Композиции и мультипараметричекие способы анализа для измерения биологических медиаторов физиологического здоровья
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ оценки воспаления и/или резистентности к инсулину у животного путем количественного определения присутствия анализируемого вещества в сыворотке или плазме. Способ включает получение биологического образца животного, причем образец содержит набор анализируемых веществ, включающий, по меньшей мере, цитокин, хемокин, гормон и адипокин. Проводят взаимодействие образца с коллекцией молекулярных зондов, иммобилизованных отдельно друг от друга к панели для мультипараметрического анализа, для определения присутствия каждого вещества из заданного набора анализируемых веществ. Для каждого анализируемого вещества в наборе коллекция молекулярных зондов включает, по меньшей мере, один зонд, подходящий для детектирования присутствия этого анализируемого вещества. Причем каждый зонд способен производить независимо детектируемый сигнал, если анализируемое вещество присутствует в образце. Детектируют независимо сигналы, полученные после взаимодействия образца с коллекцией. Устанавливают корреляцию между сигналами и присутствием вещества из набора анализируемых веществ в образце. Устанавливают корреляцию между присутствием вещества из набора анализируемых веществ в образце и известными параметрами состояния здоровья. Оценивают состояние здоровья животных в соответствии с полученными результатами. Изобретение позволяет сократить количество биологического материала, реактивов, время анализа при осуществлении способа оценки воспаления и/или резистентность к инсулину у животного. 10 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 2 пр.
Перекрестная ссылка на имеющие отношение заявки
Эта заявка претендует на все преимущества предварительной заявки на патент США серийный No.60/849928, зарегистрированной 6 октября 2006, раскрытие которой включено в настоящий документ путем этой отсылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Это изобретение в целом имеет отношение к легко выполнимым анализам для определения состояния здоровья животных и, в особенности, к мультипараметрическим анализам, включающим измерение цитокинов, гормонов и адипокинов для установления состояния здоровья животного и влияния кормления на состояние здоровья.
Уровень техники
Цитокины, адипокины и гормоны входят в число наиболее важных биологических медиаторов, обеспечивающих физиологический ответ на стимулы и стресс и, следовательно, пригодны в качестве «отличительных признаков» состояния здоровья и/или индикаторов заболевания. Оценка изменений в уровнях этих медиаторов, как постоянных, так и временных, обеспечивает определенное понимание ответа биологической системы или организма на факторы, вызывающие стресс.
Мультипараметрический анализ удобен и позволяет изучать многочисленные требующие определения соединения, с помощью таких приборов, как платформа Luminex хМАР. С помощью такого мультипараметрического анализа возможно одновременно проводить количественные измерения до 100 анализируемых веществ в одном анализе. Такие анализы, следовательно, применимы для накопления данных, необходимых для исследования биологических медиаторов, таких как те, что описаны в этом документе, и для изучения природы исследуемых образцов.
Хотя методики измерения многих биологических медиаторов известны, сохраняется необходимость в панелях зондов для развития мультипараметрических анализов, способных к одновременному измерению множества важных в биологическом смысле белков, в которых применяют очень маленькие количества биологических образцов, для быстрого установления состояния здоровья животных, в особенности, животных-компаньонов, а также для составления режимов питания для улучшения состояния здоровья животных. В частности, существует необходимость в зондах и способах для установления состояния здоровья животных и при терапевтических вмешательствах или вмешательствах, связанных с кормлением, полезных для улучшения здоровья животного.
Раскрытие изобретения
Следовательно, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении панелей зондов для развития мультипараметрических анализов, способных к одновременному измерению множества важных в биологическом смысле белков, в которых применяют очень маленькие количества биологических образцов.
Другая цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способов быстрого установления состояния здоровья животных.
Еще одна цель настоящего изобретения заключается в обеспечении режимов питания для улучшения состояния здоровья животных.
Дополнительная цель настоящего изобретения заключается в обеспечении изделий промышленного производства в форме наборов, которые содержат комбинации мультипараметрических анализов настоящего изобретения и инструкцию по применению этих анализов для различных целей.
Одну или несколько из этих и других целей достигают, применяя новую коллекцию детектируемых молекулярных зондов для определения активности, присутствия или экспрессии каждого из анализируемых веществ заданного набора в одном образце. Набор анализируемых веществ включает, по меньшей мере, один цитокин или его ген, один хемокин или его ген, один гормон или его ген, и один адипокин или его ген и, для каждого анализируемого вещества в наборе, коллекция молекулярных зондов включает, по меньшей мере, один зонд, подходящий для детектирования активности, присутствия или экспрессии этого анализируемого вещества. В некоторых воплощениях набор анализируемых веществ дополнительно включает один или несколько нейрональных факторов роста или их гены, факторы роста, отличные от нейрональных факторов роста или их гены, растворимые рецепторы или их гены, или их комбинации.
Иные и дополнительные цели, признаки и преимущества настоящего изобретения будут легко поняты специалистами в этой области техники.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Схематическое изображение метаболического синдрома, демонстрирующего центральную роль резистентности к инсулину и наибольший риск заболевания сердца, инсульта и/или воспаления.
Фигура 2. Ответов цитокинов на стимуляцию ЛПС (менополисахарид): Клетки МКПК (мононуклеарные клетки периферической крови) выращивают в присутствии различных концентраций ЛПС в течение 3, 6 или 18 часов. Для цитокинов определяют C/S. Показаны данные для IL-6 [A], TNFα [В], IL-18 [С] и IL-8 [D]. На оси Х отложено количество ЛПС в нг/мл, на оси Y - средняя интенсивность флуоресценции [MFI] или [MF] и на оси Z отображено время.
Осуществление изобретения
Определения
Термин «активность» гена охватывает любое измерение, которое имеет отношение к выполняемой геном центральной биологической роли. Например, измерение транскрипции гена, или измерение или в определенных временных точках или в реальном времени совокупности различных типов РНК, которые представляют собой продукты транскрипции этого гена. Специалисту понятно, что термин измерение «активности» гена, примененный в этом документе, может также включать измерения в определенных тканях, типах клеток или органов количества мРНК, полученной от определенного гена, как в реальном времени, так и нет. Подобным образом, специалисту также ясно, что белок анализируемых веществ может быть определен с помощью множества удобных способов. Определение белка и других анализируемых веществ может включать присутствие или отсутствие анализируемого вещества, активность (например, энзиматическую активность или другую биологическую активность), характеристики связывания, период полураспада, число оборотов или другие параметры анализируемого вещества, которые можно измерить.
Термин «анализируемое вещество» включает белки, «экспрессируемые генами» в форме нативных белков, в том виде, как они транслируются в клетке, и белки, имеющие пост-трансляционное перемещение, процессинг, модификацию и им подобные. Таким образом, в некоторых случаях белки анализируемых веществ могут быть укорочены после транслокации или, например, могут быть фосфорилированы, или иметь другие модификации, такие как модификации углеродного скелета или боковых цепей любого аминокислотного остатка. Термин «анализируемое вещество» также включает метаболические производные таких белков и комплексов, как активных, так и неактивных, одного или нескольких белков с одним или несколькими другими заместителями, обнаруженных в клетке. В предпочтительных воплощениях анализируемые вещества представляют собой белки или пептиды, и зонды представляют собой антитела. Каждое антитело в коллекции зондов специфически распознает только один белок в наборе, и существует, по меньшей мере, одно такое антитело в коллекции для каждого белка в выбранном наборе. Специалисту ясно, что после того, как набор таких белков отобран, и если аминокислотные последовательности этих белков известны, то создание серии нуклеиновых кислот или других зондов, которые соответствуют генам или мРНК, которые экспрессируют эти белки, часто доступно среднему специалисту. Следовательно, такие применения, приведенные в этом документе, также полезны.
Термин «животное» означает любое животное, имеющее цитокины, гормоны, адипокины, нейрональные факторы роста, факторы роста, отличные от нейрональных факторов роста или растворимые рецепторы, применимые в настоящем изобретении, включая, но, не ограничиваясь, людей, птиц, коров, собак, лошадей, кошек, коз, мышей, овец и свиней, предпочтительно, людей, мышей, обезьян, собак и кошек.
Термин «коллекция» в отношении группы молекулярных зондов означает множество. Обычно множество не имеет ограничения, хотя предпочитают коллекции из 100 или меньшего числа зондов.
Термин «молекулярный зонд (молекулярные зонды)» означает любую молекулу, которая может быть применена для детектирования присутствия или активности гена, соответствующей ему РНК или соответствующего ему белкового продукта экспрессии.
Термин «панель» представляет собой синоним термину коллекция. Термин панель в отдельных случаях лучше описывает применение коллекции при проведении скрининга образцов. Примененную в этом документе коллекцию предпочтительно, но не обязательно, применяют для детектирования соответствующего набора анализируемых веществ мультипараметрическим способом, т.е. все результаты для каждого из множества зондов получают в единственной реакционной или измерительной ячейке. Коллекция зондов обычно соответствует набору анализируемых веществ, в котором каждый из множества зондов соответствует определенному анализируемому веществу в наборе. В некоторых воплощениях анализируемые вещества представляют собой гены или продукты генов (белки), и зонды позволяют измерять активности или экспрессии каждого из генов (или продуктов их экспрессии) в группе (или в наборе). Более предпочтительно, анализируемые вещества представляют собой белки, экспрессированные геном.
Термин «единый комплект» означает, что компоненты набора физически объединены в одном или нескольких контейнерах или с одним или несколькими контейнерами и представляют собой единое целое для производства, распространения, продажи или применения. Контейнеры включают, но не ограничиваются, сумки, коробки, бутылки, упаковки в термоусадочной пленке, компоненты, прикрепленные скобками или прикрепленные иным способом, или их комбинации. Единый комплект может представлять собой контейнеры с компонентами для индивидуальных анализов, физически объединенные таким образом, чтобы они представляли собой единое целое для производства, распространения, продажи или применения.
Термин «виртуальный комплект» означает, что компоненты набора объединены с помощью указаний на один или несколько физических или виртуальных наборов компонентов, дающих инструкции пользователю, как получить другие компоненты, например, в комплект, содержащий один компонент и указания, в которых пользователю дают инструкции, как найти веб-сайт, прочитать записанное обращение, просмотреть зрительное обращение или проконсультироваться с ответственным лицом или инструктором для получения инструкций о том, как применять набор.
Изобретение
В одном из аспектов настоящее изобретение обеспечивает коллекцию детектируемых молекулярных зондов для определения в одном образце активности, присутствия или экспрессии каждого из анализируемых веществ заданного набора. Набор анализируемых веществ включает, по меньшей мере, один цитокин или его ген, один хемокин или его ген, один гормон или его ген, и один адипокин или его ген. Для каждого анализируемого вещества в наборе коллекция молекулярных зондов включает, по меньшей мере, один зонд, подходящий для детектирования активности, присутствия или экспрессии этого анализируемого вещества. Эти коллекции зондов предназначены для применения в способе детектирования, который предпочтительно выполняют в рамках подходящего анализа в единой реакционной ячейке. В сочетании с соответствующим способом распознавания и выбранным методом анализа, эти панели помогают предсказать или оценить функциональные последствия факторов, вызывающих стресс, и других воздействий на физиологию.
