Способ вскармливания улучшенным грудным молоком для снижения риска возникновения аллергии

Отбирают штаммы Lactobacillus, способные повышать уровень IL-10 и одновременно снижать уровень TGF-бета-2 в женском грудном молоке, и применяют их и продукты, содержащие клетки отобранных штаммов, для улучшения женского молока для вскармливания младенцев. Отобранные штаммы и продукты, содержащие клетки отобранных штаммов, применяют для повышения уровней противовоспалительного цитокина IL-10 в женском грудном молоке и сокращения риска развития аллергии впоследствии у вскармливаемого младенца, повышения противовоспалительной активности женского грудного молока и одновременно сокращения причинных факторов. Это обеспечивает снижение уровня TGF-бета-2 в молоке, что приводит к снижению риска развития мастита у кормящей матери. 10 н. и 18 з.п. ф-лы, 1 ил.

 

Уровень техники, предшествующий изобретению

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к селекции и применению молочнокислых бактерий, улучшающих грудное молоко для вскармливания младенцев.

Описание предшествующего уровня техники

Согласно "гигиенической" теории возникновения аллергических заболеваний, изменение окружающей среды в индустриально развитом мире приводит к сокращению контакта с микроорганизмами в раннем возрасте, что, таким образом, приводит к росту эпидемии аллергических заболеваний, таких как атопическая экзема, аллергический конъюнктивит и астма. Одним из таких обсуждаемых изменений окружающей среды является изменение состава перорально поступающих различных природных видов микробов, связанное с повышением качества гигиены, стандартов жизни, привычек питания и тому подобное. Это привело к изменениям состава естественной микрофлоры пищеварительного тракта (Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2001; 108: 516-520), а также к изменению состава грудного молока кормящей женщины. Такие изменения связаны с широким распространением различных видов аллергий. Также сообщалось, что у грудных детей, родившихся последними в больших семьях, снижен риск возникновения аллергии по сравнению с их родными братьями и сестрами, которые родились раньше (с первыми детьми). Из этого можно сделать вывод, что грудное молоко матери «улучшается» с увеличением числа беременностей.

Человеческое грудное молоко содержит множество компонентов, важных для иммунной системы, таких как макрофаги, иммуноглобулины или антимикробные белки, которые, как считается, защищают от инфекций и воспаления желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей детей, вскормленных грудным молоком. Кроме того, было указано на присутствие других потенциально иммуномоделирующих факторов (например, олигосахаридных комплексов, факторов роста, ферментов, гормонов или цитокинов). Эти полезные свойства совместно с высокой доступностью питательных веществ и низким содержанием антигенов в человеческом молоке являются физиологической основой современных рекомендаций по кормлению детей грудным молоком, являющимся для них лучшей пищей, по мнению специалистов педиатрии, особенно в семьях, имеющих аллергические заболевания в анамнезе.

Таким образом, известно, что грудное молоко содержит ряд цитокинов и хемокинов, что потенциально может повлиять на развитие аллергии у грудных детей. Ранее сообщалось, что компоненты, модулирующие аллергические реакции, такие как цитокины, хемокины и фактор адгезии, вырабатываются в молоке на различных стадиях лактации (S. Rudloff et al., Allergy 1999, 54, 206-211). Цитокины или хемокины могут оказывать как положительное, так и отрицательное воздействие на детей, вскармливаемых грудным молоком.

Также известно, что цитокины в грудном молоке животных способны сохраниться после прохождения через желудочно-кишечный тракт детеныша. Например, мыши с выключенным TGF бета-1 умирают от распространенных воспалительных заболеваний после прекращения вскармливания материнским молоком, предположительно защищаясь от инфекции до момента прекращения вскармливания материнским молоком вследствие переноса материнским молоком трансформирующего фактора роста (Kulcarni AB et al., Am J Pathology 1993; 143, 3-9). TGF-бета сохраняется при прохождении всей толстой кишки. IL-10, вероятно, также сохраняется на этом пути, и, таким образом, доставка грудным молоком позволяет IL-10 достичь желудочно-кишечного тракта и потенциально оказывать положительное противовоспалительное воздействие.

Кроме того, Hawkes JS et al. (Lipids 2001 Oct 36:1179-81) сообщают, что длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты связаны с аспектами иммунной регуляции, включающей продукцию цитокинов. Целью этого исследования было изучение воздействия диетических пищевых добавок, принимаемых матерью с маслом тунца, богатым докозагексаеновой кислотой (DHA) на концентрацию трансформирующего фактора роста бета-1 (TGF-бета-1) и TGF-бета-2 в грудном молоке. В этом исследовании по изменению диеты случайно выбранные матери детей грудного возраста ежедневно употребляли пищевую добавку в количестве, равном 2000 мг масла, содержащего 300 мг DHA (n=40), или 600 мг DHA (n=40) наряду с плацебо (n=40). Количественный показатель DHA в молоке и плазме возрастал пропорционально количественному показателю DHA в рационе. Не было обнаружено взаимосвязи между статусом DHA в молоке и уровнями TGF-бета-1 и TGF-бета-2.

Документально подтверждено и общепризнано, что IL-10 является противовоспалительным цитокином. Предположительно, что IL-10 будет оказывать противовоспалительное воздействие в желудочно-кишечном тракте грудного ребенка. Грудное молоко является очень хорошим продуктом для грудного ребенка, как правило считается, что оно оказывает противовоспалительное действие на грудного ребенка в том смысле, что ребенок не слишком остро реагирует на патогены/инфекции, которые возникают в его желудочно-кишечном тракте в ранний период жизни. Кроме того, данные, полученные на животных, показывают возможное положительное влияние на потомство IL-10 в молоке. Группа австралийских ученых наблюдала и исследовала на животной модели пробы на аллергическую реакцию к клещам. Животные, которые показывали негативную реакцию на инъекционную кожную пробу к клещам (SPT), продуцировали IL-10 и IL-4, IL-10 понижает IgE (аллергическую реакцию), и аллергической реакции у животных не наблюдается. SPT+ve (гистамин) на аллергию показали, что животные продуцировали только IL-4 и не продуцировали IL-10. Таким образом, IgE не снижался, имела место аллергия. Таким образом, IL-10 снижает воздействие IgE, стимулирующее аллергию, и может предотвратить развитие аллергии.

