Анти-nogo антитела ("11с7") и их фармацевтическое использование

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Описана связывающая молекула, которая является моноклональным антителом или его фрагментом, способным связываться с человеческим полипептидом NogoA, человеческим NogoA 623-640. Представлен полинуклеотид, кодирующий описанную молекулу. Описан вектор экспрессии, включающий представленный полинуклеотид. Представлена клетка-хозяин, включающая представленный полинуклеотид или описанный вектор. Описана фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, связанных с восстановлением нерва, содержащая описанную связывающую молекулу. Настоящее изобретение позволяет получить антитела, способные связывать NogoA 623-640. 7 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.

 

Настоящее изобретение относится к связывающим NogoA молекулам, таким, например, как моноклональные антитела или их Fab-фрагменты.

Регенерация поврежденных нервных клеток в центральной нервной системе (ЦНС) взрослого индивидуума ограничена подавляющим эффектом со стороны миелинового окружения аксонов (или нейритов) и формирующейся рубцовой ткани. За последние несколько лет были открыты явления, важные для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе неспособности ЦНС к спонтанному самовосстановлению после повреждения. Присутствие в миелине тормозящих рост молекул является главным препятствием к регенерации аксонов, в особенности сразу после повреждения. На сегодняшний день известны и охарактеризованы такие мощные ингибиторы роста аксонов, как NogoA, миелин-ассоциированный гликопротеин (MAG) и миелин-олигодендроцитный гликопротеин (Omgp). Кроме того, в миелине присутствуют и другие тормозящие регенерацию компоненты, такие как хондроитинсульфатные протеогликаны. Белок NogoA относится к семейству ретикулонов и имеет, по меньшей мере, два биологически активных и различных в фармакологическом отношении домена, которые называются Amino-Nogo и Nogo-66. Рецепторный сайт для первого из них пока неизвестен, a Nogo-66 тормозит рост нейронов in vitro и in vivo при участии нейронального рецептора NgR. Помимо Nogo-66 с рецептором NgR также связываются, подавляя рост нейритов (или аксонов), MAG и Omgp, причем это связывание отличается высокой аффинностью.

В настоящее время изучаются новые подходы к решению проблемы восстановления нервной ткани, в том числе ферментативное расщепление рубцовой ткани хондроитиназой АВС, формирование клеточного моста за счет трансплантации клеток обонятельной оболочечной глии и стволовых клеток, применение белковых факторов роста для стимуляции роста нервных клеток; блокирование действия ингибиторов роста аксонов путем модуляции медиаторов межклеточных коммуникаций, таких как Rho, связанная с мембраной гуанозин-трифосфатаза (ГТФ-аза), которая представляется ключевым звеном в подавлении роста аксонов; применение циклической аденозин-монофосфатазы (цАМФ-аза), которая может преодолевать связанное с миелином подавление регенерации in vitro и индуцировать регенерацию in vivo; использование пептидных ингибиторов рецептора NgR (NEP 1-40) для индукции роста и функционального восстановления нейронов у крыс после повреждения спинного мозга.

Помимо вышеописанных подходов привлекает внимание возможность нейтрализации молекул центральной и периферической нервной системы, тормозящих рост аксонов, моноклональными антителами, в частности нейтрализация подавляющего действия NogoA. Так, было показано, что моноклональные антитела IN-1 или Fab-фрагменты IN-1 индуцируют рост аксонов in vitro и стимулируют образование новых отростков (процесс получил название "спраутинг") и регенерацию in vivo (Schwab и др., Physiol. Rev., т.76, 1996, с.319-370). По результатам тестирования различных доменов молекулы NogoA на способность подавлять рост нейритов было описано несколько доменов, обладающих ингибирующей активностью (Chen и др. Nature, т.403, 2000, с.434-439; GrandPre и др., Nature, т.403, 2000, с.439-444; Prinjha и др., Nature, т.403, 2000, с.383-384; также см. подробный анализ в Примере 1).

Природные иммуноглобулины, или антитела, как правило, представляют собой Y-образные многомерные молекулы, имеющие антигенсвязывающий сайт на конце каждого верхнего «плеча». Остальная часть структуры, в частности ствол Y, выполняет присущие иммуноглобулинам эффекторные функции. Молекула антитела состоит из двух тяжелых и двух легких цепей. Как тяжелые, так и легкие цепи имеют вариабельный домен и константную часть. Антигенсвязывающий сайт состоит из вариабельного домена тяжелой цепи, связанного с вариабельным доменом легкой цепи. Вариабельные домены тяжелых и легких цепей имеют одинаковую общую структуру. Более конкретно, антигенсвязывающие свойства антитела по существу определяются тремя специфическими областями вариабельного домена тяжелой и легкой цепи, которые называются гипервариабельными участками или участками, определяющими комплементарность антител к антигену (CDR). Эти три гипервариабельных участка чередуются с четырьмя каркасными участками (FR), последовательности которых имеют относительно консервативный характер; непосредственного участия в связывании каркасные участки не принимают. CDR образуют петли и удерживаются на близком расстоянии друг от друга каркасными участками, которые в значительной степени принимают конформацию β-слоя. По существу, CDR тяжелой цепи вместе с CDR ассоциированной легкой цепи и составляют антигенсвязывающий сайт молекулы антитела. Какой участок антитела является каркасным (FR), а какой определяет комплементарность антитела к антигену (CDR), обычно выясняется путем сравнения аминокислотной последовательности множества антител, полученных у животных одного вида. Общие правила идентификации областей CDR и FR хорошо известны специалисту, работающему в данной области, и могут быть найдены в интернете, например, на сайте (http://www.bioinf.org.uk/abs/).

Неожиданно обнаружилось, что новые моноклональные мышиные антитела (именуемые здесь и далее «11C7») к фрагменту полипептида NogoA крысы (SEQ ID NO:1), относящиеся к типу IgG1, обладают лучшими свойствами, чем ранее полученные антитела к NogoA, особенно в отношении аффинности связывания с NogoA различных видов, включая человека, а также в отношении более высокой активности, направленной на нейтрализацию способности NogoA подавлять рост нейритов при заданной концентрации антител. Более того, сейчас уже возможно сконструировать другие связывающие NogoA молекулы, имеющие такие же гипервариабельные участки, как и вышеупомянутые антитела.

Таким образом, в настоящем изобретении представлены молекулы, связывающие определенные области или эпитопы NogoA (именуемые в настоящем описании «связывающие молекулы по изобретению» или просто «связывающие молекулы»). Связывающие молекулы по изобретению предпочтительно связывают NogoA_623-640 человека (ортологичный фрагмент, к которому получены антитела 11С7; = SEQ ID NO: 6), NiG-D20 человека (ортологичен самому маленькому фрагменту NogoA, сохраняющему способность подавлять рост нейритов, SEQ ID NO: 24), NogoA человека (SEQ ID NO: 5) или NiG человека (который является наиболее мощным по степени подавления роста нейритов фрагментом NogoA, начинающимся с аминокислоты в положении 186 и заканчивающимся аминокислотой в положении 1004 последовательности NogoA человека, SEQ ID NO: 5) с константой диссоциации (Kd)<1000 нМ, более предпочтительно с Kd<100 нМ, а наиболее предпочтительно с Kd<10 нМ. Реакция связывания может быть продемонстрирована с использованием стандартных методов (качественные методы), включая, например, метод ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), описанный в Примере 6, и метод определения аффинности комплементарных взаимодействий с использованием биосенсора, описанный в Примере 7. Кроме того, связывание с человеческим NogoA и, что еще более важно, его эффективность может быть продемонстрирована в тесте роста нейритов, например, как описано ниже.

Так, в другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения связывающие молекулы (в концентрации 1 мг/мл или, что более предпочтительно, в концентрации 0,1 мг/мл, но наиболее предпочтительно в концентрации 0,01 мг/мл культуральной среды) увеличивают количество нейритов у гранулярных клеток мозжечка крысы, растущих на субстрате, представляющем собой белковый экстракт спинного мозга крысы, по меньшей мере, на 20%, предпочтительно на 50%, а наиболее предпочтительно на 100%, по сравнению с количеством нейритов у гранулярных клеток мозжечка крысы, которые обрабатываются контрольными антителами, которые не связываются с NogoA человека, NiG человека, NiG-D20 человека или полипептидом NogoA_623-640 (т.е. имеют константу диссоциации >1000 нМ).

В другом предпочтительном варианте связывающие молекулы по изобретению имеют, по меньшей мере, один антигенсвязывающий сайт, который включает последовательно гипервариабельные области CDR1-11С7, CDR2-11С7 и CDR3-11C7, где CDR1-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, CDR2-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 и CDR3-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10; и их прямые эквиваленты.

В другом объекте изобретения предложены связывающие молекулы по изобретению, имеющие, по меньшей мере, один антигенсвязывающий сайт, который содержит или

а) последовательно гипервариабельные области CDR1-11С7, CDR2-11С7 и CDR3-11С7, где CDR1-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, CDR2-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 и CDR3-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, или

б) последовательно гипервариабельные области CDR1'-11С7, CDR2'-11С7 и CDR3'-11C7, где CDR1'-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, CDR2'-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, и CDR3'-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, или

в) их прямые эквиваленты.

Другим объектом настоящего изобретения являются связывающие молекулы по изобретению, содержащие, по меньшей мере,

а) первый домен, включающий последовательно гипервариабельные области CDR1-11С7, CDR2-11С7 и CDR3-11С7, где CDR1-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, CDR2-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 и CDR3-11C7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, и

б) второй домен, включающий последовательно гипервариабельные области CDR1'-11С7, CDR2'-11С7 и CDR3'-11С7, где CDR1'-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, CDR2'-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 и CDR3'-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, или

в) их прямые эквиваленты.

Кроме того, в настоящем изобретении также предлагаются связывающие молекулы по изобретению, содержащие, по меньшей мере, один антигенсвязывающий сайт, включающий

а) или вариабельную часть тяжелой цепи 11С7 (SEQ ID NO:2); или

б) вариабельную часть легкой цепи 11С7 (SEQ ID NO:3), или их прямые эквиваленты.

Когда антигенсвязывающий сайт включает оба домена - и первый, и второй - они могут находиться на одной и той же полипептидной молекуле или, что более предпочтительно, на разных, при этом первый домен является частью тяжелой цепи иммуноглобулина или его фрагмента, а второй домен является частью легкой цепи иммуноглобулина или его фрагмента.

Примеры связывающих молекул по изобретению включают антитела, продуцируемые В-клетками или клетками гибридомы, гибридные или гуманизированные антитела или любые их фрагменты, например F(ab')2; и Fab-фрагменты, а также одноцепочечные антитела или антитела, имеющие единственный домен.

Одноцепочечные антитела состоят из вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, ковалентно связанных линкерным пептидом, как правило, состоящим из 10-30 аминокислот, предпочтительно от 15 до 25 аминокислот. Так что такая структура не включает константные части тяжелой и легкой цепи, а антигенность пептидного спейсера небольшого размера считается более низкой, чем антигенность целой константной части. Под «гибридным антителом» понимают антитело, в котором константная область тяжелой цепи или константная область легкой цепи, или константные области обеих цепей имеют человеческое происхождение, тогда как вариабельные домены и тяжелой цепи, и легкой цепи являются по своему происхождению не человеческими, а, например, мышиными. Под «гуманизированным антителом» понимают антитело, в котором гипервариабельные области (CDR) являются по своему происхождению не человеческими, а, например, мышиными, тогда как все или по существу все остальные части иммуноглобулина, т.е. константные области и высококонсервативные части вариабельных доменов, например каркасные области, имеют человеческое происхождение. Гуманизированное антитело, однако, может сохранять несколько аминокислот мышиной последовательности в частях каркасных областей, прилежащих к гипервариабельным областям.

Гипервариабельные области могут быть связаны с любого рода каркасным участком, предпочтительно мышиного или человеческого происхождения. Пригодные для этой цели каркасные области описаны Kabat и др. в книге Sequences of proteins of immunological interest (Департамент здравоохранения и социального обеспечения США, Служба общественного здравоохранения, Национальный институт здоровья). Константная часть человеческой тяжелой цепи связывающих молекул предпочтительно относится к типу IgG4, включая субтипы, константная часть человеческой легкой цепи предпочтительно относится к типу κ или λ, но более предпочтительно к типу κ.

Моноклональные антитела к человеческому белку могут быть получены, например, у мышей, но прямым следствием такого способа получения будет то, что ксеногенное антитело при попадании в организм человека вызовет нежелательную иммунную реакцию, которая осуществляется главным образом при участии константной части ксеногенного иммуноглобулина. Такие антитела не могут вводиться в течение длительного времени, что естественным образом ограничивает их применение. Поэтому особенно предпочтительны для применения одноцепочечные антитела, антитела с единственным доменом, гибридные антитела или гуманизированные антитела, которые с низкой вероятностью вызовут существенный аллогенный ответ при введении людям.

