Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности с1 ингибитора по способности связываться с igal-протеазой

Авторы патента:

Козлов Леонид Васильевич (RU)

Зинченко Алексей Алексеевич (RU)

Румш Лев Давыдович (RU)

Андина Светлана Семеновна (RU)

Бичучер Анна Мироновна (RU)

Ягудаева Елена Юрьевна (RU)

G01N33/531 - получение материалов для иммунологических испытаний

Владельцы патента RU 2475756:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Группа изобретений относится к медицинской иммунологии, а именно к способу определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах и набору для его осуществления. Способ определения предусматривает: сорбцию в лунках микропанели IgA1-протеазы, внесение в лунки микропанели образцов проб, содержащих определяемый функционально активный С1 ингибитор, проведение инкубации, во время которой происходит ковалентное связывание С1 ингибитора с IgA1-протеазой, определение количества связавшегося в лунках С1 ингибитора с помощью конъюгата антител против С1 ингибитора с ферментом и хромогенного субстрата для этого фермента. Способ основан на способности функционально активного С1 ингибитора ковалентно связываться с IgA1-протеазой. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом IgA1-протеазы, конъюгат фермента с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер этого фермента и стандарт для активного С1 ингибитора. Группа изобретений обеспечивает разработку простого способа и набора для определения функциональной активности ингибитора С1 и исследования его ингибирования. 2 н.п. ф-лы, 1 ил.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

С1 ингибитор системы комплемента в качестве ингибитора сериновых протеиназ участвует в регуляции многих ферментов плазмы крови, таких как C1r, C1s - компонентов классического пути комплемента, калликреина калликреин-кининовой системы, а также факторов свертывающей и противосвертывающей систем - XIa, XIIa, XIIf и плазмина (фибринолизина) [1]. Хотя С1 ингибитор и относится к классу серпинов (ингибиторов сериновых протееиназ), известно, что такие ингибиторы не всегда способны осуществлять свое действие в отношении любой сериновой протеиназы, в особенности это относится к высоко специфичным ферментам.

Необходимость определения функциональной активности C1 ингибитора в крови больных диктуется тем обстоятельством, что дефицит этого белка приводит к периодическим отекам, затрагивающим главным образом конечности, лицо, гортань и слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта [1, 2].

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. В патенте США [3] использован модифицированный метод определения активности С1 ингибитора, основанный на тест-системе производства Cycotech (Сан Диего, Калифорния, США). Способ предусматривает следующие этапы: 1 - на микропанели сорбируют авидин, 2 - получают высокоочищенный ферментативно активный препарат субкомпонента C1s, 3 - синтезируют биотинилированный препарат C1s, 4 - образцы проб, содержащих определяемый функционально активный С1-ингибитор, инкубируют с биотинилированным препаратом C1s, 5 - образующийся комплекс функционально активного С1-ингибитора с C1s сорбируют в лунках микропанели, покрытых авидином, 6 - количество связавшегося в лунках С1-ингибитора определяют с помощью конъюгата козьих антител против С1-ингибитора с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата для пероксидазы. К недостаткам метода можно отнести его многостадийность (использование дополнительной стадии взаимодействия биотин-авидин), а также необходимость получения биотинилированного C1s и трудности в приобретении ферментативно активного C1s (присутствует в сыворотке крови в проферментной форме в количестве 30 мг/л, коммерчески недоступен).

Ранее был разработан способ определения функциональной активности С1 ингибитора [4], который предусматривает: сорбцию в лунках микропанели фибринолизина (аптечный препарат плазмина), образцы проб, содержащих определяемый функционально активный С1 ингибитор, вносят в лунки микропанели и проводят инкубацию, во время которой происходит ковалентное связывание С1 ингибитора с фибринолизином, количество связавшегося в лунках С1 ингибитора определяют с помощью конъюгата антител против С1 ингибитора с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата для пероксидазы. Способ основан на способности функционально активного С1 ингибитора ковалентно связываться с фибринолизином. К недостаткам метода можно отнести высокую протеолитическую активность плазмина и его склонность к автолизу, что обусловливает низкую стабильность плазмина при хранении и возможность нежелательного гидролиза ингибитора.