TGF-бета-2 (трансформирующий фактор роста) также является фактором роста/цитокином, документально подтвержденным. Его источником являются, например, тромбоциты, которые вырабатывают TGF-бета в количестве, измеряемом в миллиграммах/килограмм. Фактор и его изоформы (см. ниже) также могут быть выделены из различных тканей (микрограмм TGF/кг) и были обнаружены преимущественно в тканях селезенки и костных тканях. В человеческом молоке также содержится этот фактор и его также синтезируют, например, макрофаги (TGF-бета-1), лимфоциты (TGF-бета-1), эндотелиальные клетки (TGF-бета-1), кератиноциты (TGF-бета-2), зернистые клетки (TGF-бета-2), хондроциты (TGF-бета-1), глиобластомные клетки (TGF-бета-2), лейкозные клетки (TGF-бета-1).

В зависимости от типа клетки и условий секреция TGF-бета может быть индуцирована множеством различных стимулов, включая стероиды, ретиноиды, EGF (эпидермальный фактор роста), NGF, активаторы лимфоцитов, витамин D3 и IL1. Синтез TGF-бета может быть ингибирован EGF, FGF (фактор роста фибробластов), дексаметазоном, кальцием, ретиноидами и фолликуло-стимулирующим гормоном. Также TGF-бета оказывает влияние на экспрессию своего собственного гена, и это может быть важно для заживления мелких ран. TGF-бета существует в по крайней мере пяти изоформах, известных как TGF-бета-1, TGF-бета-2, TGF-бета-3, TGF-бета-4, TGF-бета-5, что не относится к TGF-альфа. Аминокислотные последовательности этих изоформ демонстрируют гомологию порядка 70-80%. TGF-бета-1 является превалирующей формой и находится почти повсеместно, тогда как другие изоформы экспрессируются в более ограниченном спектре клеток и тканей. Изоформы, выделенные из различных образцов, сохранились эволюционно близко и имеют последовательности, идентичные примерно на 98%. TGF-бета-1 взрослого человека, свиньи, обезьяны и коровы идентичны и отличаются от TGF-бета-1 мыши одним единственным аминокислотным положением. TGF-бета-1 человека и курицы также идентичны.

Кроме того, сообщалось, что члены семейства трансформирующего фактора роста бета (TGF-бета) являются плеотропными цитокинами с ключевой ролью в морфогенезе ткани и росте (Ingman WV, Bioessays 2002 Oct 24:904-14). TGF-бета-1, TGF-бета-2 и TGF-бета-3 широко распространены в репродуктивных тканях млекопитающих, где продолжают развиваться и циклически ремоделироваться в постнатальный и взрослый периоды жизни. Была установлена возможная роль TGF-бета в развитии половой железы и вторичного полового органа, сперматозоидов и овариальной функции, иммунорегуляции беременности, эмбриональной имплантации и развитии плаценты.

В Rautava et al. in Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 38:378-388, April 2004, указано, что TGF-бета-2 и IL-10, по-видимому, функционируют в синергетическом режиме, TGF-бета-2 способствует продукции IL10.

Мастит является воспалением груди, которое часто характеризуется болезненностью и эритемой, а иногда повышением температуры и связано с TGF-бета-2. При мастите обнаруживаются плотные соединения альвеолярных клеток молочной железы, и этот процесс сопровождается повышением количества натрия, воспалительных клеток и воспалительных и иммунологических медиаторов в грудном молоке. Обычно мастит является односторонним с большой частотой заболевания в первые несколько недель грудного вскармливания. В индустриально развитых странах мастит обычно возникает редко, часто женщины с этим заболеванием лечатся акушерками и младшими медицинскими сестрами. Оказалось, что мастит более распространен, чем считалось ранее, как показало долгосрочное исследование, которое было проведено среди кормящих женщин в США, Финляндии и Австралии (Semba R., Вnnals of New York Academy of Sciences. November 2000; 918:156-62), в котором сообщается, что у 20-33% женщин могло развиться клиническое проявление мастита. Соответственно, число женщин со слабым клиническим проявлением мастита оказалось больше.

Кроме того, недавно была обнаружена связь мастита с высоким содержанием вируса иммунодефицита человека (HIV) в грудном молоке и с высоким риском передачи матерью ребенку HIV. (Semba, R.D., N. Kumwenda, T.E. Taha, et al. 1999. Mastits and immunological factors in breast milk of human immunodeficiency virus-infected women. J. Hum. Lact. 15(4):301-306).

TGF-бета-2 в грудном молоке имеет эпителиальное происхождение, даже если он синтезирован другими клетками, включая В- и Т-клетки. Соответственно, возросший уровень TGF-бета-2 может быть показателем воспаления груди со слабым клиническим проявлением. Соотношение натрия и калия в грудном молоке (соотношение Na/K) считается прогностическим фактором инфекции и воспалением груди со слабым клиническим проявлением.

Также, Kalliomaki et al. in J. Allergy Clin Immunol. 1999 Dec; 104(6):1251-7, сообщают, что TGF-бета в молозиве может предотвратить развитие аллергических заболеваний при вскармливании только одним молоком и стимулировать продукцию специфического IgA у людей, которые подвергались исследованию.

Кроме того, различные участки человеческого тела и других млекопитающих заселены большим количеством различных видов бактерий, включая большое число различных видов Lactobacillus. Такие бактерии могут долгое время сосуществовать с их хозяином, давая разнообразный синергетический положительный эффект, в настоящее время также известны как отдельные, так и находящиеся под воздействием друг друга активные штаммы бактерий. Различные штаммы молочнокислых бактерий, например L.reuteri SD2112, или имеют специфические антигены на поверхности, или выделяются бактериями в желудочно-кишечный тракт матери. Данные в Valeur еt al., AEM, 70, 1176-1181 (2004) демонстрируют в качестве одного из примеров, что принятые внутрь L.reuteri SD2112 могут влиять на уровни CD4+ хелперных T-клеток в кишечнике здорового человека. Такие исследования также были проведены у других видов млекопитающих и птиц и указывают на то, что это может быть фундаментальная сигнальная система между кишечной флорой и организмом «хозяина». Через так называемую энтеромаммарную связь антигены из активных штаммов активно переносятся в область лимфатических узлов, например пейеровы бляшки под эпителием желудочно-кишечного тракта. Затем активируются антиген-специфические В-клетки, после чего они мигрируют из эпителия желудочно-кишечного тракта при кровообращении к мембранам других слизистых оболочек в теле, включая слюнные и молочные железы. Считается, что экспрессия специфических молекул к этим клеткам происходит по направлению их адгезии к этим тканям. В молочной железе эти иммунные клетки сразу же руководят другими процессами определения уровней локально продуцируемых цитокинов. Этот тип подачи сигнала через энтеромаммарную связь был продемонстрирован при выработке секреторного IgA в грудном молоке и также с высокой степенью вероятности применяется при продуцировании цитокина.

