Вазоконстрикторное средство
Владельцы патента RU 2475479:
Федеральное государственное бюджетное учреждение Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации "Медицинский радиологический научный центр" (ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России) (RU)
Изобретение относится к новым N, S-замещенным производным изотиомочевин общей формулы (I):
где R=(CH3)2CH; C2H5, обладающим NOS-ингибирующим, вазоконстрикторным и радиозащитным действием. Соединения обладают NOS-ингибирующей активностью, способной к подавлению каталитической активности синтеза оксида углерода, а также антигипотензивным действием, обусловленным выраженным и длительным повышением АД при тяжелом гиповолемическом шоке. Соединения пригодны для получения фармацевтической композиции, пригодной для лечения гипотонических состояний, таких как коллапс, гиповолемический и вазодилятационный шок, рефракторные стадии шока, артериальная гипотензия, связанная с понижением сосудистого тонуса, в эффективной дозе 0,01÷0,1 LD50 и для получения фармацевтической композиции, пригодной при защите от лучевого поражения в эффективной дозе 0,2÷0,4 LD50. 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 8 пр.
Изобретение относится к химическим соединениям и созданию лекарственных средств, которые могут найти применение в химико-фармацевтической и медицинской промышленности.
Известные на сегодняшний день вазоконстрикторные средства не решают в полной мере проблемы лечения шоковых состояний. Так, в США развитие только септического шока составляет в среднем 480 тысяч случаев в год, которые для более чем 200 тысяч пациентов заканчиваются летальным исходом (Angus D.C., Linde-Zwirble W.T., Lidicker J. et. al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care // Crit. Care Med. - 2001. - V.29, N7. - P.1303-1310. Martin G.S., Mannino P.M., Eaton S. et al. The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000 // N.Engl. J. Med. - 2003. - V.348, N16. - P.1546-1554).
Для борьбы с тяжелой гипотонией в терапии шока в настоящее время применяют вазопрессоры: селективные и неселективные α1-адреномиметики (норэпинефрин, допамин, эпинефрин, фенилэфрин, этилэфрин, мидодрин, арамин) и пептидные вазоконстрикторы (вазопрессин, терлипрессин, ангиотензин, ангиотензинамид и др.) (Brunton L.L., Blumenthal D.K., Murri N. et al. Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics / 12th ed. New York: McGraw-Hill, 2011. Boerma E.C. The role of vasoactive agents in the resuscitation of microvascular perfusion and tissue oxygenation in critically ill patients // Intens. Care Med. - 2010. - V.36. - P.2004-2018).
Практическим недостатком для длительного применения высоких доз α1-адреномиметиков при шоке является наличие у большинства из них β-адреномиметического действия, которое в этих условиях угрожает развитием избыточной тахикардии, нарушениями сердечного ритма, повышением потребности миокарда в кислороде и углублением метаболического ацидоза, что может качественно отягощать течение шока (Волков В.Е.. Волков С.В. Шок. Сепсис. Полиорганная дисфункция / Чебоксары: ПБОЮЛ Наумов Л.А., 2009. - 348 с. Boerma Е.С. The role of vasoactive agents in the resuscitation of microvascular perfusion and tissue oxygenation in critically ill patients // Intens. Care Med. - 2010. - V.36. - P.2004-2018).
Пептидные вазопрессоры являются мощными вазоконстрикторами и не имеют β-адренергического влияния, но их принципиальным недостатком является то, что их действие развивается преимущественно в чревных и коронарных сосудах. Введение таких вазопрессоров может углублять гемодинамические нарушения, снижая объемный кровоток вследствие ишемии миокарда, а также усиливать ацидоз за счет ишемии органов брюшной полости (Волков В.Е.. Волков С.В. Шок. Сепсис. Полиорганная дисфункция / Чебоксары: ПБОЮЛ Наумов Л.А., 2009. - 348 с. Delmas A., Leone М., Rousseau S. et al. Clinical review: Vasopressin and terlipressin in septic shock patients // Crit. Care. - 2005. - V.9, N2. - P.212-222).
