Способ получения растений рапса in vitro

Авторы патента:

A01H4 - Разведение растений из тканевых культур

Владельцы патента RU 2374834:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и проектно-технологический институт рапса (ГНУ ВНИПТИР) (RU)

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения растений рапса in vitro. Способ предусматривает выращивание растений, отбор листочков для получения каллуса на питательной среде с последующей пересадкой их на среды, способствующие формированию почек и развитию из них растений, причем помещают листочки на агаризованную питательную среду Мурасиге и Скуга, содержащую 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту) в концентрации - 1-5 мг/л и кинетина 1-5 мг/л, и после образования каллусов их пересаживают на среду Мурасиге и Скуга, содержащую 6-бензиламинопурин в концентрации 3,0 мг/л и нафтилуксусную кислоту 0,5 мг/л, а образовавшиеся на каллусах почки переносят на разбавленную агаризованную среду Мурасиге и Скуга без гормонов. Изобретение позволяет увеличить выход эмбриоидов растений-регенерантов из каллусной ткани растений. 1 табл., 2 ил.

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в биотехнологии и селекции, в исследованиях по физиологии и фитопатологии и морфогенезу растений.

Известен способ регенерации растений рапса in vitro из семядольных листочков, по которому изолированные семядольные листочки помещают на питательную среду Гамборга (В5) (пропись). Для получения растений добавляют следующие гормональные вещества: 6-бензиламинопурин (6-БАП) - 3,0 мг/л и нафтилуксусную кислоту (НУК) 0,5 мг/л.

Через 2-3 недели на каллусах появляются единичные зеленые зоны, из которых появляются побеги, их отделяют от семядолей и пересаживают на безгормональную среду, на которой формируются зеленые растения (Ивашута С.И., Мазин В.В. Регенерация озимого рапса in vitro для проведения генетической трансформации. / Физиология растений. - 1994. - Т.41. - №3. - С.440-442).

Недостатком способа является зависимость регенерации растений от фазы развития донорных (маточных, материнских) растений, низкий выход эмбриоидов и побегов.

Наиболее близким к заявленному является способ регенерации растений люцерны in vitro, включающий отбор ценных материнских растений, изолирование их частей (листьев), стерилизацию поверхности листового эксплантата в 0,1%-ном водном растворе диацида, трехкратную промывку в стерильной дистиллированной воде, делают на каждом из них ряд надрезов по всей площади пластинки и помещают на модифицированную питательную среду Гамборга (МВ5) (пропись) с фитогормонами 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) 8-16 мг/л, кинетином 6-10 мг/л, НУК 0,1-0,5 мг/л с доведением рН среды до 5,8-6,0 и концентрацией сахарозы 3%, инкубация 3-4 недели при непрерывном освещении люминесцентными лампами. Через 2-3 недели развившиеся каллусы делят на 3-5 частей и переносят на питательную органогенную среду, в которой гормоны заменены на 6-БАП из расчета 0,2 мг/л, и культивируют для получения эмбриоидов при тех же условиях в течение 2-4 недель. Появившиеся на каллусах через 2-3 недели единичные почки, эмбриоиды переносят на агаризованную питательную регенерационную среду МВ5, разбавленную водой вдвое, без гормонов. По мере развития растений-регенерантов на этой среде и появления у них 2-3 тройчатых листьев и корней их пересаживают в почву, акклиматизируют и выращивают в обычных условиях (Мезенцев А.В. Авторское свидетельство №679190 с приоритетом 22.03.77).

Недостатками этого способа являются низкий выход (3 шт. на один каллус) эмбриоидов и зеленых растений, высокие концентрации фитогормонов.

Цель изобретения - увеличение выхода эмбриоидов растений-регенерантов из каллусной ткани рапса.

Поставленная цель достигается тем, что в способе регенерации растений рапса in vitro, включающем отбор материнских растений, изолирование листьев, стерилизацию поверхности, промывку стерильной водой, разрезание на кусочки (сегменты, эксплантанты), частичное повреждение (поранение) поверхности, посадку производят на каллусогенную питательную среду Мурасиге и Скуга (пропись), содержащую 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) в концентрации 1-5 мг/л и кинетина 1-5 мг/л, инкубирование до получения каллуса, деление его на кусочки и пересадку на органогенную среду Мурасиге и Скуга, содержащую 6-бензиламинопурин (6 БАП) - 3,0 мг/л и нафтилуксусную кислоту (НУК) - 0,5 мг/л для получения эмбриоидов, пересадку их на агаризованную, регенерационную, безгормональную среду Мурасиге и Скуга, разбавленную водой вдвое, пересадку растений-регенерантов в почву, их акклиматизацию.

