Вирус-вакцина против ньюкаслской болезни птиц

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вирусвакцина содержит антигенный материал из штамма Ла-Сота, репродуцированного в 9-10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 9,7 lg ЭИД₅₀/см³ и гемагглютинирующей активностью, по меньшей мере 1:512, защитную среду и адъювант тимоген в эффективных соотношениях. Защитная среда содержит 20% раствор гидролизата лактальбумина и обезжиренное молоко в соотношении 1:5. Вакцину получают путем смешивания входящих в ее состав ингредиентов с последующей лиофильной сушкой препарата. Готовая вакцина представляет собой сухую пористую массу светло-желтого цвета. Вакцину используют для специфической профилактики в неблагополучных и угрожаемых по данному заболеванию хозяйствах. Введение вакцины осуществляют спрей-методом. Доза введения 1 см³/гол. Изобретение расширяет арсенал вирусвакцин на основе штамма Ла-Сота, создающих напряженный и продолжительный иммунитет у привитой птицы против циркулирующего на территории России эпизоотического вируса ньюкаслской болезни птиц. 6 з.п. ф-лы, 8 табл.

 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к вакцинам против ньюкаслской болезни (НБ) птиц, и может быть использовано как в условиях промышленного птицеводства, так и в птицехозяйствах с малым поголовьем (фермерские хозяйства и декоративное птицеводство) для профилактики вышеуказанного заболевания.

Ньюкаслская болезнь (псевдочума птиц) - это наиболее распространенная высококонтагиозная вирусная инфекция домашней птицы, характеризующаяся пневмонией, энцефалитом, множественными почечными кровоизлияниями и поражением внутренних органов. Заболевание наносит громадный экономический ущерб птицеводству. Незаменимым средством предотвращения этой болезни является вакцинопрофилактика.

Для специфической профилактики псевдочумы птиц применяют вакцины двух типов: живые и инактивированные [1].

Наиболее широкое применение получили вирусвакцины из лентогенных штаммов Ла-Сота и Бор-74 ВГНКИ, которые выпаивают с водой, вводят интраназально или аэрозольно [2-11].

Однако известные вирусвакцины не в достаточной степени стимулируют необходимый уровень антител для создания напряженного иммунитета.

Установлено, что одним из усложняющих факторов при этом является наличие у вакцинируемых цыплят материнских антител, ингибирующих размножение вакцинного вируса в организме и тем самым препятствующих формированию напряженного иммунитета. Содержание материнских антител в различных партиях суточных цыплят существенно варьирует (от 1:2 до 1:128), а птица не в состоянии полностью реагировать на живые вакцины при титре материнских антител 1:8 и выше.

Если иммунизацию проводят в возрасте 1-3 недель, когда уровень материнских антител значительно снижен, вышеупомянутый вирусингибирующий эффект будет менее выраженным.

Однако при аэрозольной форме введения у цыплят, не имеющих материнских антител, может проявляться острая реакция на вакцинацию в виде респираторных симптомов (кашель, насморк, катар и т.д.).

Не исключено, что иммунизация цыплят старшего возраста активизирует латентные инфекции, подавляет рост цыплят, что при массовом разведении птицы может привести к существенным потерям. Кроме того, при таком способе иммунизации остаются без защиты цыплята первых дней жизни.

Известно одно из направлений повышения иммуногенной активности вакцинных препаратов, основанное на использовании в их составе адъювантов.

Адъюванты - это вещества, которые добавляют к антигену и которые неспецифически усиливают возникающий в результате введения антигена иммунный ответ. Стимулирующее действие адъювантов, разных по химическому строению, является результатом замедления гидролиза и пролонгирования действия антигена, более эффективного представления антигена иммунокомпетентным клеткам и интенсификации механизмов иммуногенеза (стимуляция макрофагов, Т- и В-лимфоцитов, усиление синтеза иммуноглобулинов).

Адъюванты стимулируют в первую очередь наиболее фундаментальные и универсальные механизмы неспецифической защиты организма, и на их основе формируется более продуктивная реакция эффективных иммунных систем на введенный антиген. Более высокий уровень функционирования неспецифических механизмов защиты трансформируется (под действием антигена) в более продуктивную реакцию специфической защиты [12].

Известна вирусвакцина против НБ птиц, содержащая антигенный материал из штамма Р/77/8 гомологичного вируса, защитную среду и фармацевтически приемлемый носитель в эффективном соотношении [13].

