Способ выращивания ретикулярных клеток человека
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу выращивания ретикулярных клеток из фрагментов аутологичного неизмененного лимфатического узла человека, и может быть использовано для лечения хронического лимфатического отека. У человека-донора (больного) производят биопсию неизмененного патологически поверхностного лимфатического узла, являющегося гетеротопическим по отношению к пораженному органу, полученный биоптат очищают от капсулы и подкожно-жировой клетчатки, разделяют на фрагменты, промывают и обрабатывают смесью лизирующих ферментов, фрагменты тщательно отмывают от ферментов в полной ростовой среде, а далее производят выращивание клеток в среде MEM в течение 4-5 недель. Изобретение позволяет получить в большом количестве чистую культуру аутологичных ретикулярных клеток лимфатического узла.
Изобретение относится к медицине и биотехнологии, а именно к способам выращивания клеточных культур, представленных морфологически гомогенной популяцией клеток, из тканей человека, а именно из стромы аутологичного неизмененного лимфатического узла человека.
Известны способы выращивания клеток из кожи, суставного гиалинового хряща, роговицы человека (Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков. - Пер. с англ. - М., Мир, 1983. - 263 с; Гринберг К.Н., Кухаренко В.И., Ляшко В.Н., Терехов С.М., Пичугина Е.М., Фрейдин М.И., Черников В.Г. Культивирование фибробластов человека для диагностики наследственных болезней. Методы культивирования клеток: Сб. научн. трудов. - Л.: Наука, 1988. - с.250-257.; Терских В.В., Васильев А.В. Эпидермальные кератиноциты человека и животных: Проблемы культивирования и трансплантации. - М.: Наука, 1995. - 104 с.).
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ выращивания клеток из кроветворных и лимфоидных органов животных для экспериментальных целей (Лурия Е.А. Кроветворная и лимфоидная ткань в культурах. М.: Медицина, 1972. - 176 с.; Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С. Индукция костной ткани и остеогенные клетки-предшественники. М.: Медицина, 1973. - 234 с.; Фриденштейн А.Я., Чертков И.Л. Клеточные основы иммунитета. - М.: Медицина, 1969. - 256 с.). Ретикулярные клетки из стромы таких органов животных (крыс, мышей, морских свинок) были выращены этими авторами в органных культурах как «побочный продукт» при культивировании и изучении кроветворных элементов.
Недостатком известных способов является то, что они не позволяют вырастить ретикулярные клетки из стромы лимфатического узла человека для клинических целей.
Была поставлена задача выращивания ретикулярных клеток из стромы лимфатического узла человека, при этом в таком количестве, которое позволило бы использовать их для трансплантации с целью купирования лимфатического отека (то есть не менее 4 миллионов клеток).
Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является повышение эффективности выращивания ретикулярных клеток из стромы лимфатического узла человека в количестве, достаточном для введения человеку в виде суспензии (не менее 4 миллионов клеток).
Способ выращивания осуществляется следующим образом.
У человека-донора (больного) путем биопсии забирают неизмененный патологически поверхностный лимфатический узел, являющийся гетеротопическим по отношению к пораженному органу, и помещают его в сосуд со стерильной средой для транспортировки, в качестве которой может использоваться, например, среда 199 с антибиотиком. Узел освобождают от капсулы, размельчают на фрагменты размером 0,3 мм3 и подвергают трехкратному промыванию раствором, например Хенкса. Фрагменты переносят в сосуд со смесью лизирующих ферментов и помещают в термостат на 10 минут для разволокнения ткани биоптата и облегчения миграции клеток из него. После обработки ферментами фрагменты биоптата тщательно отмывают от них в полной ростовой среде, например MEM, содержащей сыворотку крови - аутологичную, или эмбриональную телячью, а далее клетки выращивают в полной ростовой среде с сывороткой крови или бессывороточной среде, например Stemline® Mesenchymal Stem Cell Expansion Medium MSC Medium, в течение 4-5 недель. Ежедневно контролируют состояние фрагментов во флаконе с помощью инвертированного микроскопа. Дважды в неделю производят смену среды MEM на свежую и обязательный бактериологический контроль вылитой из флакона среды для доказательства отсутствия заражения культуры инфекционными агентами. На 5-7-й день культивирования появляются мигрирующие из фрагментов по дну флакона фибробластоподобные ретикулярные клетки, которые имеют веретеновидную форму, округлое ядро и небольшое количество отростков (от 2 до 4). После покрытия клетками 75% площади дна флакона клетки можно размножать путем пересадки их в новые флаконы стандартным способом в соотношении 1:1. Таким образом можно вырастить более 4 миллионов клеток в течение 4-5 недель.
Проведены испытания предлагаемого способа выращивания ретикулярных клеток человека, результаты которых изложены в Акте испытаний (см. Акт испытаний)
Поставленный технический результат достигается тем, что в способе выращивания ретикулярных клеток человека, основанном на заборе биологического материала у человека и проведении выращивания клеток, у человека-донора (больного) производят биопсию неизмененного патологически поверхностного лимфатического узла, являющегося гетеротопическим по отношению к пораженному органу, полученный биоптат очищают от капсулы и подкожно-жировой клетчатки, разделяют на фрагменты и обрабатывают смесью лизирующих ферментов, фрагменты тщательно отмывают от ферментов, а далее производят выращивание клеток в полной ростовой среде, например MEM, в течение 4-5 недель.
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявляемого способа выращивания ретикулярных клеток человека, позволили установить, что заявители не обнаружили аналог, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам заявляемого изобретения.
Определение из перечня выявленных аналогов прототипа позволило выявить совокупность существенных по отношению к усматриваемому техническому результату отличительных признаков способа выращивания ретикулярных клеток человека, изложенных в формуле изобретения.
Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна».
Для проверки соответствия заявляемого изобретения условию «изобретательский уровень» заявители провели дополнительный поиск известных решений, чтобы выявить признаки, совпадающие с отличительными от прототипа признаками заявляемого способа выращивания ретикулярных клеток человека.
Результаты поиска показали, что заявляемое изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, определенного заявителями, не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками заявляемого изобретения преобразований на достижение поставленного технического результата.
Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».
Критерий изобретения «промышленная применимость» подтверждается тем, что предлагаемый способ выращивания ретикулярных клеток человека может быть использован в лабораториях культуры клеток для выращивания ретикулярных клеток из стромы лимфатического узла человека с целью последующей их аутотрансплантации для купирования хронического лимфатического отека, например у больных с лимфэдемой нижних конечностей.
Способ выращивания ретикулярных клеток лимфатического узла человека, предусматривающий, что у человека - донора (больного) производят биопсию неизмененного патологически поверхностного лимфатического узла, являющегося гетеротопическим по отношению к пораженному органу, полученный биоптат очищают от капсулы и подкожно-жировой клетчатки, разделяют на фрагменты, промывают и обрабатывают смесью лизирующих ферментов, фрагменты тщательно отмывают от ферментов в полной ростовой среде, а далее производят выращивание клеток в среде MEM в течение 4-5 недель.
