Средство, обладающее антиишемической и антигипоксической активностью

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к лечебно-профилактическим средствам, нормализующим функцию сердечной деятельности, в частности перспективным для лечения ишемической болезни сердца (ИБС). Предлагается в качестве лечебного средства, обладающего антиишемической и антигипоксической активностью использовать пептид общей формулы CH₃CO-Lys-Lys-Arg-Arg-NH₂. Заявленное изобретение обеспечивает выраженное антиишемическое, антигипоксическое и адаптационное воздействия на организм и перспективно для использования в медицинской практике. 5 табл.

 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к лечебно-профилактическим средствам, нормализующим функцию сердечной деятельности, в частности перспективным для лечения ишемической болезни сердца (ИБС).

Проблема лечения ИБС является чрезвычайно актуальной, т.к. по данным рабочей группы ВОЗ (1997) в России 87.5% случаев смерти среди мужчин и 85% среди женщин 45-74 лет приходится на ИБС и инсульт, а их доля в структуре общей смертности превышает 41%.

Известно большое количество фармацевтических препаратов, направленных на лечение ИБС. В их число входят антиангинальные препараты, средства, расширяющие сосуды (ментол, валидол, корвалол и т.д.), седативные средства, андрогенные и витаминные препараты, аденозинтрифосфаты, спазмолитики и т.д. (Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, ч.1. с.64-89, 173-175, 293, 347-349 ч.2, 1986, с.6-9, 88, 141-186, 511; UA 96124897, 1999; RU 97119808, 1999; RU 2144922, 2000). В частности, в этих целях применяют производные диуманкала или их смеси с анаприлином (RU 2155036, 1998), производные аденозин-5'-трифосфата (RU 2190411, 1999) в виде инъекционной формы, производные триметил-3-гидроксипиридина (RU 2276138, 2004), растворы солей эхинохрома (RU 2137472, 1998). Как правило, использование синтетических химико-фармацевтических препаратов имеет большое число ограничений. При этом препараты, обладающие антиишемическим действием, как правило, не являются антигипоксантами. Так, одним из широко применяемых средств, обладающих антиишемической активностью, является обзидан (анаприлин) (Машковский М.Д. Лекарственные средства. Харьков: Торсинг, 1997, т.1, с.262-264). Однако применение этого средства ограничено у больных с обструктивными заболеваниями периферических сосудов из-за наличия у него отрицательного инотропного эффекта. Антигипоксическая активность этого средства не описана.

Относительно более безвредными для организма считаются препараты природного происхождения. К ним, в частности, относятся мелилотин на основе экстракта донника лекарственного (RU №2002127568, 2004, кл. А61К 35/78), элеутар на основе настойки аралии и экстракта элеутерококка (RU 2005481, 1995), кардиофит, содержащий ингредиенты 14 растений (RU 2137496, 1998) и т.д.

Недостатками этой группы препаратов являются относительно невысокая эффективность, ограниченный рынок сырья, отсутствие антигипоксического эффекта.

Наиболее известным антигипоксическим средством является пирацетам (Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, ч.1, с.109-111). Он оказывает положительное влияние на обменные процессы и кровообращение. Имеются данные и о его положительном действии у больных с ишемической болезнью сердца, но только в пожилом и старческом возрасте (Л.А.Лещинский, Л.Г.Пименов, B.C.Федоров. Лечебное применение пирацетама у больных инфарктом миокарда. // Кардиология. 1987, 2, с.46-49).

Известно, что янтарная кислота и ее соли обладают адаптогенной способностью и оказывают антигипоксическое, антистрессовое и нейротропное действие, нормализуют энергетический обмен. Известно также кардиотропное и противоишемическое действие янтарной кислоты и ее солей (Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. Сборник научных статей. Пущино. 1997; RU 2108095, 1998).

Наиболее близким по эффективности к предлагаемому является средство, обладающее антиишемической и антигипоксической активностью (ЕР 199900877, 2001), включающее м-карбамоил-4-фенил-2-пирролидона (КФП) и двух- или трехосновную карбоновую кислоту. В качестве двухосновной кислоты используют или щавелевую, или яблочную, или янтарную кислоту, в качестве трехосновной - лимонную. Заявленные средства по эффективности превышают эффективность м-карбамоил-4-фенил-2-пирролидона (КФП) и ряд известных лекарственных средств, использованных в качестве эталонных препаратов сравнения. Средство, содержащее КФП и янтарную кислоту, проявило наибольшую активность во всех проведенных исследованиях. Однако эти средства плохо растворимы в воде, их растворы имеют низкое значение рН, что ограничивает способы их введения, биодоступность и это соответственно уменьшает эффективность.