Известна вирусвакцина против НБ птиц, содержащая антигенный материал из штамма Ла-Сота гомологичного вируса, защитную среду и масляный адъювант в эффективном соотношении [14].

Известна вирусвакцина против НБ птиц, содержащая антигенный материал из штамма Ла-Сота гомологичного вируса, защитную среду и адъювант в эффективном соотношении [15].

Известна вирусвакцина против НБ птиц, содержащая антигенный материал из штамма АТСС №VK-2239 гомологичного вируса, защитную среду и адъювант в эффективном соотношении [16].

Известна вирусвакцина против НБ птиц, содержащая антигенный материал из штамма CNCM №1-781 гомологичного вируса, защитную среду и фармацевтически приемлемый носитель в эффективном соотношении [17].

Известна вирусвакцина против НБ птиц, содержащая антигенный материал из штамма Ла-Сота гомологичного вируса, защитную среду и адъювант на основе минерального или растительного масла в эффективном соотношении [18].

Известна вирусвакцина против НБ птиц, содержащая антигенный материал из штамма Hitchner B1 гомологичного вируса, защитную среду и фармацевтически приемлемый носитель в эффективном соотношении [19].

Известен также препарат тимоген, используемый в качестве средства для повышения роста и сохранности животных [20].

Тимоген - синтетический пептид тимуса глютамил-триптофан (C₁₆H₂ON₃O₅) - оказывает регулирующее влияние на реакции клеточного и гуморального иммунитета, стимулирует процессы регенерации в случае их угнетения и повышает резистентность организма [21].

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вирусвакцина против НБ птиц, содержащая антигенный материал из штамма Ла-Сота гомологичного вируса, защитную среду и адъювант на основе гидроокиси алюминия или фосфата алюминия, минерального или растительного масла в эффективном соотношении [22].

Основным недостатком вышеуказанных вакцин, в том числе и вирусвакцины-прототипа, является неизученность их эффективности в отношении российских эпизоотических изолятов вируса НБ, так как они никогда не применялись на территории Российской Федерации.

В задачу создания настоящего изобретения входило поиск новых адъювантов и разработка с их использованием вирусвакцины против НБ птиц на основе штамма Ла-Сота, создающей напряженный и длительный иммунитет у привитой птицы против циркулирующего на территории России эпизоотического вируса НБ.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вирусвакцин против НБ птиц на основе штамма Ла-Сота гомологичного вируса, создающих напряженный и продолжительный иммунитет у привитой птицы против циркулирующего на территории России эпизоотического вируса НБ птиц.

Указанный технический результат достигнут созданием вирусвакцины против НБ птиц, охарактеризованной следующей совокупностью признаков:

1. Вирусвакцина против НБ птиц.

2. Антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц.

3. Антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц, репродуцированного в чувствительной биологической системе.

4. Для репродукции вируса НБ птиц из штамма Ла-Сота используют 9-10-суточные эмбрионы SPF-кур.

5. Антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц, репродуцированного в 9-10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 9,7 Ig ЭИД₅₀/см³ и гемагглютинирующей активностью (ГА-активностью), по меньшей мере, 1:512, в эффективном количестве.

6. Антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц, репродуцированного в 9-10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 9,7 Ig ЭИД₅₀/см³ и ГА-активностью, по меньшей мере, 1:512, в количестве 49,9999999-49,99999 мас.%.

7. Защитная среда.

8. Защитная среда содержит 20% раствор гидролизата лактольбумина (ГЛА) и обезжиренное молоко в соотношении 1:5.

9. Защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА и обезжиренное молоко в соотношении 1:5, в эффективном количестве.

10. Защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА и обезжиренное молоко в соотношении 1:5, в количестве 50,0 мас.%.

11. Адъювант.

12. Тимоген в качестве адъюванта.

13. Тимоген в эффективном количестве.

14. Тимоген в количестве 0,0000001-0,00001 мас.%.

15. Антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц, репродуцированного в 9-10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 9,7 Ig ЭИД₅₀/см³ и ГА-активностью, по меньшей мере, 1:512, защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА и обезжиренное молоко в соотношении 1:5, и адъювант тимоген в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	49,9999999-49,99999
Защитная среда	50,0
Адъювант тимоген	0,0000001-0,00001.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вирусвакцина против НБ птиц.

2. Антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц, репродуцированного в 9-10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 9,7 Ig ЭИД₅₀/см³ и ГА-активностью, по меньшей мере, 1:512, в эффективном количестве.

3. Защитная среда в эффективном количестве.