В свете всего вышесказанного более предпочтительный вариант связывающих молекул по изобретению выбирают из гибридных антител, которые содержат, по меньшей мере,

а) одну тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент с (1) вариабельным доменом, включающим последовательно гипервариабельные области CDR1-11С7, CDR2-11С7 и CDR3-11С7, и (2) константной частью тяжелой цепи иммуноглобулина человека или ее фрагментом, где CDR1-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, CDR2-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 и CDR3-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, и

б) одну легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент с (1) вариабельным доменом, включающим последовательно гипервариабельные области CDR1'-11С7, CDR2'-11С7 и CDR3'-11С7, и (2) константной частью человеческой легкой цепи или ее фрагментом, где CDR1'-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, CDR2'-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 и CDR3'-11C7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, или

их прямые эквиваленты.

Альтернативно, связывающие молекулы по изобретению могут представлять собой одноцепочечную связывающую молекулу, которая имеет антигенсвязывающий сайт, содержащий

а) первый домен, включающий последовательно гипервариабельные области CDR1-11C7, CDR2-11C7 и CDR3-11C7, где CDR1-11C7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, CDR2-11C7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 и CDR3-11C7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, и

б) второй домен, включающий последовательно гипервариабельные области CDR1'-11C7, CDR2'-11C7 и CDR3'-11C7, где CDR1'-11C7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, CDR2'-11C7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 и CDR3'-11C7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, и

в) линкерный пептид, который связывается или с N-концом первого домена и С-концом второго домена, или с С-концом первого домена и N-концом второго домена; или

их прямые эквиваленты.

Хорошо известно, что минимальные изменения в аминокислотной последовательности, такие как делеции, добавления или замены одной или нескольких аминокислот, могут приводить к образованию аллельных форм исходного белка, которые имеют по существу те же самые свойства. Таким образом, термин «их прямые эквиваленты» означает или любую связывающую молекулу по изобретению с единственным доменом (молекула X),

(1) в которой каждая из гипервариабельных областей CDR1, CDR2 и CDR3 связывающей молекулы по меньшей мере на 50 или 80% гомологична, предпочтительно по меньшей мере на 90% гомологична, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99% гомологична эквивалентным гипервариабельным областям CDR1-11C7 (SEQ ID NO:8), CDR2-11C7 (SEQ ID NO:9) CDR3-11C7 (SEQ ID NO:10), тогда как CDR1 эквивалентен CDR1-11C7, CDR2 эквивалентен CDR2-11C7 и CDR3 эквивалентен CDR3-11C7; и

(2) которая способна связываться с NogoA человека, NiG человека, NiG-D20 человека или NogoA_623-640 человека, предпочтительно с константой диссоциации (Kd)<1000 нМ, более предпочтительно с Kd<100 нМ, но наиболее предпочтительно с Kd<10 нМ, или

любую связывающую молекулу по изобретению, имеющую, по меньшей мере, два домена в каждом сайте связывания (молекула X'),

(1) в которой каждая из гипервариабельных областей CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' и CDR3' связывающей молекулы, по меньшей мере, на 50 или 80% гомологична, предпочтительно по меньшей мере на 90% гомологична, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99% гомологична эквивалентным гипервариабельным областям CDR1-11С7 (SEQ ID NO:8), CDR2-11C7 (SEQ ID NO:9), CDR3-11C7 (SEQ ID NO:10), CDR1'-11C7 (SEQ ID NO:11), CDR2'-11C7 (SEQ ID NO:12) и CDR3'-11C7 (SEQ ID NO:13), тогда как CDR1 эквивалентен CDR1-11C7, CDR2 эквивалентен CDR2-11C7, CDR3 эквивалентен CDR3-11C7, CDR1' эквивалентен CDR1'-11C7, CDR2' эквивалентен CDR2'-11C7, CDR3' эквивалентен CDR3'-11C7; и

(2) которая способна связываться с NogoA человека, NiG человека, NiG-D20 человека или NogoA_623-640 человека, предпочтительно с константой диссоциации (Kd)<1000 нМ, более предпочтительно с Kd<100 нМ, но наиболее предпочтительно с Kd<10 нМ.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения в них, например, предлагается связывающая молекула, которая способна связываться с человеческим NogoA, человеческим NiG, человеческим NiG-D20 или человеческим NogoA_623-640 с константой диссоциации <1000 нМ и имеет, по меньшей мере, один антигенсвязывающий сайт, который включает или

- последовательно гипервариабельные области CDR1, CDR2 и CDR3, каждая из которых гомологична, по меньшей мере, на 50%, а предпочтительно на 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% соответствующей эквивалентной гипервариабельной области CDR1-11C7 (SEQ ID NO:8), CDR2-11C7 (SEQ ID NO:9) и CDR3-11C7 (SEQ ID NO:10); или

- последовательно гипервариабельные области CDR1', CDR2' и CDR3', каждая из которых гомологична, по меньшей мере, на 50%, а предпочтительно на 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% соответствующей эквивалентной гипервариабельной области CDR1'-11C7 (SEQ ID NO:11), CDR2'-11C7 (SEQ ID NO:12) и CDR3'-11C7 (SEQ ID NO:13).

Кроме того, связывающая молекула способна связываться с человеческим NogoA, человеческим NiG, человеческим NiG-D20 или человеческим NogoA_623-640 с константой диссоциации <1000 нМ и содержит

- первый антигенсвязывающий сайт, содержащий последовательно гипервариабельные области CDR1, CDR2 и CDR3, каждая из которых гомологична, по меньшей мере, на 50%, а предпочтительно на 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% соответствующей эквивалентной гипервариабельной области CDR1-11C7 (SEQ ID NO:8), CDR2-11C7 (SEQ ID NO:9) и CDR3-11C7 (SEQ ID NO:10); и

- второй антигенсвязывающий сайт, содержащий последовательно гипервариабельные области CDR1', CDR2' и CDR3', каждая из которых гомологична, по меньшей мере, на 50%, а предпочтительно на 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% соответствующей эквивалентной гипервариабельной области CDR1'-11C7 (SEQ ID NO:11), CDR2'-11C7 (SEQ ID NO:12) и CDR3'-11C7 (SEQ ID NO:13).

Константа диссоциации может быть легко проверена различными методами, включая, например, метод определения аффинности связывания с использованием биосенсора, описанный в Примере 7. Кроме того, связывающий эффект и функционирование связывающих молекул могут быть продемонстрированы в биологической пробе, например, как описано ниже.

Константная часть тяжелой цепи иммуноглобулина человека может быть типа γ1, γ2, γ3, γ4, α1, α2, δ или ε, предпочтительно типа γ, но более предпочтительно типа γ4, а константная часть легкой цепи иммуноглобулина человека может быть типа κ или λ (который включает субтипы λ1, λ2 и λ3), но предпочтительно типа κ. Аминокислотные последовательности всех этих константных частей представлены в работе Kabat и др. (см. выше).

Конъюгаты связывающих молекул по изобретению, например, с ферментами, или токсинами, или радиоизотопами также не выходят за пределы сущности и включены в объем притязаний изобретения.

Термин «полипептид», если не указан иной способ действий, относится к любому пептиду или белку, представляющему собой аминокислоты, соединенные друг с другом пептидными связями, имеющему аминокислотную последовательность, начинающуюся на N-конце и заканчивающуюся на С-конце. Предпочтительно полипептид по настоящему изобретению - это моноклональное антитело, более предпочтительно гибридное (с вариабельными доменами мышиного происхождения) или гуманизированное (с CDR мышиного происхождения) моноклональное антитело. Гуманизированное моноклональное антитело необязательно имеет мутации, введенные в последовательности каркасных областей (FR) акцепторного антитела.

В контексте настоящего описания термин «функциональное производное полипептида» относится к молекуле, обладающей качественно одинаковой с полипептидом по настоящему изобретению биологической активностью, т.е. способной связываться с человеческим NogoA, человеческим NiG, человеческим NiG-D20 или человеческим NogoA_623-640. Функциональные производные включают фрагменты и пептидные аналоги полипептида в соответствии с настоящим изобретением. Фрагменты включают участки, входящие в состав последовательности полипептида в соответствии с настоящим изобретением, например, определенной последовательности. Термин «производное» используется для обозначения вариантов аминокислотной последовательности и ковалентных модификаций полипептида в соответствии с настоящим изобретением, например заданной последовательности. Функциональные производные полипептида в соответствии с настоящим изобретением, например заданной последовательности, например гипервариабельной области легкой и тяжелой цепи, гомологичны аминокислотной последовательности полипептида по настоящему изобретению, например заданной последовательности, по меньшей мере, примерно на 65%, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 75%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 85%, но наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 95, 96, 97, 98, 99%, и по существу сохраняют способность связываться с человеческим NogoA, человеческим NiG, человеческим NiG-D20 или человеческим NogoA_623-640.

Термин «ковалентная модификация» относится к модификациям полипептида в соответствии с настоящим изобретением, например заданной последовательности, или его фрагмента с помощью органического белкового или небелкового модифицирующего реагента, к слиянию с гетерологичными полипептидными последовательностями и к посттрансляционным модификациям. Ковалентно модифицированные полипептиды, например, заданной последовательности, сохраняют способность связываться с человеческим NogoA, человеческим NiG, человеческим NiG-D20 или человеческим NogoA_623-640 посредством образования перекрестных сшивок. Ковалентные модификации традиционно вводятся путем осуществления реакции определенных аминокислотных остатков с органическим модифицирующим реагентом, который способен вступать в реакцию с выбранными боковыми или концевыми остатками, или за счет механизмов посттрансляционных модификаций, которые функционируют в отобранных рекомбинантных клетках-хозяевах. Определенные посттрансляционные модификации являются результатом воздействия рекомбинантных клеток-хозяев на экспрессируемые полипептиды. Глутаминиловые и аспарагиниловые остатки часто подвергаются посттрансляционному дезамидированию в соответствующие глутамиловые и аспартиловые остатки. Альтернативно, эти остатки дезамидируются в слабокислых условиях. Другие посттрансляционные модификации включают гидроксилирование пролина или лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серила, тирозина или треонила, метилирование α-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (см., например, работу Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.Freeman & Co., Сан-Франциско, 1983, с.79-86). Ковалентные модификации включают, например, слитые гибридные (или химерные) белки, составной частью которых является полипептид в соответствии с настоящим изобретением, например заданная последовательность или варианты этой аминокислотной последовательности, такие как иммуноадгезины, и N-концевые присоединения к гетерологичным сигнальным последовательностям.

«Гомология» в контексте настоящего описания применительно к нативному полипептиду и его функциональному производному определяется как процент аминокислотных остатков в исследуемой последовательности, которые идентичны остаткам соответствующего нативного полипептида после выравнивания последовательностей и при необходимости заполнения брешей для достижения максимальной процентной гомологии, причем любые консервативные замены не рассматриваются как часть идентичности последовательностей. Ни N- или С-концевые расширения, ни вставки не будут истолковываться как элементы, снижающие идентичность или гомологию. Методы сравнения и предназначенные для этого компьютерные программы хорошо известны специалистам, работающим в данной области.

Термин «аминокислота(ы)» относится ко всем природным L-α-аминокислотам, например, включая и D-аминокислоты. Для обозначения аминокислот используют хорошо известные одно- и трехбуквенные обозначения.

Термин «вариант аминокислотной последовательности» относится к молекулам с некоторыми отличиями в их аминокислотной последовательности по сравнению с полипептидом в соответствии с настоящим изобретением, например с заданной последовательностью, которые все же обладают способностью связываться с NogoA человека или NiG человека, но более предпочтительно с NogoA_623-640. Варианты замещения - это те варианты, в которых в полипептиде в соответствии с настоящим изобретением, например в заданной последовательности, по меньшей мере, один аминокислотный остаток удален, а на его место в том же положении вставлена другая аминокислота. Такие замены могут быть одиночными, когда в молекуле произведена замена только одной аминокислоты, или множественными, когда в одной и той же молекуле произведены замены двух или нескольких аминокислот. Инсерционные варианты представляют собой варианты, в которых в полипептиде в соответствии с настоящим изобретением, например в заданной последовательности, произведена вставка одной или нескольких аминокислот в положение, непосредственно примыкающее к аминокислоте, находящейся в определенном положении. Непосредственно примыкающее к аминокислоте означает присоединение к функциональной α-карбоксильной или к α-аминогруппе аминокислоты. Делеционные варианты представляют собой варианты, в которых из полипептида в соответствии с настоящим изобретением, например из заданной последовательности, удалены одна или несколько аминокислот. Обычно в делеционных вариантах произведено удаление одной или нескольких аминокислот в определенной области молекулы.

Связывающая молекула по изобретению может быть изготовлена с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Ввиду этого должны быть сконструированы одна или несколько молекул ДНК, кодирующих связывающую молекулу, далее они должны быть связаны с соответствующими регуляторными последовательностями и перенесены для экспрессии в пригодный для этих целей организм хозяина.

В самых общих чертах соответственно предлагаются:

(1) молекулы ДНК, кодирующие связывающую молекулу по изобретению, имеющую один домен, одноцепочечную связывающую молекулу по изобретению, тяжелую или легкую цепь связывающей молекулы по изобретению или их фрагменты, и

(2) применение молекул ДНК по изобретению для получения связывающей молекулы по изобретению методами рекомбинации.

