Стабильные липосомальные композиции

Изобретение относится к области лекарственных средств, в частности к стабильной липосомальной композиции, стерилизованной посредством автоклавирования, для доставки фармацевтического средства, содержащей: водную среду; липосомы из подходящего фосфолипида; фармацевтическое срество, инкапсулированное в липосомах и выбранное из: i) липофильного амина и фармацевтически приемлемой кислоты, где фармацевтически приемлемая кислота выбрана из органической или неорганической кислоты, и ii) фармацевтически приемлемой соли органической кислоты липофильного амина и, необязательно, фармацевтически приемлемой органической кислоты, где количество фармацевтически приемлемой кислоты, присутствующей в композиции, является таким, что рН липосомальной композиции является меньшим или примерно равным рК_а аминогруппы фармацевтически активного липофильного амина. Кроме того, изобретение относится к набору и способу получения, а также способу повышения стабильности композиций автоклавированием и способу определения стабильных липосомальных композиций по настоящему изобретению. Технический результат заключается в повышении стабильности липосомальной композиции посредством автоклавирования. 6 н. и 57 з.п. ф-лы, 23 ил., 4 табл.

 

Изобретение относится к композициям на основе мембранных липидов, конкретнее, к стабильным липосомам, используемым для доставки лекарственного средства, и способам их получения и применения, в частности, к стерильным и стабильным липосомальным композициям, используемым для доставки лекарственного средства, и способам их получения и применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Липосомы, так же известные как липидные везикулы, представляют собой полностью замкнутые липидные бислойные мембраны, которые имеют включенный объем, составляющий водную среду. Липидный бислой часто состоит из фосфолипидов, таких как лецитин, и близких веществ, таких как гликолипиды. Липосомы могут быть одноламеллярными, имеющими один мембранный бислой, или мультиламеллярными, имеющими более чем один мембранный бислой и имеющими водное пространство между различными мембранными бислоями. Бислой состоит из двух липидных монослоев, каждый из которых имеет гидрофобную часть, которая ориентирована друг к другу, с гидрофильной частью, направленной наружу к водным фазам.

Липосомы образуются, когда фосфолипиды или другие подходящие амфифильные молекулы набухают в воде или водном растворе. Если во время данного процесса в водной фазе находятся водорастворимые вещества, то вещество может включиться в водную фазу между липидными бислоями. Аналогично, липофильные вещества можно растворить в липиде и включить их в сами бислои, хотя, если липофильное вещество также имеет полярную группу, то данная группа может попасть во внутреннюю или внешнюю водную фазу. Инкапсулирование веществ в липосомы можно проводить рядом способов, известных в данной области. Наиболее часто используемый способ включает образование тонкой пленки из фосфолипида на стенке колбы при выпаривании органического растворителя. Когда данную пленку диспергируют в подходящей водной среде, то образуются липосомы. Альтернативно, липосомы также можно получить суспендированием подходящего липида в водной среде. Затем смесь обрабатывают ультразвуком (перемешивают с помощью ультразвуковых волн высокой частоты) с получением дисперсии замкнутых везикул. Дополнительным способом получения липосом является быстрое смешивание липида в этаноле и воде. Часто это осуществляют впрыскиванием липида в водный раствор.

Липидная двухслойная мембрана часто функционирует аналогично клеточным мембранам. Следовательно, они проявляют некоторые биологические свойства, такие как способность легко попадать в окружающую среду живых клеток. Липосомы могут сливаться с живыми клетками, поскольку они сами по себе представляют органеллы. В результате в последние годы имелся большой интерес к применению липосом в качестве носителей для доставки соединений, обладающих специфическими биологическими или фармацевтическими свойствами, пациенту.

Возникают некоторые затруднения при использовании липосом в качестве средств для доставки и направленной доставки лекарственных препаратов и других соединений. Одна конкретная проблема заключается в том, что липосомы, приготовленные обычными способами с обычными композициями, часто не обладают фазовой стабильностью в течение времени, что делает такие композиции не пригодными для применения в промышленности, в частности, фармацевтической промышленности. Это может привести к вытеканию, разрушению, оседанию и разделению фаз, слиянию, агломерации и желированию липосом во время хранения.

Известные способы повышения стабильности липосом при хранении включают применение химических добавок в качестве стабилизаторов или получение сухих порошковых препаратов. Примеры способов стабилизации липосом с использованием стабилизаторов-наполнителей включают раскрытые в патенте США № 4818537, патенте США № 5100662, патенте США № 5204112, патенте США № 4804539 и патенте США № 5962015. Стабилизаторы для липосом включают амфотерные молекулы, имеющие катионную область, например, триэтаноламин, обычный косметический буфер. Данные молекулы можно добавлять для предупреждения агрегации липосом. Независимо было показано, что триэтаноламин обеспечивает адекватный срок хранения и стабильность при обработке. Использовали кватернизованные алкилированные полимеры, такие как стеардимоний гидроксицеллюлоза, для стабилизации липосом с лецитином, содержащих биологически активные ингредиенты, которые являются кислыми. Также применяли алкиламины с относительно длинной цепью для стабилизации липосом, такие как стеариламин, но данные заряженные алкиламины с длинной цепью являются токсичными в высоких концентрациях, что делает их менее желательными для фармацевтических применений.

Другие способы, используемые для стабилизации липосом, включают лиофилизацию или высушивание распылением. Данные стадии усложняют производство, и при них требуется восстановление липосом перед введением пациентам. Восстановление не желательно для продуктов, которые в конечном итоге можно использовать амбулаторно.

Одной конкретной областью, которая может быть пригодна для доставки в липосомах, являются фармацевтические продукты для ингаляционного введения. Многие лекарственные средства, применяемые ингаляционным путем, вводят с использованием водного раствора, который подается из устройства, способного образовывать водные капли аэрозоля. Согласно регламентированным требованиям к ингаляционным фармацевтическим продуктам, необходимо, чтобы продукты были обеспечены в виде стерильных композиций. Ранее, стратегии для стерилизации липосомальных композиций были основаны на стерильной фильтрации или добавлении консервантов. Терапевтические липосомальные композиции для доставки парентеральными путями (в/в, в/м, п/к) или ингаляционно (через дыхательную систему или интраназально) должны быть стерильными препаратами.

Хорошо известна конечная стерилизация фармацевтических растворов автоклавированием. Однако исторически сложилось, что липосомы считались нестабильными для жестких условий автоклавирования, которые приводят к агломерации, слиянию и желированию липосом, что во многом аналогично тому, что наблюдают во время хранения, а также к изменению размера или распределения по размеру липосом, гидролизу/окислению липидов, химическому разложению и нежелательному высвобождению инкапсулированного лекарственного препарата, например, как описано на странице 11, строки 6-10 публикации WO 2004/00246.

Различные исследовательские группы в прошлом сосредоточили свои усилия на проблемах стабильности, связанной с автоклавированием липосомальных композиций. Например, в патенте США № 5554382 и патенте США № 5776486, которые оба относятся к способам стерильного производства липосом, говорится, что липосомы трудно стерилизовать, и что их стерильность достигается независимой стерилизацией составляющих компонентов - липидов, буфера, лекарственного средства и воды - автоклавированием или фильтрацией, и затем смешиванием в стерильных условиях. В патентах постулируется, что тепловая стерилизация конечного продукта невозможна, поскольку нагревание липосом необратимо повреждает липосомы.

В патенте США № 5542935 говорится, что тепловая стерилизация конечных липосомальных продуктов является невозможной, поскольку нагревание липосом необратимо повреждает липосомы, но постулируется, что газообразные мультиламеллярные липидные суспензии перед разливочным наполнением можно автоклавировать. Автоклавирование не приводит к изменению размера газообразных липидных частиц.

В патенте США № 5770222, патенте США № 6071495 и патенте США № 6479034 также говорится об автоклавировании предшественника липосом, т.е. липосом без лекарственного средства.

В патенте США № 5834025 приводится, что липосомы на основе эфиров нельзя автоклавировать, и также раскрывается, что липосомы, приготовленные из липидов-эфиров, полученных из архебактерий, можно подвергнуть автоклавированию. Хорошо установлена безопасность липосом на основе эфиров, т.е. фосфатидилхолина, в то время как профиль токсичности липидов-эфиров не известен.

В патенте США № 5230899 раскрывается автоклавирование прелипосомных гелей, содержащих очень небольшое количество влаги, а именно, только достаточное количество воды для присутствия в количестве до 300 моль по отношению к твердым веществам. Аналогично, в патенте США № 6424857 раскрывается автоклавирование небольших (диаметром 100 нм) пустых липосом (т.е. без препарата) без изменения размера частиц.

В патенте США № 5676928 раскрывается автоклавирование мультиламеллярных липосом, которые стабилизируют включением заряженных фосфолипидов. Изобретение касается диагностической композиции, которая включает, по меньшей мере, одно контрастное вещество, используемое для визуализации.

В целом данные предшествующего уровня постулируют о том, что следует избегать тепловой обработки для стадии конечной стерилизации конечного, содержащего лекарственный препарат липосомального продукта, и не раскрывается или не предлагается повышение фазовой стабильности при конечной стерилизации липосом.

Следовательно, обеспечение стерильности и отсутствия пирогенности липосомальных препаратов ограничивалось применением фильтрации через фильтры с размером пор 0,2 микрон для препаратов, содержащих липосомы с диаметром менее 0,2 микрон, или применением асептических условий для производства более крупных липосом. Гамма-облучение рассматривается как неприемлемое за счет недопустимого разложения водных липосомальных дисперсий (смотри, например, Daan Crommelin, Liposomes as Pharmaceutical Dosage Forms, Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Vol.9, page 13).

Таким образом, стерильная фильтрация является выбором только, если липосомы являются в достаточной мере небольшими для прохождения через фильтрационную систему с размером пор 0,2 микрон. Если целью липосомальных композиций является повышение времени нахождения лекарственного средства в данном месте действия, то желаемыми являются более крупные мультиламеллярные липосомы. Липосомы размером 1-5 микрон подходят для легочной доставки через, но объективно они не подходят для конечной стерильной фильтрации.

В прошлом, в ингаляционные продукты добавляли консерванты и бактериостатические средства. Было показано, что при включении в состав бронходилятаторов многие из данных консервантов индуцировали сужение просвета легких и противодействовали положительному действию бронходилятаторов. Следовательно, добавление консервантов в ингаляционные липосомальные композиции следует предпринимать только с осторожностью, и его не следует рассматривать в качестве желаемого.

Другой конкретной областью, которая подходит для доставки липосом, является применение композиций с длительным высвобождением одного или более активных ингредиентов, таких как композиции, раскрытые в US RE38407, Delex Therapeutics, Inc. Такие композиции могут обеспечить быстрое начало высвобождения лекарственного средства из неинкапсулированной части с последующим длительным высвобождением из инкапсулированного в липосомы активного вещества. Согласно регламентированным требованиям к таким композициям также необходимо, чтобы процент инкапсулированного препарата был постоянным в течение времени, и чтобы композиции имели химическую и фазовую стабильность в течение времени.

Следовательно, имеется общая потребность в разработке липосомальных композиций с повышенной стабильностью, в частности, в получении стерильных и стабильных липосомальных композиций лекарственных продуктов, которые обладали бы фазовой стабильностью и химической стабильностью и, следовательно, подходили для фармацевтического применения.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В объем изобретения включены стабильные липосомальные композиции и способы их получения, которые обладают фазовой стабильностью. Под стабильным липосомальным препаратом для целей настоящего изобретения понимается таковой, в котором диспергированные липосомы в основном сохраняют их первоначальную природу и остаются в основном равномерно распределенными в непрерывной фазе в течение желаемого периода хранения. Стабильные липосомальные композиции по настоящему изобретению не претерпевают фазовых изменений, оседания и, при их стерилизации автоклавированием, обсеменения микроорганизмами. Стабильные липосомальные композиции по настоящему изобретению проявляют минимальное химическое разложение в результате окисления или гидролиза составляющих компонентов липосом или инкапсулированного лекарственного ингредиента.

Следовательно, один аспект настоящего изобретения относится к стабильной липосомальной композиции для доставки фармацевтического средства, где композиция содержит: а) подходящую водную среду; b) липосомы, образованные из подходящего фосфолипида; с) по меньшей мере, одно фармацевтическое средство, по меньшей мере, частично инкапсулированное в липосомы и выбранное из: i) липофильного амина и фармацевтически приемлемой кислоты, где фармацевтически приемлемая кислота выбрана из органической или неорганической кислоты и ii) фармацевтически приемлемой соли органической кислоты липофильного амина, и, необязательно, фармацевтически приемлемая кислота включает фармацевтически приемлемую органическую кислоту; где количество фармацевтически приемлемой кислоты, присутствующей в композиции, является таким, что рН липосомальной композиции меньше или примерно равно рК_а аминогруппы фармацевтически активного липофильного амина. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции автоклавируют, посредством чего получают стерильные и стабильные липосомальные композиции.