Таких недостатков лишены протеазы, обладающие ограниченной специфичностью. Одним из наиболее специфичных ферментов является IgA1-протеаза микробного происхождения, для которой практически отсутствуют другие субстраты, кроме единственного природного - человеческого иммуноглобулина А1. Однако не было известно подвергается ли этот фермент ингибированию С1 ингибитором, то есть способен ли он ковалентно связывать этот ингибитор. Сама же IgA1-протеаза, продуцируемая Neisseria meningitidis, имеет определенные коммерческие перспективы. Известен метод определения ее активности [5], использования ее для определения иммуноглобулинов А1 и А2 человека [6] и метод ее выделения из культуры Neisseria meningitidis [7].

Задачей заявленного изобретения является повышение надежности определения функциональной активности С1 ингибитора комплемента человека на основе иммуноферментного метода.

Поставленная задача достигается путем разработки способа иммуноферментного определения фунциональной активности С1 ингибитора по способности связываться с IgA1-протеазой, который предусматривает: сорбцию в лунках микропанели высокоспецифичной IgA1-протеазы, внесение в лунки микропанели образцов проб, содержащих определяемый функционально активный С1 ингибитор, проведение инкубации, во время которой происходит ковалентное связывание С1 ингибитора с IgA1-протеазой, определение количества связавшегося в лунках С1 ингибитора с помощью конъюгата антител против С1 ингибитора с ферментом и хромогенного субстрата для этого фермента. Способ основан на способности функционально активного С1 ингибитора ковалентно связываться с IgA1-протеазой.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка надежного способа и набора для иммуноферментного определения функциональной активности С1 ингибитора комплемента человека, использующего высокоспецифичную IgA1-протеазу.

Пример 1. Иммуноферментное определение функциональной активности препарата С1 ингибитора по способности связываться с IgA1-протеазой. Препарат IgA1-протеазы Neisseria meningitidis в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, с конечной концентрацией 15-50 мкг/мл вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Три раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺(VBS²⁺), по 200 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл VBS²⁺. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора, содержащего определяемый С1 ингибитор в VBS²⁺, в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, трехкратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против С1 ингибитора человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, пятикратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Количество компонента С1 ингибитора рассчитывают по стандартной кривой (рис.1).

На рисунке представлено определение активности С1 ингибитора методом иммуноферментного анализа.

Пример 2. Набор для иммуноферментного определения функциональной активности С1 ингибитора по способности связываться с IgA1-протеазой. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом IgA1-протеазы, конъюгат пероксидазы с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью С1 ингибитора человека. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных на рисунке результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного С1 ингибитора с коэффициентом корреляции R²=0,999, что позволяет достоверно определять функциональную активность С1 ингибитора заявленным способом в концентрациях от 1 нг/мл с использованием описанного набора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Davis A.E. 3rd. C1 inhibitor and hereditary angioneurotic edema. Ann. Rev. Immunol. 1988. V.66. P.595-628.

2. Андина C.C., Козлов Л.В., Дьяков В.Л. Определение функциональной активности, количества С1 ингибитора и аутоантител к нему как инструмент дифференциальной диагностики отеков. Биомедицинская химия. 2004. Т.50. №1. С.86-91.

3. Pilatte Y.M., Hammer C.H., Frank M.M., Fries L.F. Process for the purification of C1-inhibitor. Patent USA US 5030578. July 9, 1991.

4. Козлов Л.В., Андина C.C., Гузова B.A., Дьяков В.Л., Баталова Т.Н. Способ определения функциональной активности C1 ингибитора комплемента человека. Патент РФ №2195662. Бюл. №36. 27.12.2002.