Предпочтительно, молекулярные зонды включают белок, нуклеиновую кислоту или их комбинации, но могут включать небольшие молекулы или другие соединения и структуры или их комбинации. Примеры зондов, включающих белок, включают антитела, фрагменты антител, рецепторы, связывающие белки, ферменты и им подобные. Они могут быть применены для определения не только анализируемых веществ белковой природы, но и для определения разнообразных анализируемых веществ другой природы. Нуклеиновые кислоты, применяемые в качестве зондов, включают те нуклеиновые кислоты, специфичность которых возникает при образовании комплементарных пар оснований по Уотсону-Крику, а также те, специфичность которых возникает при других взаимодействиях или включает другие взаимодействия. Например, в этом документе применяют аптамеры, которые представляют собой нуклеиновые кислоты, сконструированные так, чтобы они могли специфически распознавать определенные анализируемые вещества, такие как белки или другие молекулы, применяемые в этом документе. Нуклеиновые кислоты, обладающие ферментативной активностью, такие как ДНКзимы и рибозимы, известные в этой области техники, имеют определенную специфичность, и их применяют в качестве зондов в этом документе. Зонды могут также включать лиганды для связывания молекул и рецепторов. Применение всех таких молекул в качестве зондов для анализируемых веществ, таких как продукты экспрессии генов или даже сами гены, известны в этой области техники, и, таким образом, специалисту любой квалификации понятно, как отбирать и адаптировать такие молекулы, примененные в этом документе.
Зонды могут быть созданы в лаборатории или изолированы из природных объектов. В предпочтительных воплощениях молекулярные зонды представляют собой антитела. В одном из воплощений каждое антитело в коллекции может специфически распознавать и, таким образом, служить для идентификации одного белка анализируемого вещества в соответствующем наборе белков. Зонды могут быть применены в любой подходящей форме, такой как раствор или суспензия. В некоторых воплощениях они могут быть связаны с субстратом, таким как носитель или бусина, или помещены в чип, микрочип или им подобные устройства, для того, чтобы создать полезную, удобную и/или информативную систему анализа.
Заданный набор анализируемых веществ в некоторых воплощениях представляет собой набор генов или набор белков. В некоторых воплощениях выбирают набор белков анализируемых веществ, и разрабатывают анализы, основанные на соответствующем наборе генов или мРНК. Набор анализируемых веществ выбирают из соображений целесообразности, на основании их отношения к информации, которая может быть получена с помощью этой панели. В предпочтительном воплощении набор анализируемых веществ выбирают на основании того, как каждое анализируемое вещество связано с состоянием здоровья индивидуума.
В одном из воплощений набор анализируемых веществ представляет собой набор белков, включающих, по меньшей мере, один цитокин, один хемокин, один гормон, и один адипокин. Для каждого анализируемого вещества в наборе коллекция молекулярных зондов включает, по меньшей мере, один зонд, подходящий для детектирования присутствия, активности или экспрессии этого анализируемого вещества, - т.е. существует соответствующий зонд для каждого анализируемого вещества в наборе, присутствие, активность или экспрессию которого намереваются установить. В дополнительном воплощении, в котором коллекция молекулярных зондов представляет собой вышеупомянутый набор белков анализируемых веществ, набор анализируемых веществ дополнительно включает один или несколько, по меньшей мере, один пробиотический организм другого типа.
В еще одном воплощении набор анализируемых веществ включает набор генов, по меньшей мере, с одним геном, кодирующим цитокин, с одним геном, кодирующим хемокин, с одним геном, кодирующим гормон, и с одним геном, кодирующим адипокин. В одном из воплощений набор генов анализируемых веществ дополнительно включает, по меньшей мере, один ген, кодирующий нейрональные факторы роста, по меньшей мере, один ген, кодирующий другой фактор роста (т.е. факторы роста отличные от нейрональных факторов роста), или, по меньшей мере, один ген, кодирующий растворимые рецепторы, или любых их комбинации.
Поскольку не существует конкретного ограничения в отношении числа зондов, которые могут находиться в одной коллекции в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно, чтобы в некоторых воплощениях верхний предел равен 100 зондам на коллекцию. Также подходят коллекции с меньшим числом зондов. Например, все панели, равные примерно 90-100, 80-90, 70-80 или 60-70 зондам, подходят для применения в этом документе. Подобным образом, для применения также подходят коллекции, равные примерно 10-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-60 зондам. Другое специфическое число зондов от 4 до 100 также включено в этот документ, хотя определенного числа нет, так как все возможные диапазоны от 4 до 100 зондов включены в этот документ, однако, нет определенного числа. Диапазоны зондов в особенности полезны, если исходно желательна некоторая избыточность, которая позднее станет ненужной, или, альтернативно, если установлено, что, возможно, полезно включить дополнительный зонд в определенную коллекцию, так как стало известно больше о его возможностях in vivo или возросла оценка его достоинств. В других воплощениях, например, в которых зонды могут быть связаны с чипом или микрочипом, может быть полезно, и, таким образом, предпочтительно сделать число зондов больше, чем 100 зондов на коллекцию.
В одном из воплощений коллекция молекулярных зондов включает детектируемые зонды для детектирования белка (т.е. кодируемого геном продукта) каждого набора генов, таким образом, для определения экспрессии каждого гена в наборе. В таких воплощениях предпочтительно, чтобы каждый зонд представляет собой зонд, который специфичен для детектирования белка, кодируемого одним геном в наборе. В некоторых воплощениях степень перекрестной реактивности может быть подобрана экспериментально. Это, в особенности, верно, если сами зонды представляют собой биологические молекулы, такие как антитела. Перекрестная реактивность определенных антител известна в этой области техники. Специалисту ясно, что перекрестная реактивность антитела с близкородственными антигенами, такими как некоторые белки, может создать проблемы, в особенности, если перекрестная реактивность выражена сильно. В одном из воплощений перекрестную реактивность сводят к минимуму или исключают путем применения моноспецифических антител, таких как высокоочищенные антитела или моноклональные антитела к специфически эпитопам, которые иммунологически отличны. В еще одном воплощении перекрестную реактивность отличают от предполагаемой активности на основании характеристик связывания, таких как константы связывания или измерения силы связывания, или им подобные. В еще одном воплощении применение надлежащих и тщательных контролей или других способов, таких как компьютерный анализ результатов, позволяет скорректировать экспериментальные данные для перекрестной реактивности определенных типов.
Поскольку существует много возможностей для выбора набора анализируемых веществ, как обсуждено в этом документе, предпочтителен рациональный подход к выбору анализируемых веществ. Коллекцию молекулярных зондов предпочтительно создавать или отбирать, имея в виду ее предназначение. Для этой цели набор анализируемых веществ определяют заранее с помощью рационального подхода, который базируется на известных, предварительно оцененных или раскрытых в этом документе взаимосвязях между присутствием или активностью определенных анализируемых веществ и различными аспектами здоровья животного. Факторы, такие как состояние воспаления у животного, и соответствующее присутствие определенных гормонов и других биохимических сигналов или проводников сигналов, может помочь обеспечить детальную информацию, связанную с состоянием здоровья животного.
Таким образом, в одном из воплощений набор анализируемых веществ представляет собой набор белков, который включает один или несколько цитокинов. Предпочтительно, цитокин включает один или несколько из следующих веществ: интерферон альфа, интерферон гамма, интерлейкин 12 р40, интерлейкин 18, интерферон бета, интерферон омега, лимфотоксин бета R, лимфотоксин, интерлейкин 6, интерлейкин 8, фактор некроза опухоли альфа, интерлейкин 4, интерлейкин 10, трансформирующий фактор роста бета-1, фактор некроза опухоли бета, интерлейкин 3, интерлейкин 5, интерлейкин 7, интерлейкин 13, интерлейкин 15, интерлейкин 1 альфа, интерлейкин 1 бета, интерлейкин 2, интерлейкин 11, интерлейкин 12 р70, интерлейкин 16, интерлейкин 17, хемокин, выделяемый Т-клетками при активации (RANTES), интерлейкин 21, интерлейкин 9 или рецептор III трансформирующего фактора роста бета.
В различных воплощениях набор белков включает один или несколько хемокинов, например, хемоаттрактант В-лимфоцитов, эпителиальный клеточный нейтрофил-активирующий пептид, эотаксин, эотаксин-2, хемотаксический белок моноцитов 2, хемотаксический белок моноцитов 3, фактор, ингибирующий миграцию макрофагов, воспалительный белок макрофагов 1 альфа, предшественник миелоидного ингибирующего фактора 1, макрофаг-стимулирующий белок, хемотаксический белок гранулоцитов 2, белок, индуцируемый интерфероном гамма 10, фактор, ингибирующий лейкемию, колониестимулирующий фактор макрофагов, хемотаксический белок моноцитов 1, хемокин, продуцируемый макрофагами, воспалительный белок макрофагов 1 бета, воспалительный белок макрофагов 1 дельта, нейтрофил-активирующий пептид 2, хемокин, регулируемый легкими и активацией, фактор альфа стромальных клеток, хемокин, регулируемый тимусом и активацией, бетацеллюлин, 6 Ckine, кислый фактор роста фибробластов, фракталкин, СС хемокин 1 гемофильтрата, хемотаксический белок моноцитов 4, воспалительный белок макрофагов 3 бета, фактор тромбоцитов 4, активатор рецептора NF-каппа-В, кожный хемокин, привлекающий Т-клетки, эотаксин-3, фактор роста фибробластов 4, фоллистатин, связанный с ростом окоген гамма, индуцируемый интерфероном гамма альфа-хемоаттрактант Т-клеток, рецептор фактора, ингибирующего лейкемию, альфа, мидкин, воспалительный белок макрофагов 3 альфа, плеотрофин, бета фактор стромальных клеток, экспрессируемый тимусом хемокин, трансформирующий фактор роста альфа, связанный с TNF, индуцируемый активином цитокин, белок-1 адгезии сосудов, CXCL9 или CCL1. Разумеется, набор может включать вышеупомянутые хемокины как дополнение к цитокинам, приведенным в качестве примеров в этом документе.
В различных воплощениях набор белков включает один или несколько гормонов. Предпочтительные гормоны представляют собой такие гормоны как пролактин, белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 2, лептин, инсулин, резистин, адипонектин, глюкагон, глюкагон-подобный пептид 1 или PYY. Специалисту ясно, что могут быть выбраны и другие гормоны. Предпочтительно, чтобы выбранный режим питания оказывал влияние на активность или присутствие гормонов, как обсуждено ниже, или существует взаимосвязь между активностью или присутствием гормона и состоянием здоровья животного. Как в этом документе, и для каждой из категорий, приведенной в качестве примера в этом документе, как в рамках продуманного заранее заданного набора белков, включение определенных гормонов не исключает включение других молекул, и могут быть дополнительно включены другие молекулы, например, цитокины, хемокины, адипокины и прочие, описанные в этом документе.
В еще одном воплощении набор белков включает один или несколько адипокинов, включая, но не ограничиваясь, хемотаксический белок моноцитов 1, лептин, резистин, адипонектин, IL-6, TNF-альфа или активируемый тромбином ингибитор фибринолиза.
В некоторых воплощениях заданный набор белков анализируемых веществ дополнительно включает одно из следующих веществ: нейрональный фактор роста, фактор роста, отличный от нейронального фактора роста или растворимый рецептор или их комбинации.
