Способ культивирования дрожжей для спиртового производства

Способ включает подготовку посевного материала и стадию брожения. Для подготовки посевного материала проводят адаптацию дрожжей к стрессовому агенту в аэробных или микроаэрофильных условиях при освещении видимым светом 40-90 мВт/л путем периодических пересевов. Брожение осуществляют при использовании подготовленного посевного материала и уровне освещения 40-90 мВт/л. Способ обеспечивает высокий выход биомассы дрожжей. Выход биомассы дрожжей составляет 2,2-4,2 г/л. 2 табл.

 

Изобретение относится к способам культивирования дрожжей и получения синтезируемого ими метаболита - этанола.

Известен способ культивирования дрожжей для спиртового производства [1]. Предлагаемый способ ставит целью получение чистой дрожжевой культуры с высокой концентрацией дрожжевых клеток и высокой бродильной активностью. Культивирование ведут в аэробных условиях на стерильной питательной среде с содержанием сахара 4-6%, в качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло или сахарозу до достижения концентрации дрожжевых клеток в культуральной жидкости на каждой ступени культивирования 500-1000 млн/мл, после чего культуральную жидкость последней ступени выдерживают в анаэробных условиях в течение 2-3 ч, в процессе культивирования ведут подпитку стерильным суслом или раствором сахарозы в продукте декантации послеспиртовой барды до содержания сахара в питательной среде 4-6%.

Известен также способ [2] ведения ферментационного процесса, в котором биомассу дрожжей готовят в хемостатном аэробном процессе, достигая высокой концентрации клеток - 19 г/л.

Биомассу, подготовленную по этим вариантам, используют в анаэробном процессе.

Недостатками способов является экстенсивный в основном подход к подготовке посевного материала для анаэробного процесса, связанный с повышением концентрации дрожжевых клеток, не приводятся подробные физиологические показатели ведения анаэробного процесса, не уделяется должное внимание поддержанию высокой физиологической активности клеток в течение всего анаэробного процесса, анаэробные процессы ведутся с высокой концентрацией биомассы, хотя удельная бродильная активность их мала.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения биомассы дрожжей, который можно использовать для подготовки посевного материала анаэробного процесса, включающий культивирование дрожжей на углеводсодержащем субстрате в присутствии пероксида водорода с предварительной адаптацией клеток дрожжей к пероксиду водорода [3]. Отмечено, что при использовании в микробиологических процессах предварительно адаптированных к пероксиду водорода микроорганизмов происходит повышение бродильной активности (до 10-20%) по скорости сбраживания.

Недостатком способа является недостаточная воспроизводимость положительного эффекта и игнорирование режимов аэрации при подготовке посевного материала.

Задачей изобретения является получение биомассы дрожжей с воспроизводимо высокой физиологической активностью с целью интенсификации процесса брожения и поддержание высокой физиологической активности культуры в течение анаэробного процесса.

Поставленная задача решается тем, что для подготовки посевного материала проводят адаптацию дрожжей для спиртового производства к стрессовому агенту в аэробных или микроаэрофильных условиях при освещении суспензии выращиваемых дрожжей видимым светом с интенсивностью не менее 40 мВт/л, путем периодических пересевов культуры дрожжей с воздействием стрессового агента, а последующую стадию брожения при засевании подготовленным посевным материалом ведут при уровне освещения не менее 40 мВт/л.

В настоящем изобретении культивирование дрожжей проводили в колбах на качалке и в биореакторе.

Объектами экспериментов являлись дрожжи Saccharomyces cerevisiae штаммы SL-100 и Meyen расы Т 985. При культивировании оптимальная температура для роста дрожжей S. cerevisiae 28-30°C, рН от 3,0 до 6,0.