Технической задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание лекарственного средства, сочетающего высокие антиишемическую и антигипоксическую активности с минимальным негативным воздействием на организм.

Техническая задача была решена в ходе исследований в области пептидов, входящих в состав природных гормонов, регулирующих жизнедеятельность организма человека. В результате этих исследований был создан пептид CH₃CO-Lys-Lys-Arg-Arg-NH₂, обладающий сочетанными антиишемической и антигипоксической активностями и гомологичный по первичной последовательности фрагменту адренокортикотропного гормона (АКТГ). Препарат не содержит неприродные аминокислотные остатки или какие-либо заместители, не свойственные эндогенным регуляторным пептидам, поэтому в организме он разлагается до отдельных аминокислот, включающихся в естественный метаболизм.

Препарат быстро выводится из кровотока, однако, как показывают эксперименты, результаты его действия проявляются даже через 24 часа после введения. Установлено, что в диапазоне концентраций от 0,001 до 100 мкг/мл он не обладает цитотоксическими свойствами. Согласно результатам проведенного радиолигандного анализа препарат с высоким сродством и специфичностью связывается с рецепторами АКТГ на мембранах коры надпочечников крыс. Показано, что он тормозит угасание условных рефлексов после прекращения подкрепления.

Синтез пептида проводили на автоматических синтезаторах («Applied Biosystems», модель 430А и «Vega Coupler», модель С250, США), а очистку осуществляли препаративной обращенно-фазовой хроматографией (хроматограф «Gilson», Франция), колонка Prep-Nova-Pak HR C18, 6 um, 60Å, (19×300 мм) (Waters, США). Синтезированное вещество охарактеризовывали данными аналитической обращенно-фазовой ВЭЖХ (хроматограф Gilson, Франция), колонка Waters Delta Pak C18, 5 um, 100Å, (Waters, США), аминокислотного анализа (гидролиз 6М HCl, 24 ч, 110°; аминокислотный анализатор LKB 4151 Alpha Plus (Швеция)) и масс-спектрального анализа (масс-спектрометр PerSepetive BioSystems Voyager-DE Biospectrometry WorkStation, США).

Препарат применяли интраназально. В одной капле раствора содержится 50 мкг активного вещества. Разовая доза составляет 150-1500 мкг (из расчета 2-20 мкг/кг). При необходимости использования повышенной дозировки введение осуществляется в несколько приемов с интервалами 10-15 минут. Суточная доза 400-4000 мкг (из расчета 6-60 мкг/кг). Препарат, как правило, назначают ежедневно в течение 3-5 дней, при необходимости курс лечения продлевают до 14 дней.

Эксперименты на животных показали, что препарат обладает антиишемической, кардиопротективной и антигипоксической, а также значительной стресс-протекторной и адаптогенной активностью.

Препарат достоверно улучшает коронарный кровоток и увеличивает сократительную активность миокарда в постинфарктный период, способствуя нормализации нарушений атриовентрикулярной проводимости миокарда, снижая интенсивность цитолиза миокарда, интенсивность перекисного окисления липидов.

Препарат показан (по предварительным данным) при следующих патологиях:

- интеллектуально-мнестические расстройства при сосудистых поражениях головного мозга;

- состояния после черепно-мозговой травмы и нейрохирургических операций;

- хроническая сердечная недостаточность с нарушениями кровообращения;

- для профилактики и лечения постнаркозных расстройств различного генеза, в том числе после ионизирующего излучения;

- для повышения адаптационных возможностей организма человека в экстремальных ситуациях.

Была показана эффективность интраназальных аппликаций препарата лабораторным животным в моделях теплового, холодового шоков, гипобарической гипоксии и острой геморрагии. Одним из получаемых при этом эффектов является снижение концентрации глюкокортикоидов (11-оксикортикостероидов) в надпочечниках и крови, стабилизация уровня адреналина и норадреналина в надпочечниках и плазме, восстановление активности диаминооксидазы в миокарде с одновременным снижением содержания гистамина.

Пример 1. Получение препарата и его характеристики.

Синтез пептида СН₃СО-Lys-Lys-Arg-Arg-NH₂ был проведен твердофазным методом с использованием Boc/Bzl стратегии на синтезаторе пептидов Coupler-250. Для временной защиты α-аминофункции использовали трет-бутилоксикарбонильную группу. Для блокирования боковых радикалов аргинина и лизина использовали мезитиленсульфонильную и 2-хлорбензилоксикарбонильную группировки соответственно.