Способ осуществляют следующим образом.

Отбирают материнские растения с ценными признаками. Изолируют листочки, стерилизуют в стерилизующем растворе, например 5-10%-ном водном растворе Domestos, в течение 7-10 минут и трижды промывают стерильной дистиллированной водой. Использование концентрации Domestos менее 5% приводит к сохранению бактерий и спор грибов, что приводит к инфицированию посадочного материала, а применение высоких концентраций приводит к гибели не только бактерий, спор грибов, но и растительных тканей. Затем листочки делят на кусочки (сегменты, эксплантанты) размером 5×5 мм, делают на каждом из них частичные повреждения (поранения) по всей поверхности листового кусочка, помещают на агаризованную каллусогенную питательную среду Мурасиге и Скуга с добавлением фитогормонов 2,4-Д в концентрации 1-5 мг/л и кинетина 1-5 мг/л. Материал инкубируют до получения каллуса в течение 3-5 недель, при непрерывном освещении люминесцентными лампами (0,5-4,0 тыс. лк) при 24-28°С. На среде Мурасиге и Скуга формируется максимальная частота морфогенного каллуса (фиг.1). Использование 2,4-Д и кинетина в концентрациях меньше 1 мг/л замедляют время образования каллусной ткани. Добавление в среду концентраций более 5 мг/л приводит к формированию комбинированного типа каллуса, который содержит не морфогенный (рыхлый, зернистый) и морфогенный (глобулярный) типы. Развившиеся из листочков-сегментов (эксплантантов) каллусы делят на 3-4 части и переносят на агаризованную питательную органогенную среду, т.е. на ту же по составу питательную среду, что и каллусогенная, содержащая 6-БАП в концентрации 3,0 мг/л и НУК - 0,5 мг/л. Использование меньших концентраций 6-БАП и НУК увеличивает время формирования эмбриоидов и их частоту, а концентрации выше рекомендуемых приводят к формированию вторичных эмбриоидов или к их дедифференциации. Культивирование морфогенного каллуса в течение 2-4 недель при условиях с 16-ти часовым фотопериодом способствует формированию эмбриоидов и почек более 7 штук (фиг.2), что подтверждает достижение указанной цели. Появившиеся на каллусах эмбриоиды, почки переносят на агаризованную питательную среду Мурасиге и Скуга, разбавленную водой вдвое и без гормонов.

Заявленный способ позволяет повысить получение растений-регенерантов рапса из каллусной ткани.

Прописи питательных сред представлены в таблице.

Таблица
Компоненты среды	Гамборга (В5)	МВ5	Мурасиге и Скуга	Линсмайера и Скуга	Блейдза
содержание компонентов мг/л
NH₄NO₃	-	-	1650	3300	1000
KNO₃	1000	2500	1900	1900	1000
CaCl₂·2H₂O	150	750	440	440	-
Са(NO₃)₂	-	150	-	-	347
MgSO₄·7H₂O	270	250	370	370	-
MgSO₄	-	-	-	-	35
КН₂РO₄	-	-	170	170	300
КСl	300	-	-	-	65
NaH₂PO₄·H₂O	90	150	-	-	-
Na₂HPO₄	30	-	-	-	-
(NH₄)₂SO₄	30	134	-	-	-
Н₃ВО₃	3,0	3,0	6,2	6,2	1,6
MnSO₄	-	-	-	-	4,4
MnSO₄H₂O	10	10	-	-	-
MnSO₄·4H₂O	-	-	22,3	22,3	-
CoCl₂·6H₂O	0,25	0,025	0,025	0,025	0,25
ZnSO₄·7H₂O	3,0	2,0	8,6	8,6	1,5
Na₂MoO₄·2H₂O	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
KI	0,75	0,75	0,83	0,83	0,8
CuSO₄	-	0,025	-	-	-
CuSO₄·5H₂O	0,25	-	0,025	0,025	0,025
FeSO₄·7H₂O	27,8	27,8	27,8	27,8	27,8
Nа₂ЭДТА·2Н₂O	37,3	37,3	37,3	37,3	37,3
Тиамин-HCl	1,0	10,0	0,1	0,4	0,1
Пиридоксин-HCl	0,1	1,0	0,5	-	0,1
Никотиновая кислота	0,1	1,0	0,5	-	0,5
Мезоинозит	100	100	100	100	-
Глицин	2	2	2	2	2
Сахароза	3000	3000	3000	3000	3000
РН	5,6-5,8

Способ получения растений рапса in vitro, включающий выращивание растений, отбор листочков для получения каллуса на питательной среде с последующей пересадкой их на среды, способствующие формированию почек и развитию из них растений, отличающийся тем, что помещают листочки на агаризованную питательную среду Мурасиге и Скуга, содержащую 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту) в концентрации 1-5 мг/л и кинетина 1-5 мг/л, и после образования каллусов их пересаживают на среду Мурасиге и Скуга, содержащую 6-бензиламинопурин в концентрации 3,0 мг/л и нафтилуксусную кислоту 0,5 мг/л, а образовавшиеся на каллусах почки переносят на разбавленную агаризованную среду Мурасиге и Скуга без гормонов.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. .