5. Козлов Л.В., Романов С.В., Дьяков В.Л., Суровцев В.И., Теймуразов М.Г. Способ и набор для иммуноферментного определения активности и ингибирования IgA1-протеазы. Патент РФ №2310853. Бюл. №32. 20.11.2007.

6. Козлов Л.В., Бичучер A.M., Романов С.В., Дьяков В.Л., Панурина Р.Л. Способ и набор для иммуноферментного определения IgA1 и IgA2 на основе поликлональным антител к IgA. Патент РФ №2310854. Бюл. №32. 20.11.2007.

7. Ягудаева Е.Ю., Жигис Л.С., Разгуляева О.А., Зуева B.C., Мельников Э.Э., Зубов В.П., Козлов Л.В., Бичучер A.M., Котельникова О.В., Аллилуев А.П., Аваков А.Э., Румш Л.Д. Выделение и определение активности IgA1-протеиназы из культуры N. meningitidis // Биоорган, химия. 2010. Т.36. №1. С.89-97.

1. Способ иммуноферментного определения функциональной активности С1 ингибитора по способности связываться с IgAl-протеазой, характеризующийся связыванием с сорбированной в лунках микропанели протеиназой С1 ингибитора определяемого образца с неизвестной активностью, определением количества связавшегося С1 ингибитора с помощью конъюгата фермента с антителами против С1 ингибитора и субстрата этого фермента и последующего расчета активности С1 ингибитора по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что в лунках микропанели для иммуноферментного анализа в качестве лиганда связывания сорбируют IgAl-протеазу.

2. Набор для иммуноферментного определения функциональной активности С1 ингибитора по способности связываться с IgAl-протеазой, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом IgAl-протеазой, конъюгат фермента с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер и стандарт для расчета активности С1 ингибитора.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и представляет собой способ получения слабоположительной контрольной сыворотки, содержащей AD и AY субтипы HBsAg, включающий отбор донорских сывороток с помощью ИФА, титрование положительной сыворотки, содержащей AD & AY субтипы HBsAg в разводящем стабилизированном растворе, генотипирование, проведение теста термодеградации для установления сроков годности панели, отличающийся тем, что положительные контрольные сыворотки, содержащие AY и AD субтипы HBsAg, разводят до диапазона концентраций от 0,05 до 0,025 МЕ/мл и вязкости, равной вязкости нормальной сыворотки человека, а в качестве разводящего стабилизированного раствора используют отрицательную дефибринизированную и безлипидную сыворотку, не содержащую маркеры HBV инфекции, для выявления которой предназначена искомая тест-система.

Способ изготовления панели сывороток с hbsag ad- и ay-субтипов для контроля качества диагностики гепатита в // 2463610

Изобретение относится к технологии изготовления референс-панелей сывороток, содержащих антигены вирусных инфекций. .

Способы получения растворимых многопроходных трансмембранных белков // 2441071

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в биохимии, протеомике и фармакологии для экспрессии и получения сложных трансмембранных белков из бактериальных штаммов-продуцентов.

Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека // 2417375

Изобретение относится к медицинской иммунологии и касается способа и набора для определения функциональной активности компонента С3 комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Способ получения антигенного препарата из бруцелл в l-форме // 2416429

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к микробиологии и иммунологии. .

Способ получения r-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) // 2411041

Изобретение относится к области ветеринарии. .

Способ получения диагностикума эритроцитарного сибиреязвенного антигенного для обнаружения антител к протективному антигену // 2410699

Изобретение относится к медицинской микробиологии, может быть использовано для обнаружения антител к протективному антигену в сыворотках людей и животных, больных сибирской язвой, в сыворотках зараженных, а также иммунизированных протективным антигеном животных.

Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации при коксиеллезе крупного рогатого скота // 2410698

Способ изготовления низкотитражной панели сывороток для контроля качества тест-систем и иммуноблотов, используемых для диагностики антител к разным субтипам вгс // 2408024

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в технологии приготовления панели сывороток, содержащих антитела к тестируемому вирусу, для контроля чувствительности, специфичности и сроков годности иммуноферментных, иммунохемилюминесцентных тест-систем и иммуноблотов.

Штамм боррелий генотипа borrelia garinii nt 29, используемый для идентификации боррелий и приготовления диагностических препаратов // 2407787

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Способ получения антигена из сетарий для диагностики дирофиляриоза собак // 2487722

Изобретение относится к области ветеринарии и касается способа получения антигена из сетарий

Способ получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (рбп) // 2488119

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП)

Модифицированный пептид и его использование для тестирования онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии // 2491291

Изобретение относится к области:- медицины, а именно к диагностике нарушений функции гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и мониторингу эффективности проводимой терапии; - иммуно-диагностики, а именно к определению уровня содержания натуральных антител в сыворотке крови; - пептидной химии, а именно к конструированию и модификации синтетических пептидных фрагментов для использования в качестве антигена для определения натуральных антител к природным белкам человеческого организма, в частности для определения натуральных антител к белку S100 человека

Применение моноклональных антител для идентификации ямагатской или викторианской эволюционных линий вируса гриппа типа в, штамм гибридомы 4н7 для получения моноклональных антител, предназначенных для определения вирусов гриппа в ямагатской ветви, штамм гибридомы в/4н1 для получения моноклональных антител, предназначенных для определения вирусов гриппа в викторианской ветви // 2491338

Новый аллерген-простатический калликреин // 2502074

Группа изобретений относится к медицине и касается калликреина, его варианта или фрагмента, имеющих общие эпитопы, распознаваемые антителами, с калликреином дикого типа, использующегося для получения диагностической композиции для in vitro диагностики аллергии I типа, где калликреин получен у собаки; способа получения композиции аллергенов, включающего стадию добавления калликреина собаки, или его варианта или фрагмента; способа выделения калликреина из мочи собаки. Группа изобретений обеспечивает увеличение чувствительности в диагностических тестах. 7 н.и 9 з.п. ф-лы, 11 пр., 13 ил., 5 табл.

Способ получения референс-панели образцов сывороток, предназначенной для оценки специфичности результатов серологической диагностики социально значимых заболеваний // 2521232

Изобретение относится к медицине и касается способа получения референс-панели образцов сывороток, предназначенной для оценки специфичности результатов серологической диагностики социально значимых заболеваний, включающего: исследование образцов доноров и пациентов на наличие инфекционного материала, отбор для отрицательной части референс-панели образцов, не содержащих антитела к вирусу гепатита С (ВГС), поверхностного антигена HBsAg вируса гепатита В (ВГВ), раннего белка р24 и антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ), а также антитела к Treponema pallidum, отбор для положительной части референс-панели образцов, содержащих антитела к ВИЧ, ВГС, HBsAg и Treponema pallidum и введение в отобранные образцы стабилизирующего состава. Изобретение обеспечивает создание такого способа получения референс-панели сывороток, который обеспечивает изготовление отрицательных сывороток панели, не содержащих HBsAg ВГС и антител к Treponema pallidum и к вирусам ВГС и ВИЧ, и позволяет сохранить специфические характеристики всех образцов панели сывороток в течение длительного времени (не менее 18 месяцев) при температуре хранении от 2 до 8°C. 3 з.п. ф-лы, 4 пр., 2 табл.