Современное состояние дел в данной области таково, что при наличии представленной здесь информации квалифицированный специалист может синтезировать молекулы ДНК по изобретению, т.е. аминокислотные последовательности гипервариабельных участков и последовательности ДНК, их кодирующие. Метод конструирования вариабельных доменов гена описан, например, в ЕР 239400 и может быть коротко резюмирован следующим образом: клонируют ген, кодирующий вариабельный домен моноклонального антитела любой специфичности. Определяют сегменты ДНК, кодирующие каркасную часть и гипервариабельные области, и сегменты ДНК, кодирующие гипервариабельные области, удаляют таким образом, чтобы произошло слияние сегментов ДНК, кодирующих каркасные области, с образованием удобных сайтов рестрикции в местах соединения. Эти сайты рестрикции могут быть образованы в определенных положениях стандартными средствами мутагенеза молекулы ДНК. Синтезируют наборы двухцепочечных CDR, имеющие заданные последовательности CDR1-11C7, CDR2-11C7, CDR3-11C7, CDR1'-11C7, CDR2'-11С7 и CDR3'-11C7. Получают фрагменты с липкими концами, посредством которых они могут быть лигированы к каркасной области по стандартному протоколу получения полноразмерной молекулы ДНК, кодирующей вариабельный домен иммуноглобулина.

Кроме того, для получения рекомбинантной ДНК, кодирующей моноклональные антитела по изобретению, наличие доступа к мРНК мкАТ-секретирующей гибридомы не является обязательным. Например, заявка РСТ WO 90/07861 содержит полную инструкцию, достаточную для получения моноклонального антитела с помощью технологии рекомбинантных ДНК при наличии только письменной информации о нуклеотидной последовательности гена.

Метод включает синтез набора олигонуклеотидов, их амплификацию методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и сплайсинг с получением искомой последовательности ДНК.

Векторы экспрессии с удобным промотором или гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи константных частей иммуноглобулинов, общедоступны. Таким образом, стоит только получить молекулу ДНК по изобретению, и она может быть легко перенесена в соответствующий вектор экспрессии.

Молекулы ДНК, кодирующие одноцепочечные антитела, также могут быть получены стандартными методами, например, как описано в WO 88/1649.

В частном варианте осуществления настоящего изобретения средства рекомбинантной технологии, используемые для получения некоторых из связывающих молекул по изобретению, включают конструирование первой и второй рекомбинантных ДНК, как описано ниже:

Первая рекомбинантная ДНК кодирует тяжелую цепь или ее фрагмент и содержит:

(а) первую часть, которая кодирует вариабельный домен, включающий чередующиеся каркасные и гипервариабельные области, причем гипервариабельные области представляют собой последовательно ДНК-CDR1-11С7 (SEQ ID NO:15), ДНК-СDR2-11С7 (SEQ ID NO:16) и ДНК-СDR3-11С7 (SEQ ID NO:17); эта первая часть начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту вариабельного домена, и заканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту вариабельного домена, и

(б) вторую часть, кодирующую тяжелую цепь константной части или ее фрагмента, которая начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту константной части тяжелой цепи, и заканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту константной части или ее фрагмента, за которой следует несмысловой (некодирующий) кодон.

Вторая часть предпочтительно кодирует константную часть тяжелой цепи иммуноглобулина человека, более предпочтительно константную часть γ4 цепи иммуноглобулина человека. Вторая часть может быть фрагментом геномной ДНК (включающая интроны) или фрагментом кДНК (без интронов).

Вторая рекомбинантная ДНК кодирует легкую цепь или ее фрагмент и содержит:

(а) первую часть, которая кодирует вариабельный домен, содержащий чередующиеся каркасные и гипервариабельные области, причем гипервариабельные области представляют собой последовательно ДНК-CDR1'-11C7(SEQ ID NO:17), ДНК-CDR2'-11C7(SEQ ID NO:18) и ДНК-СDR3'-11С7 (SEQ ID NO:19); эта первая часть начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту вариабельного домена, и заканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту вариабельного домена, и

(б) вторую часть, кодирующую легкую цепь константной части или ее фрагмента, которая начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту константной части легкой цепи и заканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту константной части или ее фрагмента, за которой следует некодирующий кодон.

Вторая часть предпочтительно кодирует константную часть легкой цепи иммуноглобулина человека, более предпочтительно константную часть к цепи иммуноглобулина человека.

Первая или вторая рекомбинантная ДНК предпочтительно имеют третью часть, которая расположена до первой части и кодирует часть лидерного пептида; эта третья часть начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту лидерного пептида, и заканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту лидерного пептида. Этот пептид требуется для секреции цепей организмом хозяина, в котором они экспрессируются, после чего пептид удаляется организмом хозяина. Предпочтительно третья часть первой рекомбинантной ДНК кодирует лидерный пептид, аминокислотная последовательность которого по существу идентична аминокислотной последовательности лидерного пептида тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO:21 (начиная с аминокислоты в положении - 19 и заканчивая аминокислотой в положении - 1). Также предпочтительно, чтобы третья часть второй рекомбинантной ДНК кодировала лидерный пептид, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO:23 (легкая цепь, начинающаяся с аминокислоты в положении - 18 и заканчивающаяся аминокислотой в положении - 1).

Каждая из рекомбинантных молекул ДНК помещается под контроль подходящих регуляторных последовательностей, в частности под контроль удобного промотора. Может быть использован любой промотор при условии, что он адаптирован к организму хозяина, в который будет перенесена рекомбинантная ДНК для экспрессии. Однако, если предполагается экспрессия в клетке млекопитающего, особенно предпочтительно использовать промотор гена иммуноглобулина.

Искомое антитело может быть получено в культуре клеток или в трансгенном животном. Пригодное для этих целей трансгенное животное может быть получено с помощью стандартных методов, которые включают микроинъекции в яйцеклетки первых и вторых рекомбинантных ДНК, помещенных под контроль пригодных для этой цели регуляторных последовательностей, перенос таким образом полученных яйцеклеток подходящим псевдобеременным самкам и отбор потомства, экспрессирующего искомые антитела.

Если предполагается получение антительных цепей в клеточной культуре, рекомбинантные ДНК должны быть сначала вставлены или в один вектор экспрессии, или в два различных, но совместимых вектора экспрессии, причем последний вариант является предпочтительным.

Соответственно в изобретении также предлагается вектор экспрессии, способный к репликации в прокариотической или эукариотической клетке и несущий, по меньшей мере, одну из рекомбинантных ДНК, описанных выше.

Каждый вектор экспрессии, содержащий рекомбинантную ДНК, затем переносят в пригодный для этой цели хозяйский организм. Когда рекомбинантные ДНК раздельно вставляются в два вектора экспрессии, они могут быть перенесены раздельно, т.е. каждая клетка содержит вектор одного типа, или совместно, причем последний вариант является предпочтительным. Организмом хозяина может быть бактериальная клетка, дрожжевая клетка или линия клеток млекопитающего, причем последний вариант является предпочтительным. Более предпочтительно, если клетки млекопитающего имеют лимфоидное происхождение, например клетки миеломы, гибридомы или нормальные перевиваемые В-клетки, если в них не экспрессируются тяжелые или легкие цепи эндогенных антител.

Также предпочтительно, чтобы клетка организма хозяина содержала большое количество копий вектора. Если в качестве организма хозяина используется клетка млекопитающего, эта цель может быть достигнута за счет повышения копийности стандартными средствами. Методы амплификации обычно включают селекцию по признаку повышенной резистентности к лекарственному веществу, если резистентность кодируется вектором экспрессии.

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения многоцепочечных связывающих молекул по изобретению, который включает (1) культивирование организма, который трансформируется первой и второй рекомбинантной ДНК по изобретению и (2) выделение из культуры активных связывающих молекул по изобретению.

Альтернативно, тяжелые и легкие цепи могут быть выделены раздельно и восстановлены в активную связывающую молекулу в результате рефолдинга in vitro. Методы восстановления хорошо известны специалистам, работающим в этой области. Примеры методов, в частности, даны в ЕР 120674 или в ЕР 125023. Поэтому способ также может включать

(1) культивирование первого организма, который подвергнут трансформации первой рекомбинантной ДНК по изобретению, и выделение искомой тяжелой цепи или ее фрагмента из культуры и

(2) культивирование второго организма, который подвергнут трансформации второй рекомбинантной ДНК по изобретению, и выделение искомой легкой цепи или ее фрагмента из культуры и

(3) восстановление in vitro активной связывающей молекулы по изобретению из тяжелой цепи или ее фрагмента, полученной в (1), и легкой цепи или ее фрагмента, полученной в (2).

Аналогичным образом также предлагается способ получения одноцепочечной связывающей молекулы или связывающей молекулы с одним доменом по изобретению, включающий

(1) культивирование организма, который подвергнут трансформации рекомбинантной ДНК, кодирующей соответственно одноцепочечную связывающую молекулу или связывающую молекулу с одним доменом по изобретению, и

(2) выделение указанной молекулы из культуры.

Связывающие молекулы по изобретению обладают очень хорошим нервно-восстанавливающим действием, как показано, например, на модели роста нейритов гранулярных клеток.

1. Оценка роста нейритов гранулярных клеток мозжечка (in vitro)

Рост нейритов диссоциированных гранулярных клеток мозжечка оценивают, как описано в работе Niederost и др., J. Neurosci., т.19, 1999, с.8979-8989. Краткое описание метода: у декапитированных на 5-7-й день после рождения крыс удаляют мозжечок и полученный материал обрабатывают трипсином. Для уменьшения содержания фибробластов клетки предварительно засевают на чашки Петри. Затем в каждую лунку (поверхность лунки 1 см²) 4-луночных культуральных планшет Greiner (Huber & Со AG, Rheinach, Базель, Швейцария) засевают по 75000 клеток и культивируют в среде Neurobasal с В27 вместо сыворотки (Invitrogen). Поверхность чашек покрывают поли-L-лизином (Sigma). В каждую лунку вносят по 0,5-8 мкг белкового материала, экстрагированного 3-[(холамидопропил)-диметиламмонио]-1-пропансульфонатом (CHAPS) из гомогената целого спинного мозга взрослых крыс с использованием метода Spillmann и др., J. Biol. Chem., т.273, 1998, с.19283-19293; чашки инкубируют в течение ночи при 4°С и промывают. Затем связывающие молекулы по изобретению преинкубируют 30 мин на тест-субстрате и удаляют перед добавлением клеток. Гранулярные клетки мозжечка добавляют и инкубируют в течение 24 ч. Для остановки эксперимента в культуральные чашки медленно добавляют по 2 мл 4% формальдегида в буфере. Затем культуры окрашивают иммунофлуоресцентным красителем для выявления нейрон-специфического белка 43, ассоциированного с ростом нейронов (GAP), и красителем Hoechst, окрашивающим клеточные ядра (окрашиваются ядра гранулярных клеток, чтобы увидеть, все ли клетки имеют нейриты, которые, в свою очередь, визуализируются анти-GAP-43). На определенном расстоянии от верхнего, нижнего и бокового края каждой лунки делают несколько фотографий (выбор кадров носит случайный характер), используя для этого флуоресцентный микроскоп Axiophot с объективом 40х Zeiss. На рандомизированных фотографиях с номерными кодами считают все нейриты в поле зрения. Ответ (рост нейритов гранулярных клеток) зависит от дозы в интервале примерно от 0,1 до 10 мкг общего белка на лунку (специфическая активность препарата варьирует в этом интервале).

Можно наблюдать усиление роста нейритов гранулярных клеток мозжечка, находящихся в непермиссивном окружении, создаваемом экстрактом спинного мозга, приготовленным, как описано выше, за счет преинкубации клеток со связывающей молекулой по изобретению. Пример типичного профиля нейтрализующего эффекта мышиных антител 11C7-IgG1 на модели роста нейритов гранулярных клеток приведен ниже:

Исследование 1
Крысиный миелин (1 мкг на лунку)
	Кол-во нейритов в поле зрения	Процент
без антител	80,5	100%
+IgG мыши	86,5	108%
11С7 250 мкг/мл	160	199%
Исследование 2
Крысиный миелин (8 мкг на лунку)
(препарат 2)	Кол-во нейритов в поле зрения	Процент
без антител	20	100%
+IgG мыши	17,3	86.5%
11С7 250 мкг/мл	31	155%
11С7 75 мкг/мл	26	130%
11С7 7,5 мкг/мл	26	130%

Нейтрализующая активность молекул по изобретению может быть также определена путем измерения регенеративного спраутинга и роста нейритов на модели повреждения спинного мозга in vivo:

2. Модель повреждения спинного мозга (in vivo)

Взрослым крысам породы Lewis наносили микрохирургическую травму путем билатерального рассечения дорсальной части спинного мозга на уровне 8-го грудного позвонка. Ламинэктомия, анестезия и хирургия описаны у Schnell и Schwab в Eur. J. Neurosci., т.5, 1993, с.1156-1171. Контроль и связывающие молекулы по изобретению применяли двумя различными способами: или путем имплантации 10⁶ свежих гибридомных клеток на одну сторону коры мозга («привитые» животные), или, альтернативно, путем имплантации внутрижелудочковой канюли, соединенной с имплантированным подкожно 2-мл насосом Alzet (Alza Corporation, Пало-Альто) («насосные» животные). Животные, привитые гибридомными клетками: для подавления иммунных реакций крысам в течение 7-10 дней вводили циклоспорин А; через 14 дней после травмы спинного мозга крыс умерщвляли внутрисердечным введением 4% раствора формалина в буфере. Насосные животные: связывающими молекулами по изобретению (например, в концентрации 3,3 мг/мл для мышиных 11С7) заполняли 2-мл насосы, которые подавали препарат в боковой желудочек со скоростью 0,5 мкл/ч в течение 2 недель. Насосы имплантировали в момент повреждения спинного мозга, через 2 недели крыс умерщвляли.