Ранее считалось (Laiho et al., Pediatric Research 53:642-647, 2003), что полученные в результате наблюдений научные данные показывают взаимосвязь между питательными и воспалительными факторами в грудном молоке, демонстрируя, что возможно оказывать влияние на иммунологические свойства грудного молока посредством вмешательства в диету матери. Они же отмечают, что матери с аллергическим заболеванием имели более низкую концентрацию TGF-бета-2 в грудном молоке по сравнению с теми, кто не имел аллергических заболеваний. У них (в руках) был определен IL-10 только при низких уровнях в грудном молоке, как и следовало ожидать, никакой разницы между матерями с аллергическим заболеванием и без него выявлено не было. Считалось, что защита от аллергического заболевания происходила главным образом посредством индукции оральной толерантности к TGF-бета-2 и IL-10 и что, в частности, TGF-бета-2 грудного молока может играть ключевую роль в предупреждении аллергического заболевания. Однако Weiner H. сообщает в Microbes and Infection, Volume 3, Issue 11, September 2001, pages 947-954, что из-за того, что регуляторные Т-клетки, которые генерированы орально вводимым антигеном, являются тригерными в отношении по антиген-специфической форме, но подавляются по антиген-неспецифической форме, они являются посредниками неспецифического подавления (опосредуют неспецифическое подавление), когда они встречаются со зрелым антигеном на целевом органе (органе-мишени). Таким образом, толерантность слизистой оболочки может быть использована для лечения воспалительных процессов, не аутоиммунных по своей природе.

Различные виды Lactobacillus, включая Lactobacillus reuteri, были использованы в так называемых пробиотических лекарственных композициях с живыми и полезными микроорганизмами, предназначенных для применения у животных, включая людей. Lactobacillus reuteri является одним из естественных микроорганизмов, обитающих в желудочно-кишечном тракте животных, и регулярно обнаруживаются в кишечнике и изредка в родовых путях, грудном молоке и ротовой полости здоровых животных, включая людей. Известно, что они обладают антибактериальной активностью. Смотрите, например, патенты США 5439678, 5458857, 5534253, 5837238 и 5849289. Если клетки L.reuteri выращивали в анаэробных условиях в присутствии глицерина, тогда они продуцировали антимикробное вещество, известное как реутерин (reuterin) (β-гидрокси-пропиональдегид).

Также ранее сообщалось, что кисломолочные бактерии использовались для предупреждения и лечения различных видов аллергий, примерами могут служить следующие патенты/патентные заявки: ЕР 1239032 Standler et al, касающаяся новых рекомбинантных штаммов, WO 01/37865 Clancy et al., касающаяся уменьшения количества IgE посредством лактобацилл.

Кроме того, объектом настоящего изобретения является способ снабжения отобранными молочнокислыми бактериями и их компонентами при вскармливании младенцев улучшенным грудным молоком и способ такого отбора. А именно, объект настоящего изобретения направлен на повышение уровней противовоспалительного цитокина IL-10 в молоке с одновременным снижением риска развития аллергии у вскармливаемого младенца, и одновременно, сокращением причинных факторов, и, таким образом, количества TGF-бета-2 в молоке и риска развития мастита у кормящей матери.

Кроме того, один из объектов настоящего изобретения направлен на компенсацию негативных изменений в микрофлоре путем применения специально отобранных штаммов молочнокислых бактерий для матери перед и во время периода кормления грудью.

Другим объектом настоящего изобретения является отбор с применением описанного здесь способа или подобного способа, отличающегося специфическим воздействием цитокина тестируемых штаммов на виды компетентных клеток и применением таких определенных штаммов молочнокислых бактерий в качестве диетических компонентов питания матери, что одновременно стимулирует повышение продуцирования IL-10 в грудном молоке и в то же самое время сокращает уровень TGF-бета-2, указывая на снижение уровня клинически слабовыраженных воспалений молочной железы и других тканей и, кроме того, сокращая риск мастита. Считается, что мастит и мастит со слабовыраженным клиническим проявлением препятствует грудному вскармливанию, таким образом, лишая грудного ребенка полезного для него грудного молока, лактобациллы, отобранные способом по настоящему изобретению, кроме того, могут улучшить состояние здоровья матери, что позволит вскармливать молоком в течение более длительного времени.

Другим объектом настоящего изобретения является получение продуктов, содержащих указанные штаммы, мутанты, метаболиты или их компоненты, включая агентов для введения животным, в том числе людям.

Другие объекты и преимущества будут более полно видны в следующем описании и формуле изобретения.

Краткое описание изобретения

В объем настоящего изобретения включены штаммы Lactobacillus и их компоненты, которые отобраны благодаря их способности улучшать грудное молоко для вскармливания младенцев, а именно повышать уровни противовоспалительного цитокина IL-10 в молоке для снижения риска развития аллергии у вскармливаемого младенца, в то же самое время сокращая причинные факторы и, таким образом, количество TGF-бета-2 в молоке и риск развития мастита у кормящей матери, и, кроме того, усиливая способность продуцировать грудное молоко и предоставляя глобальную защиту и оптимальный рост ребенку. Настоящее изобретение также включает способ отбора таких штаммов Lactobacillus. Также настоящее изобретение включает новый способ защиты жизнеспособных Lactobacillus в выработанном в виде масляной смеси продукте как способе доставки активного компонента.

Другие объекты и признаки настоящего изобретения будут более полно видны в следующем описании и формуле изобретения.