В качестве нерастворимой матрицы был использован 4-метил-бензгидриламинополимер (m-BHA-resin) с начальной емкостью 1 мМол/г. 2,9 г ВНА-полимера поместили в реакционный сосуд синтезатора и проводили наращивание полипептидной цепи по следующей программе присоединения одного аминокислотного остатка (таблица 1). Удаление временной защитной группы проводили трифторуксусной кислотой, нейтрализацию - 5% раствором диизопропилэтиламина в диметилформамиде. Конденсацию осуществляли методом активированных эфиров, используя трехкратный избыток соответствующего активированного компонента. Предварительное активирование карбоксильной компоненты проводили в течение 30 минут, используя оксибензотриазол и диизопропилкарбодиимид. Для контроля полноты протекания реакции конденсации использовали нингидриновый тест. После присоединения аминокислотных остатков, соответствующих последовательности синтезируемого пептида, проводили ацетилирование N-концевой аминогруппы, используя 40 эквивалентов уксусного ангидрида (5 мл) в 25 мл диметилформамида. Затем пептидил-полимер высушивали в эксикаторе до постоянного веса. Выход защищенного пептидил-полимера 96%. При такой обработке удалялись все боковые защитные группировки, и пептид отщеплялся от высокомолекулярной матрицы, время деблокирования составляло один час.

Таблица 1
Программа присоединения одного аминокислотного остатка
N п/п	Операция	Реагенты	Кратность повторения	Время, мин	Объем реагентов, мл
1.	Удаление Вос-защиты (деблокирование)	Трифторуксусная кислота	1	2	25
2.	Повторное деблокирование	Трифторуксусная кислота	1	2	25
3.	Промывка	Хлористый метилен	1	2	25
4.	Промывка	Диметилформамид	3	1	25
5.	Нейтрализация	5% р-р DIEA в DMFA	3	1	25
6.	Промывка	Диметилформамид	3	1	25
7.	Конденсация	9.0 мМол оксибензотризолового эфира соответствующего производного аминокислоты	1	20 ч	25
8.	Промывка	Диметилформамид	3	1	25
9.	Промывка	Хлористый метилен	3	1	25
10.	Нингидриновый тест

Удаление боковых защитных группировок и отщепление пептида от нерастворимой матрицы проводили под действием безводного жидкого фтористого водорода в присутствии скавенджеров. 3.5 г пептидил-полимера обрабатывали 27 мл фтористого водорода и 3 мл м-крезола при 0°С и перемешивании на магнитной мешалке в течение 1 часа. Затем фтористый водород упаривали и суспендировали остаток в 50 мл 50% раствора уксусной кислоты в воде. Раствор фильтровали и экстрагировали 3 раза по 10 мл эфиром. После лиофилизации водного раствора получено 1.4 г грубого продукта.

Синтезированный пептидный препарат был очищен с помощью препаративной обращенно-фазовой жидкостной хроматографии на колонке Prep-Nova-Pak HR С18, 6 um, 60 Å, (19×300 мм), Waters, США и охарактеризован данными аминокислотного анализа (аминокислотный анализатор Alpha Plus, LKB, Швеция) и масс-спектрометрии (масс-спектрометр Per Sepetive Biosystems «Voyager-DE Biospectrometry Workstation»). Аминокислотный состав конечного продукта соответствовал теоретическому. Чистота по данным аналитической ВЭЖХ составила не менее 98%. Выход конечного продукта - 50%.

Перевод пептида в ацетатную форму осуществляли по следующей процедуре: 450 мг полученный пептид в форме трифторацетатной соли растворили в 45 мл деионизованной воды, добавили смолу IRA- 68 в ацетатной форме и перемешивали в течение 30 минут. Затем полимер отфильтровали, промыли водой, фильтрат и промывные воды объединили и лиофилизировали. Получено 350 мг NP-4 в ацетатной форме (74%).

Пример 2. В ФГУН НИИ токсикологии ФМБА России была оценена эффективность препарата (условное наименование NP-4), полученного по примеру 1, при экспериментальном инфаркте миокарда (ЭИМ), вызванном перевязкой левой коронарной артерии, в сравнении с известным препаратом-антиоксидантом Рибоксином.

Эксперименты выполнены на нелинейных белых крысах-самцах массой 180-230 г, возрастом 3.5 - 4 мес. (Рапполово, г.Санкт-Петербург). Моделирование инфаркта миокарда проводили перевязкой левой коронарной артерии по способу Г.И.Дьячука и Г.Я.Лапкиной. Регистрацию ЭКГ проводили на ненаркотизированных животных с помощью полиграфа RM-6000 (Япония).

Всего было сформировано 5 экспериментальных групп (каждая экспериментальная группа включала по 15 животных).

1. Интактные животные (ложнооперированные);

2. Животные с ЭИМ без лечения;

3. Животные с ЭИМ - терапия препаратом Рибоксин (10 мг/кг);

4. Животные с ЭИМ - терапия препаратом NP-4 (2.0 мкг/кг);

5. Животные с ЭИМ - терапия препаратом NP-4 (20.0 мкг/кг).