Нейрональные факторы роста, полезные в этом изобретении, включают, но не ограничиваются, цилиарный нейротрофический фактор, нейротрофический фактор глиальных клеток, нейротрофический фактор головного мозга, нейротрофин 3, нейротрофин 4 или нейрональные факторы роста бета.
Факторы роста предпочтительно выбирают из ангиогенина, эпидермального фактора роста, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 9, гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующий фактор, фактора роста меланомы, онкостатина М, фактора роста плаценты, трансформирующего фактора роста бета-3, амфирегулина, фактора роста фибробластов-6, колониестимулирующего фактора гранулоцитов, фактора стволовых клеток, фактора роста эндотелия сосудов, кардиотрофина-1, связанного с ростом онкогена бета, гепарин-связывающего EGF-подобного фактора роста, фактора роста гепатоцитов, медиатора проникновения вируса герпеса, матриксной металлопротеиназы 10, матриксной металлопротеиназы 7, матриксной металлопротеиназы 9, тканевых ингибиторов металлопротеиназ 1, фактора роста эндотелия сосудов D, рецептор фактора роста эндотелия сосудов 2, основного фактора роста фибробластов, инсулиноподобного фактора роста I, инсулиноподобного фактора роста II, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста 1, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста 3, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста 4, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста 6, матриксной металлопротеиназы 1, матриксной металлопротеиназы 2 или тканевого ингибитора металлопротеиназы 2.
Растворимые рецепторы sCD23, Fas (CD95), антагонист рецептора интерлейкина 1, растворимый рецептор интерлейкина 2 альфа, TNF-связанный апоптоз-индуцирующий лиганд, рецептор активатора плазминогена урокиназного типа, лиганд fins-подобной тирозинкиназы-3, растворимый гликопротеин 130, растворимый рецептор I интерлейкина 1, растворимый рецептор интерлейкина 6, рецептор I фактора некроза опухоли, рецептор I фактора некроза опухоли I, кадхерин эпителия сосудов, CCL28, молекула цитотоксических Т-лимфоцитов 4, рецептор смерти 6, Fas-лиганд, молекула межклеточной адгезии 3, рецептор интерлейкина 2 гамма, рецептор интерлейкина 5 альфа, L-селектин, молекула-1 адгезии тромбоцитов к эндотелию, рецептор фактора стволовых клеток, рецептор TNF-связанного апоптоз-индуцирующего лиганда 4, активирующая лейкоциты молекула адгезии, CD27, CD30, CD40, рецептор цилиарного нейротрофического фактора, молекула межклеточной адгезии 1, рецептор инсулиноподобного фактора роста I, растворимый рецептор I интерлейкина II, рецептор интерлейкина 2 бета, рецептор интерлейкина 10 бета, рецептор колониестимулирующего фактора макрофагов, рецептор фактора роста тромбоцитов альфа или рецептор TNF-связанного апоптоз-индуцирующего лиганда 4 и прочие, все полезны в данном изобретении.
В другом предпочтительном воплощении набор анализируемых веществ представляет собой набор генов, который включает один или несколько генов, кодирующих один или несколько цитокинов. Предпочтительно кодируемые цитокины включают один или несколько цитокинов, перечисленных в этом документе: интерферон альфа, интерферон гамма, интерлейкин 12 р40, интерлейкин 18, интерферон бета, интерферон омега, лимфотоксин бета R, лимфотоксин, интерлейкин 6, интерлейкин 8, фактор некроза опухоли альфа, интерлейкин 4, интерлейкин 10, трансформирующий фактор роста бета-1, фактор некроза опухоли бета, интерлейкин 3, интерлейкин 5, интерлейкин 7, интерлейкин 13, интерлейкин 15, интерлейкин 1 альфа, интерлейкин 1 бета, интерлейкин 2, интерлейкин 11, интерлейкин 12 р70, интерлейкин 16, интерлейкин 17, хемокин, выделяемый Т-клетками при активации (RANTES), интерлейкин 21, интерлейкин 9 или рецептор III трансформирующего фактора роста бета.
Набор генов включает в некоторых воплощениях один или несколько генов, кодирующих один или несколько хемокинов: хемоаттрактант В-лимфоцитов, эпителиальный клеточный нейтрофил-активирующий пептид, эотаксин, эотаксин-2, хемотаксический белок моноцитов 2, хемотаксический белок моноцитов 3, фактор, ингибирующий миграцию макрофагов, воспалительный белок макрофагов 1 альфа, предшественник миелоидного ингибиторного фактора 1, макрофаг-стимулирующий белок, хемотаксический белок гранулоцитов 2, белок, индуцируемый интерфероном гамма 10, фактор, ингибирующий лейкемию, колониестимулирующий фактор макрофагов, хемотаксический белок моноцитов 1, хемокин, продуцируемый макрофагами, воспалительный белок макрофагов 1 бета, воспалительный белок макрофагов 1 дельта, нейтрофил-активирующий пептид 2, хемокин, регулируемый легкими и активацией, фактор альфа стромальных клеток, хемокин, регулируемый тимусом и активацией, бетацеллюлин, 6 Ckine, кислый фактор роста фибробластов, фракталкин, СС хемокин 1 гемофильтрата, хемотаксический белок моноцитов 4, воспалительный белок макрофагов 3 бета, фактор тромбоцитов 4, активатор рецептора NF-каппа-В, кожный хемокин, привлекающий Т-клетки, эотаксин-3, фактор роста фибробластов 4, фоллистатин, связанный с ростом окоген гамма, индуцируемый интерфероном гамма альфа-хемоаттрактант Т-клеток, рецептор фактора, ингибирующего лейкемию, альфа, мидкин, воспалительный белок макрофагов 3 альфа, плеотрофин, бета фактор стромальных клеток, экспрессируемый тимусом хемокин, трансформирующий фактор роста альфа, связанный с TNF, индуцируемый активином цитокин, белок-1 адгезии сосудов, CXCL9, или CCL1. Разумеется, набор может включать один или несколько генов для вышеупомянутых хемокинов в дополнение к тем генам для цитокинов, которые приведены в качестве примера в этом документе.
В различных воплощениях набор генов включает один или несколько генов, кодирующих различные гормоны. Предпочтительны гены, кодирующие следующие гормоны: пролактин, белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 2, лептин, инсулин, резистин, адипонектин, глюкагон, глюкагон-подобный пептид 1 или PYY. Предпочтительно, существует взаимосвязь между активностью или экспрессией кодируемого гормона и состоянием здоровья животного. Включение в набор анализируемых веществ одного или нескольких генов, кодирующих гормоны, не исключает включение одного или нескольких генов, кодирующих другие молекулы, например, цитокины, хемокины, адипокины и прочие молекулы, описанные в этом документе.
В еще одном воплощении набор генов включает один или несколько генов, кодирующих один или несколько адипокинов: хемотаксический белок моноцитов 1, лептин, резистин, адипонектин, IL-6, TNF-альфа или активируемый тромбином ингибитор фибринолиза. Гены для других адипокинов также применяют в этом документе.
В некоторых воплощениях заданный набор генов дополнительно включает один или несколько генов, кодирующих нейрональные факторы роста, фактор роста, отличный от нейрональных факторов роста или растворимый рецептор. Предпочтительные нейрональные факторы роста, факторы роста, отличные от нейрональных факторов роста и растворимые рецепторы включают, но не ограничиваются теми, которые перечислены в этом документе для набора белков. Другие такие молекулы, примененные в этом документе, также предусматриваются.
В различных воплощениях набор анализируемых веществ включает один или несколько первичных или вторичных продуктов метаболизма. Так, в одном из воплощений, набор анализируемых веществ включает один или несколько экозаноидов, класс оксигенированных гидрофобных молекул, которые, в основном, функционируют в качестве аутокринных и паракринных медиаторов биологических функций. Например, известно, что лейкотриены служат в качестве агентов при воспалительном ответе. Некоторые обладают хемотаксическим влиянием на мигрирующие нейтрофилы, и таким способом помогают перевести необходимые клетки в вовлеченную ткань. Лейкотриены также представляют собой мощные сосудосуживающие средства, в особенности, в венулах. Они действуют при бронхоконстрикции, и могут также увеличивать проницаемость сосудов. Подходящие лейкотриены, примененные в этом документе, включают, но не ограничиваются, LTA4, LTB4, LTC4, LTD4, LTE4 и LTF4. Другие экозаноиды, подходящие в качестве анализируемых веществ и примененные в этом документе, включают тромбоксаны и производные простагландина Н, простаноиды. Также могут быть полезными некоторые соединения-экозаноиды, такие как резолвины, изофураны, изопростаны, липоксины, эпоксиэйкозатриеновые кислоты (ЕЕТ), нейропротектин D и 20-углерод эндоканнабиноиды, примененные в этом документе в качестве анализируемых веществ. В дополнение, рецепторы эйкозаноидов, такие как рецепторы лейкотриенов CysLT1 (рецептор цистеинил-лейкотриена 1-го типа), CysLT2 (рецептор цистеинил-лейкотриена 2 го типа) и BLT1 (рецептор лейкотриена В4); рецепторы простаноидов PGD2: DP-(PGD2), PGE2, EP1-(PGE2), EP2-(PGE2), EP3-(PGE2), EP4-(PGE2), PGF2α: FP-(PGF2α), PGI2 (простациклин): IP-(PGI2) и ТХА2 (тромбоксан):
TP-(TXA2) также применяют в качестве анализируемых веществ в любом из аспектов или воплощений в этом документе.
В предпочтительном воплощении коллекция молекулярных зондов включает специфический зонд для каждого из следующих веществ: IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-18, IFNγ, IP-10, TNF-α, MCP-1, GLP-1, глюкагон, инсулин, адипонектин и резистин. В некоторых воплощениях коллекция зондов дополнительно включает специфические зонды для одного или несколько из следующих веществ: IL-15, КС и лептин.
В другом предпочтительном воплощении коллекция молекулярных зондов включает зонды с применением собачьих специфических молекул, подходящих для проведения анализов у собак: панель цитокинов/хемокинов, анализируемое вещество: GMCSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-18, IFNγ, IP-10, TNF-α, MCP-1, IL-15, КС. Панель эндокринная; анализируемое вещество: GLP-1, глюкагон, инсулин, лептин. Панель адипокинов, анализируемое вещество: адипонектин, резистин. В другом предпочтительном воплощении коллекция молекулярных зондов включает зонды с применением кошачьих молекул, подходящих для проведения анализов у кошек: Панель цитокинов/хемокинов, анализируемое вещество: GMCSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-1β, IL-8, IL-10, IL-18, IFNγ, Fas, TNF-α, MCP-1, лиганд Flt-3. Панель эндокринная, анализируемое вещество: GLP-1, глюкагон, инсулин, лептин. Панель адипокинов; анализируемое вещество: адипонектин, резистин.
В одном из воплощений молекулярные зонды способны детектировать присутствие, активность, экспрессию или им подобные каждого из анализируемых веществ в заданном наборе анализируемых веществ. Предпочтительно набор анализируемых веществ представляют собой набор белков и/или набор генов, описанный в этом документе. Более предпочтительны гены, полученные от человека, обезьяны, собаки или кошки. В предпочтительных воплощениях коллекция зондов представляет собой коллекцию, предназначенную для детектирования присутствия или активности набора белков собаки или кошки.