Эксперименты с дрожжами в колбах 250 мл при объеме среды 50 мл проводились на термостатируемой качалке с числом оборотов 220 об/мин при начальном значении рН среды 5,5. Компоненты среды стерилизовали при 0,5 ати в автоклаве в течение 30 мин. Посевной материал составлял 10 об.%, Н2O2 (пергидроль) вносили в различные фазы роста в количестве 0,15-1,2 г/л. В ряде экспериментов вместо Н2О2 использовали облучение дрожжей мягким ультрафиолетом - 100-400 Дж/л в течение 5 сек. Время культивирования составляло 24-28 часов.

Состав среды для культивирования дрожжей S. cerevisiae, г/л: (NH4)2SO4 - 5,0, КН2РO4 - 1,0, КСl - 0,15, MgSO4·7H2O - 0,2 г/л, CaCl2 - 0,05 г/л, дрожжевой экстракт - 0,5, сахароза - 30 или 150, вода - водопроводная, рН 5,8.

Опыты в лабораторном биореакторе с обечайкой из стекла, рабочим объемом 3 л проводили в режиме глубинного культивирования в стерильных условиях с автоматическим контролем рН, рO2, Т. Компоненты среды стерилизовали при 0,5 ати в автоклаве в течение 30 мин. Посевной материал составлял 10 об.%. Облучение мягким УФ осуществлялось через выносной контур с кварцевой кюветой.

Колбы и биореактор освещали лампами дневного света, интенсивность освещения определяли с помощью люксметра - УФ-радиометра ТКА-01/3. В вариантах культивирования без освещения содержимое колб или биореактора экранировалось от видимого света светонепроницаемым материалом. В колбах путем ведения последовательных пассажей (пересевов) в асептических условиях в зависимости от исследуемых факторов получали линии дрожжей при различном освещении и без освещения среды, в аэробных, микроаэрофильных или анаэробных условиях, при внесении разных концентраций Н2O2 в среду культивирования, при разном содержании дрожжевой биомассы и субстрата (сахарозы) в ферментационной среде.

В предварительных опытах на колбах в различных режимах при начальной концентрации субстрата 30 г/л были определены дозы внесения пероксида - 0,3-0,6 г/л и воздействия мягкого ультрафиолета 200-250 Дж/л в течение 5 сек, при содержании дрожжевых клеток в среде культивирования 2,2-2,4 г/л, остаточной концентрации субстрата <5 г/л, при этом не происходило полного вьмирания культуры. С воздействием найденных сублетальных доз стрессовых воздействий были проведены серии пассажей.

Параметры, найденные выше, не являются определяющими. Так, для другого штамма S. cerevisiae необходима другая доза H2O2 или мягкого УФ, при другой концентрации биомассы, культивирование может происходить при другой начальной концентрации субстрата. Нахождение сублетальных доз стрессовых воздействий - индивидуально для каждой культуры дрожжей. Общими определяющими параметрами служат режимы аэрации и освещения при проведении процессов.

Следующие примеры иллюстрируют сущность изобретения.

Пример 1

Подготовка посевного материала

Ведение пассажей (пересевов) в колбах при внесении пероксида 0,6 г/л или воздействии мягкого УФ 250 Дж/л в течение 5 сек, при содержании дрожжевых клеток в среде культивирования 2,2-2,4 г/л при освещении видимым светом интенсивностью 40 мВт/л, 90 мВт/л, 150 мВт/л, 220 мВт/л, 400 мВт/л, 500 мВт/л, 700 мВт/л, 1000 мВт/л в аэробном режиме.

Пример 2

Подготовка посевного материала

Ведение пассажей (пересевов) в колбах при внесении пероксида 0,6 г/л или воздействии мягкого УФ 250 Дж/л в течение 5 сек, при содержании дрожжевых клеток в среде культивирования 2,2-2,4 г/л при освещении видимым светом интенсивностью 40 мВт/л, 90 мВт/л, 150 мВт/л, 220 мВт/л, 400 мВт/л, 500 мВт/л, 700 мВт/л, 1000 мВт/л в микроаэрофильном режиме.