Способ оценки местного гуморального противохолерного иммунитета in vitro на модели экспериментальных животных // 2536707

Изобретение относится к медицине, в частности к вопросу изучения антиадгезивной активности противохолерных иммуноглобулинов и усиления ее для совершенствования специфической профилактики холеры. Для оценки местного гуморального противохолерного белых мышей иммунизируют 5×107 микробными клетками Vibrio cholerae 5879, через 10 дней выделяют общий пул противохолерных Ig из тонкокишечных промывных жидкостей. Дополнительно получают первичную культуру энтероцитов тонкой кишки от интактных мышей. Затем противохолерные Ig в двукратном разведении наносят в объеме 3 мл на монослой энтероцитов, сформированных в лунках культуральных панелей. В последние наносят живые холерные вибрионы штамма Vibrio cholerae 5879, 40 м.к. на 1 энтероцит и инкубируют в течение 3 часов. После панели трижды отмывают, фиксируют этанолом в течение 20 минут и окрашивают по Романовскому - Гимза. Оценку местного гуморального противохолерного иммунитета проводят под микроскопом по количеству вибрионов, окрашенных в темно-синий цвет и прикрепившихся к одному энтероциту. Способ позволяет оценить специфический местный гуморальный иммунитет и усилить антиадгезивную активность общего пула противохолерных иммуноглобулинов. 3 з.п. ф-лы, 2 пр., 2 табл.

Способ получения антигенного эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза // 2540902

Изобретение относится к способу получения антигенного эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза. Указанный способ включает стерилизацию культуры авирулентного штамма Burkholderia pseudomallei 107, суспендирование высушенной бактериальной массы в 0,15 М растворе NaCl, обработку полученной суспензии ультразвуком, центрифугирование взвеси разрушенных клеток с последующим отделением супернатанта и высаливание из него гликопротеиновой фракции, на основе которой получают диагностикум. Изобретение позволяет определять в реакции непрямой гемагглютинации специфические антитела в ранние сроки как сапной, так и мелиоидозной инфекций. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 3 пр.

Способ печати биологических лигандов в процессе изготовления биочипов // 2543145

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ печати биологических лигандов, представляющих собой олигосахариды, и/или полисахариды, и/или пептиды, и/или гликопептиды, и/или биотин. Предварительно на подложку наносят слой гидрофобной нелетучей жидкости, не смешивающейся с растворителем биологических лигандов и имеющей удельную массу меньше, чем удельная масса раствора биологических лигандов. Затем бесконтактным методом осуществляют печать биологических лигандов. В качестве гидрофобной нелетучей жидкости используют вазелин, минеральное масло или высшие предельные углеводороды или их смесь. Толщина слоя гидрофобной нелетучей жидкости предпочтительно составляет 50-200 мкм. Техническим результатом изобретения является повышение равномерности высыхания капель раствора биологических лигандов на подложке при одновременном обеспечении защиты биологических лигандов от преждевременного гидролиза и улучшении морфологии спотов. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

Способ получения тест-системы для диагностики цитомеговирусной инфекции методом иммуноблоттинга // 2545785

Группа изобретений относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, иммунохимии, и касается диагностики цитомегаловирусной инфекции методом иммунного блоттинга, который является референтным, наиболее высокочувствительным, высокоспецифичным, подтверждающим (или исключающим) диагноз при подозрении на инфицирование в случае получения положительных или сомнительных (неопределенных) результатов. Группа изобретений представляет собой способ получения тест-системы для диагностики цитомегаловирусной инфекции, включающий получение очищенного вирусного лизата, приготовление иммуносорбента, содержащего специфичные ЦМВ белки рр 150, рр 130, gp 75, рр 65, gp 55, pp52, p 38, pp 28, приготовление растворов для электрофореза, приготовление раствора для разведения сывороток, приготовление 5-кратного концентрата промывочного раствора, приготовление конъюгата, комплектацию тест-системы, а также тест-систему, полученную вышеуказанным способом. Использование натурального лизатного высокоочищенного антигена цитомегаловируса штамм «CMV AD 169» при получении иммуносорбента и наличие в нем полного спектра белков, специфичных ЦМВ (всего 8 белков), имеет следующие преимущества: значительно повышается чувствительность анализа, сокращается время постановки, отсутствует необходимость в предварительном разведении образцов и отсутствует первоначальный этап блокировки иммуносорбента, более удобная упаковка значительно сокращает время исследования. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 табл.