По фармакологическим вазопрессорным свойствам наиболее близким прототипом предлагаемым соединениям является известный лекарственный препарат мезатон (фенилэфрин) - гидрохлорид 1-(м-оксифенил)-2-метиламиноэтанола, который селективно стимулирует α1-адренорецепторы, вызывая сужение артериол и повышая артериальное давление. Вазопрессорное действие мезатона длится около 20 минут после внутривенного введения (0.1-0.5 мл 1% раствора) (М.Д.Машковский. Лекарственные средства, 14-е изд., М.: Новая волна, 2000, часть 1, С.233; О.М.Авакян, Фармакологическая регуляция функции адренорецепторов. М.: Медицина, 1988, С.8).
Недостатки мезатона, как и других применяемых в современной клинической практике вазоконстрикторов, - кратковременность терапевтического действия, высокие риски негативных эффектов (нарушения сердечного ритма, повышение потребности миокарда в кислороде, усугубление метаболического ацидоза), способных отягощать течение шоковых состояний, а также слабую эффективность при рефрактерных формах шока, которые существенно ограничивают его терапевтические возможности в коррекции глубокой гипотонии при критических состояниях.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в создании новых лекарственных средств для расширения возможностей терапии тяжелых шоковых состояний.
Ранее проведенные авторами исследования показали, что некоторые производные изотиомочевины обладают способностью к ингибированию NO-синтаз (NOS) и проявляют вазопрессорное действие на моделях геморрагического и эндотоксического шока (Проскуряков С.Я., Кучеренко Н.Г., Филимонова М.В. и соавт. NO-ингибирующая и вазотропная активность некоторых соединений, содержащих тиоамидиновую группу // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2002. - Т.134, №10. - С.393-396. Проскуряков С.Я., Филимонова М.В., Верховский Ю.Г. и соавт. Влияние ингибитора синтазы оксида азота, 2-АДТ на эндотоксин-индуцированные изменения гемодинамики и дыхания крыс // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2004. - Т.138, №.10. - С.446-449).
Сущность изобретения заключается в получении N,S-замещенных производных изотиомочевины общей формулы (1) и их применении в качестве NOS-ингибиторов, вазопрессорных и радиозащитных средств.
Данное изобретение относится к новым химическим соединениям, являющимся производными N,S-замещенных изотиомочевин формулы (1) в виде солей: 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромид и 1-изобутаноил-2-этилизотиомочевины гидробромид.
Синтезированное средство обладает специфической биохимической активностью, способной подавлять эндогенный синтез NO. Оно проявляет вазопрессорное (антигипотензивное) действие, обусловленное выраженным и длительным повышением АД при тяжелом гиповолемическом шоке.
Средство содействует лечению гипотонических состояний (коллапс, гиповолемический и вазодилятационный шок, рефрактерные стадии шока, артериальные гипотензии в связи с понижением сосудистого тонуса) при эффективной дозе 0,01÷0,1 LD50, проявляет радиопротекторное действие при эффективных дозах 0,2÷0,4 LD50.
Перечень фигур
Фиг.1. Структурная формула 1.
где R=(CH3)2CH; C2H5.
Фиг.2. Влияние соединения Т-1023 на выживаемость животных, облученных γ-излучением. 1 - γ-излучение 10 Гр; 2 - 40 мг/кг Т-1023 + γ-излучение 10 Гр; 3 - 82 мг/кг Т-1023 + γ-излучение 10 Гр; 4 - 120 мг/кг Т-1023 + γ-излучение 10 Гр.
Фиг.3. Влияние соединения Т-1032 на выживаемость животных, облученных γ-излучением. 5 - γ-излучение 10 Гр; 6 - 40 мг/кг Т-1032 + γ-излучение 10 Гр; 7 - 150 мг/кг Т-1023 + γ-излучение 10 Гр.
Синтез солей N,S-замещенных изотиомочевин формулы (1)
Согласно изобретению основной способ получения соединений общей формулы (1) состоит в том, что 1-изобутаноилтиомочевину подвергают реакции с соответствующим алкилирующим агентом общей формулы R-Br:
где R=(CH3)2CH; C2H5.