Исследуемый препарат NP-4 вводили интраназально один раз в сутки курсом 7 дней после ЭИМ. Рибоксин вводили интрагастрально один раз в сутки курсом 7 дней после ЭИМ. Интактным животным, ложнооперированным, вводили растворитель - дистиллированная вода. Животным с ЭИМ без лечения также вводили растворитель. Сравнительная эффективность препаратов оценивалась по нескольким группам показателей:

- летальности и клинической картине;

- функциональным - ЭКГ (1 час, 3 дня и 7 дней);

- биохимическим - кровь и ткань сердца (24 часа);

- гистологическим - (24 часа, 3 дня и 7 дней).

Экспериментальное моделирование инфаркта миокарда сопровождалось примерно 20-26% смертностью; таким образом, в исследовании наблюдались 11-12 животных из каждой группы. Как свидетельствуют полученные данные, после экспериментального инфаркта миокарда не наблюдалось достоверных различий в частоте возникновения ИМ в экспериментальных группах. Частота ИМ составила в среднем 83.2% в каждой группе, без электрокардиографических признаков ИМ - 16.8%.

Величина подъема сегмента ST достоверно не отличалась между группами. Снижение ST ниже изолинии (депрессия) характеризует постинфарктные ишемические изменения и свидетельствует о недостаточности кровоснабжения, гипоксии миокарда. Выраженность депрессии сегмента ST через 3 дня после ЭИМ достоверно отличалась от контроля (в 1.5 раза меньше, (р<0.05)) на фоне терапии препаратами Рибоксин и NP-4. Причем на фоне терапии NP-4 в дозе 20 мкг/кг величина депрессии была в 2 раза меньше, чем в контроле (р<0.05).

Величина депрессии ST у экспериментальных животных с ИМ через 7 дней после ЭИМ в контрольной группе достоверно увеличилась в 1.2 раза по сравнению со сроком 3 день (р<0.05). На фоне терапии препаратами Рибоксин и NP-4 (2 мкг/кг) величина депрессии ST сохранялась на том же уровне, а на фоне терапии NP-4 (20 мкг/кг) - снизилась достоверно в 2 раза (р<0.05), в 4 раза менее выражена по сравнению с контролем. Этот факт говорит о наличии противоишемического эффекта у препаратов Рибоксин и NP-4, повышении устойчивости миокарда к гипоксии на фоне данной терапии, причем наблюдается прямая линейная дозозависимость для препарата NP-4.

В контрольной группе наблюдался выраженный стойкий отрицательный хронотропный эффект (снижение ЧСС достоверно на 32%) (табл.2); достоверное выраженное уменьшение амплитуды зубца R на сроке наблюдения 7 дней в 2 раза по сравнению с нормой и со сроком наблюдения 1 час, что характеризует угнетение сократительной активности миокарда в постинфарктный период; стойкие прогрессирующие нарушения атриовентрикулярной и внутрижелудочковой проводимости (удлинение PQ и QT в 1.5-2 раза по сравнению со сроком наблюдения до ЭИМ).

На фоне терапии препаратом Рибоксин также наблюдалось стойкое достоверное снижение ЧСС на 30%; достоверное выраженное уменьшение амплитуды зубца R на сроке наблюдения 7 дней в 2 раза по сравнению с нормой и со сроком наблюдения 1 час; стойкие нарушения внутрижелудочковой проводимости (удлинение QT в 1.5 раза через 1 час и в 2 раза через 7 дней по сравнению со сроком наблюдения до ЭИМ); нормализация атриовентрикулярной проводимости.

Препарат NP-4 в дозе 2 мкг/кг и в дозе 20 мкг/кг не влиял на ЧСС (брадикардия сопоставима с контролем). Амплитуда зубца R не уменьшалась в подострый постинфарктный период (достоверно выше в 2 раза по сравнению с контролем). Также наблюдалось достоверное (в 2 раза) повышение амплитуды зубца Т через 7 дней. Эти характеристики свидетельствуют о повышении сократительной активности миокарда на фоне терапии препаратом NP-4, причем данный эффект одинаково проявлялся на обеих дозах исследуемого препарата. Наблюдались стойкие нарушения внутрижелудочковой проводимости (удлинение QT в 1.5 раза через 1 час и 7 дней по сравнению со сроком наблюдения до ЭИМ); нормализация атриовентрикулярной проводимости.