В одном аспекте композиций по настоящему изобретению рН липосомальной композиции примерно равно рК_а аминогруппы липофильного амина, и примерно 50% липофильного амина протонировано в композиции. В еще одном аспекте рН липосомальной композиции меньше, чем рК_а аминогруппы липофильного амина, и большая часть липофильного амина протонирована в композиции, или композиция имеет рН на примерно от 1 до примерно 2 единиц рН ниже значения рК_а аминогруппы липофильного амина. В еще одном аспекте настоящего изобретения рН липосомальной композиции находится в пределах примерно от 4 до значения рК_а аминогруппы липофильного амина. В некоторых вариантах осуществления рН находится в пределах примерно от 4 до примерно 7, или примерно от 4,5 до примерно 6, или альтернативно в пределах 5 и примерно 6.

В еще одном аспекте настоящего изобретения композиции дополнительно содержат холестерин и/или этанол. В одном аспекте настоящего изобретения этанол находится в пределах примерно от 2,5% до примерно 10% от общего объема липосомальной композиции.

В еще одном аспекте настоящего изобретения фосфолипид в липосомальных композициях по настоящему изобретению имеет общий нейтральный заряд при примерно физиологическом значении рН. В одном аспекте настоящего изобретения фосфолипид включает фосфатидилхолин.

В еще одном аспекте настоящего изобретения водная среда композиции включает воду.

В еще одном аспекте настоящего изобретения фармацевтическое средство инкапсулировано в липосомальные частицы и также находится свободным в водной среде в композициях по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления процент инкапсулированного в липосомы фармацевтического средства составляет примерно от 50% до примерно 90% от общего количества фармацевтического средства, присутствующего в липосомальных композициях, или примерно от 60% до примерно 80% от общего количества фармацевтического средства, присутствующего в липосомальных композициях, или примерно от 50% до 75% от общего количества фармацевтического средства, присутствующего в липосомальной композиции.

В еще одном аспекте настоящего изобретения фармацевтически приемлемая кислота липосомальных композиций включает органическую кислоту или неорганическую кислоту.

В еще одном аспекте настоящего изобретения липосомальные частицы липосомальной композиции имеют массовый средний диаметр (d(0,5)) меньше, чем примерно 10 микрон. В некоторых вариантах осуществления массовый средний диаметр составляет меньше, чем примерно 6 микрон или примерно 4 микрона, или примерно 2 микрона.

В еще одном аспекте настоящего изобретения автоклавированные липосомальные композиции являются физически и химически стабильными в течение, по меньшей мере, примерно одного года, или 18 месяцев, или двух лет при температуре выше точки замерзания липосомальных композиций.

В еще одном аспекте настоящего изобретения липофильный амин включает липофильный амин, который имеет значение log Р выше, чем примерно 1,0 при физиологическом значении рН. В некоторых вариантах осуществления липофильный амин имеет значение log Р в пределах примерно от 2 до примерно 5 при физиологическом значении рН.

В одном аспекте настоящего изобретения некоторые варианты осуществления липосомальных композиций являются физически и химически стабильными при автоклавировании, включая автоклавирование в инертной атмосфере, такое как автоклавирование при температуре примерно 121°С в течение минимум примерно 15 мин в инертной атмосфере.

В еще одном аспекте настоящего изобретения соотношение фармацевтического средства к фосфолипиду, присутствующему в композициях, составляет примерно от 1:100 до 1:10 моль/моль. Количество присутствующих фосфолипидов может также составлять примерно 1,5 мМ или выше в композициях по настоящему изобретению.

В композициях по настоящему изобретению процент инкапсулирования лекарственного средства в липосомальной композиции может быть в основном стабильным в течение, по меньшей мере, 20 месяцев. Также композиции по настоящему изобретению могут быть в основном химически стабильными в течение, по меньшей мере, 20 месяцев при автоклавировании, где количество фосфолипида не снижается в результате химического гидролиза или окисления более чем на 10% (масс./масс.) или более чем на 5% в течение, по меньшей мере, 20 месяцев. В некоторых автоклавированных композициях количество фосфолипида не снижается более, чем примерно 3 мг/мл липосомальной композиции в течение, по меньшей мере, 20 месяцев. Также в автоклавированных композициях по настоящему изобретению липофильный амин не подвергается химическому разложению более чем на 5% (масс./масс.) или более чем на 2% в течение, по меньшей мере, 20 месяцев.

В еще одном аспекте настоящего изобретения созданы стерильные и стабильные липосомальные композиции для доставки фармацевтического средства, содержащие: а) подходящую водную среду; b) липосомы, образованные из подходящего фосфолипида; с) по меньшей мере, одно фармацевтическое средство, по меньшей мере, частично инкапсулированное в липосомы и выбранное из: i) липофильного амина и фармацевтически приемлемой кислоты, где фармацевтически приемлемая кислота выбрана из органической или неорганической кислоты, и ii) фармацевтически приемлемой соли органической кислоты липофильного амина, и, необязательно, фармацевтически приемлемая кислота включает фармацевтически приемлемую органическую кислоту; где композицию автоклавируют, в некоторых вариантах осуществления в инертной атмосфере, и где количество фармацевтически приемлемой кислоты, присутствующее в композиции, является таким, что рН липосомальной композиции меньше или примерно равно рК_а аминогруппы фармацевтически активного липофильного амина.

В еще одном аспекте настоящего изобретения создан способ получения стабильных липосомальных композиций по настоящему изобретению для доставки фармацевтического средства, где способ включает стадии: а) получения подходящей водной среды; b) получения подходящего фосфолипида; с) получения, по меньшей мере, одного фармацевтического средства, способного, по меньшей мере, частично инкапсулироваться в липосомы и выбранного из: i) липофильного амина и фармацевтически приемлемой кислоты, где фармацевтически приемлемая кислота выбрана из органической или неорганической кислоты, и ii) фармацевтически приемлемой соли органической кислоты липофильного амина, и, необязательно, фармацевтически приемлемая кислота включает фармацевтически приемлемую органическую кислоту; где количество фармацевтически приемлемой кислоты, присутствующее в композиции, является таким, что рН липосомальной композиции меньше или примерно равно рК_а аминогруппы фармацевтически активного липофильного амина; d) объединения водной среды, фосфолипида и фармацевтического средства с образованием липосомальной композиции и е) необязательно автоклавирования указанной композиции. В важном аспекте настоящего изобретения способ включает стадию автоклавирования.

В еще одном аспекте настоящего изобретения созданы стерильные и стабильные липосомальные композиции по настоящему изобретению, проявляющие одно или более следующих свойств в течение, по меньшей мере, одного года, при автоклавировании и хранении при температуре выше точки замерзания композиции: i) изменение в проценте инкапсулирования не более, чем примерно на 5%; ii) изменение в содержании фосфолипидов не более, чем примерно на 10% по массе; iii) изменение в содержании липофильного амина в результате химического гидролиза и/или окисления не более, чем примерно на 5% по массе; iv) отсутствие образования видимых агрегатов и v) изменение среднего диаметра частиц не более, чем примерно на 10% при оптическом определении. Способы определения данных параметров подробно описаны ниже.

В еще одном аспекте настоящего изобретения включены стабильные липосомальные композиции, где они получены способами, раскрытыми в данном описании.

В еще одном аспекте настоящего изобретения включены стабильные и стерилизованные липосомальные композиции, где они получены способами, раскрытыми в данном описании.

В еще одном аспекте настоящего изобретения включен способ повышения стабильности липосомальных композиций, где указанный способ включает стадии: а) получения подходящей водной среды; b) получения подходящего фосфолипида; с) получения, по меньшей мере, одного фармацевтического средства, способного, по меньшей мере, частично инкапсулироваться в липосомы и выбранного из: i) липофильного амина и фармацевтически приемлемой кислоты, где фармацевтически приемлемая кислота выбрана из органической или неорганической кислоты, и ii) фармацевтически приемлемой соли органической кислоты липофильного амина, и, необязательно, фармацевтически приемлемая кислота включает фармацевтически приемлемую органическую кислоту; где количество фармацевтически приемлемой кислоты, присутствующей в композиции, является таким, что рН липосомальной композиции меньше или примерно равно рК_а аминогруппы фармацевтически активного липофильного амина; d) объединения водной среды, фосфолипида и фармацевтического средства с образованием липосомальной композиции и е) автоклавирования указанной липосомальной композиции в условиях, эффективных для стерилизации указанных композиций, с получением, тем самым, композиций с повышенной стабильностью по сравнению со стабильностью до автоклавирования.

В еще одном аспекте настоящего изобретения создан способ определения липосомальной композиции с фазовой стабильностью, где способ включает стадии: а) получения липосомальной композиции, содержащей фармацевтическое средство, фосфолипид, водный раствор и, необязательно, этанол и стерин; b) оптического определения массового среднего диаметра d(0,5) липосомальной композиции; с) центрифугирования липосомальной композиции при значении центробежного ускорения в пределах примерно от 1000 g до примерно 5000 g при температуре примерно 4°С в течение примерно 2 ч; d) оптического определения массового среднего диаметра d(0,5) любой оставшейся жидкой части раствора липосомальной композиции после стадии центрифугирования с) и е) вычисления соотношения значения массового среднего диаметра d(0,5) раствора после центрифугирования к таковому раствору перед центрифугированием; где липосомальная композиция с фазовой стабильностью определяется как таковая, если композиция имеет соотношение на стадии е), равное примерно 0,6 или выше, в некоторых вариантах осуществления 0,8 или выше. В предпочтительном варианте осуществления композицию автоклавируют перед центрифугированием.

Композиции по настоящему изобретению особенно подходят для легочной доставки фармацевтических продуктов. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция дополнительно содержит, по меньшей мере, один из холестерина и этанола. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции являются стабильными при автоклавировании.

Одно преимущество настоящего изобретения заключается в том, что композиции являются стабильными и не подвергаются слиянию, не разделяются, не агломерируют или желируются при хранении. Следовательно, они сохраняют гомогенные композиции, по меньшей мере, в течение недели и часто намного дольше, в некоторых вариантах осуществления в течение более 12 месяцев, или более 18 месяцев, или даже более 2 лет. Следовательно, увеличивается срок хранения таких композиций. Кроме того, это позволяет равномерно отбирать разовые дозы из большей партии и не требует восстановления композиции перед применением.

Повышенная фазовая стабильность представляет один из признаков композиции, который обеспечивает фармацевтически пригодную композицию. Если композиция обладает фазовой стабильностью в течение длительных периодов времени, то она предоставляет многочисленные преимущества. Липосомальные композиции с фазовой стабильностью по настоящему изобретению делают разливочное наполнение на конечной стадии конечных фармацевтических препаратов более грубым, и конечное разливочное наполнение фармацевтических композиций не осложняется тем, что продукт будет оседать или разделяться перед или во время наполнения. Кроме того, липосомальные композиции с фазовой стабильностью по настоящему изобретению обеспечивают однородность содержимого в различных отдельных ампулах, наполненных из одной партии. Также отдельные отобранные пробы из конечного фармацевтического контейнера, содержащего липосомальные композиции с фазовой стабильностью по настоящему изобретению, будут более однородными от дозы к дозе, посредством чего обеспечивается повышенная безопасность для пациента без необходимости в том, чтобы пациент хорошо встряхивал композицию перед применением. Это может представлять особое преимущество для пожилых пациентов. Если фаза инкапсулированного препарата в липосомальных композициях отделится, то имеется вероятность того, что пациент может получить слишком высокую дозу, если образец взят из более густого слоя или осадка композиции, или того, что пациент может не дополучить дозу, если образец отобран из менее густого слоя, или пациент может получить неэффективную дозу, если образец взят из прозрачного супернатанта. Настоящее изобретение относится к композициям и способам, которые обеспечивают уверенность в воспроизводимости от дозы к дозе.