Нейроанатомический мониторинг: мониторинг моторного и сенсорного кортико-спинального тракта (КСТ) проводили, инъецируя антероградно биотин-декстран-аминную метку (БДА) в кору на стороне, противоположной местоположению насоса или подсаженных клеток. БДА транспортировался в спинной мозг за 10-14 дней и визуализировался с использованием диаминобензидина (ДАБ) в качестве субстрата, как описано в работе Brosamle и др., J. Neurosci., т.20, 2000, с.8061-8068.

Оценка анатомических результатов: применяли два метода оценки - полуколичественный и количественный. Полуколичественная оценка интенсивности спраутинга и регенерации: полные серии сагиттальных разрезов животных, закодированных номерами и случайным образом смешанных, оценивали на наличие и плотность регенерирующих отростков, расположенных рострально по отношению к месту повреждения, используя следующие определения: регенерирующие отростки - это волокна, выходящие из рассеченного КСТ; это длинные, неровные отростки, намного менее разветвленные, чем нормальные коллатерали серого вещества, они растут в направлении очага повреждения, а также вентрально или латерально вокруг него. Регенерирующие отростки часто заканчиваются конусом роста, который может быть маленьким и луковицеобразным или большим и разветвленным. Плотность разрастания оценивается по шкале от 0 до 3 для каждого животного. - Удаленная регенерация: волокна, которые можно проследить через очаг повреждения до каудального отдела спинного мозга, считаются удаленными регенерирующими волокнами. Максимальное расстояние от очага повреждения можно измерить, но часто присутствуют некоторые неповрежденные волокна из маленького вентрального канатика КСТ; их ответвления смешиваются с ответвлениями регенерирующих нейритов, что затрудняет распознавание тех и других.

Подсчет волокон (количественный метод): линия, расположенная на расстоянии - 0,5 мм ростральнее конца рассеченного КСТ, накладывается на чередующиеся срезы серого вещества, и подсчитываются все пересечения с волокнами КСТ (нормальные коллатерали или отростки). Сходные линии накладываются каудальнее места повреждения на расстоянии +0,5, +2 и +5 мм от центра повреждения. Пересекающиеся волокна подсчитываются, и к сумме добавляется 3 уровня для получения количества волокон КСТ в каудальной части спинного мозга. Эти каудальные волокна классифицируются по количеству волокон на расстоянии -0,5 мм ростральнее конца КСТ для получения соотношения.

Через 2 недели после повреждения спинного мозга, разрушающего примерно 40% сегмента Т8 спинного мозга, преимущественно в дорсальной части, включая оба основных КСТ, визуализация КСТ контрольных животных выявляет среднюю степень реактивного роста. Этот феномен соответствует спонтанному росту в ответ на повреждение, хорошо известному по литературе. У травмированных крыс, которые получают связывающие молекулы по изобретению или которым имплантированы насосы, доставляющие связывающие молекулы по изобретению, может наблюдаться усиленный спраутинг и регенерация нейритов в очаге повреждения.

Таким образом, в изобретении также предлагается:

(1) применение связывающих молекул по изобретению для восстановления нервной системы млекопитающего, в частности нервной системы человека,

(2) способ восстановления нервной системы млекопитающего, в частности, нервной системы человека, который включает введение эффективного количества связывающих молекул по изобретению пациенту, нуждающемуся в таком лечении, или

(3) фармацевтическая композиция для восстановления нервной системы млекопитающего, в частности нервной системы человека, которая содержит связывающие молекулы по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

Более конкретно, связывающие молекулы по изобретению полезны для регенерации и улучшения спраутинга нейритов после повреждения нервных волокон. Так, молекулы по изобретению могут найти широкое применение, в частности, для лечения людей. Например, связывающие молекулы по изобретению полезны для лечения различных заболеваний периферической нервной системы (ПНС) и центральной нервной системы (ЦНС), т.е., более конкретно, нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, амиотрофический боковой склероз, болезнь диффузных телец Леви и другие виды деменции, последствия черепно-мозговой или позвоночной травмы, инсульт или демиелинизирующие заболевания. К демиелинизирующим заболеваниям относятся, без ограничения перечисленным, рассеянный склероз, монофазная демиелинизация, энцефаломиелит, многоочаговая лейкоэнцефалопатия, панэнцефалит, заболевание Маркьяфавы-Биньями, понтинный миелинолизис, адренолейкодистрофия, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, спонгиозная дегенерация, болезнь Александра, болезнь Канавана, метахроматическая лейкодистрофия и болезнь Краббе. В одном примере введение связывающих молекул по изобретению можно применять для лечения демиелинизирующего заболевания, связанного с белком NogoA. В другом примере клетки, экспрессирующие связывающие молекулы по изобретению, могут быть трансплантированы в очаг повреждения спинного мозга для стимуляции прорастания нейритов в очаг повреждения. Трансплантированные клетки будут способствовать восстановлению функции спинного мозга после повреждения или травмы. Такие клетки могут включать клетки обонятельной оболочечной глии, стволовые клетки различного происхождения или фетальные трансплантаты нервных волокон или тканей.

Кроме того, связывающие молекулы по изобретению полезны для лечения дегенеративных заболеваний органа зрения, которые могут быть напрямую или косвенно связаны с дегенерацией клеток сетчатки или роговицы глаза, включая ишемическую ретинопатию, ишемическую нейропатию передней части зрительного нерва, все формы воспаления зрительного нерва, связанную с возрастом макулярную дегенерацию, диабетическую нейропатию, кистоидный макулярный отек, пигментозный ретинит, болезнь Старгардта, наследственную дегенерацию желтого пятна (синдром Беста), врожденный амавроз Лебера и другие наследственные дегенеративные заболевания сетчатки, патологическую миопию, ретролетальную фиброплазию (синдром Терри) и наследственную патологию зрительного нерва Лебера, отдаленные последствия пересадки роговицы глаза или корригирующей преломление операции на роговице, герпетический кератит.

Кроме того, было показано, что NogoA играет роль в патогенезе психических заболеваний, в частности шизофрении и депрессии. Следовательно, связывающие молекулы по изобретению полезны для лечения психических заболеваний, в частности шизофрении и депрессии.

Связывающие молекулы по изобретению могут выпускаться в виде монопрепарата, или в составе комбинированных препаратов, или для последовательного применения в сочетании с другими агентами. Например, после инсульта или травмы спинного мозга связывающие молекулы по изобретению можно вводить в комбинации с противовоспалительными агентами, включая, без ограничения перечисленным, кортикостероиды, как средство блокирования дальнейшего повреждения нейронов и подавления регенерации нейритов; для лечения нейродегенеративных заболеваний связывающие молекулы по изобретению можно комбинировать с нейротропными факторами, такими как NGF, BDNF или другими лекарственными препаратами для лечения нейродегенеративных заболеваний, например Exelon™ или леводопа. В контексте настоящего описания о совместном применении двух агентов говорят в том случае, когда эти два агента вводят одновременно или независимо друг от друга, но таким образом, чтобы они оказывали свое действие в одно и то же время.

Для лечения психических заболеваний, в частности шизофрении и депрессии, связывающие молекулы по изобретению могут изготавливаться в виде монопрепарата или в составе комбинированного препарата, в частности, с другими агентами, выбранными из группы, включающей (а) противоэпилептические лекарственные средства, выбранные из группы, включающей барбитураты и их аналоги, бензодиазепины, карбоксамиды, гидантоины, сукцинимиды, вальпроевую кислоту и другие производные жирных кислот и другие противоэпилептические препараты, (б) обычные антипсихотические препараты, (в) нетипичные антипсихотические препараты и (г) антидепрессанты.

Термин «барбитураты и их производные» в контексте настоящего описания относится, без ограничения перечисленным, к фенобарбиталу и примидону. «Бензодиазепины» в контексте настоящего описания включают, без ограничения перечисленным, клоназепам, диазепам и лоразепам. Термин «карбоксамиды» в контексте настоящего описания относится, без ограничения перечисленным, к карбамазепину, окскарбазепину и 10-гидрокси-10,11-дигидрокарбамазепину. Термин «гидантоины» в контексте настоящего описания относится, без ограничения перечисленным, к фенитоину. Термин «сукцинимиды» в контексте настоящего описания относится, без ограничения перечисленным, к этосукцимиду и мезуксимиду. Термин «вальпроевая кислота и другие производные жирных кислот» в контексте настоящего описания относится, без ограничения перечисленным, к натриевой соли вальпроевой кислоты, солянокислому тиагабину моногидрату и виграбатрину. Термин «другие противоэпилептические препараты» в контексте настоящего описания относится, без ограничения перечисленным, к леветирацетаму, ламотригину, габапентину и фелбамату.

Термин «обычные антипсихотические препараты» в контексте настоящего описания относится, без ограничения перечисленным, к галоперидолу и флуфеназину.

Термин «нетипичные антипсихотические препараты» в контексте настоящего описания относится, без ограничения перечисленным, к клозарилу, рисперидону, оланзапину, кветиапину, зипразидону и арипипразолу.

Термин «антидепрессанты» в контексте настоящего описания относится, без ограничения перечисленным, к селективным ингибиторам обратного захвата серотонина (SSRI) или селектиным ингибиторам обратного захвата серотонина и норадреналина (SNRI). Пригодный для этой цели SSRI можно выбрать из группы, включающей флуоксетин, фувоксамин, сертралин, пароксетин, циталопрам и эсциталопрам.

Структуру активных ингредиентов, идентифицируемых по кодовым номерам, генерическим названиям или торговым названиям, можно найти в действующем издании стандартного сборника «Указатель продукции фирмы Мерк» ("The Merck Index") или в базах данных, например Patents International (например, IMS World Publications). Соответствующее содержание этих баз данных включено в настоящее описание в виде ссылок. Квалифицированный в данной области специалист легко идентифицирует активные ингредиенты и на основании этих ссылок с высокой вероятностью изготовит и протестирует показания и свойства лекарственного препарата на стандартных моделях, как in vitro, так и in vivo.

Для вышеуказанных показаний приемлемая доза, конечно, будет варьировать в зависимости от, например, применяемой молекулы по изобретению, способа введения и природы и тяжести заболевания, которое предполагается лечить. Связывающие молекулы по изобретению легко вводят с помощью насосов или путем инъекций в виде лекарственных средств в пораженные участки, например, их можно применять путем внутричерепных введений непосредственно в ЦНС или интратекально в позвоночник в пораженный участок.

Фармацевтические композиции по изобретению могут быть приготовлены традиционным способом. Например, композицию в соответствии с изобретением, содержащую молекулы по изобретению, предпочтительно готовить в лиофилизированной форме. Непосредственно перед введением препарат растворяют в пригодном для этой цели водном носителе, например в стерильной воде для инъекций или стерильном физиологическом растворе в буфере.

Чтобы упростить процедуру приготовления соответствующих композиций, связывающие молекулы по изобретению и необязательное второе лекарственное средство, усиливающее эффект связывающих молекул по изобретению, могут быть упакованы раздельно в одном и том же контейнере, к ним прилагаются инструкции по смешиванию или одновременному введению. Выше указаны лекарственные препараты, которые могут быть использованы в качестве необязательного второго лекарства.

Синергический эффект комбинации связывающих молекул по изобретению и факторов роста, таких как NGF, может быть продемонстрирован in vivo на модели повреждения спинного мозга, описанной выше.

Краткое описание фигур

Фигура 1. Сравнение последовательностей: сравнение последовательностей NiG различных видов, демонстрирующее последовательность иммуногенного пептида для моноклональных антител 11С7.

Изобретение будет легче понять во всей его полноте с помощью ссылок на следующие примеры. Однако они не должны трактоваться как ограничивающие сущность и объем притязаний по изобретению.

В нижеследующих примерах температура всегда указывается в градусах по Цельсию (°С).

Моноклональное антитело, являющееся объектом внимания в примерах - это связывающая молекула в соответствии с настоящим изобретением, содержащая вариабельную часть легкой цепи (SEQ ID NO:3) и вариабельную часть тяжелой цепи (SEQ ID NO:2).