Таблица 2
Влияние исследуемых препаратов на динамику ЧСС и показателей ЭКГ крыс у экспериментальных животных в условиях острого инфаркта миокарда, М±m
Пока-затели	ЧСС	Р	R	S	Т	PQ	QT
Контроль
1 час	323±27•	0.022±0.001	2.01±0.43	0.048±0.02	0.26±0.13	30±5	64±9•
7 дней	274±20*•	0.020±0.008	0.80±0.19*•	0.038±0.01	0.22±0.17	80±8*•	90±15•
Рибоксин
1 час	315±36•	0.022±0.001	2.02±0.45	0.049±0.01	0.27±0.13	39±5	61±9•
7 дней	334±14•	0.017±0.003	0.97±0.20*•	0.046±0.01	0.28±0.10	43±7	70±13•
NP-4 2 мкг/кг
1 час	316±16•	0.022±0.003	2.02±0.42	0.054±0.02	0.26±0.13•	35±7	60±9•
7 дней	277±14*•	0.018±0.002	1.94±0.40	0.043±0.01	0.57±0.21•*	28±10	72±7•
NP-4 20 мкг/кг
1 час	320±34•	0.022±0.0009	1.93±0.46	0.047±0.009	0.25±0.12•	28±5	63±8•
7 дней	314±21•	0.033±0.002	1.81±0.41	0.039±0.01	0.58±0.20*•	55±1*	70±6•
* р<0.05 по сравнению со сроком наблюдения 1 час
• р<0.05 по сравнению с нормой - до ЭИМ

Результаты морфометрических и биохимических исследований на фоне экспериментального инфаркта миокарда представлены в таблице 3.

Таблица 3
Морфометрическое и биохимическое исследование на фоне ЭИМ
Показатели	Интактные	Контроль	Рибоксин	NP-4 2 мкг/кг	NP-4 20 мкг/кг
Масса тела, г	185±10	180±10	200±10	205±10	195±5
Относительная масса сердца, мг/100 г массы тела	3.5±0.1	4.9±0.3	3.5±0.1*	3.1±0.1*	3.3±0.2*
АЛТ, кровь, мккат/л	0.22±0.03	2.46±0.45	1.19±0.12*	0.94±0.27	0.88±0.16
ACT, кровь, мккат/л	0.65±0.05	2.85±0.12	1.175±0.17*	0.96±0.22*	0.80±0.10*
КФ, кровь, мккат/л	0.71±0.10	1.96±0.16	0.95±0.11*	0.97±0.13*	0.79±0.11*
ЛДГ, кровь, ммоль/ч/л	4.90±0.32	8.92±0.36	6.77±0.27	6.85±0.28	4.95±0.32*
Каталаза, кровь, мг·мл/мин	445±20	252±28	260±35	300±49	302±49
МДА сыворотки, нмоль/мг белка	1.65±0.25	4.82±0.33	4.80±0.30	3.15±0.20	3.18±0.22
Восстановленный глутатион, сердце, мг%	85±10	40±5	45±5	50±10	35±10
Гликоген, сердце, мг%	2450±110	850±90	1350±100*	1850±110*	1550±150*
Молочная кислота, сердце, мг%	60±10	185±15	170±10	90±5*	140±15
АТФ, сердце, мкмоль/г	2.30±0.11	0.55±0.10	1.23±0.14*	1.57±0.16*	1.20±0.12*
СДГ, сердце, мкг формазана/г белка/час	145±15	75±10	55±15	80±10	90±15
Интенсивность тканевого дыхания, сердце, мкл O2/100 мг/час	61±6	38±4	38±5	36±5	53±5
МДА, сердце, нмоль/мг белка	3.57±0.35	7.50±0.45	4.50±0.35*	4.15±0.25*	5.15±0.30
Каталаза, сердце, мг·мл/мин	475±20	260±35	252±38	305±40	293±42
*- достоверные отличия от контроля при р<0.05

Было показано, что ЭИМ характеризуется достоверным увеличением относительной массы сердца. Кроме этого наблюдались достоверные признаки цитолиза в миокарде: увеличение АЛТ, ACT, КФ и ЛДГ в плазме крови. Фиксировались нарушения процессов тканевого дыхания и метаболизма в миокарде: снижались запасы АТФ, гликогена; повышалось содержание недоокисленных продуктов обмена - молочной кислоты; наблюдалась активация свободно-радикальных реакций (увеличение МДА) и снижение уровня антиоксидантной защиты (каталазы, СДГ, ВГ).

Введение препаратов оказывало кардиопротективное действие, причем препарат NP-4 оказался более эффективным по сравнению с препаратом Рибоксин, причем эффекты двух исследуемых доз препарата NP-4 не отличались между собой.