В одном из воплощений коллекция молекулярных зондов представляет собой множество антител, специфических для измерения или детектирования белков анализируемых веществ (т.е. продуктов экспрессии набора генов) от собак. Предпочтительно, зонды обеспечивают количественное определение уровня экспрессии каждого белка, т.е. количество каждого специфического белка, присутствующего в образце. В некоторых воплощениях получают скорее качественные результаты, обеспечивая информацию как об относительных количествах, например, указывающих на разницу или на изменения, наблюдаемые от образца к образцу, так и об изменениях на протяжении временного промежутка в образцах от одного индивидуума. В других воплощениях аналогичные измерения получают для набора генов, соответствующих выбранным белкам.
В различных воплощениях для описанной коллекции молекулярных зондов, каждый зонд прикрепляют к матрице или подложке, на которой каждый такой прикрепленный зонд сохраняет способность обеспечивать количественное определение активности или присутствия каждого вещества из набора анализируемых веществ в образце, приведенном в контакт с матрицей. Квалифицированному специалисту ясно, что зонды тех типов, что описаны в этом документе, могут быть прикреплены, иммобилизованы или помещены на подложку с помощью различных способов, что позволяет разрабатывать более легкие способы проведения анализов. В таких воплощениях целая коллекция зондов может быть прикреплена к единственной матрице, и разграничения могут быть выполнены, например, с помощью пространственного разделения набора белков (или экспрессированных продуктов генов), например, электрофоретическим способом, или с помощью детектирования дискретных или индивидуально детектируемых сигналов, соответствующих каждому из зондов. В некоторых воплощениях зонды пространственно размещены как чип или микрочип. Применение матриц, таких как «чипы» и им подобные, также используют в этом документе. Альтернативно, каждый зонд может быть прикреплен к отдельной матрице, применение таких зондов также известно в этой области техники. Примеры матриц, к которым могут быть прикреплены зонды, включают различные мембраны, полимеры, подложки, бусины, чипы, матрицы, измерительные лунки и им подобные. Для детектирования таких прикрепленных к матрице зондов могут быть применены такие способы анализа, как ELISA и FACS. В идеале, такое прикрепление может помочь при разработке мультипараметрических анализов, в которых множество генов в наборе заранее заданных генов могут быть проанализированы в единой реакционной ячейке. Прикрепление молекулярных зондов к полимерным или стеклянным бусинам различных типов может обеспечить простую форму мультипараметрических анализов, с применением, например, дифференциального мечения и FACS в качестве способа различения зондов между собой. Таким образом, в одном из воплощений обеспечивают коллекцию молекулярных зондов, в которой каждый зонд прикрепляют к отдельной матрице, и каждый зонд детектируют независимо от каждого другого зонда в коллекции. Зонды также могут быть прикреплены или ковалентно, или с помощью других способов к различным молекулярным компонентам, таким как сигналы и другие молекулы, которые могут, например, или усиливать, или тушить сигналы, или облегчать разработку анализа, такого как применен в настоящем документе. Альтернативно, такие усилители или тушители сигнала, и другие молекулы могут быть применены совместно с зондами, не будучи физически или химически к ним прикреплены.
Различные цитокины, хемокины, гормоны и адипокины, а также нейрональные факторы роста, факторы роста и растворимые рецепторы, иногда обозначают в этом документе с помощью их аббревиатур или других кратких обозначений. Ниже приведен список таких аббревиатур и других наименований для ссылок, представленный в следующем виде «Наименование; систематическое название (в скобках, если оно доступно); и название:».
Цитокины. IFN-α; Интерферон альфа: IFN-γ; Интерферон гамма: IL-12 (р40); Интерлейкин 12 р40: IL-18; Интерлейкин 18: IFN-P; Интерферон бета: ifn-γ; Интерферон омега: Лимфотоксин βr; (TNFRSF3); Лимфотоксин бета R: Лимфотоксин (Lptn); (XCL1); Лимфотоксин: IL-6; Интерлейкин 6: IL-8; (CXCL8); Интерлейкин 8: TNF-α; Фактор некроза опухоли альфа: IL-4; Интерлейкин 4: IL-10; Интерлейкин 10: TGF-β1; Трансформирующий фактор роста бета-1: TNF-β; Фактор некроза опухоли бета: IL-3; Интерлейкин 3: IL-5; Интерлейкин 5: IL-7; Интерлейкин 7: IL-13; Интерлейкин 13: IL-15; Интерлейкин 15: IL-1α; Интерлейкин 1 альфа: IL-1β; Интерлейкин 1 бета: IL-2; Интерлейкин 2: IL-11; Интерлейкин 11: IL-12 (р70); Интерлейкин 12 р70: IL-16; Интерлейкин 16: IL-17; Интерлейкин 17: RANTES; (CCL5); Хемокин, выделяемый Е-клетками при активации: IL-21; Интерлейкин 21: IL-9; Интерлейкин 9: и TGF-β RIII; рецептор III трансформирующего фактора роста бета.
Хемокины. BLC (ВСА-1); Хемоаттрактант В-лимфоцитов: ENA-78; (CXCL5); Эпителиальный клеточный нейтрофил-активирующий пептид: Eot; (CCL11); Эотаксин: Eot-2; (CCL24); Эотаксин-2: МСР-2; (CCL8); Хемотаксический белок 2 моноцитов: МСР-3; (CCL7); Хемотаксический белок моноцитов 3: MIF; Фактор, ингибирующий миграцию макрофагов: MIP-1α; (CCL3); Воспалительный белок макрофагов 1 альфа: MPIF; Предшественник миелоидного ингибиторного фактора 1: MSP; Макрофаг-стимулирующий белок: GCP-2; (CXCL6); Хемотаксический белок гранулоцитов 2: 1-309; (CCL1); Нет: IP-10; (CXCL10); Белок, индуцируемый интерфероном гамма 10: LIF; Фактор, ингибирующий лейкемию: M-CSF; Колониестимулирующий фактор макрофагов: МСР-1; (CCL2); Хемотаксический белок моноцитов 1: MDC; (CCL22); Хемокин макрофагов: MIG; (CXCL9); нет: MIP-1β; (CCL4); Воспалительный белок макрофагов 1 бета: МГР-1δ; (CCL15); Воспалительный белок макрофагов 1 дельта: NAP-2; Нейтрофил-активирующий пептид 2: PARC; Хемокин, регулируемый легкими и активацией: SDF-1α; Фактор стромальных клеток альфа: TARC; (CCL17); Хемокин, регулируемый тимусом и активацией: ВТС; бетацеллюлин: 6Ckine; (CCL21); 6Ckine: FGF кислый (FGF-1); Кислый фактор роста фибробластов: Фракталкин; (CX3CL1); Фракталкин: НСС-1; (CCL14); СС хемокин 1 гемофильтрата: МСР-4; (CCL13); Хемотаксический белок моноцитов 4: MIP-3β; (CCL19); Воспалительный белок макрофагов 3 бета: PF4; (CXCL4); Фактор тромбоцитов 4: RANK; (TNFRSF11A); Активатор рецептора NF-каппа-В: СТАСК; (CCL27); Кожный хемокин, привлекающий Т-клетки: Eot-3; (CCL26); Эотаксин-3: FGF-4; Фактор роста фибробластов 4: Фоллистатин; Фоллистатин: GRO-γ; (CXCL3); Связанный с ростом онкоген гамма: I-TAC; (CXCL11); Индуцируемый интерфероном гамма альфа-хемоаттрактант Т-клеток: sLIF-Rα (gpl90); Рецептор фактора, ингибирующего лейкемию, альфа: Мидкин; Мидкин: MIP-3α; (CCL20); Воспалительный белок макрофагов 3 альфа: Плейотрофин (PTN); Плеотрофин: SDF-1β; (CXCL12); Фактор стромальных клеток бета: ТЕСК; (CCL25); Экспрессируемый тимусом хемокин: TGF-α; Трансформирующий фактор роста альфа: TRANCE (RANK L); (TNFSF11); Связанный с TNF, индуцируемый активином цитокин: sVAP-1; и Белок-1 адгезии сосудов.
Гормоны. Пролактин; Пролактин: IGFBP-2; Белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 2: Лептин/ОВ; Лептин: Инсулин; Инсулин: Резистин; Резистин: адипонектин; адипонектин: Глюкагон; Глюкагон: GLP-1; Глюкагон-подобный Пептид 1: и PYY; Пептид YY:
Адипонектины. МСР-1; Хемотаксический белок моноцитов 1: Лептин; Лептин: Резистин; Резистин: адипонектин; адипонектин: IL-6; IL-6: TNF-α; TNF-альфа: и tPAI-1; активируемый тромбином ингибитор фибринолиза.
Нейрональные факторы роста. CNTF; Цилиарный нейротрофический фактор: GDNF; Нейротрофический фактор глиальных клеток: BDNF; Нейротрофический фактор головного мозга: NT-3; Нейротрофин 3: NT-4; Нейротрофин 4: и P-NGF; Нейрональные факторы роста бета:
Факторы роста. ANG; Ангиогенин: EGF; Эпидермальный фактор роста: FGF-7; Фактор роста фибробластов 7: FGF-9; Фактор роста фибробластов-9: GM-CSF; Гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующий фактор: GRO-α (MGSA); (CXCL1); Активность, стимулирующая рост меланомы: OSM; Онкостатин М: P1GF; Фактор роста плаценты: TGF-β3; Трансформирующий фактор роста бета-3: AR; Амфирегулин: FGF-6; Фактор роста фибробластов-6: G-CSF; Колониестимулирующий фактор гранулоцитов: SCF; Фактор стволовых клеток: VEGF; Фактор роста эндотелия сосудов: СТ-1; Кардиотрофин-1: GRO-β; (CXCL2); Связанный с ростом онкоген бета: HB-EGF; Гепарин-связывающий EGF-подобный Фактор роста: HGF; Фактор роста гепатоцитов: HVEM; (TNFRSF14); Медиатор проникновения вируса герпеса: ММР-10 (общее); Матриксная металлопротеиназа 10: ММР-7 (общее); Матриксная металлопротеиназа 7: ММР-9 (общее); Матриксная металлопротеиназа 9: TIMP-1; Тканевые ингибиторы металлопротеиназ 1: VEGF-D (F1GF); Фактор роста эндотелия сосудов D: VEGF-R2 (Flk-1/KDR); Рецептор фактора роста эндотелия сосудов 2: FGF щелочной (FGF-2); Щелочной фактор роста фибробластов: IGF-I; Инсулиноподобный Фактор роста I: IGF-II; Инсулиноподобный Фактор роста II: IGFBP-1; Белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 1: IGFBP-3; Белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 3: IGFBP-4; Белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 4: IGFBP-6; Белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 6: ММР-1 (общая); Матриксная металлопротеиназа 1: ММР-2 (общая); Матриксная металлопротеиназа 2: и TIMP-2; Тканевые ингибиторы металлопротеиназ 2.
