеров, размещенных на рабочей зоне чипа, выбирают из группы: кластеры зондов, кластеры положительных контролей, кластеры отрицательных контролей.
41. Микрочип по п.40, отличающийся тем, что соотношение между количеством кластеров, в которых размещают зонды, и кластеров, в которых размещают положительные контроли, выбирают в диапазоне от 1:1 до 500:1.
42. Микрочип по п.40, отличающийся тем, что соотношение между количеством кластеров, в которых размещают зонды, и кластеров, в которых размещают отрицательные контроли, выбирают в диапазоне от 1:1 до 500:1.
43. Микрочип по п.37, отличающийся тем, что количество нанесенных зондов одного типа дифференцирующего олигонуклеотида на поверхности каждого кластера составляет от 1 до 50.
44. Микрочип по п.37, отличающийся тем, что количество нанесенных зондов одного типа дифференцирующего олигонуклеотида в каждом кластере составляет 4 или 9.
45. Микрочип по п.40, отличающийся тем, что объем капель каждого зонда составляет не менее 0,005 мкл.
46. Микрочип по п.36, отличающийся тем, что отдельные микрочипы получают посредством отделения чипа от несущего элемента, причем отделение осуществляют отламыванием, отрезанием, отрубанием.
47. Набор для видовой идентификации урогенитальной инфекции, включающий:
а) по меньшей мере, один биологический индивидуальный микрочип для проведения разовой диагностики или биологический мультичип для проведения параллельного или последовательного скрининга, содержащий дифференцирующие олигонуклеотиды с последовательностями, представленными в SEQ ID NO:59-87;
б) реагенты, которые выбирают из реагентов для подготовки образца, реагентов для проведения ПЦР, реагентов для проведения гибридизации и их комбинации;
в) специфические олигонуклеотиды в качестве праймеров ПЦР для видовой идентификации инфекционного агента с последовательностями, которые выбирают из SEQ ID NO:1-58.
48. Набор по п.48, отличающийся тем, что дополнительно содержит устройство для проведения гибридизации и/или устройство для сканирования и интерпретации результатов анализа, причем для сканирования используют устройство, входящее в группу, состоящую из: ручного сканера, сканера индивидуальных чипов, планшетного сканера мультичипов, сканера дисковых мультичипов и компьютера как средства для интерпретации и хранения результатов диагностики.