4. Адъювант тимоген в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц, репродуцированного в 9-10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 9,7 Ig ЭИД₅₀/см³ и ГА-активностью, по меньшей мере, 1:512.

2. Антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц, репродуцированного в 9-10-суточных эмбрионах SPF-кур, с инфекционной активностью, по меньшей мере, 9,7 Ig ЭИД₅₀/см³ и ГА-активностью, по меньшей мере, 1:512, в количестве 49,9999999-49,99999 мас.%.

3. Защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА и обезжиренное молоко.

4. Защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА и обезжиренное молоко в соотношении 1:5.

5. Защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА и обезжиренное молоко в соотношении 1:5, в количестве 50,0 мас.%.

6. Тимоген в количестве 0,0000001-0,00001 мас.%.

7. Антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц, репродуцированного в 9-10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 9,7 Ig ЭИД₅₀/см³ и ГА-активностью, по меньшей мере, 1:512, защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА и обезжиренное молоко в соотношении 1:5, и адъювант тимоген в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	49,9999999-49,99999
Защитная среда	50,0
Адъювант тимоген	0,0000001-0,00001.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вирусвакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вирусвакцина против НБ птиц.

2. Антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц, репродуцированного в чувствительной биологической системе.

3. Защитная среда.

4. Адъювант.

По сравнению с вирусвакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемого изобретения является то, что в качестве адъюванта вирусвакцина содержит тимоген в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц, репродуцированного в 9-10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 9,7 Ig ЭИД₅₀/см³ и ГА-активностью, по меньшей мере, 1:512.

2. Антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц, репродуцированного в 9-10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 9,7 Ig ЭИД₅₀/см³ и ГА-активностью, по меньшей мере, 1:512, в количестве 49,9999999-49,99999 мас.%.

3. Защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА и обезжиренное молоко в соотношении 1:5.

4. Защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА и обезжиренное молоко в соотношении 1:5, в количестве 50 мас.%.

5. Тимоген в количестве 0,0000001-0,00001 мас.%.

6. Антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц, репродуцированного в 9-10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 9,7 Ig ЭИД₅₀/см³ и ГА-активностью, по меньшей мере, 1:512, защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА и обезжиренное молоко в соотношении 1:5, и адъювант тимоген в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	49,9999999-49,99999
Защитная среда	50,0
Адъювант тимоген	0,0000001-0,00001.

Предлагаемая вирусвакцина расширяет арсенал вакцинных препаратов против НБ птиц на основе штамма Ла-Сота, создающих напряженный и продолжительный иммунитет у привитой птицы против циркулирующего на территории России эпизоотического вируса НБ.

Достижение технического результата от использования предлагаемой вакцины объясняется тем, что она содержит в своем составе в качестве адъюванта тимоген в концентрации, обеспечивающей получение высокоиммуногенного и безвредного препарата.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности признаков аналога позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вирусвакцины, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое решение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" заявителем проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения.

Вирусвакцины против НБ птиц на основе штамма Ла-Сота известны. Сведения о них приведены в разделе "Уровень техники" описания данного изобретения. Существенным отличительным признаком предлагаемой вирусвакцины является тимоген, введенный в ее состав в эффективном количестве в качестве адъюванта.

Указанный признак является функционально самостоятельным.

Известно использование тимогена в качестве средства для повышения роста и сохранности животных [20].

Авторами предлагаемого изобретения обнаружено новое свойство тимогена в заявляемом диапазоне концентраций повышать уровень антител при его введении в составе вирусвакцины против НБ в организм птицы, обеспечивая ей напряженный и длительный иммунитет к данному заболеванию и оставаясь одновременно безвредным для привитой птицы.

Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с совокупностью отличительных признаков предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых совокупностью существенных признаков предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемая вирусвакцина соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Эффективность предлагаемой вирусвакцины пояснена примерами ее изготовления и использования, что не ограничивает объем изобретения.

Пример 1.

Для получения предлагаемой вакцины в качестве посевного вируса используют вируссодержащий материал из штамма Ла-Сота с титрами инфекционной и ГА-активности, по меньшей мере, 8,0 Ig ЭИД₅₀/см³ и 1:1024 соответственно. Разведением вируса с титром 4,5 Ig ЭИД₅₀/см³ заражают хорошо развитые 9-10-суточные эмбрионы SPF-кур. Эмбрионы инкубируют 96-120 часов при 36-37°С и относительной влажности 60-70%. Одновременно производят закладку незараженных эмбрионов из той же партии для контроля на присутствие гемадсорбирующих вирусов. Просмотр зараженных эмбрионов проводят один раз в сутки. Все эмбрионы, погибшие в период до 96 часов инкубации, выбраковывают.