1-Изобутаноилтиомочевину получали ацилированием тиомочевины эквимолярным количеством изобутанового ангидрида в присутствии пиридина. Алкилирование изобутаноилтиомочевины проводили двукратным избытком галоидного алкила общей формулы R-Br в инертном органическом растворителе в запаянной ампуле при повышенной температуре. Предпочтительным растворителем является ацетонитрил. Используемый объем ацетонитрила составляет от 2 до 5 объемов на грамм изобутаноилтиомочевины. Выходы производных изотиомочевины общей формулы (1) в значительной степени зависят от объема алкильного радикала (R) в алкилирующем агенте.
Структуры и чистота полученных соединений подтверждались данными элементного анализа и ПМР-спектроскопии. Хроматографирование проводилось на пластинах Silufol UV-254 в системе аммиак-хлороформ-изопропанол (1:8:4). Спектры ПМР получены на приборе Brucker DR-500 (500 МГц).
В доступной литературе способы получения соединений общей формулы (1) и их свойства не описаны, что свидетельствует о том, что они получены нами впервые.
Пример 1. 1-Изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромид (соединение Т-1023).
Смесь 6 г (40 ммоль) изобутаноилтиомочевины, 9,8 г (80 ммоль) изопропилбромида и 15 мл сухого ацетонитрила в запаянной ампуле нагревали на кипящей водяной бане в течение 20 часов. Растворитель упаривали, остаток отфильтровывали и перекристаллизовывали из 4-метил-2-пентанона.
Выход 3,6 г (33%). Тпл 129-131°C. Спектр ПМР (DMSO-d6) δ 1,1 (д, 6Н); 1,36 (д, 6Н); 2,73 (м, 1H); 4,1 (м, 1H); 10,9 (ушир.т, 2Н).
Вычислено, %: C 35,69; H 6,37; N 10,41 C8H16N2OS·HBr
Найдено, %: C 35,76; H 6,51; N 10,45
Пример 2. 1-Изобутаноил-2-этилизотиомочевины гидробромид (соединение Т-1032)
Смесь 1,5 г (10 ммоль) изобутаноилтиомочевины, 2,2 г (20 ммоль) этилбромида и 5 мл сухого ацетонитрила в запаянной ампуле нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 часов. Растворитель упаривали, остаток отфильтровывали и дважды перекристаллизовывали из 4-метил-2-пентанона.
Выход 1,6 г (62%). Тпл 68-70°C. Спектр ПМР (DMSO-d6) δ 1,1 (д, 6Н); 1,3 (т, 3H); 2,8 (м, 1H); 3,2 (к, 2Н); 10,7-11,2 (ушир.т, 2Н).
Вычислено, %: C 32,95; H 5,88; N 10,98 C7H14N2OS·HBr
Найдено, %: C 32,92; H 5,95; N 11,02
Биохимические и фармакологические свойства заявленных соединений.
Острая токсичность.
Пример 3. Токсичность соединений Т-1023 и Т-1032 исследована на беспородных белых мышах-самцах массой 22-26 г по стандартному тесту острой токсичности при однократном введении (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей ред. члена-корреспондента РАМН, проф. Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп.- М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.). Исследуемые вещества растворялись в физиологическом растворе и вводились внутрибрюшинно. Срок наблюдения за опытными животными составлял 14 суток. Оценку среднелетальной дозы (LD50) проводили по методу Литчфильда-Уилкоксона (Litchfild J.T., Wilcoxon F.A. Asimplified method of evaluating dose effect experiments // J. Pharm. Exp. Ther. - 1947. - V.95. - P.99-113).
| Таблица 1 | |
| Острая токсичность заявленных соединений | |
| Химическое соединение | LD50, мг/кг |
| Т-1023 | 410 (268÷552) |
| Т-1032 | 515 (362÷692) |
В результате проведенных испытаний установлено, что LD50 заявленных соединений составляет 400-500 мг/кг (табл. 1). Следовательно, в соответствии с классификацией токсичности химических веществ соединения общей формулы (1) являются умеренно токсичными веществами. Причем при данном способе введения заявленные соединения имеют более низкую токсичность, чем α-адреномиметические вазопрессоры, используемые в терапии шоковых состояний (LD50 мезатона составляет 191 мг/кг).