Краткое описание чертежей

На чертеже показана технологическая схема производственного процесса, которая может быть использована для получения продукта по настоящему изобретению.

Детальное описание настоящего изобретения и предпочтительных вариантов его воплощения

Настоящее изобретение направлено на продукт, улучшающий грудное молоко для вскармливания младенцев, а именно повышающий уровень противовоспалительного цитокина IL-10 в молоке и сокращающий риск развития аллергий у вскармливаемого младенца, и одновременно сокращающий причинные факторы, которые приводят в действие механизм продуцирования веществ клеточной сигнализации (TGF), и, кроме того, количество TGF-бета-2 в молоке, таким образом, в результате, сокращается риск развития мастита у кормящей матери. Уменьшение TGF-бета-2 по настоящему изобретению рассматривается как противовоспалительное воздействие, оказываемое потребляемыми отобранными молочнокислыми бактериями, что способствует сокращению области распространения слабовыраженных клинических проявлениях мастита в группе кормящих матерей, которые в последнее время ежедневно принимали бактерии. Примером штамма, отобранного по настоящему изобретению, является L.reuteri SD2112 (АТСС 55730).

В клинических испытаниях, проводимых по настоящему изобретению, анализировали три фактора, связанных с уровнем IL-10 в молозиве матерей: а) прием внутрь отобранных молочнокислых бактерий или отсутствие такового, b) количество детей, рожденных матерью до данного ребенка, и с) число предшествующих беременностей. Таким образом, чем большее число детей или беременностей имела мать, тем выше был уровень IL-10 в молозиве. Прием внутрь специально отобранных молочнокислых бактерий беременными матерями за 4 недели до родов также повышал IL-10 в молозиве при отсутствии более ранних беременностей, обуславливающих подобный уровень.

Также известно, что в некоторых ситуациях повышенная системная экспрессия IL-10 предупреждает диабет первого типа, кроме того, штаммы, отобранные по настоящему изобретению, также могут быть полезны для этой цели.

В примененном здесь способе отбора лучшие штаммы, индуцирующие IL-10 в грудном молоке и демонстрирующие снижение уровня TGF-бета-2, были отобраны с использованием мыши в качестве модели и традиционными аналитическими методами. Также были использованы другие аналогичные методы для определения продуцирования цитокина в молоке. Детали будут разъяснены на более конкретных примерах. Продукт по настоящему изобретению предпочтительно содержит живые клетки отобранного штамма(ов); однако выделенные метаболиты или их фрагменты таких клеток являются ответственными за активность живых клеток штамма(ов), продукты по настоящему изобретению могут включать такие метаболиты или их фрагменты наряду или вместо живых клеток. Продуктом по настоящему изобретению может быть любой продукт, потребляемый женщинами, такой как масляно-капельный продукт, таблетки, капсулы, пудра-саше и подобные им. Продукты, используемые по настоящему изобретению, включают масляно-капельную форму (Пример 3), которая помогает удерживать стабильную активность ингредиентов в течение длительного времени. Клетки Lactobacillus были включены в рецептуру капельно-масляного продукта для улучшения стабильности бактерий, см., например, патент США № 4518696 Gehram et al. Но ни один существующий состав молочнокислых бактерий в маслах и жирах, которые мы обнаружили, не содержит важного этапа сушки масла посредством вакуума перед введением бактериальных культур для повышения их стабильности, как описано здесь в примерах.

Концентрация отобранных клеток Lactobacillus, необходимая для эффективности продукта по настоящему изобретению, зависит от типа пищевого продукта и количества пищевого продукта, принятого внутрь (или времени использования во рту непищевого продукта для лечебно-профилактического ухода за зубами), но предпочтительно эквивалентна приблизительно 10⁵-10⁸ КОЕ (колониеобразующих единиц) для дневного приема продукта. Возможно использование в количестве до приблизительно 10¹⁰-10¹¹ КОЕ, которое может быть применено для повышения эффективности без неблагоприятного воздействия на органолептические характеристики продукта (его вкус и запах). При этом продукт является йогуртом или другим молочнокислым ферментированным продуктом, штамм(ы), использованные для получения ферментированного кисломолочного продукта предпочтительно являются стандартными культурами (например, в йогурте S.thermophilus и L.bulgaricus). Важно, что отобранный активный штамм обладает желаемым воздействием на выработку цитокина по настоящему изобретению и совместим со стандартными культурами, использованными для получения продукта, таким образом, важными свойствами каждого использованного штамма является отсутствие негативного воздействия на другой штамм(ы). Это может быть легко определено с использованием скринингтестов, известных из предшествующего уровня техники. Штаммы, использованные по настоящему изобретению, могут быть введены как до, так и после ферментации продукта при уровне, эквивалентном приблизительно 10⁶-10⁸ КОЕ для дневного потребления йогурта или более, как было приведено выше.

Предпочтительно продукт по настоящему изобретению не содержит другие антибактериальные компоненты, по крайней мере, ни одного, который ингибирует или убивает отобранный штамм(ы) Lactobacillus, или метаболиты, или их компоненты, или мешает проявлению активности.

Штамм(ы) Lactobacillus или метаболиты, или их компоненты могут быть дополнительно смешаны с ингредиентами способами, известными из предшествующего уровня техники для получения продуктов такого типа. В случае использования клеток, если способ получения отобранного пищевого продукта или другого продукта по настоящему изобретению требует этапа нагревания, штамм(ы) Lactobacillus должны быть введены после нагревания. Как только клетки Lactobacillus оказываются в продукте, предпочтительно не подвергать продукт нагреванию до 60-70°С или выше для увеличения срока хранения.

Признаки настоящего изобретения будут более полно раскрыты в приведенных примерах, которые описывают, но не ограничивают объем настоящего изобретения.

Пример 1

Способ отбора штаммов

Отбор штаммов Lactobacillus, использованных согласно настоящему изобретению, следует проводить следующим поэтапным способом:

Оценки уровня стимуляции продуцирования IL-10 и снижения уровня TGF-бета-2 в человеческом грудном молоке клетками штаммов Lactobacillus для отбора штаммов

Этот пример является примером способа отбора. Специалистом в данной области техники могут быть осуществлены определенные варианты и изменения способа без отклонения от настоящего изобретения, описанного здесь.