Для изготовления серии вакцины используют только живые эмбрионы. Эмбриональную жидкость от каждых 20-30 эмбрионов собирают в стерильные флаконы вместимостью 200-500 см³. В стерильные флаконы перед сбором аллантоис-амниотической жидкости добавляют бензилпенициллина натриевую соль 200 ЕД/см³ и стрептомицина сульфат 200 мкг/см³. Контакт экстраэмбриональной жидкости с антибиотиками проводят в течение 2 часов при температуре 24±6°С.

Затем экстраэмбриональную жидкость центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10-15 минут для удаления эритроцитов. После центрифугирования вируссодержащий материал сливают в 15-20-литровые бутыли. Из каждой бутыли берут пробу в количестве 1,0 см³ для определения титра гемагглютинина и инфекционной активности вируса НБ.

Для изготовления вакцины используют стерильный антигенный материал с титрами ГА-активности, по меньшей мере, 1:512 и инфекционной активности, по меньшей мере, 9,7 Ig ЭИД₅₀/см³.

В полученный антигенный материал добавляют адъювант тимоген из расчета 0,1-10 мл 0,01% раствора на 1 литр вируссодержащей суспензии, которая тщательно перемешивается. В одной назальной дозе вакцины должно содержатся, по меньшей мере, 0,0001 мкг тимогена, что соответствует его содержанию в вакцине 0,0000001 мас.%.

Затем антигенный материал соединяют с защитной средой, содержащей 20% раствор ГЛА и обезжиренное молоко в соотношении 1:5. Антигенный материал соединяют с защитной средой в соотношении 1:1. Смесь тщательно перемешивают, фасуют в пенициллиновые флаконы и подвергают лиофильной сушке.

Готовая вакцина представляет собой сухую пористую массу светло-желтого цвета.

Полученная вакцина имеет оптимальный компонентный состав (рецептуру), мас.%:

Антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц,
репродуцированного в 9-10-суточных эмбрионах
SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей
мере, 9,7 Ig ЭИД50/см3 и ГА-активностью,
по меньшей мере, 1:512	49,9999999-49,99999
Защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА и
обезжиренное молоко в соотношении 1:5	50,0
Адъювант тимоген	0,0000001-0,00001,

Вакцина против НБ птиц живая сухая предназначена для специфической профилактики инфекции в неблагополучных и угрожаемых по данному заболеванию хозяйствах.

Перед употреблением вакцину растворяют водой или фосфатно-буферным раствором.

После этого определяют количество доз во флаконе. Одна прививная назальная доза содержит, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД₅₀/см³.

Введение вакцины осуществляют спрей-методом. Полученная вакцина устойчива при хранении.

Готовую вакцину контролируют по показателям, установленным техническими условиями.

Внешний вид и цвет препарата определяют визуально. Вакцина должна иметь вид пористой массы светло-желтого цвета.

Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТом 28085-89 "Препараты биологические. Методы биологического контроля стерильности".

Сущность метода заключается в том, что в посевах из образцов вакцины на питательные среды не должно быть роста бактериальной и грибковой микрофлоры.

Для определения безвредности препарата дозу вакцины в объеме 1,0 см³ вводят 10 цыплятам 20-суточного возраста внутримышечно в грудную мышцу. За птицей ведут наблюдение в течение 21 суток.

Вакцину считают безвредной, если все цыплята в течение 21 суток останутся живыми, без клинических признаков переболевания. При вскрытии птицы на месте введения вакцины не должно быть выраженной воспалительной реакции.

Для проверки антигенной активности вакцины формируют опытную и контрольную группы цыплят 12-14-суточного возраста по 10 голов в каждой.

Цыплятам опытной группы вводят вакцину в объеме 0,1 см³ интраназально. 10 интактных цыплят оставляют в качестве контроля.

Сыворотки крови получают от всех цыплят опытной и контрольной групп до вакцинации и через 21 сутки после прививки для выявления специфических антител. Для этого от каждой птицы из-под крыльцовой вены отбирают 2,5-3,0 см³ крови в отдельную пробирку. Сыворотку отделяют общепринятым методом. Затем сыворотку помещают в термостат или прогревают в водяной бане при 56°С в течение 30 минут для удаления термолабильных ингибиторов.