Для композиций по настоящему изобретению не требуются химические добавки для того, чтобы они были стабильными. Липосомы по изобретению содержат липофильный амин и кислоту, такую как органическая кислота, где кислота находится в такой концентрации, что рН липосомальной композиции примерно равно или меньше значения рК_а аминогруппы липофильного амина, с обеспечением того, что рН конечного раствора не влияет отрицательно на химическую стабильность липосомальных композиций, что, как правило, наблюдают при рН ниже примерно 4. При рН, примерно равном или меньше рК_а, гарантируется, что, по меньшей мере, значительная часть липофильного амина положительно заряжена в липосомальных композициях. В одном аспекте изобретения фармацевтическое средство включает липофильный амин и органическую кислоту в качестве противоиона, например, фентанил цитрат. Это может быть получено в композициях объединением свободного основания фентанила, растворенного в этанольной фазе, с лимонной кислотой в водной фазе, и фазы, вместе с другими компонентами, объединятся вместе с получением фентанил цитрата по настоящему изобретению. Альтернативно, например, соль препарата фентанила, такая как фентанил цитрат, может быть получена из промышленных источников для применения в получении липосомальных композиций. В некоторых случаях затем может быть необходимым добавить некоторые дополнительные количества кислоты, такой как лимонная кислота, в композиции для доведения рН липосомальных композиций с получением рН, примерно равного или ниже рК_а аминогруппы липофильного амина, с обеспечением того, что рН липосомальных растворов не будет ниже примерно рН 4, когда, как правило, имеется химическая стабильность композиций. Возможность стабилизировать липосомы без дополнительной химической добавки является особенно желаемой для композиций, предназначенных для введения пациенту, поскольку это устраняет риск проявления побочных эффектов, возникающих в результате химической добавки.

В частных вариантах осуществления настоящего изобретения, дополнительно, липосомальные композиции являются стабильными при автоклавировании. Возможность автоклавировать липосомальные композиции по изобретению обеспечивает простой способ стерилизации композиций. В отличие от фильтрации, автоклавируемые липосомальные композиции позволят получать более крупные липосомы и, таким образом, более высокое инкапсулирование препарата. Кроме того, возможность автоклавировать липосомальные композиции устраняет необходимость в добавлении консервантов или бактериостатических средств, которые обычно являются нежелательными, особенно для композиций, предназначенных для введения через дыхательную систему.

Согласно дополнительному аспекту изобретения, создан способ применения липосомальных композиций в качестве лекарственного препарата.

По дополнительному аспекту изобретения стабильные липосомальные композиции включаются в упакованные фармацевтические препараты и наборы вместе с устройством для применения при легочной доставке терапевтических средств, которое способно образовывать водные аэрозольные капли стабильных липосомальных композиций.

Другой аспект настоящего изобретения включает стабильную липосомальную композицию, способ ее получения и ее применение, где фосфолипид включает фосфатидилхолин.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Эти и другие признаки изобретения будут более понятны из последующего подробного описания, при обращении к прилагаемым фигурам, где:

на фигуре 1 представлена таблица с обобщением различных липосомальных композиций и результатов визуального анализа фазовой стабильности до и после автоклавирования композиций;

на фигуре 2 приводится сравнение внешнего вида липосомального препарата с фазовой стабильностью по настоящему изобретению (фигура 2а) с внешним видом липосомального препарата, который разделяется после приготовления и хранения (фигура 2b);

на фигуре 3 показана фазовая стабильность липосом с плацебо, не содержащих фармацевтическое средство - липофильный амин, как функцию рН композиции (фигура 3а); и стабилизирующее действие липофильного амина на композиции, как функцию рН (фигура 3b);

на фигуре 4 представлена таблица с обобщением различных липосомальных препаратов, рН, размера частиц (d(0,5)) до и после автоклавирования, и показателя фазовой стабильности до и после автоклавирования;

на фигуре 5 представлен график, показывающий взаимосвязь между рН после автоклавирования с рН до автоклавирования для липосомальных композиций по настоящему изобретению;

на фигуре 6 представлен график зависимости % изменения содержания фосфатидилхолина после автоклавирования для различных липосомальных композиций по сравнению с содержанием фосфатидилхолина до автоклавирования, как функцию рН;

на фигуре 7 представлен график зависимости изменения распределения частиц по размеру после автоклавирования различных липосомальных композиций по сравнению с распределением частиц по размеру композиций до автоклавирования, как функцию рН;

на фигурах 8а-8с представлены фотографии, соответственно, нестабильной липосомальной композиции, липосомальной композиции, обладающей промежуточной стабильностью, и стабильной липосомальной композиции по настоящему изобретению;

на фигуре 9 представлена фотография липосомальной композиции, обладающей промежуточной стабильностью;

на фигуре 10 представлен график зависимости показателя фазовой стабильности композиций на основе фентанила из фигуры 4, как функцию рН до автоклавирования;

на фигуре 11 представлен график зависимости показателя фазовой стабильности композиций, содержащих фентанил из фигуры 10, как функцию рН после автоклавирования;

на фигуре 12 представлен график зависимости показателя фазовой стабильности липосомальных композиций, содержащих ондансетрон, из фигуры 4, как функцию рН до автоклавирования;

на фигуре 13 представлен график зависимости показателя фазовой стабильности липосомальных композиций, содержащих ондансетрон, из фигуры 12, как функция рН после автоклавирования;

на фигуре 14 представлен график зависимости показателя фазовой стабильности липосомальных композиций, содержащих ондансетрон, из фигуры 4, как функция рН перед автоклавированием, и исключая композиции, содержащие пальмитиновую кислоту в качестве органической кислоты, и композиции с 2,4 ммоль онданстерона;

на фигуре 15 представлен график зависимости показателя фазовой стабильности липосомальных композиций, содержащих онданстерон, из фигуры 14, как функция рН после автоклавирования, и исключая композиции, содержащие пальмитиновую кислоту в качестве органической кислоты, и композиции с 2,4 ммоль онданстерона;

на фигуре 16 представлен график зависимости показателя фазовой стабильности липосомальных композиций, содержащих суматриптан, из фигуры 4, как функция рН до автоклавирования;

на фигуре 17 представлен график зависимости показателя фазовой стабильности липосомальных композиций, содержащих суматриптан, из фигуры 16, как функция рН после автоклавирования;

на фигуре 18 представлен график зависимости показателя фазовой стабильности липосомальных композиций, содержащих прохлорперазин, из фигуры 4, как функция рН до автоклавирования;

на фигуре 19 представлен график зависимости показателя фазовой стабильности липосомальных композиций, содержащих прохлорперазин, из фигуры 18, как функция рН после автоклавирования.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

В последующем описании многочисленные конкретные детали представлены для полного понимания изобретения. Однако, очевидно, понятно, что изобретение можно использовать на практике без данных конкретных деталей.

Способы по настоящему изобретению заявлены и описаны здесь в виде ряда стадий. Очевидно, понятно, что данные способы и связанные стадии можно осуществлять в любом логическом порядке. Более того, способы можно осуществлять самостоятельно или в сочетании с другими методиками и обработками до, во время или после проведения таких способов и стадий, описанных здесь, не отступая от объема и сущности изобретения.

КОМПОНЕНТЫ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ КОМПОЗИЦИЙ

Настоящее изобретение включает липосомальные композиции, которые содержат фармацевтическое средство, включенное в липосомы, и которые обладают фазовой стабильностью в течение продолжительного периода времени. Липосомальные композиции по настоящему изобретению содержат липофильный амин и кислоту, такую как органическая кислота, где кислота присутствует в такой концентрации, что рН липосомальной композиции примерно равно или меньше значения рК_а аминогруппы липофильного амина, с обеспечением того, что рН конечного раствора не влияет отрицательно на химическую стабильность липосомальных композиций; как правило, наблюдают при рН ниже примерно 4. При рН, примерно равном или меньше рК_а, гарантируется, что, по меньшей мере, значительная часть липофильного амина положительно заряжена в липосомальных композициях. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическое средство может быть уже солью липофильного амина и приемлемой кислоты, предпочтительно, органической кислоты. Композиции по изобретению обладают фазовой стабильностью при хранении, по меньшей мере, в течение одной недели и, в большинстве случаев, намного дольше, предпочтительно, в течение одного года или более.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство включает липофильный амин и органическую кислоту в качестве противоиона, например, фентанил цитрат. Это может быть получено в композициях объединением свободного основания фентанила, растворенного в этанольной фазе, с лимонной кислотой в водной фазе, и фазы, вместе с другими компонентами, объединяются вместе с получением фентанил цитрата по настоящему изобретению. Альтернативно, например, соль препарата фентанила, такая как фентанил цитрат, может быть получена из промышленных источников для применения в получении липосомальных композиций. В некоторых случаях затем может быть необходимым добавить дополнительные количества кислоты, такой как лимонная кислота, в композиции для доведения рН липосомальных композиций с получением рН, примерно равного или ниже рК_а аминогруппы липофильного амина, с обеспечением того, что рН липосомальных растворов не будет ниже примерно рН 4, когда, как правило, имеется химическая стабильность композиций.

Липосомальные композиции по настоящему изобретению включают липосомы, образованные замкнутыми бислоями фосфолипидов. Подходящие фосфолипиды для образования липосом, предназначенных для доставки фармацевтических средств, известны специалистам в данной области и включают, но не ограничиваются этим, фосфатидную кислоту (РА) и фосфатидилглицерин (PG), фосфатидилхолин (РС), фосфатидилэтаноламин (РЕ), фосфатидилинозит (PI), фосфатидилсерин (PS), плазмалогены и сфингомиелин (SM). Липиды, используемые для получения липосомальных композиций по настоящему изобретению, могут быть заряженными или нейтральными. В одном варианте осуществления липосомы, образованные из фосфатидилхолина, являются предпочтительными, поскольку в основном они более безопасны при введении пациенту, и фармацевтические средства часто включаются лучше в нейтральные фосфолипиды. В другом варианте осуществления желаемыми являются положительно заряженные липосомы.

Как правило, стерины, такие как холестерин, добавляют в липосомальные композиции для повышения стабильности липосом и способствования включению липосом в живую среду. Термин «холестерин» предназначен для включения производных холестерина, таких как: (3-гидрокси-5,6-холестен) и близких аналогов, таких как 3-амино-5,6-холестен и 5,6-холестен; холестана, холестанола и близких аналогов, таких как 3-гидроксихолестан; и заряженных производных холестерина, таких как холестерил-бета-аланин и холестерилгемисукцинат. В некоторых вариантах осуществления холестерин находится в количестве примерно от 0% до примерно 30% от массы присутствующих фосфолипидов. В других вариантах осуществления холестерин составляет примерно до 10% от массы фосфолипидов.

Фармацевтические средства по настоящему изобретению включают средства, которые можно вводить пациенту с терапевтической целью. Средства по изобретению выбраны из группы, состоящей из фармацевтически активных липофильных аминов и их соответствующих солей. Липофильные амины по настоящему изобретению относятся к молекулам, которые состоят из растворимой в органическом растворителе (липофильной группы), а также аминогруппы, которая имеет положительный заряд при физиологическом значении рН. Подходящие липофильные амины по настоящему изобретению имеют положительно заряженную аминогруппу в пределах рН примерно от 3 до примерно 8.

