Улучшенные нанотела против фактора некроза опухоли-альфа

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложено нанотело против фактора некроза опухоли-альфа (TNF-альфа), которое включает 4 каркасные области FR и 3 HCDR. Описаны варианты полипептида на основе нанотела, каждый из которых способен связываться с TNF-альфа. Один из вариантов таких полипептидов содержит по меньшей мере одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека. Описаны соответствующие кодирующие нуклеиновые кислоты. Раскрыты также: клетка-хозяин для экспрессии нанотела и клетка-хозяин для экспрессии полипептида, каждая из которых содержит соответствующую нуклеиновую кислоту; способ получения нанотела и способ получения полипептида на его основе, где каждый из способов использует соответствующую клетку. Описано применение нанотела для получения лекарственного средства и фармацевтическая композиция против TNF-альфа. Использование изобретения обеспечивает новые нанотела к TNF-альфа с повышенным сродством, стабильностью и пригодностью к получению в мультивалентном формате и пониженной иммуногенностью, что может найти применение в медицине для профилактики, лечения, диагностики заболеваний, опосредованных активностью TNF-альфа. 12 н. и 68 з.п. ф-лы, 62 ил., 47 табл., 65 пр.

 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

1. Нанотело против TNF-альфа, включающее 4 каркасных области (FR1-FR4) и 3 гипервариабельных участка (CDR1-CDR3), в котором:
A) i) CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY;
ii) CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; и
iii) CDR3 содержит содержит аминокислотную последовательность SPSGFN;
или
B) i) CDR1 содержит аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью DYWMY, где изменения представляют собой консервативные замены;
ii) CDR2 содержит аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG, где изменения представляют собой консервативные замены; и
iii) CDR3 содержит аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SPSGFN, где изменения представляют собой консервативные замены,
причем указанное нанотело имеет значение ЕС50 лучше чем 5 нМ в основанном на клетках анализе с использованием клеток KYM.

2. Нанотело по п.1, в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY.

3. Нанотело по п.1, в котором CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

4. Нанотело по п.1, в котором CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

5. Нанотело по п.1, в котором:
CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN; или
CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или
CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

6. Нанотело по п.1, в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

7. Нанотело по п.1, в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

8. Нанотело по любому из пп.1-7, в котором:
CDR1 имеет одно отличие в аминокислотной последовательности от аминокислотной последовательности DYWMY, причем указанное отличие представляет собой консервативную аминокислотную замену;
CDR2 имеет одно или два отличия в аминокислотной последовательности от аминокислотной последовательности EINTNGLITKYPDSVKG, причем указанное(ые) отличие(я) представляет(ют) собой консервативную(ые) аминокислотную(ые) замену(ы); и/или
CDR3 имеет одно отличие в аминокислотной последовательности от аминокислотной последовательности SPSGFN, причем указанное отличие представляет собой консервативную аминокислотную замену.

9. Нанотело по п.1, в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY.

10. Нанотело по п.1, в котором CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

11. Нанотело по п.1, в котором CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

12. Нанотело по п.1, в котором:
CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY и
CDR3 состоит из аминокислотной последовательности SPSGFN; или
CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY и
CDR2 состоит из аминокислотной последовательности EINTNGLITKYPDSVKG; или
CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 состоит из аминокислотной последовательности SPSGFN.

13. Нанотело по п.1, в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

14. Нанотело по п.1, в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY, CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

15. Нанотело по п.1, которое представляет собой гуманизированное нанотело.

16. Нанотело по п.1, которое представляет собой нанотело класса GLEW, в котором аминокислотную последовательность в положениях 44-47 согласно номенклатуре Kabat выбирают из группы, состоящей из GLEW, GVEW, EPEW, GLER, DQEW, DLEW, GIEW, ELEW, GPEW, EWLP, GPER, GLER, и ELEW.

17. Нанотело по п.1, которое дополнительно содержит аргининовый остаток (R) в положении 103.

18. Нанотело по п.1, которое имеет, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности с одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) или 96 (TNF30).

19. Нанотело по п.1, которое имеет, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) или 96 (TNF30).

20. Нанотело по п.1, которое имеет, по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) или 96 (TNF30).

21. Нанотело по п.1, которое имеет, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) или 96 (TNF30).

22. Нанотело по п.1, которое дополнительно содержит лейциновый остаток (L) в положении 108.

23. Нанотело по п.1, выбранное из группы, состоящей из TNF13 (SEQ ID NO:76), TNF14 (SEQ ID NO:77), TNF29 (SEQ ID NO:95) и TNF30 (SEQ ID NO:96).