Материалы и способы

Животные: пятьдесят одна мышь, свободная от микробов BALB/с, (мужские и женские особи) были закуплены в Wisconsin University США. Мыши были перевезены в стерильных пластиковых контейнерах. Пятьдесят мышей были пересажены в 3 изолятора (изоляторы №2, 3 и 4). Две клетки содержали каждая по 2 мужских и 4 женских особи, помещенных в изолятор №1 (бридер).

Обращение с животными

Мыши содержались в стерильных прозрачных пластиковых изоляторах (Class Biologically Clean, Ltd, Madison, WI, USA). Изоляторы были простерилизованы 2% раствором гидроперекиси ацетила (FMC Corporation, Philadelphia, PA, USA), содержащим 0,1% наконала (Naconal) (Stepan Co., Rocksport, IL. USA). Пять из 6 мышей были помещены в полистироловые клетки с проволочными прутьями из нержавеющей стали, простерилизованные гидроперекисью ацетила. В каждую клетку помещали мышей одного пола. Мышей кормили кормом для грызунов, устойчивым к обработке в автоклаве Agway 3500 (Agway, Granville, Greedmoore, NC, USA). Пища, вода и подстилка были подвергнуты обработке в автоклаве. Пища и подстилка были подвергнуты автоклавированию внутри цилиндров из нержавеющей стали и затем асептически перенесены в изоляторы. Бутылки с водопроводной водой были подвергнуты обработке в автоклаве и затем стерилизованы гидроперекисью ацетила после помещения внутрь изоляторов. Все мыши получали пищу и воду неограниченно. Уровни пищи и воды проверялись ежедневно. Подстилка заменялась 1 раз в неделю. Животные содержались при 12тичасовом цикле светло/темно. Комнатная температура и относительная влажность проверялись ежедневно.

Бактерии

Молочнокислые бактерии для идентификации тестировали и исследовали биохимическими методами и методами молекулярной биологии. Лактобациллы сначала выращивали в 10 мл среды Man-Rogosa-Sharp (MRS) (BBL, Cockeysville, MD), инкубировали в течение 18 часов при температуре 37°С и затем переносили в 90 мл MRS, инкубировали при температуре 37°С в течение 18 часов и переносили в 1000 мл MRS. После 18 часов инкубации при 37°С культуры центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут в охлаждаемой центрифуге (SORVALL RC2-B, SORVALL, Norwalk, CN, USA), супернатант удаляли, осадок в пробирке после центрифугирования дважды промывали со стерильным фосфатно-буферным солевым раствором (PBS) при 3000 об/мин в течение 10 минут. Осадок в пробирке после центрифугирования каждого штамма ресуспендировали в 30 мл PBS. Культуры были помещены в 1,2-мл криопробирки и сохраняли там при температуре минус 70°С до момента использования. Перед введением бактерий мышам проверяли чистоту и концентрацию культур. Серию разведений суспензии лактобацилл 1/10 культивировали в чашках Петри со средой MRS с 1,5% агара и инкубировали в анаэробных сосудах (GasPak:BBL, Cockeysville, MD, USA ), содержащихся в анаэробных генераторах (Anaero Gen:Oxoid Ltd., Wake Road, Basingstoke, Hampshire, England, GB) в течение 48 часов при температуре 37°С. Для колоний культур определяли морфологию и продуцирование реутерина (reuterin).

Обработка проб (в этом примере)

Контроль.

Штамм Lactobacillus rеuteri SD2112, ATCC 55730,

Штамм Lactobacillus 4000,

Штамм Lactobacillus 4020.

Определение колонизации Lactobacillus

На следующий день после помещения мышей в изоляторы были взяты образцы фекалий мышей из каждой клетки для проверки отсутствия микроорганизмов. Мыши были лишены воды с 11 часов утра до 7 часов вечера. После этого периода времени 1,2 мл суспензии молочнокислых бактерий была введена в каждую бутылку, содержащую 200 мл воды, и дана мышам. Мыши в изоляторе №2 получили L.reuteri SD2112. Суспензия, введенная в воду, содержит 2,0 × 10¹⁰ КОЕ/мл L.reuteri SD2112. Мыши в изоляторе №4 получили штамм Lactobacillus 4000, и мыши в изоляторе №5 получили штамм Lactobacillus 4020. Суспензия молочнокислых бактерий, введенная в бутылку с водой, содержит 3,0 × 10¹⁰ КОЕ/мл. Мыши в изоляторе №3 получили только воду (контроль). Фекальные образцы (10 фекальных шариков) от мышей (группа, содержащаяся в одной клетке) в каждом изоляторе брали еженедельно для проверки на колонии молочнокислых бактерий и возможное заражение другими микроорганизмами.

«Конвенционализация» измененной флорой Schaedler

Через 6 дней после начала колонизации тестируемыми штаммами мыши были «конвенционализированы» измененной флорой Schaedler. Переносящие измененную флору Schaedler мыши С3Н были закуплены у Taconic Farms, Inc. (Germantown, NY, USA). В каждый изолятор были помещены 2 мыши и немедленно были взяты образцы фекалий для проведения теста на наличие тестируемого штамма. Контрольные мыши и мыши, колонизированные тестируемыми штаммами, были лишены воды на ночь. Через несколько дней 10 фекальных шариков С3Н мышей были помещены в каждую бутылку с питьевой водой, растворены в воде, которая далее использовалась мышами. Эта процедура повторялась 3 последующих дня. Фекалии мышей BALB/c и С3Н мышей тестировались 1 раз в неделю в течение месяца для определения наличия колонизации измененной флорой Schaedler и наличия тестируемых штаммов.

Оценки

Через 45 дней после моноколонизации и через 30 дней после «конвенционализации» 5 мышей из каждой обследуемой группы были умерщвлены посредством эвтаназии и взяты образцы селезенки для выделения Т-лимфоцитов и определения цитокинов.