Через 24 часа после операции в миокарде левого желудочка крыс контрольной группы наблюдались общие расстройства кровообращения в виде полнокровия, небольших кровоизлияний, стазов крови в капиллярах, отека. Преимущественно под эпикардом были видны мышечные волокна, интенсивно окрашенные эозином или пикриновой кислотой.

На 3-и сутки после операции в зоне ишемии наблюдалось формирование инфаркта. Расстройства кровообращения носили уже не общий, а местный характер. Некротизированные кардиомиоциты были лишены поперечной исчерченности ядер, гомогенно окрашивались эозином. Большая часть некротизированных волокон окрашивалась очень бледно, находясь в состоянии лизиса. В зоне некроза находились гемолизированные эритроциты, полиморфно-ядерные лейкоциты. Лейкоцитарная инфильтрация наблюдалась в основном вокруг очага некроза. Строма миокарда вне зоны некроза была отечной.

На 7-й день наблюдалась организация инфаркта, рассасывание некротизированных волокон и замещение участков некроза молодой соединительной тканью, богатой клеточными элементами преимущественно фибробластического ряда. В более поздние сроки на месте этих очагов пролиферации клеток фибробластического ряда образовывался фиброзный рубец.

При введении препаратов Рибоксин, NP-4 2 мкг/кг и NP-4 20 мкг/кг гистологическая картина была несколько иной. У крыс этих опытных групп через 24 часа после операции общие расстройства кровообращения в миокарде левого желудочка сердца были менее выражены по сравнению с контролем. В участке ишемии наблюдалась эозинофилия мышечных волокон и небольшой отек.

На 3-и сутки наблюдалось формирование инфаркта миокарда, преимущественно под эпикардом передней стенки левого желудочка. Размеры очага некроза были значительно меньше, чем у контрольных крыс. Некротизированные волокна были бледно окрашены, лишены исчерченности и ядер. В очаге некроза наблюдался отек, небольшое количество гемолизированных эритроцитов и лейкоцитов. Лейкоцитарная инфильтрация вокруг очага некроза была слабо выражена. Интерстициальный отек вне зоны ишемии отсутствовал.

На 7-е сутки на месте некротизированных волокон наблюдалась пролиферативная реакция стромы с большим количеством клеток фибробластического ряда. Размеры участка пролиферации были меньше по сравнению с контролем.

Полученные экспериментальные данные позволили сделать следующие выводы:

1. Экспериментальный инфаркт миокарда характеризуется формированием очага некроза в 82,3%, недостаточностью коронарного кровотока в острый и подострый периоды, угнетением сократительной активности миокарда и нарушением атриовентрикулярной и внутрижелудочковой проводимости; нарушением тканевого дыхания и метаболизма, активацией перекисного окисления липидов и снижения антиоксидантной защиты.

2. Препарат Рибоксин обладает выраженным противоишемическим действием: улучшает коронарный кровоток в 1.5 раза в постинфарктный период по сравнению с контролем. Препарат не влияет на сократительную активность миокарда в постинфарктный период, способствует нормализации нарушенной атриовентрикулярной проводимости; обладает кардиопротективным действием, снижает интенсивность свободно-радикального окисления и повышает уровень антиоксидантной защиты.

3. Препарат NP-4 обладает выраженным противоишемическим действием: достоверно улучшает коронарный кровоток в 1.5 раза в постинфарктный период на дозе 2 мкг/кг и в 4 раза на дозе 20 мкг/кг по сравнению с контролем. Препарат NP-4 достоверно увеличивает сократительную активность миокарда в постинфарктный период в 2 раза, способствует нормализации нарушений атриовентрикулярной проводимости миокарда, причем данный эффект достигается уже на дозе 2 мкг/кг и не изменяется при последующем увеличении дозы препарата. Препарат NP-4 обладает выраженным кардиопротективным действием, снижает интенсивность цитолиза миокарда, интенсивность перекисного окисления липидов, способствует повышению уровня антиоксидантной защиты, причем более эффективно, чем препарат сравнения Рибоксин.

Пример 3. Изучение влияния препарата NP-4 на организм в моделях острой геморрагии и гипобарической гипоксии у крыс in vivo.

В экспериментах использовали половозрелых самцов крыс линии Wistar массой 180-200 г. Моделью острой геморрагии служила 1-часовая артериальная гипотензия. Для ее создания у наркотизированных крыс (нембутал 40 мг/кг) через катетер в хвостовой артерии производили взятие крови до достижения среднего артериального давления 40 мм рт.ст. До начала кровопотери животным внутривенно вводили гепарин (0,5 мл, 50 ЕД/мл) для предотвращения свертывания крови во время проведения длительного эксперимента. По истечении времени гипотензии крыс реанимировали путем внутриартериального введения взятой крови. Сразу после восполнения кровопотери проводили внутривенную инфузию изучаемых пептидов (1 и 10 мкг/кг/мин в течение 10 мин) или аналогичного объема (0,8 мл) физиологического раствора через яремную вену. Поскольку, как правило, регуляторные пептиды имеют каскадный механизм действия и их влияние может сказываться через длительное время после введения, декапитацию животных и взятие материала для биохимических исследований проводили на 1-е и 7-е сутки. Контрольной группе животных была проведена полная операция без геморрагического шока. Значения биохимических показателей в этой группе принимали за 100%. Контрольные и опытная группы содержали по 10 крыс.