Подходящие фармацевтические средства включают, но не ограничиваются этим, следующие:

Таблица
Ацебутолол	Дигидрокодеин	Изопротеренол	Нальмефен	Пропафенон
Албутерол	Дигидроэрготамин	Изокссуприн	Налоксон	Пропоксифен
Алфентанил	Дилтиазем	Кетамин	Нальтрексон	Пропранолол
Алосетрон	Дифеноксин	Лабеталол	Наратриптан	Протрипти-лин
Амитриптилин	Дизопирамид	Льюпролид	Нефазадон	Псевдоэфед-рин
Анилеридин	Добутамин	Левамизол	Нифедипин	Квитиапин
Атенолол	Доласетрон	Лидокаин	Норэпинефрин	Квинидин
Атропин	Донепезил	Лизиноприл	Нортриптилин	Квинин
Азатадин	Дофамин	Лоразепам	Ондансетрон	Ралоксифен
Баклофен	Доксапрам	Ловарфанол	Орфенадрин	Резерпин
Бензтропин	Доксепин	Мафенид	Окспренолол	Римантадин
Бексотолол	Доксиламин	Мапротилин	Оксибутинин	Ритодрин
Бипериден	Дроперидол	Мазиндол	Оксикодон	Ропивакаин
Бримонидин	Эналаприл	Меклизин	Оксиморфон	Скополамин
Бромокриптин	Эфедрин	Милфалан	Окситетрациклин	Селегилин
Букивакаин	Эпинефрин	Меперидин	Палоносетрон	Соталол
Бупренорфин	Эрголоид	Мепивакаин	Пенбутолол	Суфентанил
Бутенафин	Эрготамин	Мизоридазин	Пентазокрин	Суматриптан
Буторфанол	Эстазолам	Метапротеренол	Перголид	Такрин
Кофеин	Фенолдапам	Метараминол	Перфеназин	Тамоксифен
Картеолол	Фентанил	Метациклин	Феназопиридин	Тербуталин
Цефепин	Фексофенодин	Метадон	Фендиметразин	Тетрациклин
Цефалексин	Флекаинид	Метотримепразин	Фенелзин	Тиэтилперазин
Хлорпрокаин	Флуоксетин	Метиламфетамин	Феноксибензамин	Тиоидазин
Хлорфенирамин	Флуфеназин	Метилклотиазид	Фентермин	Тиотиксен
Хлорквинин	Флуразепам	Метилдофа	Фентоламин	Токаинид
Ципрофлоксацин	Формотерол	Метилэргоновин	Фенилэфрин	Толазолин
Циталопрам	Глипизид	Метилфенидат	Пимозид	Трандолаприл
Кломифен	Галоперидол	Метилсергид	Пинолол	Тразодон
Клонидин	Гидралазин	Метоклопрамид	Пироксикам	Трифлуоперазин
Кодеин	Гидрокодон	Метолазон	Празосин	Трифлупромазин
Циклобензаприн	Гидроморфон	Метопролол	Примаквин	Тригексифенидил
Демеклоциклин	Гидроксихлорквин	Мексилетин	Прокаинамид	Тримепразин
Дезипрамин	Гидроксизин	Мидазолам	Прокарбазин	Триметобензамид
Десмопрессин	Гиосциамин	Миноциклин	Прохлорперазин	Верапамил
Декстроамфетамин	Имипрамин	Морицизин	Проциклидин	Золмитриптан
Диазепам	Индапамид	Морфин	Промазин
Диэтилпропион	Изоэтарин	Моксифлоксацин	Прометазин

Подходящие липофильные амины по настоящему изобретению включают липофильные амины, которые имеют значение log P выше, чем примерно 1,0 (т.е. коэффициент распределения в системе октанол/вода выше, чем примерно 10), более предпочтительно, в пределах примерно от 2 до примерно 5 при физиологическом значении рН. Липофильные амины вариантов осуществления настоящего изобретения включают фентанил, о котором сообщают, что он имеет значение log P, равное 4,25, ондансетрон, который имеет значение log P, равное 2,37, суматриптан, который имеет значение log P, равное 1,05, и прохлорперазин, который имеет значение log P, равное 3,82.

Кислота для применения в настоящем изобретении является любой фармацевтически приемлемой кислотой. Подходящие кислоты включают органические и неорганические кислоты и включают такие кислоты, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства лекарственного препарата, и которые не являются с биологической или другой точки зрения нежелаемыми. Примеры включают, но не ограничиваются этим, уксусную кислоту, аскорбиновую кислоту, аспарагиновую кислоту, бензойную кислоту, масляную кислоту, угольную кислоту, капроновую кислоту, лимонную кислоту, циннамовую кислоту, декановую кислоту, энантовую кислоту, фумаровую кислоту, фуранкарбоновую кислоту, глюконовую кислоту, глюкуроновую кислоту, глутаминовую кислоту, глицериновую кислоту, гиппуровую кислоту, соляную кислоту, молочную кислоту, лактобионовую кислоту, миндальную кислоту, яблочную кислоту, малеиновую кислоту, метансульфоновую кислоту, миристиновую кислоту, олеиновую кислоту, щавелевую кислоту, пальмитиновую кислоту, пивалиновую кислоту, пиколиновую кислоту, фосфорную кислоту, пропионовую кислоту, янтарную кислоту, салициловую кислоту, стеариновую кислоту, серную кислоту, винную кислоту, ундециловую кислоту и валериановую кислоту.

Липосомальные композиции, используемые для доставки фармацевтического средства, предпочтительно имеют значение рН, которое будет хорошо переноситься пациентом. Например, в отношении ингаляционных композиций, сообщалось, что рН легочной ткани составляет примерно от 6,8 до 6,9. рН липосомальных композиций по настоящему изобретению, как правило, имеет значение в пределах примерно от рН 4 до примерно рН 8. В одном варианте осуществления, например, в таком варианте осуществления, в котором композиции автоклавируют, значение рН липосомальных композиций по настоящему изобретению находится в пределах примерно от рН 4 до примерно рН 7. В другом варианте осуществления, например, в котором композиции автоклавируют, рН липосомальных композиций по настоящему изобретению имеет значение в пределах примерно от рН 5 до примерно рН 6. Несмотря на то, что липосомальные композиции по настоящему изобретению могут обладать фазовой стабильностью при значениях рН ниже примерно 4, такие композиции, как правило, не являются химически стабильными, и окисление и/или гидролиз фосфолипида, среди прочих других реакций, могут иметь место при более низких значениях рН в течение времени.

В настоящем изобретении рН композиции меньше или примерно равно рК_а аминогруппы активного ингредиента липофильного амина. В одном варианте осуществления рН раствора на примерно от 1 до примерно 2 рН единиц ниже значения рК_а аминогруппы липофильного амина. При наличии значения рН, которое ниже рК_а, обеспечивается то, что большая часть аминогруппы липофильного амина положительно заряжена.

Как правило, этанол составляет часть липосомальных композиций, особенно, когда этанол используют для приготовления липосом обычными методами. Возможны альтернативные варианты, но они ограничиваются таковыми, которые не обладают нежелательными токсическими свойствами, или о которых известно, что они не проявляют раздражающего действия при ингаляции. Подходящими альтернативами являются гликоли и глицерины, которые удовлетворяют данному требованию. Содержание этанола, который может находиться в липосомальных композициях по настоящему изобретению, может представлять любое, которое обеспечивает стабильные липосомальные композиции по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления концентрация этанола находится в пределах примерно от 2,5%

до 10% от общего объема липосомальных композиций. Композиции с содержанием этанола более 10% от объема также находятся в контексте настоящего изобретения, хотя, при концентрациях, приближающихся или превышающих 15% от общего объема, например, 20%, качество образовавшихся липосомальных частиц начинает ухудшаться.

Водная среда по настоящему изобретению может представлять собой любой физиологически приемлемый водный раствор, такой как буферы или вода, который не мешает образованию получаемых липосомальных композиций. В одном варианте осуществления буфер включает буфер с низкой ионной силой. Было показано в отношении буферов, что следует использовать буфер с достаточно низкой ионной силой, чтобы не повлиять на эффективность образованных липосом инкапсулировать фармацевтическое средство. В предпочтительном варианте осуществления водный раствор представляет воду.

В некоторых случаях в липосомальные композиции по настоящему изобретению добавляют дополнительные наполнители, такие как антиоксиданты, в некоторых вариантах осуществления в концентрации примерно 1 или 2% от фосфолипидов (масса/массе), как правило, на уровне 0,01-0,1% от общего объема композиции. Дополнительные компоненты, которые можно добавлять в композиции по настоящему изобретению, включают только таковые, которые не оказывают влияния на липосомальные композиции с фазовой стабильностью и, тем самым, не нарушают прочность композиций. В предпочтительном варианте осуществления композиции состоят в основном из фармацевтического средства, включающего кислоту, фосфолипид, водный раствор и, необязательно, этанол и стерин.

ПОЛУЧЕНИЕ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ КОМПОЗИЦИЙ

Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что липосомальные суспензии по изобретению можно получить обычными способами получения и разделения по размеру липосом. Таковые включают гидратацию липидных пленок, впрыскивание растворителя и обратнофазовое выпаривание.

Липосомальные композиции в последующих конкретных примерах были получены смешиванием этанольной фазы с водной фазой. Этанольная фаза содержала этанол, фармацевтическое средство, фосфатидилхолин и холестерин. Фармацевтическое средство было выбрано из группы лекарственных препаратов, состоящей из липофильных аминов. Водная фаза состояла из воды для инъекций и отрицательного противоиона для амина, представляющего кислоту. В случаях, когда фармацевтическое средство представляет соль липофильного амина и кислоты, то водная фаза включала воду для инъекций. В некоторых вариантах осуществления кислота включает гидрофобную кислоту, и ее можно добавлять к этанольной фазе, которую затем смешивают с водной фазой. Это может быть пригодным при получении липосомальных композиций липофильных аминов с желаемой кислотой, где амин не доступен в виде его соли.

Водная фаза может содержать дополнительное количество кислоты, которая не оказывает влияния на фазовую стабильность. Обе фазы перед смешиванием нагревают до температуры в пределах примерно от 56 до 60°С. Для получений в небольшом масштабе, объемом менее 1 литра в объеме, две фазы смешивают и помещают в обычный шуттель-аппарат при 75-80 об/мин. Образуются липосомальные везикулы, и смесь встряхивают еще в течение 10 мин при 50-60°С. Затем смесь удаляют из шуттель-аппарата и дают охладиться до комнатной температуры примерно в течение 2 ч. Для получения липосомальных композиций в больших масштабах этанольную фазу вносят в перешиваемую водную фазу в реакторе, снабженном устройствами для регуляции температуры. Смесь перемешивают в течение 10 мин при температуре примерно 56-60°С и затем охлаждают до комнатной температуры в течение 2 ч. Стабильные композиции характеризуются тем, что они остаются гомогенными, и фазы не разделяются при хранении в течение одной недели. В основном было установлено, что реагенты можно смешивать вместе или вносить вместе в любом порядке при условии, что они образуют липосомальные композиции.

В некоторых вариантах осуществления было установлено, что скорость добавления этанольной фазы в водную фазу оказывает влияние на распределение частиц по размеру образовавшихся липосом, особенно, когда готовят большие по объему партии липосом, где не является практичным вносить водную фазу в этанольную фазу. Было установлено в некоторых вариантах осуществления, что размер частиц липосом уменьшается по мере снижения скорости добавления этанола к воде. Очевидно, понятно, что липосомальные композиции по настоящему изобретению включают таковые с различным распределением частиц по размеру.

Были получены различные композиции с использованием различных липофильных аминов, кислот или их солей, как представлено на фигурах 1 и 4, для иллюстрации настоящего изобретения.

С использованием данного способа были получены партии различного размера, включая партии с общим объемом липосомальной композиции таким небольшим, как 30 мл, а также более крупные партии объемом 1, 2,5, 5 и 15 л, как описано в примере 4 ниже. Было установлено, что липосомальные композиции, полученные в небольших и больших объемах, являются, соответственно, стабильными в течение времени. Результаты исследований липосомальных композиций, партий объемом от 1 до 15 л, показали, что они имеют сравнимую химическую и физическую стабильность, массовый средний диаметр липосомальных частиц и сравнимый процент инкапсулирования активного ингредиента.

Фармацевтическую композицию по данному изобретению можно вводить многими путями, включая ингаляционный путь через дыхательную систему, местно, парентерально и тому подобное. Композиции могут включать глазные лекарственные формы и инъекционные лекарственные формы и могут включать медицинские диагностические продукты.

Термин «парентеральный», в том смысле, в котором он здесь используется и понимается специалистами в данной области (например, смотри Stedman's Medical Dictionary, 25^th edition, 1990 (Williams & Wilkins)), предназначен для включения любого другого пути, чем через желудочно-кишечный тракт, в частности, при обращении к введению веществ в организм с помощью внутривенной, подкожной, внутримышечной или интрамедуллярной инъекций. Фармацевтическая композиция может находиться в форме стерильного инъекционного препарата, например, в виде стерильной инъекционной водной или масляной суспензии, или продукта для ингаляций для введения посредством распыления. С учетом того, что композиции обладают фазовой стабильностью, их можно вводить ориентационно независимо конечным пользователем с использованием различных устройств, таких как распылители с подачей сверху или подачей снизу.

СТАБИЛЬНОСТЬ ЛИПОСОМ - ФИЗИЧЕСКАЯ И ХИМИЧЕСКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ

Для целей настоящего изобретения «стабильные липосомальные композиции» представляют таковые, в которых диспергированные липосомы в основном сохраняют их первоначальную природу и остаются в основном равномерно распределенными в непрерывной фазе, и показывают минимальное химическое разложение в течение желаемого периода хранения.

Термин «физическая стабильность» липосомальных композиций, в том смысле, в котором он здесь используется, относится к отсутствию значительных изменений в свойствах липосом, таких как размер липосом (выраженный в виде массового среднего диаметра d(0,5)), соотношение инкапсулированного к свободному препарату в композиции, оседание, агрегация или рассеяние света композиций в течение периода хранения.