Растворимые рецепторы. sCD23; Нет: Fas; Fas (CD95): IL-1ra; Антагонист рецептора интерлейкина 1: IL-2 sRα; Растворимый рецептор интерлейкина 2 альфа: TRAIL; (TNFSF10); TNF-связанный апоптоз-индуцирующий лиганд: uPAR; Рецептор активатора плазминогена урокиназного типа: Flt-3 L; лиганд fms-подобной тирозинкиназы-3: sgpl30; Растворимый гликопротеин 130: IL-1 sRI; Растворимый рецептор I интерлейкина 1: IL-6 sR; Растворимый рецептор интерлейкина 6: TNF RI; Рецептор I фактора некроза опухоли: TNF-RII; Рецептор I фактора некроза опухоли I: sVE-кадхерин; Кадхерин эпителия сосудов: CCL28; CCL28: CTLA-4; молекула цитотоксических Т-лимфоцитов 4: DR6; (TNFRSF21); Рецептор смерти 6: Fas-лиганд; (TNFSF6); Fas-лиганд: ICAM-3 (CD50); Молекула межклеточной адгезии 3: IL-2 Rγ; Рецептор интерлейкина 2 гамма: IL-5 Rα (CD 125); Рецептор интерлейкина 5 альфа: L-Селектин (CD62L); L-селектин: РЕСАМ-1 (CD31); Молекула-1 адгезии тромбоцитов к эндотелию: SCF R; Рецептор фактора стволовых клеток: TRAIL R4; (TNFRSF10D); Рецептор TNF-связанного апоптоз-индуцирующего лиганда 4: ALCAM (CD 166); Активирующая лейкоциты молекула адгезии: CD27; (TNFRSF7); CD27: CD30; (TNFSF8); CD30: CD40; CD40: CNTF Rα; Рецептор цилиарного нейротрофического фактора: ICAM-1 (CD54); Молекула межклеточной адгезии 1: IGF-I R; Рецептор инсулин-подобного фактора роста I: IL-1 sRII; Растворимый рецептор II интерлейкина 1: IL-2 Rβ; Рецептор интерлейкина 2 бета: IL-10 Rβ; Рецептор интерлейкина 10 бета: M-CSF R; Рецептор колониестимулирующего фактора макрофагов: PDGF Rα; Рецептор фактора роста тромбоцитов альфа: и TRAIL R4; (TNFRSF10D); Рецептор TNF-связанного апоптоз-индуцирующего лиганда 4.
В другом аспекте изобретение обеспечивает способы оценки состояния здоровья животного путем определения относительной активности или экспрессии набора анализируемых веществ. В общем, способы включают следующие стадии:
a) получение биологического образца от животного; где образец, по меньшей мере, предположительно содержит заранее заданный набор представляющих интерес анализируемых веществ. Набор анализируемых веществ включает, по меньшей мере, один цитокин, хемокин, гормон и адипокин;
b) взаимодействие образца с коллекцией молекулярных зондов для определения активности или присутствия каждого из анализируемых веществ заданного набора, в котором для каждого анализируемого вещества в наборе коллекция молекулярных зондов включает, по меньшей мере, один зонд подходящий для детектирования присутствия или измеримой активности этого анализируемого вещества. Каждый зонд в коллекции способен создавать независимо детектируемый сигнал, если анализируемое вещество, соответствующее этому зонду, присутствует в образце;
c) детектирование независимо детектируемых сигналов, полученных после взаимодействия образца с коллекцией;
d) установление корреляции между детектируемыми сигналами и, по меньшей мере, относительным присутствием или активностью в образце каждого из анализируемых веществ заданного набора;
e) установление корреляции между относительным присутствием или активностью каждого из анализируемых веществ заданного набора в образце с известными или определенными параметрами состояния здоровья; и
f) установление состояния здоровья животных в соответствии с корреляциями, полученными на стадии е).
В еще одном воплощении набор анализируемых веществ включает набор генов, и способ включает следующие стадии:
a) получения биологического образца от животного; где образец, по меньшей мере, предположительно содержит заранее заданный набор представляющих интерес генов или продуктов экспрессии этих генов. Набор генов включает, по меньшей мере, один ген, кодирующий каждое из следующих веществ: цитокин, хемокин, гормон и адипокин;
b) взаимодействия образца с коллекцией молекулярных зондов для определения активности или экспрессии каждого из генов заданного набора, в котором для каждого гена в наборе коллекция молекулярных зондов включает, по меньшей мере, один зонд, подходящий для детектирования активности или экспрессии этого гена. Каждый зонд в коллекции способен создавать независимо детектируемый сигнал, если ген или продукт экспрессии гена, соответствующий этому зонду, присутствует в образце;
c) детектирования независимо детектируемых сигналов, полученных после взаимодействия образца с коллекцией;
d) установление корреляции между детектируемыми сигналами и, по меньшей мере, относительной активностью или экспрессией каждого из генов заданного набора в образце;
e) установление корреляции между относительной активностью или экспрессией каждого из генов заданного набора в образце и известным или определенными параметрами состояния здоровья; и
f) установление состояния здоровья животных в соответствии с корреляциями, полученными на стадии е).
Способы имеют много актуальных и потенциальных применений. В таблице 1 приведен неполный перечень некоторых из таких применений.
| Таблица 1 | ||
| Анализируемое физиологическое состояние | Настоящее состояние уровня техники в области диагностики | Параметры, которые могут быть измерены с помощью способов, обеспечиваемых изобретением |
| Резистентность к инсулину | Тест на толерантность к глюкозе | Снижение уровня адипонектина; увеличение уровней инсулина, IL-6 и TNF-альфа; изменение в уровнях лептина и резистина |
| Предрасположенность к диабету 11-го типа | Тест на толерантность к глюкозе для установления резистентности к инсулину | Снижение уровня адипонектина; увеличение уровней инсулина, IL-6 и TNF-альфа (например, для того, чтобы зарегистрировать высокую степень воспаления); Изменение уровней лептина и резистина |
| Пищевое вмешательство, например, ограничение калорий в питании | Нет | Анализ изменений в уровне цитокинов/хемокинов/эндокринных молекул может быть применен для объяснения на молекулярном уровне лежащей в основе этого физиологии и, например, для создания усовершенствованных стратегий для снижения веса |
| Воспаления | Установление усовершенствованных профилей как про-, так и противовоспалительных цитокинов (например, стимулирующая регуляция) Улучшенный гомеостаз в системе приводит к лучшему противодействию воспалению или стимуляции иммунитета. | |
| Аллергии | Создание маркеров-имитаторов на основании цитокинов Т-хелпера 1 и Т-хелпера 2 для предсказания развития аллергий и/или эффективности пищевого вмешательства | |
| Старение | Создание маркеров-имитаторов старения для оценки режимов питания, которые замедляют или предупреждают старение, или способствуют долгожительству |
В некоторых воплощениях набор анализируемых веществ дополнительно включает один или несколько нейрональных факторов роста, фактор роста, отличный от нейрональных факторов роста, или растворимый рецептор, дополнительно к цитокину, хемокину, гормону и адипокину, которые обсуждают в этом документе. Если анализируемые вещества представляют собой гены, то набор включает соответствующие гены, в соответствии с вышеупомянутыми ограничениями. Предпочтительно, детектируемые зонды представляют собой зонды, специфические для детектирования присутствия или активности каждого из белков (или из кодируемых генами продуктов каждого набора генов), или для детектирования активности или экспрессии каждого из генов.
Детектируемые зонды включают антитела, фрагменты антител, лиганды, рецепторы или связывающие белки, нуклеиновые кислоты, например, ДНК или РНК. Предпочтительно, если набор включает белки, то коллекция зондов включает антитела для каждого из белков.
В одном из воплощений методов, которые обсуждают в этом документе, для коллекции зондов набор белков или генов включает один или несколько генов, кодирующих следующие вещества, или белки, которые представляют собой следующие вещества: цитокины, интерферон альфа, интерферон гамма, интерлейкин 12 р40, интерлейкин 18, интерферон бета, интерферон омега, лимфотоксин бета R, лимфотоксин, интерлейкин 6, интерлейкин 8, фактор некроза опухоли альфа, интерлейкин 4, интерлейкин 10, трансформирующий фактор роста бета-1, фактор некроза опухоли бета, интерлейкин 3, интерлейкин 5, интерлейкин 7, интерлейкин 13, интерлейкин 15, интерлейкин 1 альфа, интерлейкин 1 бета, интерлейкин 2, интерлейкин 11, интерлейкин 12 р70, интерлейкин 16, интерлейкин 17, хемокин, выделяемый Т-клетками при активации (RANTES), интерлейкин 21, интерлейкин 9 или бета-рецептор трансформирующего фактора роста III.
В различных воплощениях заданный набор анализируемых веществ может, альтернативно или в дополнении к вышеупомянутым соединениям, включать один или несколько белков, которые представляют собой следующие хемокины, или гены, кодирующие эти хемокины: хемоаттрактант В-лимфоцитов, эпителиальный клеточный нейтрофил-активирующий пептид, эотаксин, эотаксин-2, хемотаксический белок 2 моноцитов, хемотаксический белок моноцитов 3, фактор, ингибирующий миграцию макрофагов, воспалительный белок макрофагов 1 альфа, предшественник миелоидного ингибиторного фактора 1, макрофаг-стимулирующий белок, хемотаксический белок гранулоцитов 2, белок 10, индуцируемый интерфероном гамма, фактор, ингибирующий лейкемию, колониестимулирующий фактор макрофагов, хемотаксический белок моноцитов 1, хемокин, продуцируемый макрофагами, воспалительный белок макрофагов 1 бета, воспалительный белок макрофагов 1 дельта, нейтрофил-активирующий пептид 2, хемокин, регулируемый легкими и активацией, фактор альфа стромальных клеток, хемокин, регулируемый тимусом и активацией, бетацеллюлин, 6 Ckine, кислый фактор роста фибробластов, фракталкин, СС хемокин 1 гемофильтрата, хемотаксический белок моноцитов 4, воспалительный белок макрофагов 3 бета, фактор тромбоцитов 4, активатор рецептора NF-каппа-В, кожный хемокин, привлекающий Т-клетки, эотаксин-3, фактор роста фибробластов 4, фоллистатин, связанный с ростом окоген гамма, индуцируемый интерфероном гамма альфа-хемоаттрактант Т-клеток, рецептор фактора, ингибирующего лейкемию, альфа, мидкин, воспалительный белок макрофагов 3 альфа, плеотрофин, бета фактор стромальных клеток, экспрессируемый тимусом хемокин, трансформирующий фактор роста альфа, связанный с TNF, индуцируемый активином цитокин, белок-1 адгезии сосудов, CXCL9 или CCL1.
В других воплощениях заданный набор генов или белков включает один или несколько генов, кодирующих гормоны, или белки, которые представляют собой гормоны, такие как пролактин, белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 2, лептин, инсулин, резистин, адипонектин, глюкагон, глюкагон-подобный пептид 1 или PYY.
В одном из воплощений заданный набор генов или белков может также включать один или несколько генов, кодирующих адипокины, или белки, которые представляют собой адипокины, такие как хемотаксический белок моноцитов 1, лептин, резистин, адипонектин, IL-6, TNF-альфа, или активируемый тромбином ингибитор фибринолиза.