Для создания условий развития острой гипобарической гипоксии крыс помещали в барокамеру с давлением 154 мм ртутного столба, соответствующем атмосферному давлению на высоте 11500 м от уровня моря, и выдерживали в этих условиях до принятия ими бокового положения. Изучаемые препараты крысам опытной группы вводили интраназально (0,1 и 1 мкг/кг массы тела животного) за 1 и 24 часа до "подъема", параллельно крысам контрольной группы вводили физиологический раствор. Декапитацию животных и взятие материала для биохимических исследований проводили на 1-е и 7-е сутки после "подъема". Значения биохимических показателей в контрольной группе принимали за 100%. Каждая группа содержала по 10 животных.

Определение содержания глюкокортикоидов (11-оксикортикостероидов) в надпочечниках и крови проводили по методу, принцип которого основан на способности 11-оксикортикостероидов флюоресцировать после обработки смесью серной кислоты и этилового спирта (3:1, V/V). Гормоны из ткани экстрагировали с помощью хлороформа. Содержание флюоресцирующих продуктов измеряли на флуориметре "Hitachi 850" (Япония) при λ (длине волны) 530 нм (λ возбуждающего света = 470 нм). Количество 11-оксикортикостероидов определяли по калибровочной кривой и выражали в микрограммах на 1 г ткани. Для статистической обработки результатов использовали t-критерий Стьюдента.

Содержание катехоламинов в надпочечниках определяли по следующим способом. Экстракцию катехоламинов из ткани проводили последовательной обработкой гомогената кислым n-бутанолом, смесью n-гептана и воды (4,5:1, по объему). Затем к водной фазе добавляли 2 М ацетат натрия, содержащий 0,2% ЭДТА и алюминий по Брокману I. После центрифугирования (5 минут при 2000g) сорбент промывали водой, переносили в 0,5 М фосфатный буфер, рН 6.0, содержащий 0,75% ЭДТА, и помещали на 15 минут в шейкер для элюирования катехоламинов, а затем снова центрифугировали. Флюоресцирующие продукты катехоламинов получали с помощью тригидроксииндольной реакции. Измерение флюоресценции проводили на флуориметре "Hitachi 850" (Япония) для адреналина при λ=500 нм и возбуждающем свете с λ=410 нм и для норадреналина при λ=485 и λ=385 нм соответственно. Количество адреналина и норадреналина определяли по калибровочной кривой и выражали в микрограммах на 1 г ткани. Достоверность различий экспериментальных данных между контролем и опытом оценивали по t-критерию Стьюдента.

В таблице 4 представлены данные о влиянии препарата NP-4 на содержание 11-оксикортикостероидов и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс в на 1-е и 7-е сутки постреанимационного периода после геморрагического шока. Видно, что через 1 сутки после шока уровень 11-оксикортикостероидов в надпочечниках и плазме возрастал на 59%. Через 7 суток содержание 11-оксикортикостероидов в надпочечниках и плазме снижалось, оставаясь выше контрольного уровня на 19%. Введение пептида в дозе 1 мкг/кг приводило к уменьшению содержания 11-оксикортикостероидов в надпочечниках и плазме как через 1, так и через 7 суток, увеличение дозы до 10 мкг/кг сопровождалось снижением уровня гормонов во всех изученных случаях до контрольных значений. Как видно из таблицы 2, через 1 сутки после шока концентрация адреналина и норадреналина в надпочечниках снижалась по сравнению с контрольным уровнем на 38%. Через 7 суток после шока эти показатели были близки к контрольным значениям. Напротив, через 1 час после шока содержание адреналина в плазме возрастало на 79%, а через 7 суток превышало контрольный уровень на 24%. Резкое снижение содержания адреналина в надпочечниках через 1 час после шока и одновременный рост его в плазме свидетельствует об увеличении секреции гормона из надпочечников в кровь. Введение пептида в дозах 1 и 10 мкг/кг предотвращало данный эффект: содержание адреналина в железе и плазме через 1 и 7 суток после шока было близко к контролю. Таким образом, исследуемый препарат в дозах 1 и 10 мкг/кг оказывает позитивное корригирующее действие на организм крыс, подвергнутых геморрагическому шоку.

