Способ получения крови с наличием гемопоэтических и стромальных стволовых клеток от плодов-телят
Владельцы патента RU 2412993:
Федеральное государственное учреждение высшего профессионального образования Волгоградская государственная сельскохозяйственная академия (RU)
Изобретение относится к ветеринарной медицине к области клеточной терапии. Способ заключается в том, что извлекают беременную матку после нутровки стельных коров, освобождают плод от детской и материнской плацент без травмирования и ампутации пуповины. Затем берут кровь из яремной вены у 4-5-месячных плодов телят. При этом вакуумное пространство в грудной и брюшной полости плода, которое препятствует свободному вытеканию крови (гидродинамика), ликвидируют методом прокола их троакаром, добавляют к крови, антиоксидант, отстаивают, центрифугируют. Способ позволяет получать большее количество крови, богатой гемопоэтическими, стромальными стволовыми клетками, ферментами и ядросодержащими форменными элементами крови. 1 табл.
Изобретение относится к области ветеринарной медицины, а именно к клеточной технологии в ветеринарной медицине.
Известен способ взятия крови у кроликов, где кровь берут при помощи шприца из яремной вены или из сердца путем прокола его иглой или острием скальпеля (1).
Однако этот способ непригоден для взятия крови у новорожденных или плодов, чтобы набрать кровь, имеющую в наличии бактерицидные ферменты, стволовые стромальные клетки. Взятие крови из ушной вены кролика иглой осложняется малой скоростью тока крови, т.к. периодически наступает спадание стенок кровеносных сосудов капилляров, приходится в несколько приемов массажировать ушную раковину, получив заполнение сосудов кровью, производить один за другим сбор крови в шприц и несколько раз прокалывать кровобрательной иглой стенку кровеносных сосудов ушной раковины кролика.
Также известен способ взятия крови у нутрий, когда производят фиксацию животного, нагревают конечности в горячей воде до 50°C и вскрывают одну из конечностей там, где проходят кровеносные сосуды, для взятия крови. Берут кровь в пробирку с 5%-ным раствором цитрата натрия в соотношении 1:10 (2).
Недостатком этого способа является то, что этот способ хотя и является безигольным и не наблюдается спазм стенок кровеносных сосудов, но периодический подогрев конечностей, отрезание когтей с захватом мягкой ткани задней лапы создает стрессовые факторы болевого характера. Открытая связь с окружающей средой при взятии крови у нутрий не обеспечивает ее стерильность. При снижении температуры при подогреве конечностей поток крови уменьшается или прекращается, поэтому приходится брать кровь в малых дозах и в несколько приемов.
В качестве ближайшего аналога - прототипа принят способ получения ядросодержащих клеток из пуповины (3), характеризующийся тем, что ядросодержащие клетки собирают с пуповинной кровью, которую собирают в два этапа, в непрерывном режиме путем эксфузии из дистального отдела пупочной вены с последующим внесением антикоагулянта, а оставшуюся кровь собирают путем перфузии. Сбор крови производят в два контейнера, поочередно перемешивают, отделяют супернатант, центрифугируют при 2000 об/мин, добавляют 10-12% диметилсульфаксид в полиглюкине с последующим замораживанием и дальнейшим использованием с лечебной целью.
Однако этот известный способ непригоден для получения плодной крови, богатой ядросодержащими клетками. Недостатком этого способа является получение малого объема пуповинной крови. Это связано с изменением давления в грудной и брюшной полости плода, когда кровеносные сосуды запустевают, поэтому приходится собирать кровь из пуповины в несколько приемов, используя эксфузию, перфузию, получая пуповинную кровь малыми дозами, используя для сбора крови несколько контейнеров с добавлением антикоагулянта. Сам процесс сбора крови трудоемок.
Техническим решением задачи является повышение эффективности взятия крови у плодов крупного рогатого скота за счет аннулирования процесса спазмирования стенок кровеносных сосудов и свертывания крови в кровеносных сосудах пуповины.
Поставленная задача достигается тем, что используется способ взятия крови у 4-5-месячных плодов-телят, взятых от стельных коров, подвергнутых убою в результате объявления скотоферм, колхозов банкротами.
При выполнении способа процедуры выполняли в следующем порядке:
- извлечение беременной матки после нутровки стельных коров;
- освобождение плода от детской и материнской плацент;
- взятие крови из яремной вены-плода;
- добавление к крови антиоксиданта, отстаивание, центрифугирование, отличающегося тем, что:
- освобождение плода от детской и материнской плацент производят без травмирования и ампутации пуповины;
- кровь берут из яремной вены у 4-5-месячных плодов телят;
- вакуумное пространство в грудной и брюшной полости плода, препятствующее свободному вытеканию крови (гидродинамика), ликвидируют методом прокола их троакаром.
Проводимые манипуляции в предложенном способе приводят к максимальному получению количества крови, необходимого для сбора крови, а также не повышает риск микробного заражения. Процесс сбора крови происходит без контакта с матерью, быстро, не предоставляет никакого риска для мясной продукции убойных туш коров, поступивших на убой с убойного цеха в цех переработки в холодильные камеры, потребителю.