Оценку антигенной активности вакцины по компоненту НБ проводят в РТГА или в ИФА согласно наставлению по применению соответствующего набора.

Вакцина считается антигенно активной (иммуногенной), если через 21 сутки после вакцинации не менее чем у 80% привитых цыплят титр антител к вирусу НБ не ниже 3,0 log₂ в РТГА или не ниже, чем 1:500 в ИФА в одном разведении.

Вакцину фасуют по 4 см³ в стерильные флаконы, закрывают резиновыми пробками, закатывают алюминиевыми колпачками и этикетируют.

Пример 2.

Проведены испытания вирусвакцины против НБ птиц, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Вируссодержащий материал
из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц,
репродуцированного в 9-10-суточных эмбрионах
SPF-кур с инфекционной активностью 10,2 Ig ЭИД50/см3
и гемагглютинирующей активностью 1:512	49,999999
Защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА
и обезжиренное молоко в соотношении 1:5	50,0
Адъювант тимоген	0,000001.

В опыте использовали три группы цыплят по 15 голов в каждой в возрасте 14 суток. Первая и вторая группы - опытные, а третья служила контролем.

Первую группу цыплят иммунизировали коммерческой серией вирусвакцины против НБ из штамма Ла-Сота, изготовленной согласно ТУ 10-19-212-86, интраназально в дозе 6,7 Ig ЭИД₅₀/см³ на цыпленка. Вторую группу цыплят иммунизировали предлагаемой вакциной спрей-методом в дозе 1 см³/гол., содержащей адъювант тимоген в разведении 10^-4 (исходный препарат в виде 0,01% раствора), что соответствует его количеству 0,001 мкг в одной назальной дозе и 0,000001 мас.% содержанию тимогена в предлагаемой вакцине.

Через 14 суток от всех цыплят отбирали пробы крови и сыворотки исследовали в РТГА. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Согласно данным таблицы 1 средний титр антител у первой группы цыплят составил 5,2 log₂ через 21 сутки после вакцинации, средний титр антител во второй группе составил 6,5 log₂ через тот же срок после вакцинации. Средний титр антител во второй группе в 1,25 раза был выше, чем в первой группе.

Пример 3.

Проведены испытания вирусвакцины против НБ птиц, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Антигенный материал
из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц,
репродуцированного в 9-10-суточных
эмбрионах SPF-кур с инфекционной
активностью 10,2 Ig ЭИД50/см3 и
ГА-активностью 1:512	49,999999
Защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА
и обезжиренное молоко в соотношении 1:5	50,0
Адъювант тимоген	0,000001.

В опыте использовали 70 цыплят, в возрасте 17 дней. Цыплят разделили на 3 группы: контрольную в количестве 30 голов и 2 опытных по 20 голов в каждой. Предварительно определили фоновые показатели антигемагглютининов у 10 цыплят контрольной группы.

Иммунизацию птицы проводили по следующей схеме:

1) контрольной группе-плацебо (изотонический раствор хлорида натрия);

2) первую опытную группу прививали коммерческой серией вакцины в соответствии с наставлением по ее применению;

3) вторую опытную группу-предлагаемой вакциной спрей-методом в дозе 1 см³/гол., содержащей адъювант тимоген в разведении 10^-4 (исходный препарат в виде 0,01% раствора), что соответствует его количеству 0,001 мкг в одной назальной дозе и 0,000001 мас.% содержанию тимогена в предлагаемой вакцине.

Продолжительность опыта 28 дней. Напряженность иммунитета контролировали в РТГА, титры антигемагглютининов определяли на 7, 14, 21 и 28 день после вакцинации. Кровь отбирали у 5 цыплят из каждой группы методом декапитации. Наряду с этим определяли фагоцитарную активность псевдоэозинофилов, лейкограмму, НСТ-тест, Т- и В-лимфоциты.

Цыплята считались защищенными от заражения вирулентным штаммом вируса НБ, если титр антител в сыворотке крови в РТГА был равен или превышал 3,0 log₂. Результаты исследований представлены в таблице 2. Анализ приведенных в таблице 2 результатов свидетельствует о выраженном антителостимулирующем действии тимогена при его использовании в разведении 10^-4 в составе вирусвакцины из штамма Ла-Сота. Срок наблюдения - 28 дней.

Аналогичные результаты получены при тестировании естественной резистентности и клеточного звена иммунитета.

Пример 4.