NOS ингибирующая активность.
Следующий аспект изобретения состоит в открытии у соединений формулы (1) специфической биохимической активности, состоящей в способности подавлять эндогенный синтез NO путем ингибирования каталитической активности NO-синтаз.
Исследование влияния заявленных соединений на активность NOS проведено радиометрическим методом in vitro по скорости накопления [3H]-L-цитруллина в катализируемой NOS реакции окисления [3Н]-L-аргинина (van Eijk Н.М., Luiking Y.C., Deutz N.E. Method using stable isotopes to measure nitric oxide synthesis in the L-arginine/NO pathway in health and disease // J. Chromatogr. В Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. - 2007. - V.851, N.1-2. - P.172-185). Количественная оценка NOS-ингибирующей активности проводилась in vitro в двух препаратах: в растворимой фракции гомогената макрофагов мыши, стимулированных липополисахаридом Е.colli, где NO-синтазная активность представлена преимущественно индуцибельной NOS (iNOS), и в растворимой фракции гомогената мозжечка крыс, где NO-синтазная активность представлена преимущественно нейрональной NOS; (nNOS).
Пример 4. В табл.2 представлены результаты исследования каталитической активности индуцибельной и нейрональной NOS в зависимости от концентрации в среде заявленных соединений.
| Таблица 2 | ||||
| Влияние заявленных соединений на каталитическую активность NOS | ||||
| Концентрация исследуемого соединения | Т-1023 | Т-1032 | ||
| Активность фермента, % | ||||
| iNOS | nNOS | iNOS | nNOS | |
| 0 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 1 мкМ | 71,8 | 100 | 99,2 | 93,4 |
| 10 мкМ | 29 | 65,5 | 56 | 65,3 |
| 100 мкМ | 26,3 | 43,6 | 34,2 | 33,4 |
Полученные результаты свидетельствуют, что, в целом, соединения Т-1023 и Т-1032 проявляют отчетливую NOS-ингибирующую активность. Причем заявленные соединения проявляют ингибирующую активность к iNOS и nNOS примерно в равной мере, без существенной селективности к различным изоформам NOS.
Вазопрессорное действие.
Следующий аспект изобретения состоит в открытии у соединений формулы (1) вазопрессорного (антигипотензивного) действия, проявляющегося длительным достоверным повышением АД при тяжелом гиповолемическом шоке, а также касается предложенного способа лечения гипотонических состояний (коллапс, гиповолемический и вазодилятационный шок, рефрактерные стадии шока, артериальные гипотензии в связи с понижением сосудистого тонуса), заключающегося в назначении эффективной дозы заявленных соединений или фармацевтических композиций, включающих терапевтически эффективное количество этих соединений.
Исследование вазопрессорных свойств соединений Т-1023 и Т-1032 проведено на самках крыс линии Wistar массой 300-400 г на моделях тяжелого геморрагического шока (по 3-7 животных в каждой экспериментальной группе).
Перед оперативным вмешательством животное наркотизировали тиопенталом натрия (60 мг/кг, в/б). Далее устанавливали трахеостому, катетеризировали яремную вену и обе сонные артерии, подключали инвазивный датчик АД, электроды регистрации ЭКГ. Внутривенно вводили гепарин 100 ед. После стабилизации состояния животного с помощью приборов Polygraph RM-6000 (Nihon Kohden, Japan) и кардиограф (Nihon Kohden, Japan) регистрировали исходные показатели частоты сердечных сокращений (ЧСС), дыхательных движений (ЧДД), систолического и диастолического артериального давления (АДс, АДд) в левой сонной артерии.
Для создания гиповолемического шока из правой сонной артерии производили забор крови в объеме 2,5 мл на 100 г массы опытного животного. Такая массивная и пролонгированная кровопотеря (~50% объема циркулирующей крови) приводит к развитию крайне тяжелой степени геморрагического шока (Саркисов Д.С., Ремезов П.И. Воспроизведение болезней человека в эксперименте / Под ред. А.А.Вишневского - М. - 1960. - 780 с.). Значительная часть животных, не получающих лечения, гибнет после такой кровопотери в течение первых двух часов.