В том смысле, в котором он здесь используется, термин «распределение частиц по размеру» или «PSD» относится к распределению частиц по размеру в липосомальной дисперсии по данным методов определения динамического рассеяния света, которые хорошо известны специалистам в данной области, таких как с использованием прибора для определения размера Malvern Mastersizer^™ 2000. Удобным способом выражения распределения частиц по размеру липосомальных композиций является определение значения d(0,5), которое относится к массовому среднему диаметру частиц и представляет средний размер липосом при том, что 50% пробы находится в виде более мелких липосом и 50% пробы - в виде более крупных липосом. Предпочтительные пределы размера частиц липосом по настоящему изобретению составляют менее, чем примерно 10 микрон, предпочтительно менее, чем примерно 6 микрон, или менее, чем примерно 4 микрона, или менее, чем примерно 2 микрона. Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что желаемые пределы размера частиц могут варьировать в зависимости от применения. Например, значение d(0,5) в пределах 1-3 микрон может привести к максимальному увеличению процента липосом с размером липосом для ингаляционного введения.

«Процент инкапсулирования» или степень инкапсулирования, или %Е для различных композиций относится к проценту липофильного амина, инкапсулированного в липосомы, по отношению к общему количеству липофильного амина в композициях. Процент инкапсулирования липофильного амина в липосомах по настоящему изобретению выражен в виде процента фармацевтического средства, включенного в липосомы. Предпочтительные пределы инкапсулирования составляют примерно от 50% до примерно 90%, более предпочтительно, примерно от 60% до примерно 80%, более предпочтительно, примерно от 50% до примерно 75%. Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что различные проценты инкапсулирования могут быть преимущественными для различных применений в зависимости от, помимо прочего, времени исходного начала и общего периода действия лекарственного продукта, которые являются желательными.

Получали липосомы с плацебо вышеуказанным способом, которые не содержали фармацевтического средства. Следовательно, данные липосомы с плацебо содержали только фосфолипид, холестерин, этанол, воду и в некоторых случаях соль. Было установлено, что данные липосомы не были стабильными и подвергались фазовому разделению в течение периода времени от часов до суток с момента приготовления.

Липосомы, полученные вышеуказанным способом, но содержащие свободное основание препарата липофильного амина в качестве фармацевтического средства, также не были стабильными при хранении. Фармацевтически приемлемую кислоту не добавляли в композиции. Отмечали разделение фаз в течение суток после получения.

Было установлено, что липосомы, содержащие протонированную форму свободного основания основного иона липофильного амина и соответствующий противоион кислоты, обеспечивают стабильные липосомальные препараты. В частности, в некоторых вариантах осуществления было установлено, что молярные соотношения кислоты:амина в пределах примерно от 10:1 до 1:10 (моль/моль) являются эффективными для повышения стабильности липосом. Более узкие пределы соотношения кислоты:амина порядка 3:1 до 1:3 были также эффективными. Кроме того, было установлено, что данные липосомы являются стабильными при автоклавировании. Липосомы, приготовленные с фармацевтическим средством, которое представляет соль липофильного амина и органической кислоты, также проявляли стабильность при хранении и стабильность при автоклавировании.

Диализ инкапсулированных в липосомы лекарственных продуктов в условиях, которые приводят к истощению препарата-кандидата, приводит к фазовому разделению липосомальных композиций. В таблице 1 различные липосомальные композиции диализовали в течение указанных периодов времени. Стабильные липосомальные композиции по настоящему изобретению, с водой в качестве водного растворителя, показывали в основном такой же процент инкапсулирования после диализа, как до того.

Таблица 1
Липосомальная композиция	Среда для диализа	%Е до диализа	%Е через 24 часа диализа	Внешний вид после диализа
Фентанил с цитратом	Вода для инъекций	60%	60%	гомогенная
Фентанил с цитратом	Фосфатный буфер	60%	< 14%	осадок
Ондансетрон с НСl	Вода для инъекций	60%	60%	гомогенная
Ондансетрон с НСl	Фосфатный буфер	60%	11%	осадок

С удивлением было установлено, что автоклавирование инкапсулированных в липосомы лекарственных продуктов по настоящему изобретению приводит к соответственно стабильным и стерильным инкапсулированным в липосомы лекарственным продуктам. Еще с большим удивлением в некоторых случаях наблюдали, что стабильные инкапсулированные в липосомы лекарственные продукты показывают повышение стабильности по сравнению со стабильным продуктом до автоклавирования. В таком случае, в другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается способ повышения стабильности липосомальных композиций, в котором липосомальные композиции по настоящему изобретению автоклавируют в инертной атмосфере. Даже если не требуется, чтобы такие композиции были стерильными для их применений, например, композиции для местного применения, стадию автоклавирования можно использовать в способе для повышения стабильности липосом.

Условия автоклавирования, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают таковые, которые позволяют стерилизовать лекарственный продукт, инкапсулированный в липосомы, и которые не приводят к существенному снижению химической стабильности композиций в течение времени. В одном варианте осуществления инкапсулированные в липосомы лекарственные продукты автоклавируют при температуре примерно 121°С в течение примерно 15 мин в инертной атмосфере, такой как азот или аргон. В одном варианте осуществления инертная атмосфера представляет таковую, которая обычно содержит менее, чем примерно 1,5% кислорода. Также можно использовать более высокие значения температуры с более короткими периодами времени. Если композиция может выдержать цикл нагревание/охлаждение, то конечная стерилизация представляет грубый, быстрый и дешевый способ получения стерильных фармацевтических препаратов.

Были получены многочисленные композиции с использованием различных липофильных аминов, органических кислот или их солей, представленных на фигурах 1 и 4, и тестировали их стабильность для дополнительной иллюстрации стабильных композиций и способов получения стабильных композиций по настоящему изобретению.

Признаком настоящего изобретения является то, что композиции инкапсулированного в липосомы лекарственного продукта представляют однородные дисперсии. В некоторых композициях однородные дисперсии являются полупрозрачными и не требуют встряхивания перед введением, поскольку они диспергированы гомогенно, несмотря на тенденцию включать такую стадию для мутных лекарственных форм для конечного пользователя. Наблюдали, что стабильные композиции являются физически и химически стабильными в течение продолжительных периодов времени и не проявляют образования видимых агрегатов, в некоторых вариантах осуществления даже через 24 месяца. У нестабильных инкапсулированных в липосомы лекарственных продуктов наблюдается оседание, разделение и агрегация в течение времени.

В настоящем изобретении стабильная липосомальная композиция представляет таковую, которая обладает фазовой стабильностью и, в значительной мере, не образует агрегаты, предпочтительно таковые, которые не образуют агрегаты примерно в течение, по меньшей мере, одного года, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 18 месяцев, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 24 месяцев, хотя периоды времени могут быть более длительными или более короткими, как это требуется, в зависимости, помимо прочего, от активного ингредиента, который доставляется, и способа доставки.

Фазовую стабильность липосомальных композиций также можно предварительно определить согласно протоколу, описанному здесь в примере 3, в котором определяют значение d(0,5) липосомальных частиц и потемнение в супернатанте липосомальных композиций при центрифугировании. Дополнительные детали представлены в примерах ниже.

Кроме того, стабильные инкапсулированные в липосомы лекарственные продукты по настоящему изобретению характеризуются в основном постоянным размером частиц в течение времени при хранении, включая такие стабильные инкапсулированные в липосомы лекарственные продукты, которые стерилизуют путем автоклавирования, как здесь описано. Например, в примере 4 ниже показано, что распределение частиц по размеру различных липосомальных композиций по настоящему изобретению остается в основном без изменения в течение периода времени до 20 месяцев хранения, что свидетельствует о том, что композиции по настоящему изобретению в основном стабильны по размеру частиц в течение времени хранения. Дополнительные детали представлены в примерах ниже.

Кроме того, стабильные инкапсулированные в липосомы лекарственные продукты по настоящему изобретению характеризуются в основном стабильным процентом инкапсулирования активного ингредиента в течение времени при хранении, включая такие стабильные инкапсулированные в липосомы лекарственные продукты, которые стерилизуют путем автоклавирования, как здесь описано. Несмотря на то, что было показано, что автоклавирование некоторых композиций по настоящему изобретению оказывает влияние на процент инкапсулирования активного ингредиента по сравнению с процентом инкапсулирования активного ингредиента до автоклавирования, очевидно, понятно, что различие в проценте инкапсулирования в течение времени, как здесь уже обсуждалось, относится к изменению в проценте инкапсулирования в течение времени в композиции, которую не автоклавируют, или во время периода хранения после автоклавирования. Следует также понимать, что желаемый процент инкапсулирования свободного препарата к инкапсулированному препарату в настоящих композициях для применения может варьировать в зависимости от природы активного ингредиента, желаемой дозировки и относительного вклада инкапсулированного и свободного препарата в желаемый терапевтический эффект.

Для доказательства физической стабильности липосом в примере 4 ниже показана стабильность процента инкапсулирования активного ингредиента в различных липосомальных композициях по настоящему изобретению в течение периода времени до 20 месяцев в инертной атмосфере. Дополнительные детали представлены в примерах ниже.

Кроме того, стабильные липосомальные композиции по настоящему изобретению характеризуются как в основном химически стабильные в течение времени. Термин «химическая стабильность», в том смысле, в котором он здесь используется, относится к отсутствию значительных изменений химической структуры липофильного амина, кислоты, фосфолипида, холестерина или других компонентов конечной композиции. Для активного ингредиента, в частности, липофильного амина, химическая стабильность определяется как разложение или изменение эффективности активного ингредиента менее, чем примерно на 5%, предпочтительно, разложение менее, чем примерно на 2% в течение периода хранения. Для носителя фосфолипидов химическая стабильность определяется как наличие потери в содержании фосфолипидов менее, чем примерно на 10% в результате разложения липосомы в результате гидролиза или окисления.

В одном варианте осуществления было установлено, что липосомальные композиции по настоящему изобретению являются в основном стабильными при 4°С, рН 4, по меньшей мере, в течение одного года при некотором присутствии кислорода. В другом варианте осуществления, как описано в примере 4 ниже, было установлено, что химическая стабильность фосфатидилхолина в липосомальных композициях по настоящему изобретению в основном не изменяется в течение периода времени до 20 месяцев. Дополнительные детали представлены в примерах ниже.

Значение рН липосомальных композиций по настоящему изобретению, при котором они, как правило, обладают как фазовой, так и химической стабильностью, представляет значение рН в пределах примерно от рН 4 до примерно рН 8. В одном варианте осуществления липосомы по настоящему изобретению обладают химической и фазовой стабильностью при значении рН в пределах примерно от рН 4 до примерно рН 7. В другом варианте осуществления липосомальная композиция по настоящему изобретению обладает химической и фазовой стабильностью при значении рН в пределах примерно от 4,5 до примерно 6,5 или примерно от рН 5 до примерно рН 6. Несмотря на то, что липосомальные композиции по настоящему изобретению могут обладать фазовой стабильностью при значениях рН ниже примерно 4, такие композиции, как правило, не являются химически стабильными, и окисление и/или гидролиз фосфолипида, среди прочих реакций, могут в значительной мере иметь место при таких более низких значениях рН в течение времени.

Липосомальные композиции по настоящему изобретению содержат липофильный амин, имеющий заряженную аминогруппу, в качестве активного ингредиента, что придает стабильность липосомальным композициям. Было установлено, что липосомы, полученные при отсутствии заряженного липофильного амина, не являются стабильными и быстро оседают. Фосфолипиды, обычно используемые при получении липосом, включают фосфатидилхолин. Не желая связываться с какой-либо теорией, последующее представляет описание взаимодействий и сил, которые могут вносить свой вклад в стабилизацию или дестабилизацию липосомальных композиций. При физиологических значениях рН фосфатидилхолин ведет себя как нейтральная молекула с общим нулевым зарядом. При физиологических значениях рН отрицательный заряд фосфатидильной группы компенсируется зарядом азота четвертичного аммония в холине. В липосоме молекулы фосфатидилхолина в основном располагаются рядом друг к другу так, что положительно заряженный холин одной молекулы взаимодействует электростатически с фосфатидильной группой смежной липидной молекулы. Общий заряд такого липосомального препарата равен 0 (по данным определения дзэта-потенциалов). Включение незаряженных лекарственных препаратов в липосому не приводит к изменению общего заряда липосом. Стабилизация липосом препаратами липофильными аминами достигается при выборе рН липосомальной композиции таким образом, что рН примерно равно или меньше рК_а липофильного амина, придавая липофильному амину все в большей и большей степени положительный заряд. Таким образом, положительно заряженный липофильный амин может встраиваться в фосфолипидные бислои структуры липосомы таким образом, что положительный заряд амина располагается более тесно с отрицательно заряженной фосфатидильной группой, и может нарушиться баланс заряда на поверхности липосомы с образованием в целом положительно заряженной липосомы при физиологическом значении рН. Полагается, что при значении рН меньше рК_а липофильного амина можно повысить роль лекарственного препарата в качестве стабилизатора в липосомальных композициях per se с получением заряженной липосомы на поверхности. Таким образом, заряженные липосомы могут отталкивать друг друга с получением устойчивости к агрегации. Также это может быть объяснением невозможности получить стабильные липосомальные композиции с плацебо, которые не содержат липофильный амин и его соли, и фармацевтически приемлемую кислоту. Кроме того, это может служить объяснением невозможности получения стабильных липосомальных композиций с липофильными аминами, которые представлены в основном в виде незаряженных, нейтральных молекул.