Проведены испытания вирусвакцины против НБ птиц, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Антигенный материал
из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц,
репродуцированного в 9-10-суточных
эмбрионах SPF-кур с инфекционной
активностью 10,2 Ig ЭИД50/см3
и ГА-активностью 1:512	49,9999999
Защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА
и обезжиренное молоко в соотношении 1:5	50,0
Адъювант тимоген	0,0000001.

Исследования проведены так, как описано в примере 3. Отличие состоит в том, что вторую опытную группу цыплят иммунизировали предлагаемой вакциной спрей-методом в дозе 1 см³/гол., содержащей адъювант тимоген в разведении 10^-5 (исходный препарат в виде 0,01% раствора), что соответствует его количеству 0,0001 мкг в одной назальной дозе и 0,0000001 мас.% содержанию тимогена в предлагаемой вакцине.

Результаты исследований представлены в таблице 3.

Анализ приведенных в таблице 3 результатов свидетельствует о выраженном антителостимулирующем действии тимогена при его использовании в разведении 10^-5 в составе вирусвакцины из штамма Ла-Сота.

Аналогичные результаты получены при тестировании естественной резистентности и клеточного звена иммунитета.

Пример 5.

Проведены испытания вирусвакцины против НБ птиц, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Антигенный материал
из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц,
репродуцированного в 9-10-суточных
эмбрионах SPF-кур с инфекционной
активностью 9,7 Ig ЭИД50/см3
и ГА-активностью 1:512	49,99999
Защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА
и обезжиренное молоко в соотношении 1:5	50,0
Адъювант тимоген	0,00001.

В опытах использовали 40 цыплят в 18-дневном возрасте, которых разделили на 2 группы - контрольную и опытную (по 20 цыплят в каждой). Цыплят вакцинировали спрей-методом. Контрольную группу иммунизировали коммерческой серией вакцины из штамма Ла-Сота в соответствии с наставлением в дозе 1 см³, а цыплят опытной группы иммунизировали в той же дозе вакциной с тимогеном, взятым в разведении 10^-3 (исходный препарат в виде 0,01% раствора), что соответствует его количеству 0,01 мкг в одной назальной дозе и 0,00001 мас.% содержанию тимогена в предлагаемой вакцине.

Титр антигемагглютининов определяли в РТГА трехкратно с интервалом в 14 дней. При этом учитывали также степень защиты. РТГА ставили по общепринятой методике. За привитой птицей вели ежедневное наблюдение. Результаты испытаний представлены в таблице 4.

Представленные в таблице 4 данные свидетельствуют о выраженном антителостимулирующем действии адъюванта тимогена в составе вирусвакцины из штамма Ла-Сота. Титры антигемагглютининов и показатели уровня защиты в опытной группе более высокие, чем в контрольной.

Пример 6.

Проведены испытания вирусвакцины против НБ птиц, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Антигенный материал
из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц,
репродуцированного в 9-10-суточных
эмбрионах SPF-кур с инфекционной
активностью 9,7 Ig ЭИД50/см3
и ГА-активностью 1:512	49,999999
Защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА
и обезжиренное молоко в соотношении 1:5	50,0
Адъювант тимоген	0,000001.

Исследования провели так, как описано в примере 5. Отличие состоит в том, что адъювант тимоген использовали в составе вакцины в разведении 10^-4 (исходный препарат в виде 0,01% раствора), что соответствует его количеству 0,001 мкг в одной назальной дозе и 0,000001 мас.% содержанию тимогена в предлагаемой вакцине.

Результаты исследований приведены в таблице 5.

Представленные в таблице 5 данные свидетельствуют о выраженном антителостимулирующем действии тимогена в составе вирусвакцины из штамма Ла-Сота. Титры антигемагглютининов и показатели уровня защиты в опытной группе более высокие, чем в контрольной.

Пример 7.

Проведены испытания вирусвакцины против НБ птиц, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Антигенный материал
из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц,
репродуцированного в 9-10-суточных
эмбрионах SPF-кур с инфекционной
активностью 9,7 Ig ЭИД50/см3
и ГА-активностью 1:512	49,9999999
Защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА
и обезжиренное молоко в соотношении 1:5	50,0
Адъювант тимоген	0,0000001.

Исследования провели так, как описано в примере 5. Отличие состоит в том, что адъювант тимоген использовали в составе вакцины в разведении 10^-5 (исходный препарат в виде 0,01% раствора), что соответствует его количеству 0,0001 мкг в одной назальной дозе и 0,0000001 мас.% содержанию тимогена в предлагаемой вакцине.