Поголовье коров представлено убою в результате обанкротившегося хозяйства и должно быть перед убоем подвергнуто диспансеризации по заразным и незаразным болезням.
Способ выполняется следующим образом.
1. Сбор крови проводят в прокварцованном помещении.
2. Беременную матку с плодом кладут на металлический стол, дезинфицируют, обливая раствором марганцевого кислого калия 1:1000.
3. Через продольный разрез стенки матки большого рога матки освобождают плод от детской и материнской плацент, от амниотической и аллантоисной жидкостей, не травмируя пупочное кольцо, не ампутируя пуповину, добиваясь свободной видимости головы, шеи, туловища плода.
4. Проводят осмотр и пальпацию яремного желоба, прощупывая яремную вену в дальнейшем у плода, находящегося в лежачем положении. Наружная яремная вена на шее плода расположена под кожей в яремном желобе, образованном плечеголовной и грудоголовной мышцами.
5. Одним движением руки вводят изогнутую со шлангом (130°) иглу в набухшую плодной кровью яремную вену, лежащую в яремном желобе вдоль шеи плода. Для сбора крови из яремной вены у плода используют специальные стеклянные емкости или закрытые трансфузионные системы, содержащие антикоагулянт типа «Гемакон», «Baxter», оснащенные стерильной дренажной иглой, имеющей изгиб в 130°, соответствующий топографии вогнутости мышц яремного желоба, что исключает препятствие для вытекания крови у плода, находящегося в лежачем положении.
6. Троакаром, оставляя гильзу, удаляя стилет, прокалывают стенку брюшной (возле диафрагмы), грудной полости, ликвидируют вакуумное состояние, что способствует беспрепятственой транссудации крови по сосудам, через иглу, введенную в яремную вену, кровь вытекает в емкость с антиоксидантом.
Наличие вакуума в брюшной и грудной полости плода приводит к запустению кровеносных сосудов пуповины (по законам физиологии), поэтому медикам удается брать малые объемы пуповинной крови у только что родившихся детей.
Наиболее обильное образование форменных элементов, ядросодержащих клеток, гемопоэтических и стромальных стволовых клеток, ферментов у плодов в крови достигается в середине беременности, а к концу внутриутробного развития плодов уменьшается. Поэтому наиболее рациональным является то, что кровь от плодов-телят необходимо собирать в 4-5-месячном возрасте внутриутробного развития.
Практическое применение
Важнейшей характеристикой плодной крови является наличие в ней количеств ядросодержащих клеток. Образцы плодной крови подвергали методу подсчета лейкоцитов в формуле, подсчитывая на световом микроскопе при стандартной окраске мазков по Романовскому. Исследования показали, что в пробах крови у плодов-телят имеется от 1-0,5·109 до 2·109 ядросодержащих клеток: лейкоцитов 7,24·109/л до 25,3·109/л, тромбоцитов от 130·109/л до 410,1·109/л.
В последующем проводят фракционирование вытяжек для выделения ядросодержащих клеток из плодной крови центрифугированием супернатанта при 2000 об/мин (20 мин). Из фракционированной плодной крови после центрифугирования изготовили 10% мазь. Ежедневно эту мазь в течение 7 дней по 100 мл вводили в канал шейки матки коровам с послеродовым гнойным цервицитом (таблица 1).
| Таблица 1 | ||||||
| Лечение послеродовых гнойных цервицитов у коров | ||||||
| Способ лечения | Больных коров (всего) | Из них выздоровело | Срок выздоровления (дни) | |||
| число | % | 5 | 10 | 15 | ||
| 10% мазь из фракционной плодной крови после центрифугирования | 12 | 10 | 83,3 | 2 | 8 | 2/16,7% |
| Фуразолидоновые палочки, пенообразующие | 11 | 6 | 54,5 | 3/27,2% |
После использования фракционной мази из плодовой крови (таблица 1) в форме 10% мази коровам в канал шейки матки выздоровление наступило на 10 день 83,3% коров, раннее болевших воспалением шейки матки, это на 28,8% выздоровело коров больше, чем после лечения коров в контрольной группе, которой в канал шейки матки вводили в течение 7 дней по 5-6 фуразолидоновых пенообразующих палочек. Сроки лечения опытной группы коров были на 6-10 дней меньше, чем в контрольной группе коров.
Список литературы
1. Лабораторные методы исследования в ветеринарии. М.:Госиздат сельскохозяйственной литературы. 1954, 223 с.
2. Катаева T.C. (RU); Лопатин B. (RU). Способ взятия крови у нутрии. Авторское свидетельство, патент №2236815 С1, Россия.
3. Исаев А.А; Мхеидзе Д.М; Гришина В.В; Приходько А.В., патентRU №2343928 С1.
Способ получения гемопоэтических и стромальных стволовых клеток от плодов-телят, заключающийся в том, что извлекают беременную матку после нутровки стельных коров, освобождают плод от детской и материнской плацент без травмирования и ампутации пуповины, берут кровь из яремной вены у 4-5 месячных плодов телят, при этом вакуумное пространство в грудной и брюшной полостях плода, препятствующие свободному вытеканию крови (гидродинамика), ликвидируют методом прокола их троакаром, добавляют к крови антиоксидант, отстаивают, центрифугируют.