По окончании кровопотери у животных повторяли регистрацию показателей внешнего дыхания и центральной гемодинамики. Затем животным опытных групп внутрибрюшинно вводили одно из исследуемых соединений (Т-1023 в дозе 5 мг/кг, Т-1032 в дозе 20 мг/кг), растворенное в физиологическом растворе - из расчета 0,1 мл на 100 г веса животного. Дальнейший мониторинг физиологических показателей продолжали в течение последующих 60 минут.
Пример 5. Массивная кровопотеря приводила к развитию у экспериментальных животных тяжелого геморрагического шока (табл.3). К моменту окончания кровопотери показатели АДс и АДд были достоверно понижены и составляли 26-28% от исходных значений. Характерной для более легких степеней шока компенсаторной тахикардии не наблюдалось - наоборот, отмечалась умеренная брадикардия.
Внутрибрюшинное введение соединения Т-1023 в дозе 5 мг/кг крысам (n=7) в состоянии глубокого геморрагического шока вызывало устойчивое и длительное повышение АД, преимущественно за счет роста АДд (табл.3). Эффект развивался с первых минут после инъекции, мягко, без видимых изменений состояния животного. Через 10-20 минут значения АДс достигали 75-80%, АДд - 90-100% от исходных значений. Снижалась выраженность брадикардии. Частота и характер дыхания соответствовали физиологической норме. С 50-й минуты после инъекции наблюдается тенденция к ослаблению вазопрессорного эффекта Т-1023.
| Таблица 3 | ||||
| Влияние соединения Т-1023 на показатели АД, ЧСС и ЧДД у крыс-самок после кровопотери (n=7) | ||||
| Время наблюдения, мин | АДс (ммHg) | АДд (ммHg) | ЧСС (уд./мин) | ЧДД (дв./мин) |
| Исходно | 209.4±5.8 | 136.6±1.5 | 431.6±14.8 | 64.6±6.4 |
| Кровопотеря | 54.4±1.2* | 38.9±1.4* | 376.9±16.4* | 64.0±5.1 |
| Т-1023, 5 мг/кг | ||||
| 2 | 85.6±4.1*” | 68.4±4.7*” | ||
| 5 | 110.7±6.0*” | 92.9±6.6*” | 383.9±23.8 | 58.6±5.6 |
| 10 | 158.4±15.8*” | 122.1±9.3” | 384.0±30.5 | 56.0±5.6 |
| 20 | 171.4±12.1*” | 132.6±5.8” | 394.1±20.1 | 64.1±5.4 |
| 30 | 136.7±11.8*” | 110.1±10.7*” | 365.3±31.8 | 58.4±4.6 |
| 40 | 170.0±10.2*” | 132.0±4.5” | 376.4±25.8 | 54.6±3.3 |
| 50 | 159.3±8.3*” | 126.4±6.9*” | 381.0±27.2 | 54.9±5.0 |
| 60 | 148.7±6.5*” | 121.4±6.3*” | 380.9±24.4 | 55.3±6.4 |
| Примечание: | ||||
| * - достоверное различие по U-критерию Уитни-Манна (p<0,05) с исходным значением показателя; | ||||
| " - достоверное различие по U-критерию Уитни-Манна (p<0,05) со значением показателя в момент окончания кровопотери. |
Пример 6. Подобно Примеру 5, кровопотеря приводила к развитию у опытных животных тяжелого геморрагического шока (табл.4). К моменту окончания кровопотери показатели АДс и АДд были достоверно снижены и составляли 27-30% от исходных значений. Компенсаторной тахикардии не наблюдалось.