Приготовление клеток селезенки

Селезенки были извлечены асептически и помещены в холодный РВS + 0,5% бычий сывороточный альбумин (BSA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) + 0,1% азида натрия (NaN3) (Sigma). Клеточная суспензия, полученная из каждой селезенки, была приготовлена смешиванием с 5 мл среды RPMI-6140 (Sigma) + 0,1 мг/мл гентамицина (Sigma). Клеточная суспензия была перенесена в 15-мл стерильные конические пробирки и была центрифугирована при 2000 об/мин в течение 10 мин в охлаждаемой центрифуге. Супернатант был декантирован, и эритроциты из каждой пробирки подвергали лизису путем ресуспендирования клеток в 0,5 мл PBS 1X, затем вводили 9 мл дистиллированной воды, хорошо перемешивали и добавляли быстро 1 мл PBS 10X, и хорошо перемешивали. Суспензию центрифугировали, как описано выше, затем удаляли супернатант, и клетки ресуспендировали в 5 мл полной среды RPMI-6140. Образец суспензии проверяли под микроскопом и, если присутствовали другие частицы, кроме клеток, суспензию фильтровали через стерильную нейлоновую ткань и снова центрифугировали. Осадок в пробирке после центрифугирования ресуспендировали в 5 мл полной среды RPMI-6140, промывали дважды и окончательно ресуспендировали в 5 мл полной среды. Жизнеспособную клетку определяли с помощью трипанового синего (Sigma). 20 мкл клеточной суспензии разводили в 380 мкл 0,1% раствора трипанового синего (разведение 1:20) и просчитывали в гемацитометре. Концентрация клеточной суспензии была установлена 1,0 × 10⁶ клеток на мл в полной RPMI-6140.

Культура клеток: клетки культивировали в 96 ячеечных плоскодонных пластинах для культивирования тканей (Fisherbrand, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) в полной среде RPMI-6140 в отсутствие (не стимулировали) и в присутствии индуцирующих агентов, таких как Concavalin А (5 мкг/мл), LPS (1 мкг/мл) из Salmonella typhimurium, форбол 12-миристат-13-ацетата (PMA 10 мкг/мл), иономицина (I; 0,5 мкг/мл) и термически инактивированных L.reuteri (4,5 мг белка на мл). 100 мкл клеточной суспензии, содержащей 1,0 × 10⁵ клеток и 50 мкл термически инактивированных L.reuteri (4,5 мг белка на мл), были введены в каждую ячейку. Каждую серию выполняли с 5-ю повторениями. Культуры клеток инкубировали в атмосфере с 5% содержанием СО₂ в течение 48 часов при 37°С с митогеном и в течение 96 часов с L.reuteri. Собирали супернатанты из 5 ячеек, объединяли и хранили при минус 70°С до момента использования для проведения проб на цитокины.

Количественный анализ цитокина: цитокины (IL-10, TGF-бета-2) измерялись в супернатантах при помощи ELISA с использованием набора мышиного Qantikine^TM M (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), затем следует процедура, рекомендуемая производителем.

Результаты

Цитокины - белки иммунной системы, которые являются модуляторами биологических реакций. Они координируют взаимодействие антитела и Т-клетки иммунной системы и усиливают иммунореактивность. Цитокины включают в себя монокины, синтезированные макрофагами, и лимфокины, продуцированные активированными Т-лимфоцитами, и натуральные клетки киллеры (NK).

Тестируемый штамм L.reuteri SD 2112 демонстрирует более высокую концентрацию IL-10 (Р < 0,05), чем клетки из штамма 4000, 4020 или контрольных мышей. Также уровни TGF-бета-2 были выше для штамма SD2112. Этот штамм был отобран по настоящему изобретению.

Подтверждение стимуляции продуцирования IL-10 и сокращения в человеческом грудном молоке TGF-бета-2 клетками штаммов Lactobacillus

Этот пример подтверждает, что отобранный штамм дает желаемый эффект in vivo. Был протестирован Lactobacilluss reuteri, АТСС 55730 (доступный от The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA). Тестируемый штамм Lactobacillus выращивали в бульоне MRS (Difco) и собирали во время экспоненциальной фазы роста центрифугированием при 1000×g, промывали дважды фосфатно-буферным солевым раствором (PBS; pH 6,8) и ресуспендировали в том же буфере. После этого культуру включали в масляно-капельный продукт согласно способам, описанным в примере 3 ниже.

Это исследование проводилось дважды вслепую, исследование с применением плацебо подтвердило потенциал отобранных молочнокислых бактерий против аллергии, исследование проводили в отделениях педиатрии при окружном госпитале Jönköping, Motala и Norrköping и окружном госпитале Linköping, Швеция.

Беременные женщины из семей с аллергическими заболеваниями были случайно выбраны для перорального приема Lactobacillus reuteri SD2112, АТСС 55730 дневной дозы 1×10⁸ КОЕ или плацебо в течение 4-х недель перед родами. История аллергических заболеваний была подтверждена телефонным опросом, проводимым медсестрой - специалистом в области аллергии. Все эти 232 семьи были включены в исследования с января 2001 по апрель 2003 года и случайно разделены на экспериментальную и плацебо группы испытуемых пациентов.

Было получено согласие на сбор всех использованных бутылок для изучения продукта и оценки того, что в них осталось.

Методы

Настоящее исследование включает молозиво, полученное в течение первых трех дней после родов, и зрелое молоко, полученное в первый месяц после родов от 109 матерей. Образцы молока были собраны с использованием ручного молокоотсоса в стерильные пластиковые пробирки и хранились при температуре минус 70°С до момента исследований.

После размораживания образцы молока центрифугировали для отделения жира и разрушения клеточных стенок (Böttcher, 2000). Оставшаяся сыворотка немедленно анализировалась на содержание IL-10, и остаток сыворотки в определенном количестве был сохранен при температуре минус 70°С и позднее анализировался на наличие TNF-α, IL4, TGF-бета-1, TGF-бета-2, растворимого CD14 (sCD14), общего IgA, секреторного IgA (sIgA) и натрия, и калия.

Были проанализированы уровни TGF-бета-1, TGF-бета-2 и sCD14 (растворимого CD14) с использованием коммерческих наборов ELISA (R&D Systems, Abingdon, UK) согласно рекомендациям производителя. Исследования TGF-бета-1 и TGF-бета-2 были выполнены после обработки кислотой для преактивации латентного TGF-бета, как описано ранее (Böttcher, 2000). Уровни IL-10 и TNF-α были определены с использованием коммерческих наборов реагентов ELISA (CLB PeliPair reagent set, Amsterdam, the Netherlands) согласно рекомендациям производителя. Наиболее низкие определяемые количества составляли для TGF-бета-1 и TGF-бета-2 62,5 пг/мл, для sCD14 250 пг/мл, для IL-10 2,3 пг/мл и для TNF-α 7,8 пг/мл.