24. Нанотело по п.1, представляющее собой нанотело TNF30 (SEQ ID NO:96)

25. Нанотело по п.1, которое представляет собой гуманизированный вариант негуманизированного нанотела против TNF-альфа, причем указанное негуманизированное нанотело против TNF-альфа имеет следующие каркасные последовательности: FR1: SEQ ID NO:130; FR2: SEQ ID NO:198; FIG: SEQ ID NO:266; и FR4: SEQ ID NO:334.

26. Нанотело по п.25, которое направлено против того же эпитопа на тримере TNF-альфа, что и нанотело TNF1 (SEQ ID NO:52).

27. Нанотело по п.1, которое направлено против того же эпитопа на тримере TNF-альфа, что и нанотело TNF1 (SEQ ID NO:52).

28. Нанотело по п.1, которое направлено против того же эпитопа на тримере TNF-альфа, что и нанотело TNF3 (SEQ ID NO:60).

29. Нанотело по п.1, которое представляет собой гуманизированный вариант нанотела TNF1 (SEQ ID NO:52).

30. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа, который содержит, по меньшей мере, одно нанотело по любому из пп.1-29.

31. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.30, который, по существу, состоит только из одного нанотела по любому из пп.1 -29.

32. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.30, который содержит два нанотела по любому из пп.1-29.

33. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.32, который содержит два нанотела TNF 30 (SEQ ID NO:96).

34. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.32 или 33, который после связывания с тримером TNF способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

35. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.32 или 33, который способен к внутримолекулярному связыванию, по меньшей мере, с двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

36. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.32, в котором два нанотела против TNF-альфа непосредственно связаны друг с другом.

37. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.32, в котором два нанотела против TNF-альфа связаны друг с другом посредством линкера.

38. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.37, в котором линкер представляет собой аминокислотную последовательность.

39. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.38, в котором линкер представляет собой аминокислотную последовательность, которая содержит, по меньшей мере, 14 аминокислот.

40. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.38, в котором линкер представляет собой аминокислотную последовательность, которая содержит, по меньшей мере, 17 аминокислот.

41. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.37, в котором линкер представляет собой аминокислотную последовательность, которая содержит, по меньшей мере, 20-40 аминокислот.

42. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по любому из пп.39-41, в котором линкер содержит глициновые и сериновые остатки.

43. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.32, который содержит полипептид TNF 7 (SEQ ID NO:73), в котором оба нанотела TNF 1 были гуманизированы.

44. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.32, который содержит полипептид TNF 55 (SEQ Ю NO: 419) или TNF 56 (SEQ ID NO:420).

45. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.30, который дополнительно пегилирован.

46. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа, который содержит, по меньшей мере, одно нанотело по любому из пп.1-29 и, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека.

47. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.46, в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, имеет CDR последовательности, имеющиеся в ALB 8 (SEQ ID NO:102).

48. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.32, который содержит два нанотела по любому из пп.1-29 и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека.

49. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.48. в котором два нанотела против TNF-альфа связаны непосредственно с нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека.

50. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.48, в котором два нанотела против TNF-альфа связаны с нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, посредством линкера.

51. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.50, в котором линкер представляет собой аминокислотную последовательность.

52. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.50 или 51, в котором линкер представляет собой аминокислотную последовательность, которая содержит 3-40 аминокислот.

53. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.50 или 51, в котором линкер представляет собой аминокислотную последовательность, которая содержит 5-15 аминокислот.

54. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.50 или 51, в котором линкер содержит глициновые и сериновые остатки.

55. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.48, в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, имеет последовательности CDR, присутствующие в ALB 8 (SEQ ID NO:102).

56. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.48, в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированное нанотело.

57. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.56, в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированный вариант нанотела ALB I (SEQ ID NO:63).

58. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.56, в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, выбирают из группы, состоящей из ALB 3 (SEQ ID NO:87), ALB 4 (SEQ ID NO:88), ALB 5 (SEQ ID NO:89), ALB 6 (SEQ ID NO:100), ALB 7 (SEQ ID NO:101), ALB 8 (SEQ ID NO:102), ALB 9 (SEQ ID NO:103) и ALB 10 (SEQ ID NO:104).

59. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.58, в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой ALB 8 (SEQ ID NO:102).

60. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.48, который содержит два нанотела против TNF-альфа, которые являются гуманизированными вариантами нанотела против TNF-альфа по любому из пп.1-29, и одного гуманизированного варианта нанотела ALB I (SEQ ID NO:63).

61. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.48, в котором как нанотело TNF 1 (SEQ ID NO:52), так и нанотело ALB I (SEQ ID NO:63) были гуманизированы.

62. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.48, который содержит два нанотела TNF 30 (SEQ ID NO:96) и одно нанотело ALB 8 (SEQ ID NO:102).

63. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.48, который содержит полипептид TNF 60 (SEQ ID NO:417).

64. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.48, который состоит из полипептида TNF 60 (SEQ ID NO:417).

65. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.30, который имеет, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности с полипептидом TNF 60 (SEQ ID NO:417).

66. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.30, который имеет, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с полипептидом TNF 60 (SEQ ID NO:417).

67. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.30, который имеет, по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с полипептидом TNF 60 (SEQ ID NO:417).

68. Полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по п.30, который имеет, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с полипептидом TNF 60 (SEQ ID NO:417).

69. Нуклеиновая кислота, кодирующая нанотело против TNF-альфа по любому из пп.1-29.

70. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по любому из пп.30-68.

71. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.69, способная к экспрессии нанотела против TNF-альфа по любому из пп.1-29.

72. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.70, способная к экспрессии полипептида который способен связываться с TNF-альфа по любому из пп.30-68.

73. Способ получения нанотела против TNF-альфа, который включает культивирование или поддержание клетки-хозяина по п.71 при таких условиях, что указанная клетка-хозяин продуцирует нанотело против TNF-альфа по любому из пп.1-29.

74. Способ по п.73, который дополнительно включает выделение нанотела против TNF-альфа по любому из пп.1-29.

75. Способ получения полипептида, который способен связываться с TNF-альфа, который включает культивирование или поддержание клетки-хозяина по п.72 при таких условиях, что указанная клетка-хозяин продуцирует полипептид, который способен связываться с TNF-альфа, по любому из пп.30-68.

76. Способ по п.75, который дополнительно включает выделение полипептида, который способен связываться с TNF-альфа, по любому из пп.30-68.

77. Фармацевтическая композиция против TNF-альфа, содержащая, (а) по меньшей мере, одно нанотело против TNF-альфа по любому из пп.1-29 и при необходимости, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель; или (b) по меньшей мере, один полипептид, который способен связываться с TNF-альфа по любому из пп.30-68, и при необходимости, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель.

78. Фармацевтическая композиция по п.77 для применения в лечении, по меньшей мере, одного состояния, выбранного из воспаления, ревматоидного артрита, ХОБЛ, астмы, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, воспалительных заболеваний кишечника, множественного склероза, болезни Аддисона, аутоиммунного гепатита, аутоиммунного паротита, диабета I типа, эпидидимита, гломерулонефрита, болезни Грейвса, синдрома Гийена-Барре, тиреоидита Хашимото, гемолитической анемии, системной красной волчанки, мужского бесплодия, множественного склероза, злокачественной миастении, пузырчатки, псориаза, ревматического полиартрита, ревматоидного артрита, саркоидоза, склеродермии, синдрома Шегрена, спондилоартропатии, тиреоидита и васкулита.

79. Применение нанотела против TNF-альфа по любому из пп.1-29 для получения лекарственного средства для лечения, по меньшей мере, одного состояния, выбранного из воспаления, ревматоидного артрита, ХОБЛ, астмы, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, воспалительных заболеваний кишечника, множественного склероза, болезни Аддисона, аутоиммунного гепатита, аутоиммунного паротита, диабета I типа, эпидидимита, гломерулонефрита, болезни Грейвса, синдрома Гийена-Барре, тиреоидита Хашимото, гемолитической анемии, системной красной волчанки, мужского бесплодия, множественного склероза, злокачественной миастении, пузырчатки, псориаза, ревматического полиартрита, ревматоидного артрита, саркоидоза, склеродермии, синдрома Шегрена, спондилоартропатии, тиреоидита и васкулита.

80. Применение полипептида, который способен связываться с TNF-альфа, по любому из пп.30-68 для получения лекарственного средства для лечения, по меньшей мере, одного состояния, выбранного из воспаления, ревматоидного артрита, ХОБЛ, астмы, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, воспалительных заболеваний кишечника, множественного склероза, болезни Аддисона, аутоиммунного гепатита, аутоиммунного паротита, диабета I типа, эпидидимита, гломерулонефрита, болезни Грейвса, синдрома Гийена-Барре, тиреоидита Хашимото, гемолитической анемии, системной красной волчанки, мужского бесплодия, множественного склероза, злокачественной миастении, пузырчатки, псориаза, ревматического полиартрита, ревматоидного артрита, саркоидоза, склеродермии, синдрома Шегрена, спондилоартропатии, тиреоидита и васкулита.