Пример 3

Подготовка посевного материала

Ведение пассажей (пересевов) в колбах при внесении пероксида 0,6 г/л или воздействии мягкого УФ 250 Дж/л в течение 5 сек., при содержании дрожжевых клеток в среде культивирования 2,2-2,4 г/л при освещении видимым светом интенсивностью 40 мВт/л, 90 мВт/л, 150 мВт/л, 220 мВт/л, 400 мВт/л, 500 мВт/л, 700 мВт/л, 1000 мВт/л в анаэробном режиме.

Примеры 4-6

Подготовка посевного материала

То же, что в примерах 1-3, но без освещения.

Примеры 7-9

Подготовка посевного материала

То же, что в примерах 1-3, но при освещении видимым светом интенсивностью 30 мВт/л.Сравнение доли мертвых клеток различных вариантов ведения пассажей (пересевов) с контрольным вариантом без воздействия стрессового агента по окончании культивирования приведено в табл.1. Контрольные варианты велись для каждого примера, и результаты оказались идентичными, поэтому контрольный вариант в табл.1 представлен одной строкой.

Таблица 1
N примера 1-й пассаж 5-й пассаж 10-й пассаж
1 60-70% 30-35% 25-30%
2 60-65% 30-35% 25-30%
3 85-90% 90-95% 90-95%
4 85-90% 70-75% 70-75%
5 85-90% 70-74% 70-75%
6 90-95% 95-100% 95-100%
7 70-75% 60-65% 55-60%
8 65-70% 55-60% 50-65%
9 85-90% 90-95% 90-95%
Контроль 30-35% 30-35% 30-35%

Видно, что в анаэробных условиях клетки не адаптируются к стрессору (примеры 3, 6, 9).

Доля мертвых клеток, подвергнутых действию пероксида либо мягкого УФ в аэробных либо микроаэрофильных условиях, при последующем нахождении в темноте составляет более 85% соответственно для 1-го пассажа. Без освещения доля мертвых остается высокой и к 10-му пассажу примерно 75% (примеры 4, 5).

При освещении же среды доля мертвых клеток падает до уровня в контроле (без воздействия стресс-фактора) уже к 5-му пассажу для аэробных и микроаэрофильных условий (примеры 1,2). При этом возрастание интенсивности освещения выше 40 мВт/л не сказывается существенно на выживаемости и скорости адаптации клеток. Таким образом, достаточно рассеянного света с интенсивностью 40 мВт/л, чтобы восстановить жизнеспособность клеток. Свет в данном случае выступает как антистрессор, помогающий клеткам дрожжей преодолевать последствия окислительного стресса, вероятно, через механизм фоторепарации. Снижение уровня освещения видимым светом ниже 40 мВт/л приводит к росту доли мертвых клеток (примеры 7,8 по сравнению с примерами 1, 2).В примерах 1, 2 наблюдается также явная корреляция между падением доли мертвых клеток, уменьшением лаг-фазы, увеличением удельной скорости роста и устойчивостью к рН (с приобретением устойчивости к Н2О2 либо мягкому УФ клетки становятся устойчивыми к более низким рН) по мере пересевов в линиях со стрессовыми воздействиями, т.е. наблюдается адаптация популяции к стрессору с изменением показателей культивирования в благоприятную сторону, при этом повышается и устойчивость клеток к внесению повышенных доз Н2О2 либо воздействию мягкого УФ: адаптированные клетки выдерживают внесение 1,8-2,4 г/л пероксида, тогда как в контрольном варианте клетки полностью погибают при внесении 1,2 г/л пероксида.

Опыты в реакторе с ведением линий примеров 1 либо 2 показали падение доли мертвых клеток в середине экспоненциальной фазы с 8-10% в контроле, до 4-5% в 5-ом и 10-ом пассажах (пересевах), лаг-фаза уже к 5-му пассажу уменьшилась примерно в 2 раза. Добавление пероксида водорода приводит к лизису клеток в контрольном варианте: на момент окончания опыта после воздействия стрессора доля мертвых клеток достигает 65-70%, уровень биомассы падает на 35-40% по сравнению с тем же вариантом без внесения пероксида. При культивировании же адаптированных дрожжей наблюдается даже некоторое увеличение выхода биомассы после воздействия стрессора. К концу опыта после внесения, например, пероксида водорода при культивировании дрожжей 5-го пассажа доля мертвых клеток составляет 30-35%, а 10-го пассажа- 20-25%.