Способ создания восстановителей фертильности ярового рапса (brassica napus l.) // 2366705

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения восстановителей фертильности. .

Культура корня hed.th. (hedysarum theinum krasnob.) - продуцент изофлавонов // 2360964

Изобретение относится к области физиологии растений, биотехнологии и генной инженерии и может быть использовано в фармацевтической промышленности. .

Способ восстановления фертильности андроклинных регенерантов тритикале // 2354111

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам восстановления фертильности андроклинных регенерантов тритикале (Triticosekale Wittmack), полученных в культуре пыльников, без использования полиплоидизирующего агента (колхицина) и условий теплицы, за счет опыления смесью пыльцы константных селекционных сортов тритикале в полевых условиях.

Способ получения трансгенных однодольных растений // 2351121

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в селекции однодольных растений при создании новых сортов и гибридов с помощью генной инженерии, в работах по инсерционному мутагенезу, выделению и клонированию генов растений.

Способ получения трансгенных растений кукурузы // 2351120

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в селекции кукурузы при создании новых сортов и гибридов с помощью генной инженерии, в работах по инсерционному мутагенезу, выделению и клонированию генов кукурузы.

Способ сохранения возбудителя ложной мучнистой росы (лмр) подсолнечника // 2342828

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в селекции подсолнечника на устойчивость к ложной мучнистой росе. .

Производные фактора vii свертывания крови // 2338752

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения фактора VII свертывания крови человека. .

Рекомбинантная полинуклеотидная последовательность, характеризующая уникальный трансформационный акт между генетической конструкцией, включающей ген cryiiia, и геномной днк картофеля сорта луговской, ее применение и содержащие эту последовательность клетка, трансгенное растение и его потомство // 2337529

Изобретение относится к области генетической инженерии и направлено на получение устойчивого к колорадскому жуку и отвечающего условиям биологической и пищевой безопасности трансгенного картофеля на основе высокопродуктивного отечественного сорта и разработку надежного средства для идентификации соответствующего трансформационного события в геноме растения.

Способ получения высоких урожаев зиготоподобных семядольных зародышей сосны с использованием сред, содержащих дисахарид и глюкозу (варианты) // 2333633

Способ размножения лилий in vitro // 2384050

Изобретение относится к области садоводства

Способ получения стефарина сульфата в культуре клеток растения стефания гладкая // 2399665

Изобретение относится к биотехнологической промышленности и касается получения субстанции медицинского препарата - стефаглабрина сульфата из культуры клеток растения стефания гладкая

Способ получения стефарина сульфата в культуре клеток растения стефания гладкая // 2399666

Система с регулируемой средой и способ быстрого разведения семенного картофеля // 2411715

Штамм культивируемых клеток растения женьшеня настоящего pg-1 (panax ginseng c.a. mey) в условиях in vitro - продуцент гинзенозидов // 2415927

Изобретение относится к биотехнологии, в частности культивированию клеток растения женьшеня настоящего, и может быть использовано для получения ценных биологически активных соединений - гинзенозидов, которые широко используются в фармацевтической промышленности и косметологии

Способ получения "искусственных семян" из культуры корня шлемника байкальского (scutellaria baicalensis georgi) // 2415928

Способ генетической трансформации растений селекционно-ценных образцов клевера лугового // 2420060

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в селекции растений для направленного создания исходного селекционного материала клевера лугового с хозяйственно-ценными признаками методом генетической трансформации, а также в исследованиях по физиологии, фитопатологии и генетике растений

Способ укоренения растений, полученных в культуре in vitro // 2423045

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности, к тем методам культивирования в условиях in vitro, где требуется укоренение полученных растений-регенерантов и адаптация их к естественным условиям выращивания (ex vitro)

Штамм культивируемых клеток растения стефания гладкая ифр sg 26127 (stephania glabra (roxb.) miers) в условиях in vitro - продуцент стефарина // 2453598

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к штамму продуценту стефарина

Способ микроклонального размножения лиственницы сибирской в культуре in vitro через соматический эмбриогенез на среде аи для плантационного лесовыращивания // 2456344

Изобретение относится к лесному хозяйству, а именно к созданию сортового плантационного лесовыращивания на основе современных инновационных биотехнологий