Способ изготовления вирусвакцины против ньюкаслской болезни птиц для орального применения
Владельцы патента RU 2378013:
ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии (RU)
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Способ включает выращивание вакцинного штамма вируса «Ла-Сота» на куриных эмбрионах. Затем крупу перловки, обработанную теплом, смешивают с аллантоисной жидкостью, содержащей вакцинный штамм, пропитывают раствором стабилизатора в виде смеси 40%-ного пептона и 8%-ной лактозы, замораживают при минус 50±20°С в течение 8-10 часов и лиофилизируют в течение 30-32 часов. Способ позволяет получить вакцину для оральной иммунизации птиц с высокой иммунологической эффективностью, устойчивую при хранении. 2 табл.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к вирусвакцине против ньюкаслской болезни (НБ) птиц, предназначенной для орального применения.
В условиях экономического развития птицеводства массовая иммунизация оральным методом существенно сокращает трудозатраты и потери от поствакцинальных стрессов, отрицательно влияющих на здоровье и продуктивность птицы.
Особенно актуальным и перспективным в реализации орального способа иммунизации птиц против НБ представляют сухие вирусвакцины, способные создавать стойкий иммунитет к заболеванию при добавлении в небольших количествах к корму. Их преимущество - совместимость с различной технологией кормления птицы в любых хозяйственных условиях.
Известен способ изготовления вакцины против НБ птиц на основе гранул лактозы из штамма V-4 (Veter. Microbiol. - 1995, vol.46, №1/3-p.47-53).
Кроме этого, разработана технология получения гранулированной вирусвакцины против НБ птиц для перорального применения на основе гранул лактозы (патент РФ №2153356, 27.07.2000 г.), заключающаяся в распылении аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, инфицированных шт. «Ла-Сота вируса НБ, на лактозные агломераты».
Недостаток этого способа в том, что для получения вирусвакцины против НБ птиц для перорального применения используют специально приготовленные для этих целей агломераты лактозы.
Известен способ получения вирусвакцины на основе обработанных теплом дробленных зерен ячменя и сорго (М.Nasser, J.E.Johr, Y.V.Mebraty at all. Oral Newcastle disease Vaccination trials in Ethiopia - Avian Pathologe, 2000, 29, p.27-34).
С этой целью зерно заливали кипяченой водой и кипятили 2 мин, остужали, воду сливали. По истечении 5 мин зерно охлаждали под струей водопроводной воды, а затем сушили на открытом воздухе 48 часов. Пропитывали водой в течение дня, после чего ее сливали. Процесс пропитывания повторяли, выдерживали ночь. Воду сливали, зерно сушили на открытом воздухе 48 часов. После этого аллантоисную жидкость (околоплодная жидкость куриных эмбрионов), содержащую вирус, разбавленную в 10 раз водой, добавляли к зерну в отношении 1 части аллантоисной жидкости и 4 части зерна. Цыплят кормили приготовленной смесью сразу и 6 часов спустя из расчета 10 г вакцины на голову. После иммунизации свежеприготовленной смесью к контрольному заражению устойчивыми оказались 100% цыплят, а вакцинированных смесью через 6 часов после ее приготовления - 95%. Сорго оказалось непригодным для этих целей - только 30% цыплят оказались устойчивыми к контрольному заражению, получивших смесь - вируссодержащая аллантоисная жидкость - зерно сразу после ее приготовления.
Недостатками способа является получение вакцинного препарата на основе дробленного ячменя, сохраняющего иммуногенные свойства не более 6 часов после его приготовления - этого времени недостаточно для предварительной проверки инфекционной активности, безвредности, иммуногенности вакцины из-за их продолжительности во времени, так как из перечисленных самая кратковременная операция - определение инфекционной активности - занимает не менее 92-х часов. Указанное не позволяет применять препарат по назначению в птицеводческих хозяйствах.
Целью настоящего изобретения является разработка способа вирусвакцины против ньюкаслской болезни птиц для оральной иммунизации птиц, обладающей высокой иммуногенной эффективностью, длительным сроком хранения.
Указанная цель достигается тем, что крупу перловки, обработанную теплом, смешивают с аллантоисной жидкостью, содержащей вакцинный штамм «Ла-Сота» вируса ньюкаслской болезни птиц пропитывают раствором стабилизатора, в виде смеси 40%-ного пептона и 8%-ной лактозы, замораживают при минус 50±20°С в течение 8-10 часов и лиофилизируют в течение 30-32 часов.
Добавление крупы перловки обеспечивает адсорбцию вакцинного вируса на ее поверхности и в порах, получение вакцины в виде гранул, доставку вируса в желудочно-кишечный тракт.
Примеры конкретного выполнения.
В металлическую емкость объемом 3,5-4,0 л засыпают крупу перловки массой 1,0 кг, заливают 2,5 л водопроводной воды и кипятят 40 минут на слабом огне при периодическом помешивании во избежание пригорания. Промывают в течение 3-5 мин водопроводной водой, заливают таким же объемом дистиллированной воды и кипятят 40 мин. Промывают дистиллированной водой. Такую же процедуру повторяют третий раз, заливая крупу и промывая физиологическим раствором. Крупу помещают в сушильный шкаф, распределяют тонким слоем и высушивают в течение 3-4-х часов при температуре 130-140°С.