Внутрибрюшинное введение соединения Т-1032 в дозе 20 мг/кг крысам (n=3) в состоянии глубокого геморрагического шока сопровождалось устойчивым и длительным повышением АД, преимущественно за счет роста АДд (табл.4). Эффект развивался с первых минут после инъекции, без видимых изменений состояния животного. Через 10 минут значения АДс достигали 80-85%, АДд - 100% от исходных значений. ЧСС и ЧДД весь период наблюдения статистически не отличались от физиологической нормы. И хотя с 40-50-й минуты после инъекции наблюдалась тенденция к ослаблению вазопрессорного эффекта Т-1032, показатели АДд до конца всего периода наблюдения статистически не отличались от исходных значений.
| Таблица 4 | ||||
| Влияние соединения Т-1032 на показатели АД, ЧСС и ЧДД у крыс-самок после кровопотери (n=3) | ||||
| Время наблюдения, мин | АДс (ммHg) | АДд (ммHg) | ЧСС (уд/мин) | ЧДД (дв/мин) |
| Исходно | 190.7±12.3 | 134.3±5.2 | 423.7±14.4 | 62.7±6.6 |
| Кровопотеря | 51.7±5.9* | 41.0±5.5* | 401.3±15.6 | 56.7±11.7 |
| Т-1032, 20 мг/кг | ||||
| 2 | 92.3±3.2*” | 78.0±2.1*” | ||
| 5 | 117.0±8.0*” | 100.7±9.3*” | 433.3±13.9 | 53.3±10.3 |
| 10 | 158.3±12.7” | 132.3±8.7” | 421.0±22.0 | 48.7±11.6 |
| 20 | 159.7±17.7” | 132.3±11.1” | 411.3±20.7 | 51.3±7.4 |
| 30 | 148.0±17.9” | 124.7±13.7” | 400.0±0 | 54.0±12.0 |
| 40 | 128.0±9.5*” | 110.3±10.3” | 402.3±12.2 | 50.0±9.0 |
| 50 | 140.7±8.8*” | 117.7±5.8” | 403.7±3.7 | 52.0±9.2 |
| 60 | 141.0±30.6” | 113.0±19.7” | 401.3±15.6 | 51.3±5.7 |
| Примечание: обозначения аналогичны табл. 3. |
Полученные экспериментальные данные позволяют авторам изобретения утверждать наличие у соединений формулы (1) выраженных вазопрессорных свойств, без признаков β-адренергического, инотропного влияния, характерного для вазопрессорных катехоламинов, что является одним из аспектов данного изобретения.
Важной особенностью наблюдаемых сосудистых эффектов является высокая продолжительность вазопрессорного действия при однократном введении заведомо нетоксичных доз заявленных соединений (40-50 минут), существенно превосходящая таковую при действии «стандартных» мезатона, норэпинефрина или допамина (не более 15-20 минут). В этой связи у авторов изобретения есть основания рассматривать соединения формулы (1) перспективными в качестве основы для создания новых вазопрессорных, противошоковых средств и предложить способ лечения гипотонических состояний (коллапс, гиповолемический и вазодилятационный шок, рефрактерные стадии шока, артериальные гипотензии в связи с понижением сосудистого тонуса), заключающийся в назначении эффективной дозы (~0,01-0,1 LD50) заявленных соединений или фармацевтических композиций, включающих терапевтически эффективное количество этих веществ. Что также является одним из аспектов данного изобретения.
Радиозащитное действие.
Следующий аспект изобретения состоит в подтверждении у соединений формулы (1) радиопротекторного действия, проявляющегося статистически достоверным повышением 30-суточной выживаемости опытных животных при воздействии летальных доз γ-излучения, и касается предложенного способа защиты биологических объектов от радиационного поражения, заключающегося во введении перед лучевым воздействием эффективных доз заявленных соединений или фармацевтических композиций, включающих эффективное количество этих соединений.
Изучение радиопротекторных свойств соединений общей формулы (1) проведено на белых беспородных мышах (по 10 животных в каждой экспериментальной группе). Животным опытных групп внутрибрюшинно вводили одно из исследуемых соединений (Т-1023 в дозах 40, 82 и 120 мг/кг, Т-1032 в дозах 40 и 150 мг/кг), растворенное в физиологическом растворе - из расчета 0,1 мл на 100 г веса животного. Введение исследуемых соединений в столь высоких дозах не сопровождалось видимыми изменениями в состоянии и поведении животных. Через 10-15 минут после инъекции животных опытных и контрольных групп подвергали общему облучению γ-излучением в дозе 10 Гр на исследовательской установке «Луч-2» (2,14 рад/сек). Радиозащитные свойства соединений Т-1023 и Т-1032 оценивали по стандартным показателям 6, 12 и 30-суточной выживаемости и кривым выживаемости животных в течение 30 суток наблюдения (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей ред. члена-корреспондента РАМН, проф. Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.).