Таблица 4
Влияние препарата NP-4 на уровень 11-оксикортикостероидов (КС) и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс в постреанимационном периоде после геморрагического шока
Гормон	Группа животных	Уровень гормона (%)
Через 1 сутки	Через 7 суток
КС в плазме	Контроль ГШ+ФР*** ГШ+NP-4 (1 мкг/кг) ГШ+NP-4 (10 мкг/кг)	100±26* (0,38±0,1 мкг/мл) 148±8* 118±9* 99±6**	100±28* (0,28±0,08 мкг/мл) 131±10* 109±6* 94±8*
Адреналин в надпочечниках	Контроль ГШ+ФР*** ГШ+NP-4 (1 мкг/кг) ГШ+NP-4 (10 мкг/кг)	100±10* (422±42 мкг/г) 62±9* 90±6** 98±5**	100±13* (440±58 мкг/г) 110±15* 102±10* 99±9*
Адреналин в плазме	Контроль ГШ+ФР*** ГШ+NP-4 (1 мкг/кг) ГШ+NP-4 (10 мкг/кг)	100±6* (39,9±2,4 мкг/мл) 179±12* 111±10* 100±6**	100±7* (27,0±1,9 мкг/мл) 124±11* 110±10* 98±9*
Норадреналин в надпочечниках	Контроль ГШ+ФР*** ГШ+NP-4 (1 мкг/кг) ГШ+NP-4 (10 мкг/кг)	100±10* (200±20 мкг/г)) 78±8* 111±10* 100±6**	100±13* (192±25 мкг/г) 105±12* 102±10* 100±4**
*Р<0.02, **Р<0.001
*** Геморрагический шок+физиологический раствор

В таблице 5 приведены результаты исследования влияния препарата NP-4 на содержание 11-оксикортикостероидов и адреналина в надпочечниках и плазме крови крыс в на 1-е и 7-е сутки после гипобарической гипоксии. Видно, что характер изменений содержания гормонов в надпочечниках и плазме после "подъема" был таким же, как и в случае геморрагического шока. Интраназальное введение пептидов в дозах 0,1 и 1 мкг/кг за 1 и 24 часа до "подъема" нормализовало содержание 11-оксикортикостероидов и адреналина в надпочечниках и плазме крови крыс, подвергнутых гипоксии.

Таблица 5
Влияние препарата NP-4 на уровень 11-оксикортикостероидов (КС) и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс после гипобарической гипоксии
Гормон	Группа животных	Уровень гормона (%)
Через 1 сутки	Через 7 суток
КС в надпочечниках	Контроль ГГ+ФР*** ГГ+NP-4 (0,1 мкг/кг дважды) ГГ+NP-4 (1 мкг/кг дважды)	100±17* (35±6 мкг/г) 164±12* 123±11* 102±8*	100±14* (36±5 мкг/г) 111±8* 108±9* 104±10*
КС в плазме	Контроль ГГ+ФР*** ГГ+NP-4 (0,1 мкг/кг дважды) ГГ+NP-4 (1 мкг/кг дважды)	100±33* (0,3±0,1 мкг/мл) 148±8* 118±9* 99±6**	100±33* (0,3±0,1 мкг/мл) 131±10* 109±6* 94±8*
Адреналин в надпочечниках	Контроль ГГ+ФР*** ГГ+NP-4 (0,1 мкг/кг дважды) ГГ+NP-4 (1 мкг/кг дважды)	100±8* (410±35 мкг/г) 84±10* 98±5** 98±5**	100±13* (418±56 мкг/г) 107±12* 102±10* 99±9*
Адреналин в плазме	Контроль ГГ+ФР*** ГГ+NP-4 (0,1 мкг/кг дважды) ГГ+NP-4 (1 мкг/кг дважды)	100±10* (30,8±3,1 мкг/мл) 156±13* 104±10* 102±4**	100±8* (28,0±2,2 мкг/мл) 114±12* 107±10* 99±8*
*Р<0.02, **Р<0.001 ***Гипобарическая гипоксия + Физиологический раствор

Полученные результаты показали, что препарат NP-4 оказывает корригирующее нормализующее действие на организм крыс при таких формах стресса, как геморрагический шок и гипобарическая гипоксия.

Приведенные в примерах данные свидетельствуют, что заявляемое средство обладает выраженным антиишемическим, антигипоксическим и адаптационным воздействием на организм и перспективно для использования в медицинской практике.

Пептид общей формулы CH₃CO-Lys-Lys-Arg-Arg-NH₂ в качестве средства, обладающего антиишемической и антигипоксической активностью.