Общий IgA и sIgA были проанализированы с ELISA, как описано ранее (Böttcher, 2002). Наиболее низкие определяемые количества составляли для обоих исследований 31,2 нг/мл. Уровни содержания натрия и калия были определены в Департаменте клинической биохимии университетского госпиталя Linköping согласно стандартным правилам (ионселективный электрод). Были исследованы уровни сыворотки IgE с помощью набора аллергических ингалянтов UniCap® Pharmacia CAP System^TM Phadiatop® (Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden).

Статистические исследования

Количество человек в изучаемой группе рассчитывалось исходя из того, что у 80% участников легко определить реальную разницу в клинических проявлениях в группе, принимавшей L.reuteri по сравнению с плацебо-группой. Расчет базировался на предположении, что клинические проявления аллергии или экземы имели, по крайней мере, 40% участников плацебо-группы и что для участников экспериментальной группы число людей с подобными проявлениями может быть сокращено на половину. Необходимое число участников для образования группы 91 участник, 25% от числа участников исследования в течение исследования заменялось. Список случайно выбранных участников был выполнен компанией, не занятой в исследовании, и был разделен на 4 группы в процентном отношении. Общее число зарегистрированных участников в исследуемой группе, включая тех, кто был заменен, составило 116 женщин и их детей.

Этические принципы

Согласно Хельсинской Декларации медицинских исследований с привлечением добровольцев участники получают информацию в письменном виде и дают письменное согласие. Тестируемый штамм L.reuteri SD2112 в масле был отнесен к убедительно подтвержденным документальными доказательствами и также отнесен к продуктам, безопасным как для детей, так и для взрослых, и, следовательно, это не рассматривается как этическая проблема для участия беременных женщин и их детей.

Процедуры, связанные с исследованиями, были также расценены как представляющие незначительную проблему в отношении того факта, что у большей части участников могли бы развиться аллергические заболевания, и они перенесли скрининг-тест на аллергию. Протокол был утвержден этической комиссией госпиталя при университете Linköping.

Результаты

В исследовании авторы изобретения устанавливали воздействие на грудное молоко беременных женщин, перорально принимавших в течение 4-х недель перед родами штамма Lactobacillus reuteri SD2112.

Сравнительные характеристики матерей двух групп были сходными. Количество недель, когда матери ежедневно потребляли исследуемый продукт, не отличалось для двух групп так же, как и вскармливание исключительно грудью в течение первого месяца. В обеих группах детей до месяца кормили грудью, это явилось причиной того, что исследования проводились в неонатальном отделении (один из важнейших критериев). Не было заметных различий между двумя группами.

В группе, принимавшей тестируемый штамм L.reuteri, профиль цитокина в грудном молоке был изменен повышением уровня противовоспалительного цитокина IL-10 в молозиве (средний 6,61 пг/мл [пределы 1,15-150]), по сравнению с образцами матерей плацебо-группы (4,78 пг/мл [1,15-150]); р=0,046. При этом было видно понижение уровня TGF-бета-2 в группе, принимавшей L.reuteri SD2112. Уровень TGF-бета-2 был значительно ниже в группе, принимавшей L.reuteri (средний 674 пг/мл [102,5-2800]) в сравнении с 965 пг/мл [211,7-2800]), по сравнению с группой, принимавшей плацебо; р=0,020. Другие показатели были идентичными в обеих группах.

Грудное молоко, полученное в течение 4 недель после родов в плацебо группе и после прекращения ежедневного приема пробиотиков в исследуемой группе, не показало никаких различий.

Пример 3

Производство продуктов, содержащих отобранный штамм

В этом примере был произведен продукт, названный «Reuteri Drops». Данный продукт является продуктом на масляной основе, содержащим L.reuteri SD2112, произведенный подобным образом для хорошей стабильности и длительного срока хранения. Уникальным признаком способа получения является этап сушки масла для удаления наибольшего количества воды из масла.

Масло, использованное в настоящем изобретении, является чистым, употребляемым в пищу растительным маслом, предпочтительно подсолнечным маслом. Хотя нельзя предположить, что масло, такое как чистое подсолнечное масло, содержит воду, неожиданный эффект производственного этапа - сушки масла - путем помещения его под вакуум вызывает значительное повышение стабильности лактобацилл в составе. Следовательно, маслом, используемым в изобретении, может быть масло, из которого возможно извлечь воду. Хотя из предшествующего уровня техники известно, что стабильность таких культур близко коррелирует с водной активностью состава, неизвестен способ сушки масла под вакуумом для стабилизации лактобацилл.

Описание способа получения

Предпочтительная технологическая схема способа получения продемонстрирована на чертеже. Далее приведены детали одного такого возможного варианта способа, который может быть использован для воплощения настоящего изобретения.

Смесь ингредиентов

1. Смесь из триглицерида жирной кислоты со средней длиной цепи (например, Akomed R, (Karlshamns AB, Karlshamn Sweeden) и подсолнечного масла (например, Akosun, Karlshamns), диоксида кремния Cab-o-sil M5P, M5P, Cabot) смешивают в смесителе/реакторе Bolz (Alfred BOLZ Apparatebau GmbH, Wangem im Alläдu, Germany).

2. Гомогенизация. Помпа Sine и DISPAX (Sine Pump, Arvada, Colorado) были соединены со смесителем Bolz, и смесь была гомогенизирована.

3. Вакуумная сушка. Смесь сушили под вакуумом при 10 мбар в танке Bolz в течение 12 часов.

4. Введение Lactobacillus reuteri. Приблизительно 20 кг масляной сухой смеси были помещены в сосуд из нержавеющей стали объемом 50 литров. Был введен порошок L.reuteri (предпочтительно, высушенный сублимацией; количество используемого L.reuteri может варьировать в зависимости от требуемого количества масла, но в данном примере вводят 0,2 кг культуры, содержащей 10¹¹ КОЕ/г). Смешивание производили медленно до начала гомогенизации.