В наших исследованиях 6-суточная выживаемость контрольных животных составляла 50%, 12-суточная - 10%, а к 13-м суткам наблюдалась 100%-ная гибель контрольных животных (табл.5, 6; фиг.2 кривая 1; фиг.3 кривая 5).
Пример 7. Введение животным перед радиационным воздействием соединения Т-1023 в дозе 40 мг/кг (~1/10 LD50) сопровождалось достаточно слабым радиозащитным эффектом - рост показателей выживаемости наблюдался в пределах статистической погрешности (табл.5; фиг.2 кривая 2). Однако в дозах 82 мг/кг (~1/5 LD50) и 120 мг/кг (~1/3 LD50) соединение Т-1023 обеспечивало в наших экспериментах 100%-ную выживаемость животных в течение всего периода наблюдения (табл.5, фиг.2 кривые 3, 4).
| Таблица 5 | ||||
| Влияние Т-1023 на показатели выживаемости животных при воздействии γ-излучения | ||||
| Группа | Выживаемость, % | Средняя прод. жизни, сутки1 | ||
| 6-суточная | 12-суточная | 30-суточная | ||
| Контроль; 10 Гр | 50,0±5,3 | 10,0±3,2 | 0 | 7,4±1,1 |
| Т1023 40 мг/кг + 10 Гр | 70,0±4,8 | 50,0±5,3 | 20,0±4,2 | 13,8±3,1 |
| Т1023 82 мг/кг + 10 Гр | 100** | 100** | 100** | 30* |
| Т1023 120 мг/кг + 10 Гр | 100** | 100** | 100** | 30* |
| Примечание: | ||||
| 1 - средняя продолжительность жизни животных в течение 30 суток наблюдения; | ||||
| * - статистически значимое различие с контролем (p<0,05) по U-критерию Уитни-Манна: | ||||
| ** - статистически значимое различие с контролем (p<0,05) по точному критерию Фишера. |
Пример 8. Введение животным перед радиационным воздействием соединения Т-1032 в дозе 40 мг/кг (~1/12 LD50) сопровождалось умеренным радиозащитным эффектом, проявившемся в снижении темпов развития начальных этапов лучевой болезни - 100%-ная 6-суточная выживаемость. Но в последующем периоде наблюдения рост показателей выживаемости не превысил статистическую погрешность (табл.6; фиг.3 кривая 6). В то же время в дозе 150 мг/кг (~1/3 LD50) соединение Т-1032 обеспечивало в наших экспериментах выраженный радиозащитный эффект, сопровождавшийся повышением 30-суточной выживаемости опытных животных до 80% (табл.6, фиг.3 кривая 7).
| Таблица 6 | ||||
| Влияние Т-1032 на показатели выживаемости животных при воздействии γ-излучения | ||||
| Группа | Выживаемость, % | Средняя прод. жизни, сутки1 | ||
| 6-суточная | 12-суточная | 30-суточная | ||
| Контроль; 10 Гр | 50,0±5,3 | 10,0±3,2 | 0 | 7,4±1,1 |
| Т1032 40 мг/кг+10 Гр | 100** | 30,0±4,8 | 20,0±4,2 | 13,8±3,1 |
| Т1032 150 мг/кг+10 Гр | 90,0±3,2 | 80,0±4,2** | 80,0±4,2** | 25,4±3,1* |
| Примечание: обозначения аналогичны табл.5. |
Полученные данные позволяют авторам изобретения утверждать наличие у соединений формулы (1) высоких радиозащитных свойств при их введении перед лучевым воздействием, что является одним из аспектов данного изобретения.