На дистиллированной воде готовят стабилизаторы - 4%-ный раствор гидролизата лактальбумина и смесь 40%-ного пептона и 8%-ной лактозы. Стабилизатор стерилизуют автоклавированием при 1,2-1,5 ати в течение 1 часа.
Пример 1.
Вирусвакцину изготавливают следующим образом: 10,0 г перловой крупы, обработанной теплом, пропитанной смесью 5,0 мл 40%-ного пептона и 8%-ной лактозы заливают 10 мл аллантоисной жидкости вакцинного штамма «Ла-Сота» вируса НБ птиц, выращенного на 9-10 дневных куриных эмбрионах в течение 92 часов при температуре 37±0,5°С и относительной влажности 60-70%. Смесь наносят на поддон равномерным слоем высотой 3,0-5,0 мм, замораживают при минус 50±2°С в течение 8-10 часов и лиофилизируют.
Пример 2.
Вирусвакцину изготавливают следующим образом: 10,0 г перловой крупы, обработанной теплом пропитанной 10,0 мм аллантоисной жидкости вакцинного штамма «Ла-Сота» вируса НБ, выращенного на 9-10 дневных куриных эмбрионов в течение 92 часов при температуре 37±0,5°С и относительной влажности 60-70%. Смесь наносят на поддон равномерным слоем высотой 3,0-5,0 мл, замораживают при минус 50±2°С в течение 8-10 часов и лиофилизируют. Лиофилизацию проводят в сублимационный установке. После загрузки сушильной камеры подключают датчик контроля температуры материала, камеру герметизируют и вакуумируют до остаточного давления 80-100 мм рт.ст. Затем включают циркуляционный насос и в течение первых 10-14 часов сушки нагрев полок проводится за счет естественного нагрева до минус 20°С. Температура материала в течение первых 10-12 часов не должна превышать минус 30-32°С. Далее нагрев полок ступенчато (по 2-3 часа) повышают до минус 15; 10; 5°С и плюс 5, 10 и 30°С. Конечная температура полок (30°С) поддерживается в течение 3 часов, при этом температура материала не должна превышать 20°С. Досушивание вакцины проводят при температуре материала плюс 15-20°С в течение 5 часов. Продолжительность сушки составляет 30-32 часа при остаточной влажности готового препарата 2-3%.
Биологическая активность полученной вирусвакцины образца №1 составляла 9,5 lg ЭИД50/г, образца №2 - 9,75 lg ЭИД50/г.
Вирусвакцина обоих образцов была стерильна в отношении бактериальной и грибковой микрофлоры, безвредна при введении внутримышечным методом и вскармливании пятикратной дозы вакцины цыплятам, смешанной с дневной нормой комбикорма, сохраняла биологические и иммуногенные свойства в течение 8 месяцев хранения для образца №1 и 3 месяцев - для образца №2 при температуре 4-6°С и обеспечивала защиту 100% привитых цыплят при заражении вирулентным штаммом «Т-53» вируса НБ внутримышечным методом в дозе 1000 ЛД50.
В таблице приведены иммуногенные свойства вирусвакцины против НБ для перорального применения.
Использование вирусвакцины против НБ птиц из штамма «Ла-Сота» для перорального применения обеспечивается за счет сохранения биологической активности, иммуногенности и эффективности метода вакцинации по сравнению с вирусвакциной из штамма «Ла-Сота» сухой (СТО 00495549-0015-2006), применяющейся аэрозольным, интраназальным и пероральным (выпойкой) методами. Однако выпаивание этой вирусвакцины с питьевой водой создает определенные практические трудности, что снижает качество и эффективность вакцинации.
Полученные данные свидетельствуют, что предлагаемый способ позволяет получить вакцину для оральной иммунизации птиц с высокой иммунологической эффективностью, устойчивой при хранении в условиях 4-6°С в течение 8 мес.
| Таблица 1 Биологическая активность вирусвакцины против НБ из штамма «Ла-Сота» для орального применения |
|||
| Активность исходной аллантоисной жидкости lg ЭИД50/см3 | Биологическая активность вирусвакцины, lg ЭИД50/г | ||
| Срок хранения, мес | Образцы | ||
| 1 | 2 | ||
| 10,5 | 0 | 10,0-10,25 | 10,5 |
| 1,5 | 10,0 | 10,25 | |
| 2 | 9,5-9,75 | 9,75 опыт на цыплятах | |
| 3 | 9,5 | 9,75 | |
| 6,0 | 9,5 опыт на цыплятах | 8,25 | |
| 7 | 9,5 | 8,0-8,25 | |
| 8 | 9,5 | 8,0 | |
| 13 | 8,5 | 7,0-7,5 |
Способ изготовления вирусвакцины против ньюкаслской болезни птиц, включающий выращивание вакцинного штамма вируса «Ла-Сота» на куриных эмбрионах, отличающийся тем, что крупу перловки, обработанную теплом, смешивают с аллантоисной жидкостью, содержащей вакцинный штамм «Ла-Сота» вируса ньюкаслской болезни птиц, пропитывают раствором стабилизатора в виде смеси 40%-ного пептона и 8%-ной лактозы, замораживают при минус 50±20°С в течение 8-10 ч и лиофилизируют в течение 30-32 ч.