Таким образом, в настоящем изобретении рН липосомальных композиций по настоящему изобретению примерно равно или меньше, чем значение рК_а аминогруппы активного ингредиента липофильного амина.

Очевидно, понятно, что различные пределы, обсужденные выше и использованные в контексте настоящего изобретения, в отношении стабильности следует рассматривать, как приблизительные и служащие в качестве указания, и их следует рассматривать специалистами в данной области для включения их любых вариантов при условии, что полученные композиции являются стабильными, как здесь определено.

Преимущества настоящего изобретения дополнительно иллюстрируются последующими примерами. Примеры и их конкретные детали, представленные здесь, приводятся только для иллюстрации, и их не следует рассматривать в качестве ограничения формулы настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - получение липосом

Каждую опытную партию липосомального препарата получали с 1,2 г очищенного соевого лецитина, 0,12 г холестерина, растворяли в 3 г этанола и нагревали до 56°С. В некоторых получениях добавляли этанольную фазу, также содержащую липофильный амин или соль липофильного амина (фигура 1), в количестве, которое обеспечивало нужную концентрацию в конечной композиции. После растворения всех составляющих компонентов в этанольной фазе этанольный раствор смешивали с 27 г водного раствора, подогретого до 56°С. Водная фаза, необязательно, содержала различные кислоты или соли, как показано на фигуре 1. После смешивания двух жидких фаз смесь встряхивали при 56°С в течение 10 мин на орбитальном шуттель-аппарате и затем постепенно охлаждали до комнатной температуры. Наличие мультиламеллярных липосом подтверждали микроскопией. Выбранные липосомальные препараты автоклавировали при 121°С в течение 15 мин.

Пример 2 - фазовая стабильность при хранении

Фазовая стабильность липосомальных препаратов по настоящему изобретению обеспечивает фармацевтически пригодные липосомы. Фазовую стабильность препаратов, как уже указывалось в примере 1, определяли визуально по образованию осадка или агрегатов. Липосомальные композиции, которые не обладали достаточной фазовой стабильностью, как правило, очень быстро оседали, часто в течение ночи, в то время как у других не наблюдали признаков осаждения даже после нескольких лет хранения. Пример внешнего вида липосом с фазовой стабильностью при визуальном исследовании представлен на фигуре 2а, в то время как пример внешнего вида липосом с отсутствием фазовой стабильности при визуальном исследовании на фигуре 2b показывает оседание и разделение фаз.

Обращаясь к фигуре 1, липосомальные композиции с плацебо, не содержащие фармацевтического средства, в основном не обладают фазовой стабильностью и быстро оседают. При значениях рН в пределах 4-7 липосомы с плацебо на фигуре 1, которые не автоклавировали, не обладают фазовой стабильностью (фигура 3а). Липосомальные препараты с плацебо с фазовой стабильностью в основном были связаны с предельными значениями рН, а именно, меньше рН 3 и выше рН 8, когда обычно нарушается химическая стабильность.

Вновь обращаясь к фигуре 1, было установлено, что добавление соли липофильного амина оказывает стабилизирующее действие на липосомальный препарат. В противоположность, липосомальный препарат, содержащий только липофильный амин фентанил (без противоиона кислоты), был не стабильным. Однако по мере увеличения соотношения кислоты в композиции повышалась фазовая стабильность препарата. Стабилизирующий эффект липофильного амина в сочетании с соответствующей концентрацией кислоты обеспечивает липосомальные препараты с фазовой стабильностью при значениях рН меньше, чем примерно 7, как представлено на фигуре 3b, до автоклавирования. В противоположность композициям с плацебо липосомальные препараты, содержащие липофильный амин, обладают фазовой стабильностью в пределах рН примерно от рН 4 до примерно рН 6, за исключением препаратов, включающих хлорид натрия.

Пример 3 - стабильность различных инкапсулированных в липосомы лекарственных композиций, включая автоклавированные композиции

В фармацевтической промышленности стерильные композиции можно «окончательно стерилизовать», т.е. их стерилизуют автоклавированием после заполнения в отдельные ампулы. Подвергшиеся конечной стерилизации инкапсулированные в липосомы лекарственные продукты по настоящему изобретению посредством автоклавирования могут обеспечить индивидуально упакованные стабильные и стерильные липосомальные композиции, подходящие для применения в фармацевтической промышленности.

Как уже указывалось выше, различные источники предшествующего уровня, относящиеся к автоклавированию липосом, свидетельствуют о поддерживаемой специалистами в данной области точке зрения о том, что липосомы, в частности, на основе фосфатидилхолина, являются неустойчивыми и нестабильными в жестких условиях автоклавирования, приводящих к агломерации липосом, изменению размера и распределения по размеру липосом, гидролизу/окислению липидов, химическому разложению и нежелательному высвобождению инкапсулированного препарата (например, смотри WO 2004/002468). Как здесь описано, варианты осуществления липосомальных композиций по настоящему изобретению могут не только выдержать автоклавирование, но также, как оказалось, они обладают повышенной фазовой стабильностью после автоклавирования. Кроме того, последующие параметры, имеющие отношение к стабильности липосомальных композиций по настоящему изобретению, определяли до и после автоклавирования для дополнительного подтверждения стабилизирующего действия автоклавирования на композиции по настоящему изобретению: рН, распределение частиц по размеру, гидролиз липидов, окисление липидов и фазовую стабильность. Обсуждение каждого из данных параметров следует.

Липосомальные препараты получали с различными добавленными липофильными аминами в виде основания в комбинации с различными количествами различных кислот. Каждую опытную партию липосомального препарата получали с 1,2 г очищенного соевого лецитина, 0,12 г холестерина и основанием липофильного амина, растворяли в 3 г этанола и нагревали до 56°С. Водную фазу из 27 г воды для инъекций, необязательно содержащую различные кислоты или соли, подогревали до 56°С. В композициях, в которых опытная кислота представляла собой пальмитиновую кислоту, кислоту растворяли в этанольной фазе, в то время как другие кислоты растворяли в водной фазе. После растворения всех составляющих компонентов этанольный раствор вносили в водный раствор, смесь встряхивали при 56°С в течение 10 мин на орбитальном шуттель-аппарате и затем постепенно охлаждали до комнатной температуры. Наличие мультиламеллярных липосом подтверждали микроскопией. Пробы каждого липосомального препарата переносили в запаянные стеклянные ампулы и автоклавировали при 121°С в течение 20 мин.

Определяли различные параметры липосомальных композиций до и после автоклавирования для характеристики физической стабильности и химической стабильности композиций.

На фигуре 4 приведены суммарные данные по липосомальным препаратам, значению рН, размеру частиц до и после автоклавирования и показателю фазовой стабильности до и после автоклавирования.

Стабильность по отношению к значению рН: автоклавирование липосом является потенциальной проблемой в отношении химического разложения фосфолипида или лекарственных компонентов. Химическое разложение в композиции часто отражается изменениями в значении рН. Как показано на фигуре 5, взаимосвязь между значением рН после автоклавирования по сравнению с рН до автоклавирования липосомальных композиций по настоящему изобретению обычно можно описать уравнением рН(после) = рН(до), которое указывает на отсутствие изменения рН композиций, имеющих первоначальное значение рН меньше 7. Липосомальные композиции, которые были слабо щелочными до автоклавирования, особенно композиции с рН > 8, после автоклавирования имели более низкое значение рН, и точки на графике отклонялись от желаемой линейной зависимости. Оказалось, что подвергнутые автоклавированию композиции с более высокими значениями рН подвергались химическому разложению компонентов композиции.

Влияние автоклавирования на содержание фосфатидилхолина: автоклавирование липосом является потенциальной проблемой в отношении гидролиза фосфолипидов на основе эфира, таких как фосфатидилхолин. Определяли концентрации фосфатидилхолина в двенадцати композициях по настоящему изобретению до и после автоклавирования. Определяли концентрации фосфатидилхолина в двенадцати различных липосомальных композициях до и после автоклавирования. Фосфатидилхолин и связанные с ним продукты гидролиза лизофосфатидилхолина определяли нормальнофазовой ВЭЖХ с использованием колонки силикагель-диол при выпарительном детектировании рассеяния света, и градиента от элюента А (н-гексан:2-пропанол:уксусная кислота:триэтиламин 81,4:17:1,5:0,8) до элюента В (2-пропанол:вода:уксусная кислота:триэтиламин 84,4:14:1,5:0,08) в течение 15 мин со скоростью потока от 1,5 до 2 мл/мин.

Отбирали двенадцать композиций, представленных на фигуре 4, для охвата полных пределов значений рН композиций на фигуре 4. Несмотря на то, что гидролиз мог быть существенным при значениях рН меньше 4 или при значениях рН выше 10, как представлено на фигуре 6, липосомальные препараты по настоящему изобретению с рН в пределах от 4 до 9 и, более предпочтительно, в пределах от рН 4 до рН 7, можно было автоклавировать без значительной потери фосфолипида, как правило, находящейся на уровне менее 10%, более предпочтительно, менее 5%.

Влияние автоклавирования на окисление липидов: окисление липидов во время автоклавирования сводили до минимума получением и разливочным наполнением композиций в инертной атмосфере. В таблице 2 представлены обобщенные результаты по изменениям в результате окисления липидов после автоклавирования для липосомальных композиций, содержащих в качестве фармацевтического средства фентанил:лимонную кислоту (1:1). Окисление липидов анализировали колориметрическим методом. Все пробы, содержащие липиды, и стандарты подвергали взаимодействию с реагентом двухвалентное железо/ксиленол оранжевый (FOX), и интенсивность окраски определяли при 562 нм. Готовили контрольные пробы, полученные при взаимодействии трифенилфосфина, анализировали при 562 нм и вычитали из показаний поглощения проб. Количественное определение проводили по стандартной кривой для гидропероксида кумена. Исключали кислород для предупреждения окисления во время автоклавирования.

Таблица 2
Условия наполнения	% увеличения содержания окисленного липида после автоклавирования
Аргон	0%
Азот	0%
Кислород	340%
Воздух	155%

Влияние автоклавирования на показатель фазовой стабильности: фазовая стабильность липосомальных композиций по настоящему изобретению обеспечивает фармацевтически пригодные липосомальные композиции. Для липосомальных композиций, которые в достаточной мере не обладают фазовой стабильностью, как правило, наблюдают оседание подобно представленному на фигуре 2b, очень быстрое, часто в течение ночи, в то время как другие могут оседать только спустя недели хранения. Желаемое время хранения фармацевтического продукта в некоторых вариантах осуществления составляет два года или более в указанных условиях хранения. Например, в одном варианте осуществления было показано, что липосомальные композиции по настоящему изобретению, содержащие фентанил цитрат в качестве активного ингредиента/органической кислоты, сохраняют фазовую стабильность в течение двух лет при 4°С.

Во время разработки композиций для новых препаратов-кандидатов невыполнимо прослеживать стабильность в реальном времени для периода из месяцев или лет для оценки фазовой стабильности. В результате заявители разработали способ с использованием центрифугирования для получения аналитического инструмента для прогноза наличия длительной фазовой стабильности липосомальной композиции.

В тесте липосомальные композиции готовили, как здесь описано, и обобщенные данные представлены на фигуре 4. Определение распределения частиц по размеру проводили по рассеянию света с использованием прибора Malvern Mastersizer^™ 2000 после разведения липосом диспергатором, водой для инъекций. Отбирали пробу липосомальных препаратов и определяли распределение частиц по размеру с использованием прибора Malvern Mastersizer^™ 2000. Регистрировали массовый средний диаметр (d(0,5)) липосомальной композиции. Аликвотную порцию объемом 3 мл каждого липосомального препарата центрифугировали при 2292 g и при температуре 4°С в течение 2 ч. После центрифугирования отбирали аликвотную порцию пробы из верхнего слоя в центрифужной пробирке и определяли распределение частиц по размеру с использованием прибора Malvern Mastersizer^™ 2000. Регистрировали средний массовый диаметр верхнего слоя супернатанта.