В описании используются следующие сокращения:

ELISA	ферментный иммуносорбентный анализ
FACS	флюоресцентно-активируемая клеточная сортировка
FITC	флуоресцеин изотиоцианат
FBS	фетальная бычья сыворотка
HCMV	цитомегаловирусный промотор человека
IgG	иммуноглобулин изотипа G
мкАТ	моноклональное антитело
PBS	забуференный фосфатом физиологический раствор
ПЦР	полимеразная цепная реакция

Пример 1

NiG-D20 (SEQ ID NO:24) является одним из фрагментов NogoA, способных подавлять рост нейритов

Методы:

а) Делеционная библиотека Nogo-A крысы: делеционные варианты получали путем обработки нуклеазой ExonucleaseIII/Mung Bean Nuclease ДНК Nogo-A крысы по внутренним сайтам рестрикции с последующим проведением ПЦР с праймерами, специфическими для Nogo-A крысы (метод описан в WO 00/31235): Nogo-A крысы (аа 1-1163; ДНК, как будет показано ниже, имеющая отношение к аминокислотной последовательности Nogo-A крысы (SEQ ID NO:26), например, аа 1-1163 означает, что кДНК кодирует полипептид, начинающийся с аминокислоты 1 и заканчивающийся аминокислотой 1163 последовательности полипептида NogoA крысы), Nogo-B крысы (аа 1-172+976-1163), Nogo-C крысы (N-концевой фрагмент 11 аа+аа 976-1163 Nogo-C крысы), Nogo-66 крысы (аа 1019-1083), GST-Nogo-66 крысы (аа 1026-1091), NiR-G крысы (аа 1-979), NiR крысы (1-172), NiR-D1 крысы (аа 1-31), NiR-D2 крысы (аа 59-172), NiR-D3 крысы (аа 1-31+59-172), EST-Nogo1 крысы (аа 762-1163), NiG крысы (аа 174-979), NiG-Dl крысы (аа 174-909), WG-D2 крысы (аа 174-865), NiG-D3 крысы (аа 172-723), NiG-D4 крысы (аа 172-646), NiG-D5 крысы (аа 293-647), NiG-D6 крысы (аа 763-975), NiG-D7 крысы (аа 174-235+294-979), NiG-D8 крысы (аа 218-653), NiG-D9 крысы (аа 172-259+646-974), NiG-D10 крысы (аа 293-979). NiG-D11 крысы (аа 209-268), NiG-D12 крысы (аа 198-233), NiG-D13 крысы (аа 174-216), NiG-D14 крысы (аа 174-260), NiG-D15 крысы (аа 174-190+493-979), NiG-D16 крысы (аа 174-190+621-979), NiG-D17 крысы (аа 174-190+259-979), NiG-D18 крысы (аа 174-190+263-979), NiG-D19 крысы (аа 763-865), NiG-D20 крысы (аа 544-725), NiG-D21 крысы (аа 812-918), NiG-D22 крысы (аа 866-975), NiG-D23 крысы (аа 914-975), NiG-D24 крысы (аа 544-685), NiG-D25 крысы (аа 614-725), NiG-D26 крысы (аа 544-613), NiG-D27 крысы (аа 581-648), NiG-D28 крысы (аа 614-685), NiG-D29 крысы (аа 648-725), NiG-D30 крысы (аа 682-725), NiG-D31 крысы (аа 544-580), NiG-D32 крысы (аа 581-613), NiG-D33 крысы (аа 614-648), NiG-D34 крысы (аа 648-685), NiG-D35 крысы (аа 260-556), NiG-D36 крысы (аа 260-415). NiR-G и NiR-a получены из Nogo-A-pET28 в результате расщепления ферментами рестрикции. NiG получен из NiR-G в результате расщепления рестриктазами и обработки нуклеазой MungBean. NiG-D1, -D3, -D4, -D5, -D7, -D8, -D9, -D10 получены из NiG-pET28 в результате расщепления ферментами рестрикции. NiG-D15, -D16, -D17, -D18 получены из NiG-pET28 в результате расщепления экзонуклеазой III. NiR-b, NiR-D1, -D2, -D3 получены в ПЦР с NiR-a-pET28 в качестве матрицы. NiG-D2, -D6, -D11, -D12, -D13, -D14, -D19, -D20, -D21, -D22, -D23, -D24, -D25, -D26, -D27, -D28, -D29, -D30, -D31, -D32, -D33, -D34, -D35. -D36 получены в ПЦР с NiG-pET28 в качестве матрицы. Все рекомбинанты субклонированы в плазмиду рЕТ28. В состав всех вышеупомянутых рекомбинантных молекул входит плазмида рЕТ28. Плазмида pGEX-6P использована для GST-Nogo66, а плазмида рЕТ26 для периплазматической экспрессии NiG крысы. GST-Nogo-66 человека (аа 1055-1120 Nogo-A человека) клонирован с помощью ПЦР на ДНК NogoA человека (SEQ ID NO:4) в качестве матрицы. Делеционные варианты затем клонировали в плазмидные векторы рЕТ28 (Novagen), pGEX-6P (Amersham Pharmacia Biotech) и рЕТ26 (Novagen). GST-Nogo-66 человека соответствует белку GST-nogo, описанному GrandPré и др. (см. выше). Синтетический пептид 4 крысы EELVQKYSNSALGHVNSTIKELRRL (SEQ ID NO:27) соответствует пептиду 4 человека (было показано, что пептид 4 человека представляет собой ингибирующий фрагмент домена Nogo-66 (GrandPré et al., 2000)). Ортологичный пептид крысы имеет единственное несовпадение C->S (см. последовательность пептида 4 в работе GrandPré и др. 2000, см. выше). Синтетический пептид PSSPPPSSPPPSSPPPS с высоким содержанием Pro/Ser (SEQ ID NO:28), а также пептид 4 крысы получены и очищены S.A.Primm методом ВЭЖХ. NogoA_623-640 человека (SEQ ID NO:6) синтезирован и очищен в Research Genetics Inc.

б) Создание генетических конструкций, экспрессирующих Nogo-A человека (pRK7-hNogo-A): скрининг библиотеки кДНК человека, созданной с использованием фагового вектора λ gt10 (Clontech), проводили на двойных наборах фильтров с использованием стандартных процедур. Фрагменты Nogo-A человека амплифицировали в ПЦР из кДНК мозга человека (Clontech) с использованием стандартного протокола и затем субклонировали в плазмиду pBluescript, расщепляли и выделяли, или сразу использовали в качестве зондов для скрининга. Фрагмент XhoI/Smal (400 т.п.н.) использовали в качестве 5'-зонда, 3'-зонд амплифицировали с праймерами CA-NA-2F: 5'-AAG CAC CAT TGA АТТ CTG CAG ТТС С-3' (SEQ ID NO:29) и CA-NA-3R: 5'-ААС TGC AGT ACT GAG CTC CTC CAT CTG C-3' (SEQ ID NO:30). Отбирали позитивные клоны, субклонировали и подтверждали последовательность. Для получения полноразмерной кДНК Nogo-A человека проводили сборку перекрывающихся клонов по уникальному сайту расщепления рестриктазой EcoRI в последовательности Nogo-A человека и далее субклонировали в вектор Bluescript с получением кодирующей последовательности, названной Pbsnogoa. Для получения pRK7-hNogo-A полноразмерную кДНК встраивали в вектор экспрессии эукариотических клеток pRK-7 путем направленного клонирования.

в) Создание плазмидного вектора экспрессии NiG (hNiG) человека (рЕТ28а-hNiG) для продукции в бактериальных клетках: кодирующий hNiG фрагмент ДНК субклонировали в BamHI/XhoI плазмиды рЕТ28а (Novagen) после амплификации в ПЦР соответствующей кодирующей области Pbsnogoa в рамке считывания с N-концевым His- и T7-tag для экспрессии в бактериальных клетках с использованием набора праймеров - прямого 5'-GTC GCG GAT CCA TGG AGA CCC TTT TTG CTC ТТС-3' (SEQ ID NO:31) и обратного 5'-GTT CTC GAG ТТА TGA AGT TTT ACT CAG-3' (SEQ ID NO:32). Конечную плазмиду назвали pET28a-hNiG. Затем hNiG экспрессировали в E.coli BL21 pRP путем индукции 1 мМ изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (IPGT).

г) Создание экспрессирующей плазмиды NiG-экзон3 (mNiG-ехоn3) мыши: область, кодирующую экзон 3 мышиной последовательности, амплифицировали с использованием праймеров - прямого 5'-GTG CGG АТС CAT GGA TTT GAA GGA GCA GC-3' (SEQ ID NO: 33) и обратного 5'-GTT TCT CGA GTG AAG TTT TAT TCA GCT С-3' (SEQ ID NO:34) - и субклонировали в рЕТ28а по сайтам BamHI/XhoI. Конечную плазмиду назвали pET28a-mNiG-exon3.

Клонирование NiG обезьяны: Poly(А)-РНК выделяли из замороженных тканей мозга обезьяны и синтезировали кДНК с использованием (oligo)dT праймера. Два перекрывающихся фрагмента, охватывающие 5'- и 3'-область кДНК, амплифицировали в ПЦР, используя специфические для последовательности праймеры и фермент, проверяющий правильность считывания. Праймеры сконструированы по известной последовательности кДНК NiG человека. Для амплификации 5'-фрагмента использовали праймеры 5'-TCCACCCCGGCCGCGCCCAA-3' (SEQ ID NO:35) и 5'-AATGATGGGCAAAGCTGTGCTG-3' (SEQ ID NO:36), для 3'-фрагмента 5'-GGTACAAAGATTGCTTATGAAACA-3' (SEQ ID NO:37) и 5'-AGCAGGGCCAAGGCAATGTAGG-3' (SEQ ID NO:38). Затем два фрагмента субклонировали и проводили анализ последовательностей не менее четырех независимых клонов, полученных от каждого фрагмента. Полноразмерную кДНК амплифицировали в ПЦР из перекрывающихся последовательностей, используя вышеупомянутые праймеры, полученный продукт клонировали и повторно секвенировали.

д) Получение рекомбинантных белков NogoNiG и делеционной библиотеки Nogo-A, как определено выше: делеционную библиотеку Nogo-A экспрессировали в Escherichia coli. Белки экстрагировали путем повторной обработки ультразвуком в специальном буфере (20 мМ Tris, 50 мМ NaH₂PO₄, 100 мМ NaCl, pH 8,0) с 0,75 мг/мл лизоцима, путем солюбилизации с В-Per™ (Pierce) или с 8 М мочевины. NiG, экспрессированный с лидерной последовательностью pelB, выделяли из периплазматического пространства по протоколу, рекомендованному фирмой Novagen для очисти периплазматических белков. Супернатанты клонов, несущих рекомбинантные молекулы ДНК, созданные на основе вектора рЕТ28, очищали с помощью аффинной хроматографии на Co²⁺-Talon™ Metal Affinity Resin (Clontech) в статическом режиме. Лизаты, солюбилизированные 8 М мочевиной или В-Per™, переносили в неденатурирующие условия путем замещения буфера буфером для ультразвуковой обработки в ходе хроматографической процедуры, которую проводили в статическом режиме. Белки элюировали 250 мМ имидазола в буфере для ультразвуковой обработки на самотечной колонке (BioRad). Белки NiG далее очищали методом гель-фильтрации на Superdex 200 HiLoad 16/60. Супернатанты клонов, несущих рекомбинантные молекулы ДНК, созданные на основе вектора pGEX-6P, очищали, используя колонку, заполненную G-sepharose, в статическом режиме, в соответствии с инструкциями фирмы-изготовителя (Amersham Pharmacia). Расщепление GST-Nogo-66 осуществляли, инкубируя солюбилизированный GST-Nogo-66 с протеазой PreScission с последующей очисткой методом ВЭЖХ. Гель-электроэлюцию рекомбинантного белка Nogo, очищенного методом аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных ионов металлов (IMAC), проводили методом препаративного электрофореза в полиакриламидном геле с додецил-сульфатом натрия и элюции с использованием прибора для электроэлюции BioRad Electro-Eluter в буфер, содержащий 50 мМ Tris, рН 7,4, 100 мМ NaCl, 0,2% (мас./об.) CHAPS, в течение 1 ч при 250 мА; по окончании процедуры на 30 с меняли полярность электродов. Концентрации хроматографически очищенных белков определяли с использованием красителя Pierce Coomassie и БСА в качестве стандартного белка. Концентрации белков после элюции из геля определяли по интенсивности полос в гелях, окрашенных серебром (см. работу Merril и др., A rapid sensitive silver stain for polypeptides in polyacrylamide gels. Analyt.Biochem., т.110, 1981, с.201-207), с БСА в качестве стандарта.

е) Получение фрагментов рекомбинантного NogoA в клетках СНО: NiR-G - фрагмент размером 3119 т.п.н., получающийся в результате частичного расщепления рестриктазой HincII кДНК Nogo-A крысы, клонировали в вектор экспрессии pSecTag2 (Invitrogen, Гренинген, Нидерланды). Трансфекция pNiR-G клеток СНО приводила к внутриклеточной, цитоплазматической экспрессии NiR-G. Стабильные линии клеток СНО, секретирующих NiR-G, отбирали, используя Zeocin в концентрации 250 мкг/мл (Invitrogen). Рекомбинантный NiR-G выделяли из клеточных лизатов на колонке с Ni²⁺-NTA (Qiagen AG, Базель, Швейцария). NiG-D20 и Nogo-66 крысы клонировали в вектор pAPtag5 с помощью ПЦР. Трансфекция pNiG-D20-AP клеток СНО приводила к секреции NiG-520-AP в культуральный супернатант. Стабильные клеточные линии pNiG-D20-AP и pNogo-66-AP отбирали, используя Zeocin в концентрации 250 мкг/мл (Invitrogen). Обе клеточные линии адаптированы к условиям культивирования в среде без сыворотки (Gibco) и культивируются в камерах для клеточных линий (Integra). Перед использованием супернатанты концентрировали в 10 раз, концентрацию гибридного белка определяли, как описано в работе Flanagan и др., The kit ligand: a cell surface molecule altered in steel mutant fibroblasts. Cell, т.63. 1990, с.185-194).