В других воплощениях заданный набор генов или белков дополнительно в разных вариантах включает один или несколько генов, кодирующих одно или несколько из следующих веществ, или сами белки, такие как нейрональные факторы роста, цилиарный нейротрофический фактор, нейротрофический фактор глиальных клеток, нейротрофический фактор головного мозга, нейротрофин 3, нейротрофин 4, или нейрональные факторы роста бета; фактор роста ангиогенин, эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов 7, фактор роста фибробластов 9, гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующий фактор, фактор роста меланомы, онкостатин М, фактор роста плаценты, трансформирующий фактор роста бета-3, амфирегулин, фактор роста фибробластов-6, колониестимулирующий фактор гранулоцитов, фактор стволовых клеток, фактор роста эндотелия сосудов, кардиотрофин-1, связанный с ростом онкоген бета, гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста, фактор роста гепатоцитов, медиатор проникновения вируса герпеса, матриксная металлопротеиназа 10, матриксная металлопротеиназа 7, матриксная металлопротеиназа 9, тканевые ингибиторы металлопротеиназ 1, фактор роста эндотелия сосудов D, рецептор фактора роста эндотелия сосудов 2, основной фактор роста фибробластов, инсулиноподобный фактор роста I, инсулиноподобный фактор роста II, белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 1, белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 3, белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 4, белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 6, матриксная металлопротеиназа 1, матриксная металлопротеиназа 2, или тканевый ингибитор металлопротеиназ 2; или растворимые рецепторы sCD23, Fas (CD95), антагонист рецептора интерлейкина 1, растворимый рецептор интерлейкина 2 альфа, TNF-связанный апоптоз-индуцирующий лиганд, рецептор активатора плазминогена урокиназного типа, лиганд fins-подобной тирозинкиназы-3, растворимый гликопротеин 130, растворимый рецептор I интерлейкина 1, растворимый рецептор интерлейкина 6, рецептор I фактора некроза опухоли, рецептор I фактора некроза опухоли I, кадхерин эпителия сосудов, CCL28, молекула цитотоксических Т-лимфоцитов 4, рецептор смерти 6, Fas-лиганд, молекула межклеточной адгезии 3, рецептор интерлейкина 2 гамма, рецептор интерлейкина 5 альфа, L-селектин, молекула-1 адгезии тромбоцитов к эндотелию, рецептор фактора стволовых клеток, рецептор TNF-связанного апоптоз-индуцирующего лиганда 4, активирующая лейкоциты молекула адгезии, CD27, CD30, CD40, рецептор цилиарного нейротрофического фактора, молекула межклеточной адгезии 1, рецептор инсулин-подобного фактора роста I, растворимый рецептор II интерлейкина 1, рецептор интерлейкина 2 бета, рецептор интерлейкина 10 бета, рецептор колониестимулирующего фактора макрофагов, рецептор фактора роста тромбоцитов альфа, или рецептор TNF-связанного апоптоз-индуцирующего лиганда 4.
В одном из предпочтительных воплощений способа заданный набор анализируемых веществ включает один или несколько генов, кодирующих каждое из следующих соединений: IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-18, IFN γ, IP-10, TNF-α, МСР-1, GLP-1, глюкагон, инсулин, адипонектин и резистин. В еще одном воплощении набор анализируемых веществ включает сами вышеупомянутые белки. В различных воплощениях животное представляет собой человека, мышь, обезьяну, собаку или кошку. В некоторых воплощениях заданный набор анализируемых веществ дополнительно включает один или несколько генов, кодирующих IL-15, КС или лептин, или сами белки этих веществ.
В одном из предпочтительных воплощений способа анализируемые вещества получают от собаки, и зонды представляют собой антитела, специфические для белков или продуктов экспрессии генов, кодирующих эти белки. В одном из воплощений коллекция молекулярных зондов позволяет проводить количественное определение содержания белка или уровня экспрессии каждого гена.
Способ может быть реализован с каждым зондом, прикрепленным к матрице, в котором каждый такой прикрепленный зонд сохраняет способность обеспечить количественное определение уровня экспрессии гена, соответствующего этому зонду, в образце, который привели в контакт с матрицей.
В некоторых воплощениях способ дополнительно включает стадию взаимодействия образца и коллекции молекулярных зондов с серией вторичных антител, включающих одно или несколько антител, которые могут, например, детектировать присутствие определенной части или типа антител, детектировать специфическое связывание между продуктом экспрессии каждого гена в наборе и соответствующего зонда в коллекции. Применение вторичных антител для такой детектирования понятно специалистам в области разработки анализов, основанных на применении антител, таких как определенные методы ELISA и различные так называемые «сэндвич»-методики. Как зонд, так вторичное антитело могут быть дополнительно связаны с генерацией сигнала или с системой усиления сигнала, такой как фермент.
В некоторых воплощениях способы включают применение коллекции молекулярных зондов, в которой каждый зонд прикрепляют к отдельной матрице, такой как бусина или подложка из полимерного материала.
Способы включают применение биологического образца, предпочтительно представляющего собой такой образец, который с большой вероятностью содержит гены в заданном наборе или который с большой вероятностью содержит продукты их экспрессии, который можно получить легко и относительно безболезненно, которого имеется в избытке или чье отсутствие не причинит вреда животному, и который представляет собой воспроизводимый образец. Подобные различные биологические образцы известны специалистам, примеры включают образцы различных тканей и жидкости. Примеры включают кровь, сыворотку, плазму, мочу, тканевые экстракты, цереброспинальную жидкость (CFS), синовиальную жидкость и клеточные экстракты. В этом документе также применяют клетки культуры тканей, экстракты, супернатанты и отработанные культуральные среды. Предпочтительные образцы представляют собой кровь, сыворотку, и плазму. Размер образца не важен, образцы могут быть любого размера, что полезно, практично и важно для аналитических определений. Предпочитают образцы размером менее чем 1 мл. Образцы обычно бывают менее чем 100 мкл, например, 75 или 50 мкл. Образцы меньшего размера также применяют в этом документе. Разумеется, для проведения анализов с помощью стандартного лабораторного оборудования, предпочитают образцы, которые имеет очень небольшой размер, поскольку они уменьшаю размеры пробы.
В другом аспекте изобретение обеспечивает способы разработки режима питания для улучшения здоровья животного. Способы включают:
а) выбор заданного набора представляющих интерес анализируемых веществ у животного, где активности анализируемых веществ или их присутствие могут быть скорреллированы с состоянием здоровья животного, и с режимом питания животного, причем набор включает, по меньшей мере, один белок или один ген, кодирующий каждый из следующих веществ: цитокин, хемокин, гормон и адипокин;
b) получение биологического образца от животного; причем указанный образец предположительно содержит заданный набор анализируемых веществ или продукты их экспрессии, причем указанный образец отражает текущий режим питания животного;
c) определение базовой линии измерения путем взаимодействия образца с коллекцией молекулярных зондов для определения активности или присутствия каждого из анализируемых веществ заданного набора или продуктов их экспрессии, где для каждого анализируемого вещества в наборе коллекция молекулярных зондов включает, по меньшей мере, один зонд, подходящий для детектирования активности или присутствия этого анализируемого вещества, причем каждый зонд способен производить независимо детектируемый сигнал, если анализируемое вещество или продукт экспрессии анализируемого вещества, соответствующий этому зонду, присутствует в образце;
d) детектирование независимо детектируемых сигналов, полученных после взаимодействия образца с коллекцией,
e) установление корреляции между детектируемыми сигналами и относительной активностью или присутствием каждого из анализируемых веществ заданного набора или продуктов их экспрессии в образце;
f) установление корреляции между относительной активностью или экспрессией каждого из генов заданного набора в образце и известными параметрами состояния здоровья;
g) установление состояния здоровья животного при текущем режиме питания в соответствии с этой корреляцией;
h) разработка одного или нескольких тестируемых режимов питания или состава кормовых добавок для животного путем подбора количества или источника одного или нескольких питательных макроэлементов, количества или источника одного или нескольких питательных микроэлементов, дополнительных питательных компонентов или содержания калорий в диете по сравнению с текущим режимом питания животного;
i) обеспечение животного одним или несколькими тестируемыми режимами питания или кормовыми добавками, или их комбинацией, в количестве и на время, достаточное для изменения активности, присутствия или экспрессии одного или нескольких из заданного набора анализируемых веществ;
j) для каждого из тестируемых режимов питания или кормовых добавок, или их комбинации, повторение стадий от b) до g) с новым образцом, полученным от животного, для определения того, улучшили ли тестируемые режимы питания или кормовые добавки, или их комбинация состояние здоровья животного; и
k) выбор разработанного режима питания или кормовой добавки, или их комбинации, который улучшает состояние здоровья животного.
Опытному специалисту понятно, что стадия j) означает повторение стадий от b) до g), хотя эти стадии повторяют с новым образцом, полученным от животного после стадии j), т.е. после того, как животное получило новый режим питания.
Как и с другими способами и композициями, которые обеспечивает этот документ, выбор заданных анализируемых веществ представляет собой в высшей степени рациональный процесс выбора этих анализируемых веществ, присутствие, активность или экспрессии которых могут коррелировать как с состоянием здоровья, так и с режимом питания, и которые обеспечивают полезные результаты. Выбор анализируемых веществ, которые имеют нулевую корреляцию с состоянием здоровья и нулевую корреляцию с любым режимом питания должно быть исключено, хотя такие анализируемых вещества может быть включены в качестве контролей или тестируемых анализируемых веществ, или им подобных.
Способы, описанные в этом документе, полезны для разработки любого режима питания для любого животного, такого как описано в этом документе. В различных предпочтительных воплощениях способы достаточно удобны в ситуациях, в которых животное страдает ожирением, имеет диабет, имеет симптомы предрасположенности к диабету, имеет нежелательный уровень воспаления, имеет нежелательный уровень резистентности к инсулину, имеет метаболический синдром, преждевременный атеросклероз, нарушенный метаболизм глюкозы или нарушенный метаболизм жиров. Многие из таких состояний, известные в этой области техники, могут быть слабо или более строго связаны с режимом питания, в особенности, с долговременным режимом питания. В одном из воплощений разработанные режим питания, кормовая добавка или их комбинация улучшают иммунную функцию, снижают воспаления, снижают резистентность к инсулину или воздействуют на их комбинацию у животного.
В различных воплощениях разработанный режим питания, кормовая добавка или их комбинация обладают одним или несколькими из следующих эффектов: (1) снижают воспаление у животного, и обладают одним или несколькими из следующих эффектов: увеличивают противовоспалительные цитокины, снижают про-воспалительные цитокины, или снижают цитокины-медиаторы воспаления; (2) снижают резистентность к инсулину у животного и обладают одним или несколькими из следующих эффектов: увеличивают адипонектин, снижают резистин или снижают лептин; или (3) ослабляют один или несколько из следующих процессов: дислипидемия, воспаление, повышенное кровяное давление, измененная реакция сосудов или ожирение внутренних органов, или улучшают фибринолиз. В специфических воплощениях набор анализируемых веществ включает каждое и любое из анализируемых веществ, описанных в этом документе, для других аспектов изобретения.
В предпочтительном воплощении заданный набор анализируемых веществ включает один или несколько генов, кодирующих каждое из следующих веществ: IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-18, IFN γ, IP-10, TNF-α, MCP-1, GLP-1, глюкагон, инсулин, адипонектин, и резистин, или соответствующие белки. Дополнительно, могут быть включены один или несколько генов, кодирующих IL-15, КС или лептин, или соответствующие белки.
В некоторых воплощениях животное представляет собой человека, мышь, обезьяну, собаку или кошку. В предпочтительном воплощении анализируемые вещества представляют собой белки собаки, и молекулярные зонды представляют собой антитела, которые позволяют проводить количественное определение содержания таких белков. В некоторых воплощениях каждый зонд прикрепляют к матрице, и он сохраняет способность обеспечивать количественное определение содержания анализируемого вещества, соответствующего этому зонду, при условии, что образец контактирует с матрицей.