Пример 10

Подготовка посевного материала

Как и при культивировании в колбах, при выращивании адаптированных к пероксиду или мягкому УФ линий дрожжей в реакторе для возникновения физиологически благоприятных изменений важно освещение содержимого ферментационной среды видимым светом интенсивностью не менее 40 мВт/л. В темноте после внесения Н2О2 0,6 г/л или воздействия мягкого УФ 250 Дж/л в течение 5 с к концу культивирования доля мертвых клеток составляла 70-75%, а на свету 30-35%, что происходило при культивировании адаптированных дрожжей 5-го и 10-го пассажей примеров 1,2 в аэробных или микроаэрофильных условиях.

Посевной материал примеров 1,2 после адаптации к пероксиду или мягкому УФ при освещении видимым светом не менее 40 мВт/л можно использовать в качестве посевного для анаэробного культивирования в биореакторе.

Все варианты анаэробного культивирования в биореакторе велись при концентрации субстрата (сахарозы) 150 г/л. Посевной материал составлял 10 об.%.

Пример 11

Анаэробное культивирование

Анаэробное культивирование при использовании в качестве инокулята неадаптированных дрожжей (контрольный вариант) при освещении интенсивностью 40 мВт/л, 90 мВт/л, 150 мВт/л, 220 мВт/л, 400 мВт/л, 500 мВт/л, 700 мВт/л, 1000 мВт/л и без него.

Пример 12

Анаэробное культивирование

Анаэробное культивирование при использовании в качестве инокулята дрожжей 5-го пассажа примеров 1,2 при освещении интенсивностью 40 мВт/л, 90 мВт/л, 150 мВт/л, 220 мВт/л, 400 мВт/л, 500 мВт/л, 700 мВт/л, 1000 мВт/л.

Пример 13

Анаэробное культивирование

Анаэробное культивирование при использовании в качестве инокулята дрожжей 10-го пассажа примеров 1,2 при освещении интенсивностью 40 мВт/л, 90 мВт/л, 150 мВт/л, 220 мВт/л, 400 мВт/л, 500 мВт/л, 700 мВт/л, 1000 мВт/л.

Пример 14

Анаэробное культивирование

Анаэробное культивирование без освещения при использовании в качестве инокулята дрожжей примера 10 (после внесения Н202 в аэробном или микроаэрофильном режимах и культивировании в темноте).

Пример 15

Анаэробное культивирование

Анаэробное культивирование при использовании в качестве инокулята дрожжей, подготовленных по прототипу в условиях изменения освещенности лабораторного помещения естественным видимым светом при смене дня и ночи.

Таблица 2
N примера Удельная скорость роста, ч-1 % мертвых в середине эксп. фазы % мертвых в конце эксперимента Наибольшая бродильная активность (мл СO2/л·ч) Время брожения, ч Выход спирта, % Выход биомассы, г/л
11 0,046 15-20% 75% 680-700 73 6,2-6,4 4
(контроль)
12 0,059 10-12% 60-65% 880-900 57 6,2-6,4 4,1
13 0,067 8-10% 60-65% 980-1000 52 6,2-6,4 4,2
14 0,044 40-45% 90-95% 480-500 93 4,0-4,1 2,2
15 0,05-0,06 10-15% 65-70% 830-850 59 6,2-6,4 4,1

Исследование роли освещения и аэрации при подготовке посевного материала и освещения при анаэробном культивировании позволило предложить новый вариант ведения процесса спиртового брожения по сравнению с прототипом (пример 15), в котором при подготовке посевного материала вышеозначенные параметры не учитывались.