ж) Тесты «растекания» 3Т3 фибробластов и клеток СНО: тест «растекания» на фибробластах 3Т3 ставили, как описано ранее (Spillmann и др., Identification and characterization of a bovine neurite growth inhibitor (bNI-220). J. Biol. Chem., т.273, 1998, с.19283-19293). Тест растекания на клетках СНО проводили по существу таким же образом, как и на фибробластах 3Т3. Краткое описание процедуры: клетки СНО разводили 1:2. Через 24 ч их обрабатывали трипсином в PBS с ЭДТА в течение 30 с и примерно 8000 клеток СНО засевали в планшеты, покрытые слоем NiG или Nogo-66 в количестве 5, 1, 0,5 и 0,2 мкг на лунку. Через 30-45 мин клетки фиксировали раствором, содержащим 4% (мас./об.) параформальдегида и 5% (мас./об.) сахарозы, и далее анализировали, как описано Spillmann и др. (см. выше). В каждой лунке подсчитывали примерно по 100 клеток, используя для этой цели световой микроскоп. Критериями «растекания» клеток были следующие признаки: (а) прикрепление к чашке И (б) растянутость и расширение клеток, указывающие на образование ламеллиподий; под световым микроскопом клетки выглядят более темными и более крупными, чем нерастекшиеся, округлые клетки; нерастекшимися клетками считаются клетки, которые (а) не прикрепились к чашке ИЛИ (б) прикрепились к чашке, но имеют небольшой размер, округлую форму, без видимых выступающих ламеллиподий. Соотношение между растекающимися и нерастекающимися клетками характеризует степень непермиссивности субстрата.

з) Тест роста нейритов PC12: оценку роста нейритов PC12 проводили, как описано ранее (Rubin и др., Inhibition of PC-12 cell attachment and neurite outgrowth by detergent solubilized CNS myelin proteins. Europ.J. Neurosci., т.7, 1995, с. 2524-2529). Клетки PC12 (клон клеток PC12, способный расти независимо от наличия ламинина, полученный от Moses Chao (г.Нью-Йорк, США), праймировали в течение 2 дней 50-100 нг/мл NGF (Harlan Bioproducts, шт.Индианаполис, США) в культуральной среде DMEM, содержащей 5% фетальной телячьей сыворотки, 10% лошадиной сыворотки, 100 ед/мл пенициллина и 0,5 мг/мл стрептомицина (продукт Pen-Strep, доступный на фирме Gibco-BRL). Клетки PC 12 снимали механически, трипсинизировали в течение 5 мин 0,05% раствором трипсина (Sigma) в HBSS (Gibco) и засевали в концентрации 3000-5000 клеток/см² в культуральную среду, содержащую 100 нг/мл NGF. Тест останавливали через 24 ч добавлением раствора, содержащего 4% (мас./об.) параформальдегида и 5% (мас./об.) сахарозы в PBS при рН 8. Для клеток PC12 культуральные планшеты готовили таким же образом, как и для клеток 3Т3.

и) Тест с полосками на клетках ретинального ганглия: тест проводили, как описано в работе Vielmetter (см. Vielmetter и др., In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Exp.Brain Res., т.81, 1990, с.283-287) с некоторыми модификациями (см. Schmalfeldt и др., Brain derived versican V2 is a potent inhibitor of axonal growth. J. Cell Sci., т.113, 2000, с.807-816). Экспланты исследовали после фиксации раствором, содержащим 4% (мас./об.) параформальдегида и 0,1% (об./об.) глутарового альдегида в PBS, в течение 10 мин при КТ. Для иммунного окрашивания фиксированные экспланты блокировали при КТ в течение 1 ч с RNO-блокирующим раствором, содержащим 0,5% (мас./об.) БСА, 0,3% (мас./об.) TopBlock (Juro Supply) и 0,1% (мас./об.) NaN₃ в PBS, обрабатывали 10 мин 0,05% (об./об.) Тх-100 в RNO-блокирующем растворе для нарушения проницаемости мембран, замораживали 1 мин при -20°С и инкубировали с первыми антителами (AS Bianca для NiR, AS Laura для Nogo-A, NiR-G, NiG, NiG-D3 и NiG-D20, Novagen мкАТ анти-Т7 для Nogo-C и контрольного белка β-Gal). После промывания PBS к эксплантам добавляли конъюгаты антител с FITC и TRITC (FITC: флуоресцеин-изотиоцианат, TRITC: тетраметил родамин изотиоцианат) (Jackson ImmunoResearch Laboratories) (1:150). Образцы накрывали покровными стеклами в 50% (об./об.) глицерине, содержащем 25 мМ NaHCO₃, 40 мМ NaCl и 1% (мас./об.) р-фенилендиамина (Sigma).

Результаты:

а) Две области в N-концевой части Nogo-A подавляют растекание ЗТЗ фибробластов: чтобы идентифицировать области Nogo-A, ответственные за подавление растекания 3Т3 фибробластов, была создана библиотека из 50 делеционных вариантов Nogo. Рекомбинантные белки экспрессировали в бактериальных клетках (см. метод 1а). Для Nogo-A концентрация, подавлявшая растекание 50% фибробластов 3Т3 (ЕС₅₀), составляла примерно 400-500 нг/0,1 мл на см² поверхности (инкубация плат с Nogo-A в течение ночи) (˜4 пмоля/см²). Обработка Nogo-A или его фрагментов 8 М мочевины приводила к значительному снижению ингибирующей активности, что указывало на важную роль конформации молекулы для проявления активности белка. Анализ фрагментов Nogo в тесте растекания фибробластов выявил, что по меньшей мере два участка белка Nogo-A участвуют в подавлении растекания свежезасеянных фибробластов, а именно NiR-D2 (aa 59-172) и NiG-D20 (aa 544-725). Все фрагменты, полученные из области NiG, обладающей ингибирующей активностью (например, NiG-D4 и NiG-D8), частично перекрываются с NiG-D20. Незначительная ингибирующая активность при высоких концентрациях белка наблюдалась у NiG-D19 в пределах области NiG-D6. Nogo-C, Nogo-66 и пептид 4 крысы (по данным GrandPré и др. 2000, пептид 4 является ингибирующим участком Nogo-66) не подавляют растекание фибробластов. Эти данные показывают, что подавление растекания ЗТЗ фибробластов свойственно двум определенным участкам Nogo-A, расположенным на N-конце (NiR-D2) и в пределах Nogo-A-специфичной области (NiG-D20) белка. Эффект не связан с неспецифическими физико-химическими свойствами (кислотность фрагментов, структурные эффекты, обусловленные остатками пролина и серина). С-концевой домен RTN не участвует в подавлении растекания фибробластов.

б) Область NiG-D20 Nogo-A подавляет рост нейритов: чтобы определить, оказывают ли фрагменты Nogo-A, которые непермиссивны для растекания клеток, также подавляющее действие на рост нейритов, в различных экспериментах с нервными клетками протестировали серию фрагментов Nogo-A, синтезированных бактериальными клетками, а также гибридный белок Nogo-AP, синтезированный в эукариотических клетках. В тесте с полосками (метод 1) нейриты избегали покрытых ламинином/Nogo-A полосок и росли на полосках, покрытых только ламинином, тогда как на полосках, покрытых ламинином/бета-галактозидазой, роста не было. Полноразмерный белок Nogo-A проявлял высокую подавляющую активность в отношении роста нейритов клеток ретинального ганглия, а N-концевая часть (NiR) оказывала незначительное действие. Активность Nogo-C не отличается от активности контрольного белка (бета-галактозидаза). Nogo-A-специфичная область NiG-D20 содержала основную область, ответственную за подавление роста нейритов клеток ретинального ганглия; конусы роста останавливались при столкновении с полосками, покрытыми NiG-D20. Непермиссивный эффект зависел от концентрации. При более низких концентрациях Nogo-A количество перекрещивающихся волокон увеличивалось. Не наблюдалось никаких явных различий между нейритами клеток назального и височного ретинальных ганглиев в отношении их чувствительности к области Nogo-A. Ламинин-независимый, NGF-чувствительный клон клеток PC12 праймировали 50 нг/мл NGF в течение 24 ч и затем засевали в планшеты, покрытые слоем фрагментов Nogo, синтезированными в бактериальных клетках, в концентрации 0,1-3 мкг/см². Рост нейритов оценивали на следующий день. Nogo-A-специфичная область (NiG) и ее фрагмент NiG-820 значительно подавляли рост нейритов PC 12. Напротив, N-концевой фрагмент NiR обладал лишь незначительной активностью, выявляемой только при высоких концентрациях белка. Nogo-C и Nogo-66 не обладали активностью.

Пример 2

Наличие сайта (сайтов) связывания NiR-G и NiG-D20 на фибробластах 3Т3 и мембранах клеток коры головного мозга крысы

Методы

а) Введение радиоактивной метки и эксперименты по связыванию: очищенный методом аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных ионов металлов NiG-D20 иодировали на фирме ANAWA Trading SA (Wangen, Швейцария) (2030 Ci/ммолей) с использованием лактопероксидазы и очищали с помощью обратно-фазовой ВЭЖХ. Мембраны клеток коры головного мозга крысы получали, как описано ранее (Olpe и др., CGP 35348: a centrally active blocker of GABAB receptors. Eur. J. Pharmacol., т.187, 1990, с.27-38). Связывание проводили в течение 1 ч при КТ по методике, по существу описанной ранее (Kaupmann и др.. Expression cloning of GABA (B) receptors uncovers similarity to metabotropic glutamate receptors. Nature, т.386, 1997, с.239-246), с использованием 2,5-мл пробирок, преинкубированных в течение 2 ч с 1% (мас./об.) БСА для уменьшения неспецифического связывания. Гомогенаты мембран в буфере HEPES при рН 7,4 (125 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0,6 мМ MgCl₂, 1,8 мМ CaCl₂, 20 мМ HEPES, 6 мМ декстрозы), содержащем ингибиторы протеолитических ферментов (Rôche Diagnostics, Мангейм, ФРГ), инкубировали с 1,3 нМ иодированного NiG-D20 в присутствии возрастающих концентраций немеченого NiG-D20 или без него.

б) Проточная цитометрия: проточную цитометрию и сортировку клеток проводили на высокоскоростном приборе Cytomation MoFlo (Fort Collins, шт.Колорадо, США). Проточный цитометр оснащен лазерной насадкой (аргон-ионный/УФ лазер Enterprise II), настроенной на 488 нм при мощности 130 мВт. Флуоресценцию FITC измеряли после оптических фильтров на 530/40 нм. Для анализа фибробласты ЗТЗ снимали с помощью буфера для диссоциации клеток фирмы Gibco. Предобразованные комплексы, используемые для выявления связывания NiR-G с 3Т3 фибробластами, готовили следующим образом: NiR-G и Мус-АТ (9Е10) инкубировали в молярном соотношении 1:1 в течение 30 мин при 4°С. Затем добавляли FITC-конъюгированные F(ab)₂ фрагменты IgG козы к мышиным IgG и инкубировали еще 30 мин при 4°С. Получающееся при этом молярное соотношение тримерных комплексов составляло 1:1:0,5. Комплекс добавляли к 1×10⁶ 3Т3 фибробластов в конечном объеме 0,1 мл, инкубировали 2 ч при 4°С, отмывали и анализировали методом проточной цитометрии.

Результаты

Наличие сайта (сайтов) связывания Nogo-A-специфичных активных фрагментов на фибробластах ЗТЗ и мембранах клеток коры головного мозга крысы: Поскольку области N1R-D2 и NiG-D20 белка Nogo-A подавляют "растекание" клеток и рост нейритов, несмотря на отсутствие Nogo-66 и независимо от него NgR, можно принять без доказательств существование отдельного от них Nogo-A-специфического рецептора. Эксперименты по связыванию проводили с мультимером NiR-G, меченым myc и очищенным методом аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных ионов металлов, и живыми фибробластами ЗТЗ, которые анализируются с помощью проточной цитометрии. Комплексы NiR-G с антителами эффективно связывались с клетками ЗТЗ, о чем свидетельствовало усиление флуоресценции более 90% клеток ЗТЗ. Напротив, после инкубации с первыми анти-myc мкАТ мыши (9Е10), связанными с FITC-конъюгированными F(ab)₂-фрагментами антител козы к мышиным IgG или только со вторыми AT, клетки ЗТЗ не давали сигнала. Для определения связывания NiG-D20 с мембранами клеток коры головного мозга крысы использовали [¹²⁵I]-NiG-D20 в тесте связывания радиолиганда. Доказательства присутствия специфических сайтов связывания NiG-D20 в мембранах клеток головного мозга крысы были получены при концентрации [¹²⁵I]-NiG-D20, равной 1,3 нМ, так как была обнаружена зависимость конкуренции за связывание между радиолигандом и немеченым NiG-D20 от концентрации. Эти результаты показывают, что аминотерминальные фрагменты Nogo-A могут связываться с поверхностью клеток ЗТЗ и мембранами клеток коры головного мозга крысы, свидетельствуя о наличии связанных с мембраной специфических сайтов связывания Nogo-A, т.е. специфического рецептора (рецепторов).