Примеры липосомальных композиций, тестированных по настоящему протоколу, представлены на фигурах 8а-8с. Когда проба не обладала фазовой стабильностью, то при центрифугировании образовывался твердый осадок на дне центрифужной пробирки и прозрачный супернатант, фигура 8а. При определении на приборе Malvern Mastersizer^™ 2000 важно, чтобы не обнаруживались частицы в супернатанте, что подтверждали значением потемнения, в основном равным нулю. Определение потемнения хорошо известно специалистам в данной области, как подходящий тест для определения объемного количества липосом. Когда проба обладала фазовой стабильностью, то осадок после центрифугирования не был виден, и проба в центрифужной пробирке оставалась в виде гомогенной дисперсии. При анализе на приборе Malvern Mastersizer^™ 2000 значение потемнения подтверждало наличие многочисленных липосом в супернатанте, и массовый средний диаметр липосом составлял в основном 60%-100% от значения, полученного для исходной композиции.

При использовании значения d(0,5) в качестве маркера постоянства распределения частиц по размеру заявители определяли показатель фазовой стабильности (показатель PS) с использованием следующего уравнения:

показатель фазовой стабильности = d(0,5)(после центрифугирования)/d(0,5) до центрифугирования.

Когда проба обладала фазовой стабильностью, как здесь определено, то после центрифугирования не было заметно видимого осадка, и липосомы оставались равномерно распределенными в жидкой фазе, фигура 8с, и показатель PS был примерно выше примерно 0,6.

Если проба имела промежуточную фазовую стабильность, то после центрифугирования при визуальном осмотре обнаруживали градиент плотности или частичный осадок, как представлено на фигуре 8b, и, как правило, показатель PS был выше или равным 0,1, но был примерно ниже или равным 0,6. Для дополнительной иллюстрации композиций с промежуточной фазовой стабильностью на фигуре 9 представлена фотография липосомальной композиции с промежуточной фазовой стабильностью. После центрифугирования некоторая часть липосом оседала, и был виден осадок. Супернатант не был прозрачным при том, что некоторые липосомы оставались в суспензии. Данную картину получали с подсветкой для визуализации разграничения между осадком и супернатантом.

Показатель PS для различных липосомальных композиций определяли с использованием данного способа до и после автоклавирования композиций, и данные обобщены на фигуре 4.

В целом композиции, содержащие только свободное основание лекарственных препаратов, в основном не имели фазовой стабильности до и после автоклавирования. Единственным исключением была композиция с суматриптаном. Однако суматриптан был заряжен при значении рН конечной композиции, в то время как все другие молекулы были не заряжены или только частично заряжены при значении рН конечной композиции.

В целом автоклавирование липосомальных композиций повышало число липосомальных композиций, для которых был характерен показатель PS выше 0,6, как представлено в виде суммированных данных в таблице 3 следующим образом:

Таблица 3
Показатель PS	% композиций до автоклавирования	% композиций после автоклавирования
Показатель PS<0,1	51%	25%
0,1 Показатель PS0,6	23%	13%
Показатель PS>0,6	26%	62%

До автоклавирования 51% композиций в основном имел слабую фазовую стабильность, или она вовсе отсутствовала, при том, что только 26% композиций обладали высокой фазовой стабильностью. После автоклавирования число липосомальных композиций с фазовой стабильностью значительно повысилось до 62% от всех препаратов.

При добавлении соответствующего количества кислоты возможно оттитровать рН препаратов до пределов ниже значения рК_а так, что возрастающее количество аминогрупп препарата липофильного амина было протонировано. При значениях рН в пределах примерно от 4 до примерно 7 и после стадии автоклавирования, липосомы показывали высокую фазовую стабильность. На фигуре 10 и фигуре 11 проводится сравнение показателя фазовой стабильности липосомальных препаратов, содержащих фентанил в качестве липофильного амина из фигуры 4, до и после автоклавирования. На фигуре 10 графики показывают, что до автоклавирования композиции проявляли склонность к оседанию во время центрифугирования, что отражается низким значением показателя PS. В противоположность, после автоклавирования все композиции со значениями рН ниже рК_а фентанила (рК_а = 7,3) имели фазовую стабильность.

Обращаясь к фигуре 12 и фигуре 13, на графиках приводится сравнение показателя фазовой стабильности липосомальных препаратов из фигуры 4, содержащих онданстерон (рК_а = 7,4) в качестве липофильного амина, до и после автоклавирования. Для композиций с онданстероном наблюдали больший разброс в данных по сравнению с фентанилом, и это оказалось отличным от двух основных групп композиций, содержащих пальмитиновую кислоту и содержащих высокие концентрации онданстерона. Содержащие пальмитиновую кислоту композиции были хуже, поскольку у них имелась тенденция к образованию вязких смесей, и содержание липосом было менее однородным. При высокой концентрации онданстерона (2,4 мМ) наблюдали видимые кристаллы препарата. Без данных по этим двум группам композиций поведение онданстерона совпадало с фентанилом, т.е. после автоклавирования композиции со значениями рН ниже рК_а липофильного амина имели фазовую стабильность, фигуры 14 и 15.

Обращаясь к фигуре 16 и фигуре 17, относящимся к композициям, содержащим суматриптан из фигуры 4, только композиция со свободным препаратом имела фазовую стабильность при первоначальном получении. В отношении других препаратов титрование композиции до более низких значений рН придавало фазовую стабильность большей части композиций после автоклавирования. Необходимое значение рН ниже для суматриптана. Важно, что, несмотря на то, что суматриптан является липофильным амином, он также содержит сульфонамидную группу в своей структуре, имеет много ионизируемых групп и соответствующие значения рК_а, и имеет самый низкий коэффициент распределения в системе октанол/вода (Log P = 1,05).

Обращаясь к фигуре 18 и фигуре 19, относящимся к композициям, содержащим прохлорперазин из фигуры 4, было установлено, что композиции имели фазовую стабильность как до, так и после автоклавирования. Было показано, что автоклавирование оказывает отрицательное влияние только на композиции с более высокими значениями рН в отличие от композиций с другими препаратами. Прохлорперазин имеет более высокое значение рК_а, равное 8,1, которое выше, чем для онданстерона или фентанила. Многие композиции, полученные на основе онданстерона, имели значение рН на 2 единицы ниже, чем рК_а.

Размер липосомальных частиц: на предшествующем уровне считалось, что липосомы должны значительно изменяться в размере после автоклавирования. Определение распределения частиц по размеру для липосом проводили анализом рассеяния света с использованием прибора Malvern Mastersizer^™ 2000 после разведения липосом диспергатором, водой для инъекций. Результаты исследований заявителей с использованием препаратов с показателем PS > 0,6 после автоклавирования показали, что установленное значение d(0,5) липосом, определенное до центрифугирования нативного препарата, или автоклавированного препарата, незначительно возрастает после автоклавирования, при том, что для большинства композиций имело место увеличение размера липосом на уровне ниже 33%. Более существенные изменения размера липосом установили для композиций со значениями рН ниже рН 4 или выше рН 7, как представлено на фигуре 7. Как уже обсуждалось выше, предпочтительные пределы рН для композиций составляют примерно 4-7 и, предпочтительно, 5-6 для оптимизации физической и химической стабильности целой композиции.

Пример 4 - стабильность при хранении

Препараты, содержащие смесь свободного фентанила и инкапсулированного в липосомы фентанила, готовили смешиванием этанольной фазы с водной фазой при различном размере партий. Этанольная фаза содержала этанол, фентанил цитрат, фосфатидилхолин и холестерин. Водная фаза включала воду для инъекций. Перед смешиванием обе фазы нагревали до температуры примерно 56-60°С. Две фазы смешивали, и смесь перемешивали еще в течение 10 мин при 56-60°С. Затем смеси давали охладиться до комнатной температуры примерно в течение 2 ч. Как правило, каждый мл конечной водной композиции содержал 500 мкг фентанила (или 800 мкг фентанила цитрата), 40 мг фосфатидилхолина, 4 мг холестерина и 100 мг этанола в растворе в воде для инъекций. После разливочного наполнения препараты автоклавировали для конечной стерилизации (присутствовало некоторое количество воздуха). Конечные препараты содержали 30-40% фентанила в виде свободного препарата с оставшейся частью (70-60%) в инкапсулированной фракции.

Таблица 4
Размер партии	Конечное время хранения при 4єС	Размер частиц d(0,5) (микроны)	Процент инкапсулирования	Фосфатидилхолин (мг/мл)
		T=0	Конеч- ное время	Т=0	Конеч- ное время	Т=0	Конеч- ное время
1 л	13 месяцев	5,7	5,7	-	-	-	-
2,5 л	20 месяцев	6,4	6,3	66,6	64,9	33,5	32,8
15 л	12 месяцев	6,1	6,3	63,9	65,5	33,6	34,8

Водные липосомальные препараты хранили при 4°С и определяли стабильность распределения частиц по размеру и изменения в инкапсулировании препарата. Распределение частиц по размеру для липосом определяли по рассеянию света с использованием прибора Malvern Mastersizer^™ 2000 после разведения липосом диспергатором, профильтрованной водой для промывания. Процент инкапсулирования препарата в липосомы определяли центрифугированием липосом при высоком значении центробежной силы (g макс 277816) при температуре 4°С в течение 2 ч. Предельные условия были необходимы для получения подходящего осадка для композиций с очень высокой фазовой стабильностью. Супернатант и осадок после центрифугирования анализировали на содержание препарата обратнофазовой ВЭЖХ с использованием колонки С8 при УФ-детектировании и буфера ацетат аммония/метанол/ацетонитрил 40/40/20. Также в хроматограф вводили целую пробу для подсчета массового баланса. Процент инкапсулирования рассчитывали по формуле:

где С(осадок) представляет концентрацию препарата в осадке и С(супернатант) представляет концентрацию препарата в супернатанте.

Не наблюдали значительных изменений в распределении частиц по размеру, проценте инкапсулирования или содержании фосфатидилхолина. Препараты обладали фазовой стабильностью при визуальном осмотре, и для проб из партии объемом 15 л значение показателя фазовой стабильности равнялось 0,72 после 19 месяцев хранения.

Несмотря на то, что здесь описаны варианты осуществления изобретения, специалистам в данной области, очевидно, понятно, что могут быть сделаны их вариации, не отступая от сущности изобретения или объема прилагаемой формулы изобретения. Также, специалистам в данной области, очевидно, понятно, что элементы различных вариантов осуществления настоящего изобретения можно объединить в любом логическом порядке.

1. Стабильная липосомальная композиция, стерилизованная посредством автоклавирования, для доставки фармацевтического средства, где композиция содержит
a) подходящую водную среду;
b) липосомы, образованные из подходящего фосфолипида;
c) по меньшей мере, одно фармацевтическое средство, по меньшей мере, частично инкапсулированное в липосомах и выбранное из
i) липофильного амина и фармацевтически приемлемой кислоты, где фармацевтически приемлемая кислота выбрана из органической или неорганической кислоты, и
ii) фармацевтически приемлемой соли органической кислоты липофильного амина и, необязательно, фармацевтически приемлемой органической кислоты, при этом, необязательно, фармацевтически приемлемая кислота включает фармацевтически приемлемую органическую кислоту;
где количество фармацевтически приемлемой кислоты, присутствующей в композиции, является таким, что рН липосомальной композиции является меньшим или примерно равным рК_а аминогруппы фармацевтически активного липофильного амина.

2. Композиция по п.1, где указанная липосомальная композиция физически и химически стабильна при автоклавировании.

3. Композиция по п.1, где липосомальная композиция физически и химически стабильна при автоклавировании при температуре примерно 121°С в течение, по меньшей мере, примерно 15 мин.

4. Композиция по п.1, где рН липосомальной композиции примерно равно рК_а аминогруппы липофильного амина, и примерно 50% липофильного амина протонировано в композиции.

5. Композиция по п.1, где рН липосомальной композиции является меньшим чем
рК_а аминогруппы липофильного амина, и большая часть липофильного амина протонирована в композиции.

6. Композиция по п.1, где композиция имеет рН примерно на 1-2 единицы рН ниже значения рК_а аминогруппы липофильного амина.

7. Композиция по п.1, где рН липосомальной композиции находится в пределах примерно от 4 до значения рК_а аминогруппы липофильного амина.

8. Композиция по п.1, где композиция имеет рН в пределах примерно от 4 до 8, предпочтительно, в пределах примерно от 4 до 7, более предпочтительно, в пределах примерно от 4,5 до 6,5, и еще более предпочтительно, в пределах примерно от 5 до 6.

9. Композиция по п.1, дополнительно содержащая холестерин.