Таким образом, показана возможность существенного улучшения показателей роста дрожжевых культур и процесса спиртового брожения при сочетанном воздействии на дрожжи дозами стрессорных факторов (пероксида водорода или мягкого ультрафиолета) и антистресс-фактором, в частности видимым светом, что позволяет предложить новый способ ведения процесса спиртового брожения. По предлагаемому способу для поддержания высокой физиологической активности дрожжей-сахаромицетов посевной материал получают при росте дрожжей в аэробных или микроаэрофильных условиях и совместном воздействии видимого света и Н2О2 или мягкого ультрафиолета диапазона УФА/УФБ при пассивировании (пересевах) культуры.

Предложенный способ позволяет поддерживать высокую физиологическую активность клеток дрожжей и способствует повышению производительности процесса - сокращению времени брожения на 30% по сравнению с контролем, и на 12% по сравнению с прототипом.

Литература

1. Патент РФ N 2136746 Способ культивирования дрожжей для спиртового производства, приоритет 17.08.1998.

2. Патент WO 2007038833 ETHANOL FERMENTATION PROCESS AND PRODUCTS, приоритет 03.10.2005.

3. Патент РФ N 2268924 Способ получения биомассы дрожжей, приоритет 23.11.2004.

Способ культивирования дрожжей для спиртового производства, включающий подготовку посевного материала и стадию брожения, отличающийся тем, что для подготовки посевного материала проводят адаптацию дрожжей к стрессовому агенту в аэробных или микроаэрофильных условиях при уровне освещения видимым светом 40-90 мВт/л путем периодических пересевов культуры дрожжей с воздействием стрессового агента, а последующую стадию брожения при засевании подготовленным посевным материалом ведут при уровне освещения 40-90 мВт/л.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к способам генерирования электрических колебаний с помощью полупроводников и жидких диэлектриков и может найти широкое применение в биологии, экологии, медицине.

Изобретение относится к способу генерирования электрических колебаний с помощью полупроводников и жидких диэлектриков и может найти широкое применение в биологии, экологии, медицине и других отраслях, связанных с биологическими объектами.

Изобретение относится к области биотехнологии, биологии, медицины и биофизики. .
Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии, в частности к методам сушки биологических препаратов из микробного сырья. .
Изобретение относится к хлебопекарному производству, в частности к процессу активации прессованных дрожжей. .
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для активации макро- и микроорганизмов как до введения их в биотехнологический процесс, так и при реализации биотехнологического процесса.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к области средств воздействия на макроорганизмы и микроорганизмы, используемые в биотехнологических процессах. .

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для проведения ферментативных реакций, субстратом в которых служат нуклеиновые кислоты. .
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению кормовой биологически активной белково-углеводной добавки, обладающей пробиотическими свойствами, на основе крупнотоннажного отхода пивоваренного производства - зерновой дробины.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для идентификации дрожжеподобных грибов Candida albicans. .

Изобретение относится к микробиологической промышленности. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению питательных сред для культивирования клеток, и может быть использовано для значительного снижения вариаций продукции рекомбинантных белков, которые имеют место при культивировании клеток с использованием разных партий коммерчески доступного соевого гидролизата.
Изобретение относится к микробиологии и представляет собой новый штамм пивных дрожжей, предназначенный для использования в пивоваренной промышленности. .

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека. .
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в различных областях пищевой промышленности, в частности, для приготовления теста, кваса и других пищевых продуктов, а также в микробиологической промышленности, в биотехнологии, в частности к способам выращивания хлебопекарных дрожжей.
Изобретение относится к спиртовой промышленности, а именно к созданию нового штамма спиртовых дрожжей Saccharomyces cerevisiae 1039 (ВКПМ Y-3327), обладающего осмофильными свойствами и способного сбраживать зерновое сусло с концентрацией сухих веществ выше 30%.

Изобретение относится к спиртовой промышленности, в частности к способу культивирования дрожжей для спиртового производства. .

Изобретение относится к способам культивирования дрожжей и получения синтезируемого ими метаболита - этанола

Наверх