5. Смешивание. Премикс L.reuteri был возвращен в смеситель Bolz.

6. Выгрузка. Суспензию помещали в стеклянный сосуд объемом 200 литров и закачивали азот. Суспензия находилась в сосуде до момента розлива в бутылки.

Для специалиста в данной области техники ясно, что представленные здесь варианты воплощения изобретения могут иметь варианты модификации, не выходящие за объем настоящего изобретения.

1. Способ отбора штамма молочнокислых бактерий, способного повышать уровень IL-10 и одновременно снижать уровень TGF-бета-2 в женском грудном молоке, включающий стадии:
а) введения тестируемого штамма Lactobacillus млекопитающему, используемому для исследования;
б) выделения клеток из указанного млекопитающего;
c) оценки уровней IL-10 и TGF-бета-2 в супернатантах, полученных из указанных выделенных клеток, где повышение уровня IL-10 одновременно со снижением уровня TGF-бета-2 в указанном супернатанте по сравнению с супернатантом, полученным из клеток контрольного млекопитающего, указывает на то, что тестируемый штамм является искомым штаммом молочнокислых бактерий; и
d) отбора штамма молочнокислых бактерий, способного повышать уровень IL-10 и одновременно снижать уровень TGF-бета-2 в супернатанте исследуемого млекопитающего.

2. Способ улучшения женского грудного молока, включающий стадию введения женщине эффективного количества продукта, содержащего клетки штамма молочнокислых бактерий, отобранного в соответствии со способом по п.1.

3. Способ уменьшения риска развития аллергии у ребенка, находящегося на грудном вскармливании, включающий стадии введения кормящей грудью женщине эффективного количества продукта, содержащего клетки штамма молочнокислых бактерий, отобранного способом по п.1, где снижение риска развития аллергии у ребенка, находящегося на грудном вскармливании, одновременно снижает риск развития мастита у кормящей грудью женщины.

4. Способ повышения противовоспалительной активности женского грудного молока, включающий стадию введения женщине эффективного количества продукта, содержащего клетки штамма молочнокислых бактерий, отобранного способом по п.1.

5. Способ повышения уровня IL-10 и одновременного снижения уровня TGF-бета-2 в женском грудном молоке, включающий стадию введения женщине эффективного количества продукта, содержащего клетки штамма молочнокислых бактерий, отобранного способом по п.1.

6. Способ по любому из пп.2-5, где продукт, содержащий клетки штамма молочнокислых бактерий, вводят женщине перед рождением ребенка.

7. Способ по любому из пп.2-5, где продукт, содержащий клетки штамма молочнокислых бактерий, вводят женщине после рождения ребенка.

8. Применение штамма молочнокислых бактерий, отобранного способом по п.1, для получения лекарственного средства для улучшения женского грудного молока.

9. Применение по п.8, где лекарственное средство вводят женщине перед рождением ребенка.

10. Применение по п.8, где лекарственное средство вводят женщине после рождения ребенка.

11. Применение штамма молочнокислых бактерий, отобранного способом по п.1, для получения лекарственного средства для снижения риска развития аллергии у ребенка, находящегося на грудном вскармливании, где снижение риска развития аллергии у ребенка, находящегося на грудном вскармливании, одновременно снижает риск развития мастита у кормящей грудью женщины.

12. Применение по п.11, где лекарственное средство вводят женщине перед рождением ребенка.

13. Применение по п.11, где лекарственное средство вводят женщине после рождения ребенка.

14. Применение штамма молочнокислых бактерий, отобранного способом по п.1, для получения лекарственного средства для повышения противовоспалительной активности в женском грудном молоке.

15. Применение по п.14, где лекарственное средство вводят женщине перед рождением ребенка.

16. Применение по п.14, где лекарственное средство вводят женщине после рождения ребенка.

17. Применение штамма молочнокислых бактерий, отобранного способом по п.1, для получения лекарственного средства для повышения уровня IL-10 одновременно со снижением уровня TGF-бета-2 в женском грудном молоке.

18. Применение по п.17, где лекарственное средство вводят женщине перед рождением ребенка.

19. Применение по п.17, где лекарственное средство вводят женщине после рождения ребенка.

20. Продукт, содержащий клетки штамма молочнокислых бактерий, отобранного способом по п.1.

21. Продукт по п.20, где продукт, содержащий клетки штамма молочнокислых бактерий, вводят женщине перед рождением ребенка.

22. Продукт по п.20, где продукт, содержащий клетки штамма молочнокислых бактерий, вводят после рождения ребенка.

23. Продукт по п.20, который используется в способе улучшения женского грудного молока, включающем стадию введения женщине эффективного количества продукта;
в способе уменьшения риска развития аллергии у ребенка, находящегося на грудном вскармливании, включающем стадии введения кормящей грудью женщине эффективного количества продукта, где снижение риска развития аллергии у ребенка, находящегося на грудном вскармливании, одновременно снижает риск развития мастита у кормящей грудью женщины;
в способе повышения противовоспалительной активности женского грудного молока, включающем стадию введения женщине эффективного количества продукта;
в способе повышения уровня IL-10 и одновременного снижения уровня TGF-бета-2 в женском грудном молоке, включающем стадию введения женщине эффективного количества продукта.

24. Продукт по п.20, который используется для улучшения женского грудного молока, что включает стадию введения женщине эффективного количества продукта;
уменьшения риска развития аллергии у ребенка, находящегося на грудном вскармливании, что включает стадии введения кормящей грудью женщине эффективного количества продукта, где снижение риска развития аллергии у ребенка, находящегося на грудном вскармливании, одновременно снижает риск развития мастита у кормящей грудью женщины;
повышения противовоспалительной активности женского грудного молока, что включает стадию введения женщине эффективного количества продукта;
повышения уровня IL-10 и одновременного снижения уровня TGF-бета-2 в женском грудном молоке, что включает стадию введения женщине эффективного количества продукта.

25. Продукт по п.20, дополнительно содержащий пищевое растительное масло.

26. Продукт по п.25, где пищевое растительное масло является подсолнечным маслом.

27. Продукт по п.25, где масло подвергают обработке с этапом вакуумной сушки.

28. Продукт по любому из пп.20-27, который дополнительно содержит высушенную культуру различных Lactobacillus.