Пример 3

Создание мышиных 11C7-IgG1

Мышей линии С3Н и C57BI6/J иммунизировали путем подкожного введения синтетического пептида SYDSIKLEPENPPPYEEA (=NogoA_623-640 крысы; SEQ ID NO:1), соответствующего определенному эпитопу NiG-D20. Это высококонсервативный эпитоп Nogo-A-специфичной области NiG-D20 человека, макак циномолгус и мыши, который начинается с аминокислоты в положении 623 и заканчивается аминокислотой в положении 640 аминокислотной последовательности NogoA человека (SEQ ID NO:5) (см. также сравнение последовательностей на чертеже). Моноклональные AT 11C7 получали от мышей, иммунизированных гибридным белком крысиный NogoA_623-640-KLH (KLH - белок-носитель). Скрининг моноклональных антител проводили методом ELISA с крысиным NogoA_623-640-KLH, свободным пептидом NogoA_623-640 крысы и гибридной молекулой, представляющей собой инертный пептид-KLH. При дальнейшем скрининге мкАТ тестировали методом ELISA с NiR-G или b-галактозидазой, причем оба белка экспрессировались как his-белки; процедуру очистки проводили методом металлоаффинной хроматографии. Затем мкАТ тестировали на способность распознавать Nogo-A при Вестерн-блоттинге олигодендроцитов и лизатов мозговой ткани крысы. Антитела тестировали на распознавание белка с использованием методов иммуноцитохимии на клетках СНО или COS, трансфецированных Nogo-A крысы, и с эндогенным Nogo-A олигодендроцитов крысы (пермеабилизированные клетки). Они также были проверены на связывание с поверхностью живых олигодендроцитов крысы. Межвидовую перекрестную реактивность тестировали на рекомбинантных молекулах NiG крысы, мыши, человека и быка с помощью ELISA и на эндогенных Nogo-A крысы, мыши, человека и быка в Вестерн-блоттинге тканевых и клеточных экстрактов.

Вестерн-блот анализ: Электрофорез в полиакриламидном геле с додецил-сульфатом натрия (SDS-PAGE) и Вестерн-блот анализ проводили, как описано ранее (Huber и др., Patterns of Nogo mRNA and protein expression in the developing and adult rat and after CNS lesions. J. Neurosci., т.22, 2002, с.3553-3567), блокирование осуществляли с использованием 3% (мас./об.) Top Block (Juro Supply, г.Люцерна, Швейцария). Антитела разводили следующим образом: очищенные моноклональные антитела 11С7 или супернатанты гибридомы разводили в соотношении 1:150. Вторыми антителами были конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) анти-мышиные антитела (Pierce; 1:5000, 1:50000).

Гибридизацию с антителами 11С7 проводили в течение ночи при 4°С. Для визуализации использовали реагенты для детекции ECL, доступные на фирме Amersham Pharmacia.

Результаты

Моноклональные антитела 11С7 идентифицировали соответствующую 190-кДа Nogo-A полосу при Вестерн-блот анализе гомогената клеточной культуры олигодендроцитов. Также в Вестерн-блот анализе моноклональные антитела 11С7 обнаруживали NiG человека, клеточный лизат NiG циномолгус и NiG-D20 крысы. мкАТ 11С7 относятся к изотипу IgGI (IsoStrip Kit, Roche).

Пример 4

Характеристика мышиных моноклональных антител 11С7

Иммуноцитохимия: олигодендроциты зрительного нерва выделяли, как описано в работе Schwab и Caroni, (Schwab, Caroni, Neuron, 1988). Культуры, выращенные на покрытых поли-L-лизином покровных стеклах в течение 3-5 дней, дважды промывали PBS, фиксировали раствором 4% (мас./об.) параформальдегида (ПФА), 5% (мас./об.) сахарозы в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре (КТ) и блокировали неспецифическое связывание 10% (об./об.) фетальной телячьей сывороткой. Далее клетки инкубировали с мышиными 11С7 (1:100). В качестве вторых антител использовали TRITC-конъюгированные антимышиные антитела козы (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Для окрашивания клеточной поверхности двухдневные культуры клеток зрительного нерва крысы инкубировали с моноклональными антителами в среде в течение 25 мин при КТ. Конъюгаты вторых антител с щелочной фосфатазой (Milan Analytica, Lausanne) использовали в разведении 1:7500 в 0,1 М малеиновой кислоте с 1% (мас./об.) блокирующего реагента (1 ч). Культуры дважды промывали буфером, содержащим малеиновую кислоту, и один раз буфером с щелочной фосфатазой (0,1 М Tris-HCl рН 9,5, 0,1 М NaCl, 5 мМ MgCl₂). Окрашивание проявлялось за 3 ч при комнатной температуре в присутствии 0,175 мг/мл 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфата (BCIP, Sigma) и 0,338 мг/мл нитротетразолия синего (NBT, Sigma) в буфере с щелочной фосфатазой.

Эпитоп NogoA_623-640 Nogo-A на клеточной поверхности культивируемых олигодендроцитов: в живых культурах олигодендроцитов, инкубированных с мышиными мкАТ 11С7, окрашивались тела олигодендроцитов и их радиальные отростки. В присутствии контрольных IgG мыши или антител к внутриклеточной циклической нуклеотид-фосфодиэстеразе (CNPase) живые клетки не окрашивались. Преинкубация мышиных 11С7 с соответствующим иммуногенным пептидом (=NogoA_623-640 крысы SEQ ID NO:1) уменьшала интенсивность окрашивания до фонового уровня (конкурентный количественный анализ). Клеточная поверхность окрашивалась у всех крупных и мелких отростков и у тела клетки. Таким образом, Nogo-A-специфичная часть молекулы, распознаваемая мышиными 11С7 мкАТ, экспонирована во внеклеточном пространстве на плазматической мембране олигодендроцитов.

Получение и очистка мышиных мкАТ 11С7: для непрерывного культивирования гибридомы, секретирующей мкАТ 11С7, использовали 10-литровый стеклянный биореактор. Биореактор оснащен лопастным колесом в центральной трубке для мягкого перемешивания, вращающимся фильтром для задержки клеток и свернутой силиконовой трубкой для аэрации культуры без образования пузырьков. Клетки гибридомы культивировали на нашей бессывороточной среде на основе RPMI. Среду инокулировали клетками в дозе 3,7×10⁵ /мл. Через 28 ч начинали непрерывный ток среды через биореактор со скоростью 0,5 объема ферментера в день (5 литров/день). Еще через 24 ч скорость прохождения среды через ферментер увеличивали до конечного уровня, составлявшего 1 ферментер/день (10 литров/день). Через 1 неделю культура достигала стационарного состояния с плотностью 11×10⁵ клеток/мл и процесс продолжали еще 1 неделю. Титр мышиных мкАТ 11С7 определяли ежедневно с помощью ВЭЖХ. Всего с биореактора собирали 150 литров культурального супернатанта, который подвергали стерильной фильтрации с целью удаления клеток и клеточных остатков. 150 литров культурального супернатанта концентрировали примерно до 6 литров, используя тангенциальное проточное устройство Pellikon (Millipore; отделение фракций до 10 кДа). Концентрированный супернатант очищали в три этапа через 220-мл колонку, заполненную Sepharose C1-4B, конъюгированной с белком A (Pharmacia; высота колонки 11 см). Краткое описание процедуры: культуральный супернатант после доведения рН до 8,1 наносили на колонку со скоростью 4 мл/мин, затем колонку промывали до фонового значения 100 мМ Na₂HPO₄ (рН 8,1) со скоростью 8 мл/мин. Связавшийся материал окончательно элюировали со скоростью 8 мл/мин элюирующим раствором, содержащим 50 мМ NaH₂PO₄, рН 3,0, 140 мМ NaCl, элюат сразу нейтрализовали (рН 7,0) 5 N NaOH и стерилизовали путем фильтрации. Поглощение измеряли при 280 нм. Фракции очищенного материала дополнительно концентрировали путем ультрафильтрации и/или диализовали против PBS. Все буферные растворы, применявшиеся при очистке, фильтровали на тангенциальном проточном аппарате ULTRASETTE™, отделяющем фракции с мол. массой выше 10-кДа (Filtron Technology Corporation), чтобы удалить возможные примеси эндотоксина. С этой же целью хроматографический носитель, конъюгированный с белком А, интенсивно промывали 20% этанолом, а все трубки/насосы обрабатывали перед использованием 0,1 М NaOH. Концентрацию белка измеряли спектрофотометрически при 280 им, принимая в качестве стандарта поглощения при концентрации белка 1 мг/мл значение 1,35. Чистоту контролировали путем SDS-PAGE электрофореза в восстанавливающих условиях, используя 4-20% градиентные гели Novex. Содержание эндотоксина измеряли в классическом LAL тесте (Limulus Amoebocyte Lysate) в соответствии с инструкциями изготовителя (Endotell AG, Allschwil, Швейцария).

Получение Fab-фрагментов: часть мышиных мкАТ 11С7 интенсивно диализовали против 100 мМ Na-ацетатного буфера (рН 5,5), содержащего 2 мМ ЭДТА, и доводили концентрацию до 6 мг/мл. F_ab-фрагменты получали путем расщепления папаином (в весовом соотношении 1:200) в присутствии 0,25 мМ цистеина. Реакция продолжалась в течение 16 ч при 37°С, затем ее останавливали добавлением специфического ингибитора папаина Е64 (N-[N-(L-3-транс-карбоксиран-2-карбонил)-L-лейцил]агматина в большом избытке (10 мкМ). Расщепленные антитела прогоняли через колонку, заполненную Sepharose Fast Flow, конъюгированной с белком А, для удаления интактного материала и Fc-фрагментов. Фракцию F_ab интенсивно диализовали против PBS и концентрировали до примерно 3 мг/мл (Папаин и Е64 доступны на фирме Roche Molecular Biochemicals).

ВЭЖХ, масс-спектрометрия и N-концевое секвенирование областей V_L и V_H:

(а) Восстановление и алкилирование: очищенные, высушенные антитела 11С7 растворяли в 40 мкл буферного раствора, содержащего 8М мочевины и 0,4 М NH₄HCO₃ (рН 8,3). Затем добавляли 60 мкг ДТТ (Calbiochem), предварительно растворенного в 10 мкл того же самого буфера, в котором растворен белок. Восстановление проводили при 50°С в течение 30 мин в атмосфере аргона (100-кратный молярный избыток ДТТ относительно содержания тиолов). После восстановления материал охлаждали до комнатной температуры. Добавляли 304 мкг иодацетамида (Sigma Ultra, I-1149), растворенного в том же буфере, что и белок. Карбоксамидометилирование проводили при комнатной температуре 15 мин в темноте. Для остановки реакции добавляли 1 мкл β-меркаптоэтанола.

(б) Выделение тяжелых и легких цепей: Карбоксамидометилированные тяжелые и легкие цепи антител выделяли с помощью обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC) в системе Hewlett Packard 1090M HPLC System с насосом DR5 и УФ-детектором с диодным пучком. Хроматографию проводили на колонке PerSeptive Biosystems Poros размером 2,1×100 мм, заполненной R1/H, со скоростью 0,5 мл/мин, с использованием следующих растворов: (А) 0,1%-ный раствор трифторуксусной кислоты (ТФУ) в воде и (Б) ацетонитрил/вода в соотношении 9:1 с 0,09% ТФУ; градиент раствора Б от 25 до 70% за 8 мин при 80°С; детекция при 218/280 нм.

(в) ЖХ-ЭСИ-МС: Масс-спектрометрию проводили с использованием квадрупольного время-пролетного гибридного тандемного масс-спектрометра Q-Tof (Micromass, г.Манчестер, Великобритания), оснащенного электростатическим источником ионизации Micromass Z-типа (ESI). Типичный диапазон массовых чисел составлял m/z 500-2000. Данные записывали и обрабатывали с использованием пакета программ MassLynx. Калибровку шкалы 500-2500 m/z проводили с использованием разнозаряженных ионных пиков миоглобина сердца лошади (мол. масса 16951,5).