Результаты исследований приведены в таблице 6.

Представленные в таблице 6 данные свидетельствуют о выраженном антителостимулирующем действии тимогена в составе вирусвакцины из штамма Ла-Сота. Титры антигемагглютининов и показатели уровня защиты в опытной группе более высокие, чем в контрольной.

Пример 8.

Проведены испытания вирусвакцины против НБ птиц, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Антигенный материал
из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц,
репродуцированного в 9-10-суточных
эмбрионах SPF-кур с инфекционной
активностью 10,0 Ig ЭИД50/см3
и ГА-активностью 1:512	49,99999
Защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА
и обезжиренное молоко в соотношении 1:5	50,0
Адъювант тимоген	0,00001.

В опытах использовали 20 цыплят в 18-дневном возрасте, которых разделили на 2 группы - контрольную и опытную (по 10 цыплят в каждой). Цыплят контрольной группы иммунизировали коммерческой серией вакцины из штамма Ла-Сота в соответствии с наставлением по ее применению, а цыплят опытной группы иммунизировали предлагаемой вирусвакциной из штамма Ла-Сота в сочетании с тимогеном, в качестве адъюванта, при этом тимоген использовали в разведении 10^-3 (исходный препарат в виде 0,01% раствора), что соответствует его количеству 0,01 мкг в одной назальной дозе и 0,00001 мас.% содержанию тимогена в предлагаемой вакцине. Доза введения 1 см³/гол. Метод введения - спрей-метод. Титр антигемагглютининов определяли двухкратно с интервалом в 14 дней. Результаты учитывали по титру антигемагглютининов. Реакцию задержки гемагглютинации (РЗГА) ставили общепринятым методом. Результаты испытаний представлены в таблице 7.

Приведенные в таблице 7 данные свидетельствуют о выраженном антителостимулирующем действии адъюванта тимогена в составе вирусвакцины из штамма Ла-Сота. В опытной группе по сравнению с контролем обеспечивается более длительная циркуляция антител в высоких титрах (в течение 30 дней - срок наблюдения).

Пример 9.

Проведены испытания вирусвакцины против НБ птиц, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Антигенный материал
из штамма Ла-Сота вируса НБ птиц,
репродуцированного в 9-10-суточных
эмбрионах SPF-кур с инфекционной
активностью 10,0 Ig ЭИД50/см3
и ГА-активностью 1:512	49,99999
Защитная среда, содержащая 20% раствор ГЛА
и обезжиренное молоко в соотношении 1:5	50,0
Адъювант тимоген	0,00001

Исследования провели так, как описано в примере 8. Отличие состоит в том, что адъювант тимоген использовали в составе предлагаемой вакцины в разведении 10^-4 (исходный препарат в виде 0,01% раствора), что соответствует его количеству 0,001 мкг в одной назальной дозе и 0,00001 мас.% содержанию тимогена в предлагаемой вакцине.

Результаты исследований приведены в таблице 8.

Представленные в таблице 8 данные свидетельствуют о выраженном антителостимулирующем действии адъюванта тимогена в составе вирусвакцины из штамма Ла-Сота. В опытной группе по сравнению с контролем обеспечивается более длительная циркуляция антител в высоких титрах (в течение 30 дней - срок наблюдения).

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- вирусвакцина против НБ птиц, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью приведенных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- при использовании предлагаемой вирусвакцины против НБ птиц достигается технический результат, предусмотренный задачей создания изобретения и заключающийся в расширении арсенала вирусвакцин против НБ птиц на основе штамма Ла-Сота гомологичного вируса, создающих напряженный и продолжительный иммунитет у привитой птицы против циркулирующего на территории России эпизоотического вируса НБ птиц. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Таблица 1 Результаты проверки антигенных свойств вирусвакцины против ньюкаслской болезни птиц с адъювантом тимогеном
Группа цыплят	Титры антител в РТГА через 21 сутки после вакцинации, в log2
Группа 1 (цыплята, иммунизированные вакциной без тимогена)	5, 5, 6, 4, 5, 6, 6, 5, 4, 4, 6, 6, 5, 6, 5
Группа 2 (цыплята, иммунизированные вакциной с тимогеном)	6, 6, 7, 8, 7, 6, 7, 7, 5, 6, 7, 7, 6, 7, 6
Контрольные (невакцинированные цыплята)	2, 1, 2, 2, 2, 1, 2, 2, 1, 2, 1, 2, 1, 2, 1

Таблица 4 Динамика антителообразования и степень защиты у молодняка кур при иммунизации вакциной из штамма Ла-Сота в сочетании с адъювантом тимогеном
Возраст птицы, (дни)	Группы
контрольная	опытная
32
46
60
Примечание: числитель - титр антигемагглютининов (log2); знаменатель - степень защиты (%).