Способы могут также включать дополнительную стадию взаимодействия образца и коллекции молекулярных зондов с серией вторичных зондов, например, вторичные антитела, включающие одно или несколько антител, которые увеличивают специфичность или путем амплификации увеличивают сигнал. В одном из воплощений каждый зонд прикрепляют к отдельной матрице.
Как описано в этом документе, образец может быть любым биологическим образцом, таким как ткань или жидкость организма. Примеры включают кровь, сыворотку, плазму, мочу, тканевые экстракты, цереброспинальную жидкость (CFS), синовиальную жидкость и клеточные экстракты. В этом документе также применяют ех vivo образцы, такие как постоянно или временно культивируемая ткань или клетки, или супернатант, отработанная культуральная среда, экссудаты или им подобные. Для применения в способах предпочитают образцы, включающие или состоящие из сыворотки или плазмы.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает наборы, подходящие для определения в одном образце активности, присутствия или экспрессии каждого из анализируемых веществ заданного набора. Наборы включают отдельные контейнеры в единой упаковке или отдельные контейнеры в виртуальной упаковке, в том виде, в каком это больше подходит для набора компонентов, мультипараметрический анализ, включающий коллекцию детектируемых молекулярных зондов, таких как описаны в этом документе, и один или несколько из следующих компонентов: (1) инструкции по применению мультипараметрического анализа для определения активности, присутствия или экспрессии каждого из анализируемых веществ заданного набора, (2) инструкция по определению состояния здоровья животного с помощью мультипараметрического анализа, (3) инструкции для разработки режима питания для улучшения здоровья животного с помощью мультипараметрического анализа, и (4) один или несколько ингредиентов, подходящих для потребления животным. В некоторых воплощениях набор включает мультипараметрический анализ и пищевую композицию, такую как полностью обеспеченный питательными веществами корм для домашних животных или питательные кормовые добавки, такие как витамины и минералы, которые полезны для разработки питания для улучшения здоровья животного.
Если набор включает виртуальную упаковку, то набор ограничен инструкциями в виртуальном пространстве в сочетании с одним или несколькими физическим компонентом набора. Набор может содержать дополнительные элементы, такие как устройство для перемешивания реагентов, применяемых при мультипараметрическом анализе, или устройство обеспечения и/или проведения мультипараметрического анализа.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает средство для передачи информации о применении мультипараметрического анализа или инструкции по применению мультипараметрического анализа для выполнения одного или нескольких из следующих действий: (1) определение в одном образце активности, присутствия или экспрессии каждого из анализируемых веществ заданного набора, (2) оценка состояния здоровья животного, или (3) разработка режима питания для улучшения здоровья животного. Средство включает документ, цифровое устройство для хранения данных, оптическое устройство для хранения данных, аудио презентацию или визуальный показ, содержащий информацию или инструкции. В некоторых воплощениях средство для передачи информации представляет собой воспроизводимый на дисплее веб-сайт, киоск для визуального показа, брошюру, этикетку изделия, листовку-вкладыш в упаковку, объявление, рекламную листовку, публичное сообщение, аудиозапись, видеозапись, DVD, CD-ROM, компьютерный чип, компьютерную карта, компьютерный диск, компьютерную память или их комбинации, содержащие такую информацию или инструкции. Применяемая информация включает одно или несколько из следующего: (1) способы и методики проведения действий с биологическими образцами для применения в мультипараметрическом анализе, (2) контактная информация для применения индивидуумами, в случае, если у них возникли вопросы по поводу мультипараметрического анализа и его применения.
Изобретение не ограничено определенной методикой, протоколами и реагентами, описанными в этом документе, поскольку они могут варьировать. Дополнительно, терминология, примененная в этом документе, предназначена только для описания отдельных воплощений и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения. Примененные в этом документе и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа с артиклями «a», «an» и «the» включают отсылки к множественным формам, кроме тех случаев, когда контекст указывает на обратное, например, ссылка на «цитокин» включает множество таких цитокинов. Подобным образом, слова «включают», «включает» и «включающий» следует интерпретировать как «включительно», нежели как «исключительно».
Если не определено иначе, все технические и научные термины и любые аббревиатуры, примененные в этом документе, имеют такие же значения, как те, что обычно понятны специалисту среднего уровня компетентности в той области техники, которая имеет отношение к этому изобретения. Хотя любые композиции, способы, изделия промышленного производства или другие средства или материалы, похожие или эквивалентные тем, что описаны в этом документе, могут быть применены при практическом применении настоящего изобретения, в этом документе описаны предпочтительные композиции, способы, изделия промышленного производства или другие средства или материалы.
ПРИМЕРЫ
Изобретение может быть дополнительно проиллюстрировано с помощью следующих примеров, хотя следует понимать, что эти примеры включены с единственной целью служить иллюстрацией, и не предназначены для ограничения объема изобретения, если специально не указано иное.
Пример 1
Исследование мышей с модифицированным режимом питания, включающим рыбий жир и витамин Е.
Эксперимент проводили с целью идентифицировать молекулярные пути, на которые оказывает влияние модифицированная диета, и установить механизмы действия, приводящие к увеличению продолжительности жизни. План эксперимента: группа I: мыши, получавшие с кормом модифицированную диету с 10-го по 16-ый месяцы [n=19]; группа II: мыши, получавшие с кормом контрольную диету с 10-го по 16-ый месяцы [n=19]; группа III: мыши, получавшие с кормом модифицированную диету с 17-го по 23-ий месяцы [n=7]; и группа IV: мыши, получавшие с кормом контрольную диету с 17-го по 23-ий месяцы [n=9]. Эксперимент: Применение мультипараметрического способа для измерения уровней 27-и белков (MIP-1α, GM-CSF, МСР-1, КС, RANTES, IFN-γ, IL-1β, IL-1α, G-CSF, IP-10, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, TNF-α, IL-9, IL-13, IL-15, IL-17, инсулин, лептин, tPAI-1, резистин и адипонектин), применяя 75 мкл образца плазмы. Мультипараметрические измерения проводят с панелью зондов, соответствующих 27-и выбранным белкам, с помощью устройства Luminex. Временные точки: применяют мышей-самцов С57 В1/6. Мышей переводят на диетический режим на 10-ом или на 17-ом месяце жизни. Мыши получают с кормом или модифицированную («анализируемую») диету или контрольную диету в течение 6-ти месяцев - либо с 10-го по 16-ый месяцы жизни («Y», молодые мыши, группы II и I), или либо с 17 по 23 месяцы жизни («О», старые мыши, группы III и IV). Образцы крови берут у забитых мышей, и органы быстро замораживают для формирования банка тканей. Биообразцы анализируют на 27 белков анализируемых веществ. Результаты приведены в таблице 2.
| Таблица 2А | |||||||||
| - Цитокины | |||||||||
| Определяемый образец | MIP-1α | GM-CSF | МСР-1 | КС | RANTES | IFN-γ | IL-1β | ||
| (Возраст - месяцы) | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | ||
| Группа II | С1-12 | 10-Y | 83 | 37 | 18 | 35 | 8 | 12 | <3 |
| С2-12 | 10-Y | 147 | 67 | 40 | 32 | 13 | 14 | 3 | |
| С3-12 | 10-Y | 99 | 7 | 29 | 24 | 16 | 32 | 11 | |
| С4-12 | 10-Y | 64 | 35 | 23 | 31 | 12 | 6 | 4 | |
| С5-12 | 10-Y | 632 | 216 | 47 | 77 | 40 | 8 | 14 | |
| С6-12 | 10-Y | 110 | 69 | 9 | 80 | 38 | <3 | <3 | |
| С7-12 | 10-Y | 4 | 13 | 26 | 34 | 26 | <3 | 13 | |