(г) ВЭЖХ-МС тяжелых и легких цепей: отделение восстановленных и карбоксамидометилированных тяжелых и легких цепей проводили с использованием системы НР1100 HPLC (Hewlett Packard, Пало-Альто, шт.Калифорния, США) на колонке размером 1 мм×150 мм LC Packings, заполненной Perseptive Biosystems POROS R1/H. Колонку держали при 60°С. На колонку наносили пробы объемом 10 мкл с помощью автоматического устройства для введения пробы СТС PAL (CTC, Zwingen, Швейцария) с клапаном модели Valco C6UW HPLC (Valco, г.Хьюстон, шт.Техас, США) и инъекционной петлей на 10 мкл. Процесс ВЭЖХ контролировался программой MassLynx (Micromass, г.Манчестер, Великобритания). Измерения УФ-спектра проводили при 214 нм. Элюент А - вода, содержащая 0,05% ТФУ. Элюент Б - смесь вода/ацетонитрил в соотношении 1:9, содержащая 0,045% ТФУ. Градиент элюента Б от 20% до 90% проходил за 20 мин при 80°С. В типичном случае хроматографию проводили со скоростью 60 мкл/мин. Весь материал из системы ЖХ без разведения поступал в спектрофотометрическую кювету, затем в источник ЭСИ. Управление системой ВЭЖХ и обработку сигнала с УФ-детектора осуществляли с помощью программы MassLynx (Micromass, г.Манчестер, Великобритания). Были получены следующие пять сигналов:

Таблица 1
Данные измерений:	Интерпретация сигнала
А=50959,0 Да	Н-цепь с карбоксамидометил-цистеином (CAMCys)*
В=51119,5 Да	Сигнал А+162 Да (=гексоза)**
C=51086,0 Да	Сигнал А+127 (Lys), Н-цепь с CAMCys*
D=51251,0 Да	Сигнал С+162 Да (=гексоза)**
Е=24464,8 Да	L-цепь с CAMCys
* Наличие Н-цепей двух типов: Н-цепь с С-концевым Lys и без него. Соотношение между цепями двух типов составляет примерно 50:50%.
** Оба типа Н-цепей имеют соответствующие гликозилированные формы (+162)

(е) N-концевое секвенирование областей V_L и V_H: Анализ аминокислотных последовательностей проводили на собранных после ВЭЖХ пиках цепей H+L. Аминокислотную последовательность определяли с помощью системы для N-концевого секвенирования белков Hewlett Packard G1000A N-terminal Protein Sequencing System. Система автоматически осуществляет реакции Эдмана на белковых пробах, собранных на миниатюрных поглощающих бифазных колонках. Для повышения химической эффективности метода, минимизации фазовых сдвигов и таким образом расширения анализа последовательности до примерно 50 остатков применяли метод химической оптимизации (двойная пара 3.0). Анализ РТН-аминокислот проводили on-line в системе Hewlett Packard HP 1090 HPLC System, оснащенной трехкомпонентной насосной системой и узкой колонкой РТН размером (2,1 мм×25 см).

Результаты

Анализ масс подтвердил выделение гомогенных препаратов тяжелых и легкий цепей мышиных 11C7-IgG1. Н-цепь представляла собой одиночную гликозилированную цепь, существующую в двух формах с разницей в одном С-концевом лизиновом остатке. Общий анализ масс тяжелых и легких цепей показал, что для обеих цепей существует единая масса. ВЭЖХ мышиных 11С7-IgG1 продемонстрировала наличие одного пика. В результате очистки путем ВЭЖХ с последующим восстановлением и алкилированием были получены чистые тяжелые и легкие цепи. Провели N-концевое секвенирование тяжелой и легкой цепи. Были идентифицированы от 45 до 55 аминокислот N-концевых последовательностей L- и Н-цепей методом химической деградации.

Пример 5

Клонирование генов тяжелой и легкой цепи мышиных мкАТ 11С7

Общую РНК получали из 10 клеток гибридомы (клон 11С7) с использованием реагента TriPure (Roche diagnostics, Германия, кат. # 1667157) и руководствуясь инструкциями фирмы-изготовителя. Для синтеза кДНК выделяли мРНК из препарата общей РНК с использованием Oligotex Resin (Qiagen, Германия, кат. # 70022).

Библиотеку кДНК создавали путем обратной транскрипции в следующих условиях: реакционная смесь состояла из 2 мкл мРНК, 2 мкл 10-кратного буфера для обратной транскрипции, 2 мкл праймера (dT)₂₀ (10 мкМ), 0,5 мкл RNasin (Promega, 40 Е/мл), 2 мкл dNTP (no 5 мМ каждого), 1 мкл обратной транскриптазы Omniscript™ (Qiagen, кат. # 205110), 10,5 мкл ddH₂O; реакцию проводили 1 ч при 37°С. При проведении ПЦР-амплификации кДНК, кодирующих V_H и V_L, использовали ДНК-полимеразу ProofStart™ DNA-фермент, проверяющий правильность считывания.

ПЦР легкой и тяжелой цепи: реакционная смесь состояла из 2 мкл кДНК, 5 мкл 10-кратного реакционного буфера, 3 мкл dNTP (по 5 мМ каждого), 2 мкл 5'-праймера (10 мкМ) (см. Таблицу 2), 2 мкл 3'-праймера (10 мкМ) (см. Таблицу 2), 1 мкл ProofStart (Qiagen, кат.# 202203), 36 мкл ddH₂O. Условия ПЦР: 95°С/5 мин, (95°С/40 с, 53°С/1 мин, 72°С/1 мин)×35, 72°С/10 мин. Продукты ПЦР лигировали напрямую с плазмидой pCRbluntTOPO (Invitrogen). Производили трансфекцию 10 клеток TOP (Invitrogen) полученной лигационной смесью и отбирали несколько клонов. Последовательности нуклеотидов в кДНК вариабельной части тяжелой цепи мкАТ 11С7 (V-H, SEQ ID NO:43) и легкой цепи мкАТ 11С7 (V-L, SEQ ID NO:44) определяли на секвенаторе ABI. Последовательность аминокислот V-H и V-L показана в SEQ ID NO:2 (V-H) и SEQ ID NO:3 (V-L). Все праймеры, использованные для ПЦР-амплификации кДНК V_H и V_L, синтезированы на фирме MWG Biotech (Германия).

Таблица 2
Праймер	Последовательность	SEQ ID NO:
5'-VL лидерная	AATATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTC	39
3'-Сκ	TTAGGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG	40
3'-VH лидерная	AATATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG	41
3'-Сн шарнирная	ААТТ GGGCAACGTTGCAGGTGACG	42

Пример 6

Иммуноферментный анализ связывания 11С7 и Fab с доменами Nogo-А

В каждую лунку 96-луночных PS планшет Greiner (#655161) вносили по 100 мкл PBS, содержащего фрагменты белка Nogo (0,4-2 мкг/мл), планшеты закрывали и инкубировали 4 ч при комнатной температуре. Затем планшеты стряхивали, в каждую лунку вносили по 200 мкл блокирующего буфера (PBS+2% БСА), закрывали и инкубировали 1 ч при КТ или в течение ночи при 4°С, затем 4 раза промывали водой и PBS. Различные концентрации мышиных мкАТ 11С7 или 11С7 Fab-фрагментов в PBS+2% БСА вносили в лунки (по 100 мкл в лунку) и инкубировали 2 ч при КТ или в течение ночи при 4°С. Повторяли все этапы промывания и добавляли в лунки антитела козы к мышиным IgG, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) в разведении 1:5000 (ICN #55550) в PBS/0,1% БСА/0,1% Nonidet 40 (по 100 мкл в лунку); планшеты инкубировали 2 ч при КТ или в течение ночи при 4°С, затем повторяли процедуру промывания. Пероксидазную реакцию начинали, добавляя в лунки по 100 мкл раствора 3,3'-5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ) (продукт ВМ Blue POD Substrate фирмы Roche #1484281), планшеты инкубировали в темноте при КТ в течение 15 мин. Для остановки реакции с субстратом HRP добавляли в каждую лунку по 50 мкл 1М H₂SO₄ и определяли оптическую плотность с использованием устройства для определения оптической плотности в микротитрационных планшетах (Packard Spectra Count), установленного на 450 нм.

Мышиные 11С7 мкАТ связывались с NiG человека, NiG крысы, NiG мыши, NIG-D20 крысы и пептидом 472 при очень низких концентрациях от 0,02 to 2,5 нМ. Связывание с NiG человека, NiG крысы, NiG мыши при очень низких концентрациях подтверждали очень высокие показатели аффинности (Кд 0,1-0,44 нМ, как определено путем измерений аффинности с помощью биосенсора) и согласуется с тем фактом, что пептид 472, за исключением 2-3 аминокислот, идентичен в эквивалентных областях последовательностей человека, крысы и мыши. На специфичность связывания указывал тот факт, что в том же диапазоне концентраций мышиные 11С7 мкАТ вообще не связывались с NiG-D6 крысы и фрагментами Nogo-66. Моновалентные Fab-фрагменты связывался с NiG человека и NiG-D20 крысы в концентрациях от 0,025 до 25 нМ, но в том же диапазоне концентраций не связывался с NiG-D6 крысы и фрагментами Nogo-66. Для NiG человека значение Кд, измеренное с помощью биосенсора, составляло 7,14 нМ.

Пример 7

Измерение аффинности мышиных 11C7-IgG1 к доменам Nogo-A и их Fab-фрагментов с помощью биосенсора

Аффинность мышиных 11С7 мкАТ и Fab-фрагментов 11С7 измеряли с помощью технологии резонанса поверхностных плазмонов (SPR) с использованием оптического биосенсора BIAcore 2000 (Biacore, г.Уппсала, Швеция) в соответствии с инструкциями фирмы-изготовителя.

Рекомбинантные NIG человека, мыши и крысы ковалентно подшивали к трем отдельным проточным кюветам сенсорного чипа СМ5. Краткое описание процедуры: матрицу из карбоксиметилированного декстрана активировали путем инъекции 35 мкл раствора, содержащего 0,025 М NHS и 0,1 М дихлорэтана. Для иммобилизации на сенсорном чипе рекомбинантные NIG мыши, человека и крысы разводили в 0,01 М цитратном буфере при рН от 3,5 до 4,5 и инъецировали со скоростью 5 мкл/мин для достижения уровня связывания, достаточного для измерения аффинности. Инактивация оставшейся NHS-эфирной группы осуществлялась путем инъекции 35 мкл 1М этаноламина гидрохлорида (рН 8,5). Поверхность сенсорного чипа регенерировали путем инъекции 5 мкл 0,1М HCl. Для измерения аффинности антитела инъецировали в разных концентрациях, от 0,50 до 100 нМ, со скоростью 200 мкл/мин. После каждой инъекции поверхность сенсорного чипа регенерировали путем инъекции 10 мкл HCl без потери поверхностной связывающей активности. Кинетические константы ka, kd и константы аффинности KA и КД, оценивали с использованием программы BIAevaluations 3.0, предоставленной изготовителем.

Определение аффинности с помощью BIAcore: Кинетические параметры и константы аффинного связывания мышиных мкАТ 11С7 и моновалентных Fab-фрагментов, произведенных из мкАТ 11С7, с рекомбинантным NogoA измеряли в реальном времени с помощью технологии SPR (Biacore). Для этого анализа рекомбинантные NIG человека, крысы и мыши связывали с тремя несвязанными поверхностями сенсорного чипа и инъецировали антитела в разных концентрациях. Кинетические параметры связывания рассчитывали по сенсограммам путем нелинейной аппроксимации кривой. Константы аффинности в стационарном состоянии для 11C7-IgG1 мыши составляли КД=0,1 нМ, КД=0,4 нМ и КД=0,19 нМ для NIG человека, крысы и мыши соответственно (Таблица 3). Для Fab-фрагментов, полученных из 11С7, константа аффинности к NIG человека составляла KD=7,14 нМ. Более низкая аффинность Fab-фрагментов является следствием снижения обеих кинетических констант - константы ассоциации и константы диссоциации (ka, kd). Более низкая аффинность Fab-фрагментов по сравнению с цельным антителом, вероятно, связана с эффектом авидности, который отсутствует в мономерных Fab.

Таблица 3
11С7	ka (1/Mc)	kd (1/c)	KA (M-1)	КД (М)
NIG человека	4,48×105	4,6×10-5	9,73×109	1,03×10-10
NIG крысы	8.76×105	3,89×10-4	2,25×109	4,44×10-10
NIG мыши	5,52×105	1,06×10-4	5,2×109	1,92×10-10
11С7 Fab	Ka (1/Mc)	кд (1/C)	KA (M-1)	КД(М)
NIG человека	7,29×104	5,28×10-4	1,4×108	7,14×10-9

1. Связывающая молекула, которая является моноклональным антителом или его фрагментом, способным связываться с человеческим полипептидом NogoA, человеческим NogoA 623-640 (SEQ ID NO:6), который включает по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, причем этот антигенсвязывающий сайт содержит

в последовательности гипервариабельные области CDR1-11C7 (SEQ ID NO:8), CDR2-11С7 (SEQ ID NO:9) и CDR3-11C7 (SEQ ID NO:10), и в последовательности гипервариабельные области CDR1'-11C7 (SEQ ID NO:11), CDR2'-11C7 (SEQ ID NO:12) и CDR3'-11C7 (SEQ ID NO:13); или

их прямые эквиваленты, где гипервариабельные области имеют последовательность, идентичную по меньшей мере на 95%.

2. Связывающая молекула по п.1, дополнительно включающая константную часть тяжелой цепи иммуноглобулина человека или ее фрагмент и константную часть легкой цепи иммуноглобулина человека или ее фрагмент.

3. Связывающая молекула по п.2, в которой константная часть тяжелой цепи иммуноглобулина человека или ее фрагмент относится к типу γ4 и константная часть легкой цепи иммуноглобулина человека или ее фрагмента относится к типу к.

4. Полинуклеотид, кодирующий связывающую молекулу по любому из пп.1-3.

5. Вектор экспрессии, включающий полинуклеотид по п.4.

6. Клетка-хозяин, включающая полинуклеотид по п.4 или вектор экспрессии по п.5, причем эта клетка способна продуцировать полипептид по любому из пп.1-3.

7. Применение связывающей молекулы по любому из пп.1-3 в качестве лекарственного средства для лечения заболеваний, связанных с восстановлением нерва.

8. Применение связывающей молекулы по любому из пп.1-3 для получения лекарственного средства для восстановления нерва.

9. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, связанных с восстановлением нерва, содержащая связывающую молекулу по любому из пп.1-3 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.