Таблица 5 Динамика антителообразования и степень защиты у молодняка кур при иммунизации вакциной из штамма Ла-Сота в сочетании с адъювантом тимогеном
Возраст птицы, (дни)	Группы
контрольная	опытная
32
46
60
Примечание: числитель - титр антигемагглютининов (log2); знаменатель - степень защиты (%).

Таблица 6 Динамика антителообразования и степень защиты у молодняка кур при иммунизации вакциной из штамма Ла-Сота в сочетании с адъювантом тимогеном
Возраст птицы, (дни)	Группы
контрольная	опытная
32
46
60
Примечание: числитель - титр антигемагглютининов (log2); знаменатель - степень защиты (%).

Источники информации

1. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998. - С.214-233.

2. Авт. свид. СССР №132771; 30 h, 6; 1960 г.

3. Авт. свид. СССР №177042; 30 h, 6; 01.12.65 г.

4. Инструкция по изготовлению и контролю сухой вирусвакцины против псевдочумы птиц из штамма В₁. Утверждена ГУВ МСХ СССР 10.09.73 г.

5. Инструкция по изготовлению и контролю сухой вирусвакцины против псевдочумы птиц из штамма Ла-Сота. Утверждена ГУВ МСХ СССР 10.09.73 г.

6. Авт. свид. СССР №826584, А 61 К 39/17, С 12 N 7/00, 07.11.82 г.

7. Авт. свид. СССР №1124585, А 61 К 39/17, 1984 г.

8. Авт. свид. СССР №1212045, А 61 К 39/12, С 12 N 7/00, 1990 г.

9. Авт.свид. СССР №1785098, А 61 К 39/17, 09.08.95 г.

10. Патент РФ №2035917, А 61 К 39/17, 27.05.95 г.

11. Патент РФ №2122429, А 61 К 39/17, 27.11.98 г.

12. Сергеев В.А. Вирусные вакцины. Киев: Урожай, 1993. - С.158-172.

13. Патент США №4235876, А 61 К 39/12, С 12 К 7/00, 25.11.80 г.

14. Патент Франции №2577139, А 61 К 39/00, 39/17, 39/102, 39/10, 39/07, 14.08.86 г.

15. Патент США №4824668, А 61 К 35/75, 25.04.89 г.

16. Патент США №5118502, А 61 К 39/12, С 12 N 7/00, 02.06.92 г.

17. Патент США №5149530, А 61 К 39/12, С 12 N 7/00, 22.09.92 г.

18. Патент США №5152981, А 61 К 39/12, 39/00, 06.10.92 г.

19. Патент США №5250298, А 61 К 39/12, 05.10.93 г.

20. Патент РФ №2111756, А 61 К 35/55, 38/05, 27.05.98 г.

21. Наставление по применению раствора тимогена 0,01% для ветеринарии. Утверждено ГУВ МСХ СССР 13.09.1991 г.

22. Патент США №5733556, А 61 К 39/17, 31.03.98 г. (прототип).

1. Вирус-вакцина против ньюкаслской болезни птиц, содержащая антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса ньюкаслской болезни, репродуцированного в чувствительной биологической системе, защитную среду и адъювант, отличающаяся тем, что в качестве адъюванта она содержит тимоген в эффективном количестве.

2. Вирус-вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса ньюкаслской болезни, репродуцированного в 9-10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 9,7 lg ЭИД₅₀/см³ и гемагглютинирующей активностью, по меньшей мере, 1:512.

3. Вирус-вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса ньюкаслской болезни в количестве 49,9999999-49,99999 мас.%.

4. Вирус-вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит защитную среду, содержащую 20%-ный раствор гидролиза лактальбумина и обезжиренное молоко в соотношении 1:5.

5. Вирус-вакцина по п.4, отличающаяся тем, что она содержит защитную среду в количестве 50,0 мас.%.

6. Вирус-вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит тимоген в количестве 0,0000001-0,00001 мас.%.

7. Вирус-вакцина по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что она содержит антигенный материал из штамма Ла-Сота вируса ньюкаслской болезни, защитную среду и адъювант тимоген в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	49,9999999-49,99999
Защитная среда	50,0
Тимоген	0,0000001-0,00001