Согласно литературным данным при воздействии γ-излучения в дозе 10 Гр 30-суточная выживаемость данного вида животных составляет около 2%, и этот показатель увеличивается до 50-55% при введении максимально переносимой дозы (1/2 LD50) «стандартного» радиопротектора цистеамина (Васин М.В. Средства профилактики и лечения лучевых поражений. - М. - 2006. - 340 с.). В этой связи наблюдаемый масштаб радиозащитного действия заявленных соединений (80-100%) позволяет авторам изобретения рассматривать эти вещества весьма перспективными в качестве основы для создания новых эффективных радиозащитных средств и обоснованно предложить новый метод защиты биологических объектов от лучевого поражения, состоящим во введении перед лучевым воздействием эффективных доз (0,2÷0,4 LD50) заявленных соединений или фармацевтических композиций, включающих эффективное количество этих веществ, что также является одним из аспектов данного изобретения.
Доказательство достижения заявленного результата
В результате исследований впервые синтезированных производных изотиомочевины выявлены соединения общей формулы (1), обладающие выраженной NOS-ингибирующей активностью. Благодаря этому специфическому свойству соединения общей формулы (1) могут быть отнесены к новой группе отечественных фармакологических препаратов - ингибиторов NOS. Они обладают вазопрессорным действием, отчетливо проявляющимся на модели геморрагического шока у крыс, без признаков β-адренергического, инотропного влияния, характерного для вазопрессорных катехоламинов. Эффект развивается с первых минут после инъекции, без видимых изменений состояния животного. Через 10 минут значения АДс достигали 80-85%, АДд - 100% от исходных значений. ЧСС и ЧДД весь период наблюдения статистически не отличались от физиологической нормы. И хотя с 40-50-й минуты после инъекции заявленных соединений наблюдалась тенденция к ослаблению вазопрессорного эффекта, показатели АДд до конца всего периода наблюдения статистически не отличались от исходных значений.
Соединения общей формулы (1) менее токсичны, чем прототип - мезатон, а по длительности вазоконстрикторного действия превосходят его и многие другие вазопрессорные препараты, применяющиеся в медицинской практике для лечения гипотонических состояний.
Полученные экспериментальные данные позволяют утверждать, что соединения формулы (1) могут применяться для лечения гипотонических состояний (коллапс, гиповолемический и вазодилятационный шок, рефрактерные стадии шока, артериальные гипотензии в связи с понижением сосудистого тонуса) при назначении их в эффективной дозе (0,01÷0,1 LD50) или в составе фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество этих соединений.
Кроме того, у соединений формулы (1) выявлено радиозащитное действие, проявляющееся статистически достоверным повышением 30-суточной выживаемости мышей при воздействии летальных доз γ-излучения. Радиозащитный эффект наблюдался при внутрибрюшинном введении указанных соединений в дозах, не вызывающих токсические реакции у животных, и превосходил защитный эффект допущенного к практическому применению известного радиопротектора цистеамина. Причем в отличие от цистеамина заявленные соединения проявляли высокий радиозащитный эффект при заведомо нетоксичных дозах (0,2 LD50), что указывает на наличие у этих соединений значительной терапевтической широты.
Полученные экспериментальные данные позволяют утверждать, что соединения формулы (1) могут применяться для защиты биологических объектов от радиационного поражения при назначении их в эффективных дозах (0,2÷0,4 LD50) или фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество этих соединений.
1. N,S-замещенные производные изотиомочевины общей структурной формулы:
где R=(CH3)2СН; С2Н5,
обладающие NOS-ингибирующим, вазоконстрикторным и радиозащитным действием.
2. Соединение по п.1, обладающее NOS-ингибирующей активностью, способной к подавлению каталитической активности синтеза оксида углерода.
3. Соединение по п.1, отличающееся тем, что проявляет антигипотензивное действие, обусловленное выраженным и длительным повышением АД при тяжелом гиповолемическом шоке.
4. Соединение по п.1 для получения фармацевтической композиции, пригодной для лечения гипотонических состояний, таких как коллапс, гиповолемический и вазодилятационный шок, рефракторные стадии шока, артериальная гипотензия, связанная с понижением сосудистого тонуса, в эффективной дозе 0,01÷0,1 LD50.
5. Соединение по п.1, обладающее радиозащитным действием для получения фармацевтической композиции, пригодной при защите от лучевого поражения в эффективной дозе 0,2÷0,4 LD50.