10. Композиция по п.1, дополнительно содержащая этанол, где этанол предпочтительно находится в количестве в пределах примерно от 2,5 до 10% от общего объема липосомальной композиции.

11. Композиция по п.1, где фосфолипид имеет общий нейтральный заряд при примерно физиологическом значении рН.

12. Композиция по п.1, где фосфолипид включает фосфатидилхолин.

13. Композиция по п.1, где водная среда является водой.

14. Композиция по п.1, где фармацевтическое средство также является свободным в водной среде.

15. Композиция по п.14, где процент инкапсулированного в липосомах фармацевтического средства составляет примерно от 50 до 90%, предпочтительно, от 60 до 80% от общего количества фармацевтического средства, присутствующего в липосомальной композиции.

16. Композиция по п.14, где процент инкапсулированного в липосомах фармацевтического средства составляет примерно от 50 до примерно 75% от общего количества фармацевтического средства, присутствующего в липосомальной композиции.

17. Композиция по п.1, где фармацевтически приемлемая кислота в компоненте (c)(i) включает органическую кислоту.

18. Композиция по п.1, где фармацевтически приемлемая кислота в компоненте (c)(i) включает неорганическую кислоту.

19. Композиция по любому из пп.1-18, где липосомальные частицы липосомальной композиции имеют массовый средний диаметр d(0,5) меньше чем примерно 10 мкм, предпочтительно меньше чем примерно 6 мкм, более предпочтительно меньше чем примерно 4 мкм, еще более предпочтительно меньше чем примерно 2 мкм.

20. Композиция по любому из пп.1-18, где липофильный амин включает липофильный амин, который имеет значение log P выше чем примерно 1,0, предпочтительно в пределах примерно от 2 до 5, при физиологическом значении рН.

21. Композиция по любому из пп.1-18, где соотношение фармацевтического средства к фосфолипиду составляет примерно от 1:100 до примерно 1:10 моль/моль.

22. Композиция по любому из пп.1-18, где количество присутствующего фосфолипида составляет примерно 1,5 мМ или выше в композиции.

23. Композиция по любому из пп.1-18, где при центрифугировании с центробежным ускорением в пределах примерно от 1000 до 5000, температуре примерно 4°С и периоде времени примерно 2 ч соотношение распределения частиц по размеру для липосом в супернатанте липосомальной композиции после центрифугирования по сравнению с таковым до центрифугирования равно или выше примерно 0,6.

24. Композиция по любому из пп.1-18, где липосомальная композиция физически и химически стабильна в течение, по меньшей мере, одного года, предпочтительно, по меньшей мере, 18 месяцев, более предпочтительно, по меньшей мере, 24 месяца при температуре выше точки замерзания липосомальной композиции.

25. Композиция по любому из пп.1-18, где процент инкапсулирования лекарственного средства в липосомальной композиции в основном стабилен в течение, по меньшей мере, 20 месяцев.

26. Композиция по любому из пп.1-18, где процент инкапсулирования лекарственного средства в липосомальной композиции в основном стабилен в течение, по меньшей мере, 20 месяцев в инертной атмосфере.

27. Композиция по любому из пп.1-18, где количество фосфолипида не изменяется химически более чем примерно на 10% (мас./мас.), предпочтительно более чем примерно на 5% (мас./мас.) в течение, по меньшей мере, 20 месяцев.

28. Композиция по любому из пп.1-18, где липофильный амин не подвергается химическому разложению более чем примерно на 5% (мас./мас.), предпочтительно более чем примерно на 2% (мас./мас.) в течение, по меньшей мере, 20 месяцев.

29. Стерильная и стабильная композиция по любому из пп.1-18, где композиция является в основном химически стабильной в течение, по меньшей мере, 20 месяцев.

30. Стерильная и стабильная композиция по любому из пп.1-18, где количество фосфолипида не изменяется химически более чем примерно на 10% (мас./мас.), предпочтительно более чем примерно на 5% (мас./мас.) в течение, по меньшей мере, 20 месяцев.

31. Способ получения стабильной стерильной липосомальной композиции для доставки фармацевтического средства, включающий следующие стадии:
a) обеспечение подходящей водной среды;
b) обеспечение подходящего фосфолипида;
c) обеспечение, по меньшей мере, одного фармацевтического средства, способного, по меньшей мере, частично инкапсулироваться в липосомы и выбранного из
i) липофильного амина и фармацевтически приемлемой кислоты, где фармацевтически приемлемая кислота выбрана из органической или неорганической кислоты, и
ii) фармацевтически приемлемой соли органической кислоты липофильного амина, при этом, необязательно, фармацевтически приемлемая кислота включает фармацевтически приемлемую органическую кислоту;
где количество фармацевтически приемлемой кислоты, присутствующей в композиции, является таким, что рН липосомальной композиции является меньшим или примерно равным рК_а аминогруппы фармацевтически активного липофильного амина;
d) объединение водной среды, фосфолипида и фармацевтического средства с образованием липосомальной композиции; и
e) автоклавирование указанной композиции.

32. Способ по п.31, где рН липосомальной композиции примерно равно рК_а аминогруппы липофильного амина, и примерно 50% липофильного амина протонировано в композиции.

33. Способ по п.31, где рН липосомальной композиции является меньшим чем pK_a аминогруппы липофильного амина, и большая часть липофильного амина протонирована в композиции.

34. Способ по п.31, где композиция имеет рН примерно на 1-2 единицы рН ниже значения рК_а аминогруппы липофильного амина.

35. Способ по п.31, где рН липосомальной композиции находится в пределах примерно от 4 до значения рК_а аминогруппы липофильного амина.

36. Способ по п.31, где композиция имеет рН в пределах примерно от 4 до 8, предпочтительно в пределах примерно от 4 до 7, более предпочтительно в пределах примерно от 4,5 до 6,5, еще более предпочтительно в пределах примерно от 5 до 6.

37. Способ по п.31, где, по меньшей мере, дополнительно присутствует один из холестерина и этанола, и стадия (d) включает стадию объединения водной среды, фосфолипидов, фармацевтического средства и, по меньшей мере, одного из холестерина и этанола с образованием липосомальных композиций.

38. Способ по п.37, где этанол находится в количестве примерно от 2,5 до 10% от общего объема липосомальной композиции.

39. Способ по п.31, где фосфолипид имеет общий нейтральный заряд при примерно физиологическом значении рН.

40. Способ по п.31, где фосфолипид включает фосфатидилхолин.

41. Способ по п.31, где водная среда является водой.

42. Способ по п.31, где фармацевтическое средство также является свободным в водной среде.

43. Способ по п.31, где процент инкапсулированного в липосомы фармацевтического средства составляет примерно от 50 до 90%, предпочтительно, примерно от 60 до 80% от общего количества фармацевтического средства, присутствующего в липосомальной композиции.

44. Способ по п.31, где процент инкапсулированного в липосомах фармацевтического средства составляет примерно от 50 до 75% от общего количества фармацевтического средства, присутствующего в липосомальной композиции.

45. Способ по п.31, где фармацевтически приемлемая кислота на стадии (c)(i) включает органическую кислоту.

46. Способ по п.31, где фармацевтически приемлемая кислота на стадии (c)(i) включает неорганическую кислоту.

47. Способ по любому из пп.31-46, где липосомальные частицы липосомальной композиции имеют массовый средний диаметр d(0,5) меньше чем примерно 10 мкм, предпочтительно меньше, чем примерно 6 мкм, более предпочтительно меньше чем примерно 4 мкм, еще более предпочтительно меньше чем примерно 2 мкм.

48. Способ по любому из пп.31-46, где липосомальная композиция физически и химически стабильна и стерильна в течение, по меньшей мере, одного года, предпочтительно в течение, по меньшей мере, 18 месяцев, более предпочтительно в течение по меньшей мере, 24 месяцев при температуре выше точки замерзания липосомальной композиции.

49. Способ по любому из пп.31-46, где липофильный амин включает липофильный амин, который имеет значение log P выше чем примерно 1,0, предпочтительно в пределах примерно от 2 до примерно 5, при физиологическом значении рН.

50. Способ по любому из пп.31-46, где соотношение фармацевтического средства к фосфолипиду составляет примерно от 1:100 до примерно 1:10 моль/моль.

51. Способ по любому из пп.31-46, где количество присутствующих фосфолипидов составляет примерно 1,5 мМ или выше в композиции.

52. Способ по любому из пп.32-46, где процент инкапсулирования лекарственного средства в липосомальной композиции в основном стабилен в течение, по меньшей мере, 20 месяцев.

53. Способ по любому из пп.32-46, где композиции являются в основном химически стабильными в течение, по меньшей мере, 20 месяцев.

54. Способ по любому из пп.32-46, где количество фосфолипида не снижается в результате химического гидролиза или окисления более чем примерно на 10% (мас./мас.), предпочтительно более чем примерно на 5% (мас./мас.) в течение, по меньшей мере, 20 месяцев.

55. Способ по любому из пп.32-46, где липофильный амин не подвергается химическому разложению более чем примерно на 5% (мас./мас.), предпочтительно более чем примерно на 2% (мас./мас.) в течение, по меньшей мере, 20 месяцев.

56. Стерильная и стабильная липосомальная композиция по любому из пп.1-18, проявляющая одно или более из следующих свойств в течение, по меньшей мере, одного года при автоклавировании и хранении при температуре выше точки замерзания композиции:
i) изменение в процентном инкапсулировании не более чем примерно на 5%;
ii) изменение в концентрации фосфолипида не более чем примерно на 10 мас.%;
iii) изменение в концентрации липофильного амина в результате химического гидролиза и/или окисления не более чем примерно на 5 мас.%;
iv) отсутствие образования видимых агрегатов;
v) изменение массового среднего диаметра частиц не более чем примерно на 10% при оптическом определении.

57. Устройство, содержащее стабильную липосомальную композицию по любому из пп.1-30 и способное образовывать капли аэрозоля для ингаляции композиции пациентом.

58. Набор для доставки фармацевтического средства пациенту, где набор включает инструкции по применению и устройство, содержащее стабильную липосомальную композицию по любому из пп.1-30 и способное образовывать капли аэрозоля композиции для ингаляции пациентом.

59. Способ повышения стабильности липосомальных композиций, где указанный способ включает следующие стадии:
a) обеспечение подходящей водной среды;
b) обеспечение подходящего фосфолипида;
c) обеспечение, по меньшей мере, одного фармацевтического средства, способного, по меньшей мере, частично инкапсулироваться в липосомы и выбранного из
i) липофильного амина и фармацевтически приемлемой кислоты, где фармацевтически приемлемая кислота выбрана из органической или неорганической кислоты, и
ii) фармацевтически приемлемой соли органической кислоты липофильного амина и, необязательно, фармацевтически приемлемой органической кислоты;
где количество фармацевтически приемлемой кислоты, присутствующей в композиции, является таким, что рН липосомальной композиции является меньшим или примерно равным рК_а аминогруппы фармацевтически активного липофильного амина;
d) объединение водной среды, фосфолипида и фармацевтического средства с образованием липосомальной композиции; и
e) автоклавирование указанной липосомальной композиции в условиях, эффективных для стерилизации указанных композиций с получением, таким образом, композиций с повышенной стабильностью по сравнению со стабильностью композиции до автоклавирования.

60. Способ по п.59, где стадию автоклавирования проводят при температуре примерно 121°С в течение, по меньшей мере, приблизительно 15 мин в инертной атмосфере.

61. Способ по п.60, где инертная атмосфера во время автоклавирования включает аргон или азот.

62. Способ определения липосомальной композиции с фазовой стабильностью, где способ включает следующие стадии:
a) обеспечение липосомальной композиции, содержащей фосфолипид, водный раствор, фармацевтическое средство и, необязательно, этанол и стерин;
b) оптическое определение массового среднего диаметра (d(0,5)) липосомальной композиции;
c) автоклавирование композиции;
d) центрифугирование липосомальной композиции при примерно от 1000 g до примерно 5000 g при температуре примерно 4°С в течение примерно 2 ч;
e) оптическое определение массового среднего диаметра (d(0,5)) супернатанта раствора липосомальной композиции после стадии центрифугирования (d);
f) вычисление соотношения значения массового среднего диаметра d(0,5) в распределении частиц по размеру в растворе после центрифугирования к таковому в растворе перед центрифугированием;
где липосомальная композиция с фазовой стабильностью определяется как таковая, если композиция имеет соотношение на стадии (f), равное примерно 0,6 или выше.

63. Способ по п.62, где липосомальная композиция с фазовой стабильностью определяется как таковая, если композиция имеет соотношение на стадии (f), равное примерно 0,8 или выше.