| С8-12 | 10-Y | 94 | 25 | 25 | 134 | 23 | <3 | <3 | |
| С9-12 | 10-Y | 88 | 48 | 19 | 21 | 30 | 2,187 | <3 | |
| С10-12 | 10-Y | 407 | 151 | 21 | 33 | 30 | <3 | <3 | |
| С11-12 | 10-Y | 679 | 117 | 29 | 128 | 6 | 51 | 16 | |
| С12-12 | 10-Y | 105 | 25 | 13 | 18 | 34 | <3 | <3 | |
| С-13 | 10-Y | 125 | 31 | 21 | 8 | 48 | <3 | <3 | |
| С14-12 | 10-Y | 105 | <5 | 9 | 95 | 26 | <3 | <3 | |
| С15-12 | 10-Y | 338 | 90 | 18 | 27 | 21 | <3 | 5 | |
| С16-12 | 10-Y | 99 | 33 | <6 | 107 | 13 | <3 | <3 | |
| С17-12 | 10-Y | 83 | 45 | 16 | 51 | 31 | <3 | <3 | |
| С18-12 | 10-Y | 210 | 110 | 29 | 419 | 25 | <3 | 5 | |
| С19-12 | 10-Y | 176 | 47 | 13 | 59 | 17 | <3 | <3 | |
| С20-12 | 10-Y | 4,861 | 52 | 26 | 16 | 20 | 12 | 7 |
| Определяемый образец | MIP-1α | GM-CSF | МСР-1 | КС | RANTES | IFN-γ | IL-1β | ||
| (Возраст - месяцы) | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | ||
| Группа I | Т1-12 | 10-Y | 4 | 23 | <6 | 12 | 14 | <3 | <3 |
| Т2-12 | 10-Y | 77 | 101 | <6 | 27 | 17 | <3 | <3 | |
| Т3-12 | 10-Y | 241 | 77 | 24 | 45 | 38 | 13 | <3 | |
| Т4-12 | 10-Y | 99 | 65 | 162 | 71 | 43 | <3 | 6 | |
| Т5-12 | 10-Y | 115 | 52 | 11 | 40 | 20 | <3 | <3 | |
| Т6-12 | 10-Y | 105 | 71 | 19 | 30 | 36 | <3 | <3 | |
| Т7-12 | 10-Y | 120 | 156 | 32 | 79 | 52 | <3 | <3 | |
| Т8-12 | 10-Y | 94 | <5 | 11 | 5 | 34 | 4 | <3 | |
| Т9-12 | 10-Y | 210 | 187 | 25 | 67 | 50 | <3 | 10 | |
| Т10-12 | 10-Y | 147 | 180 | 89 | 59 | 42 | 9 | 83 | |
| Т11-12 | 10-Y | 414 | 123 | 24 | 70 | 25 | 5 | 8 | |
| Т12-12 | 10-Y | 70 | 38 | 6 | 30 | 10 | <3 | <3 | |
| Т13-12 | 10-Y | 41 | 63 | 15 | <3 | 43 | <3 | <3 | |
| Т14-12 | 10-Y | 70 | <5 | 13 | 20 | 4 | 5 | <3 | |
| Т15-12 | 10-Y | 267 | 72 | 90 | 47 | 25 | <3 | 14 | |
| Т16-12 | 10-Y | 88 | 63 | 15 | 26 | 22 | <3 | <3 | |
| Т17-12 | 10-Y | 41 | 35 | <6 | 94 | 18 | <3 | <3 | |
| Т19-12 | 10-Y | 180 | 34 | 23 | 59 | 31 | <3 | <3 | |
| Т20-12 | 10-Y | 120 | 52 | 34 | 63 | 18 | <3 | 5 | |
| Группа III | Т1-12 | 20-O | <3 | <5 | <6 | 17 | <3 | <3 | <3 |
| Т3-12 | 20-O | 301 | 55 | 34 | 20 | 21 | 4 | 9 | |
| Т5-12 | 20-O | 650 | 107 | 49 | 57 | 14 | 41 | 83 | |
| Т6-12 | 20-O | 160 | 15 | 18 | 29 | 9 | 35 | <3 | |
| Т7-12 | 20-O | <3 | <5 | 15 | <3 | 11 | <3 | 3 | |
| Т8-12 | 20-O | 228 | 76 | 51 | 19 | 20 | 229 | 19 | |
| Т12-12 | 20-O | 192 | 57 | 30 | 110 | 20 | 4 | 5 | |
| Т16-12 | 20-O | 1,500 | 262 | 102 | 213 | 17 | 144 | 44 | |
| Т17-12 | 20-O | 312 | 103 | 1,562 | 74 | 452 | 51 | 1,175 | |
| Группа IV | С1-12 | 20-O | 419 | 69 | 15 | 40 | 14 | 47 | <3 |
| С2-12 | 20-O | 286 | 59 | 56 | 33 | 24 | 87 | 25 | |
| С3-12 | 20-O | 147 | 88 | 304 | 64 | 124 | 54 | 423 | |
| С5-12 | 20-O | 365 | <5 | 1,426 | 9 | 645 | 4 | 444 | |
| С6-12 | 20-O | 88 | 48 | 44 | 27 | 13 | <3 | 11 | |
| С9-12 | 20-O | 389 | 65 | 461 | 110 | 64 | 31 | 614 | |
| С10-12 | 20-O | 143 | 122 | 41 | 39 | 18 | <3 | 3 | |
| Таблица 2 | |||||||||
| - Продолжение | |||||||||
| Определяемый образец | IL-1α | G-CSF | IP-10 | IL-2 | IL-4 | IL-5 | IL-6 | ||
| (Возраст - месяцы) | ПГ/МЛ | ПГ/МЛ | ПГ/МЛ | ПГ/МЛ | ПГ/МЛ | ПГ/МЛ | ПГ/МЛ | ||
| Группа II | С1-12 | 10-Y | 20 | 36 | 35 | 3 | <3 | 3 | <3 |
| С2-12 | 10-Y | 11 | 26 | 34 | <3 | <3 | 7 | 7 | |
| С3-12 | 10-Y | 17 | 105 | 371 | <3 | <3 | 8 | 6 | |
| С4-12 | 10-Y | 33 | 136 | 64 | <3 | <3 | 8 | 10 | |
| С5-12 | 10-Y | 51 | 274 | 86 | 21 | 4 | 30 | 35 | |
| С6-12 | 10-Y | 24 | 102 | 71 | 9 | <3 | 28 | 2 |
| Определяемый образец | IL-1α | G-CSF | IP-10 | IL-2 | IL-4 | IL-5 | IL-6 | ||
| (Возраст - месяцы) | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | ||
| С7-12 | 10-Y | 10 | 36 | 45 | 42 | <3 | 11 | 7 | |
| С8-12 | 10-Y | 81 | 463 | 80 | <3 | <3 | 17 | 122 | |
| С9-12 | 10-Y | 26 | 87 | 93 | <3 | <3 | 5 | 7 | |
| С10-12 С11-12 | 10-Y 10-Y | 16 22 |
168 93 |
74 117 | 4 <3 |
7 <3 |
9 7 |
5 6 |
|
| С12-12 | 10-Y | 14 | 65 | 29 | <3 | <3 | 15 | 5 | |
| С-13 | 10-Y | 37 | 80 | 44 | <3 | <3 | 26 | 7 | |
| С14-12 | 10-Y | 20 | 141 | 30 | <3 | <3 | 6 | 18 | |
| С15-12 | 10-Y | 21 | 83 | 38 | 4 | <3 | 11 | 5 | |
| С16-12 | 10-Y | 23 | 76 | 56 | <3 | <3 | 5 | 3 | |
| С17-12 | 10-Y | 22 | 100 | 46 | 19 | <3 | 29 | 8 | |
| С18-12 | 10-Y | 241 | 2,328 | 42 | 10 | <3 | 22 | 317 | |
| С19-12 | 10-Y | 20 | 42 | 32 | 4 | <3 | 8 | <3 | |
| С20-12 | 10-Y | 9 | 24 | 26 | 5 | <3 | 7 | 6 | |
| Группа I | Т1-12 | 10-Y | 8 | 57 | 6 | 4 | <3 | 4 | <3 |
| Т2-12 | 10-Y | 14 | 202 | 46 | 6 | <3 | 8 | <3 | |
| Т3-12 | 10-Y | 34 | 160 | 73 | 3 | <3 | 31 | 8 | |
| Т4-12 | 10-Y | 31 | 193 | 712 | <3 | <3 | 53 | 3 | |
| Т5-12 | 10-Y | 12 | 30 | 36 | 7 | <3 | 13 | <3 | |
| Т6-12 | 10-Y | 21 | 92 | 53 | 5 | <3 | 10 | <3 | |
| Т7-12 | 10-Y | 33 | 246 | 104 | 28 | <3 | 14 | <3 | |
| Т8-12 | 10-Y | 18 | 83 | 57 | <3 | <3 | 1,092 | <3 | |
| Т9-12 | 10-Y | 39 | 224 | 93 | 39 | <3 | 32 | 3 | |
| Т10-12 | 10-Y | 38 | 259 | 57 | 10 | <3 | 65 | 75 | |
| Т11-12 | 10-Y | 25 | 218 | 41 | 13 | <3 | 19 | <3 | |
| Т12-12 | 10-Y | 11 | 53 | 23 | <3 | <3 | 14 | 5 | |
| Т13-12 | 10-Y | 19 | 93 | 60 | <3 | <3 | 13 | <3 | |
| Т14-12 | 10-Y | 19 | 105 | 32 | <3 | <3 | 4 | <3 | |
| Т15-12 | 10-Y | 19 | 62 | 47 | 8 | <3 | 9 | 4 | |
| Т16-12 | 10-Y | 35 | 56 | 35 | 6 | <3 | 10 | <3 | |
| Т17-12 | 10-Y | 15 | 70 | 38 | <3 | <3 | 6 | <3 | |
| Т19-12 | 10-Y | 38 | 87 | 47 | 5 | <3 | 8 | <3 | |
| Т20-12 | 10-Y | 68 | 141 | 44 | 4 | <3 | 8 | 26 | |
| Группа III | Т1-12 | 20-O | 190 | 171 | <6 | <3 | <3 | 8 | 5 |
| Т3-12 | 20-O | 186 | 879 | 42 | 7 | <3 | 8 | 131 | |
| Т5-12 | 20-O | 42 | 298 | 29 | 11 | <3 | 16 | 13 | |
| Т6-12 | 20-O | 35 | 102 | 16 | <3 | <3 | 8 | <3 | |
| Т7-12 | 20-O | 28 | 85 | 6 | <3 | <3 | 6 | <3 | |
| Т8-12 | 20-O | 99 | 550 | 26 | 3 | <3 | 16 | 47 | |
| Т12-12 | 20-O | 63 | 112 | 9 | 4 | <3 | 12 | 24 | |
| Т16-12 | 20-O | 63 | 115 | 38 | 68 | <3 | 25 | 18 | |
| Т17-12 | 20-O | 79 | 1,818 | 88 | <3 | <3 | 273 | 1,528 | |
| Группа IV | С1-12 | 20-O | 90 | 698 | 36 | 5 | <3 | 10 | 365 |
| С2-12 | 20-O | 150 | 629 | 39 | 10 | <3 | 10 | 44 | |
| С3-12 | 20-O | 40 | 191 | 433 | <3 | <3 | 175 | 761 | |
| С5-12 | 20-O | 78 | 396 | 28 | <3 | <3 | 122 | 35 | |
| С6-12 | 20-O | 83 | 183 | 42 | <3 | <3 | 12 | <3 |
| Определяемый образец | IL-1α | G-CSF | IP-10 | IL-2 | IL-4 | IL-5 | IL-6 | |||
| (Возраст - месяцы) | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | |||
| С9-12 | 20-O | 40 | 527 | 104 | 5 | <3 | 83 | 143 | ||
| С10-12 | 20-O | 181 | 199 | 15 | 17 | <3 | 24 | 13 | ||
| Таблица 2 - Продолжение |
||||||||||
| Определяемый образец | IL-7 | IL-10 | IL-12 | TNFα | IL-9 | IL-13 | IL-15 | IL-17 | ||
| (Возраст - месяцы) | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | ||
| Группа II | С1-12 | 10-Y | 9 | <10 | <4 | 8 | * | 6 | <9 | 9 |
| С2-12 | 10-Y | 80 | <10 | 77 | 15 | * | 9 | 11 | 27 | |
| С3-12 | 10-Y | <4 | <10 | 87 | 9 | * | <5 | 11 | 13 | |
| С4-12 | 10-Y | 6 | <10 | <4 | 7 | * | 20 | 18 | 11 | |
| С5-12 | 10-Y | 4 | <10 | 232 | 13 | * | 21 | 56 | 17 | |
| С6-12 | 10-Y | <4 | <10 | 52 | 5 | * | 13 | <9 | 11 | |
| С7-12 | 10-Y | 15 | <10 | 71 | 6 | * | 21 | <9 | 30 | |
| С8-12 | 10-Y | <4 | <10 | 32 | 16 | * | 12 | 220 | 10 | |
| С9-12 | 10-Y | 55 | 72 | 238 | 15 | * | 12 | 17 | 57 | |
| С10-12 | 10-Y | <4 | <10 | 146 | 4 | * | 20 | 22 | 15 | |
| С11-12 | 10-Y | <4 | <10 | 32 | <3 | * | 13 | 13 | 10 | |
| С12-12 | 10-Y | <4 | <10 | 59 | 5 | <11 | 9 | <9 | 13 | |
| С-13 | 10-Y | <4 | <10 | 55 | 5 | * | <5 | 21 | 34 | |
| С14-12 | 10-Y | <4 | <10 | 228 | 8 | <11 | 22 | <9 | 7 | |
| С15-12 | 10-Y | 9 | <10 | 170 | 6 | <11 | 25 | 61 | 7 | |
| С16-12 | 10-Y | <4 | <10 | 69 | <3 | * | 24 | <9 | 6 | |
| С17-12 | 10-Y | <4 | <10 | 170 | 5 | 31 | 19 | 26 | 19 | |
| С18-12 | 10-Y | 9 | <10 | 148 | 18 | * | 31 | 66 | 20 | |
| С19-12 | 10-Y | <4 | <10 | 54 | 4 | <11 | 20 | <9 | 5 | |
| С20-12 | 10-Y | 8 | <10 | 208 | 8 | <11 | 20 | 124 | 11 | |
| Группа I | Т1-12 | 10-Y | <4 | <10 | 47 | 3 | * | 8 | <9 | <3 |
| Т2-12 | 10-Y | <4 | <10 | 35 | 5 | <11 | 7 | <9 | 7 | |
| Т3-12 | 10-Y | <4 | <10 | 141 | 7 | <11 | 20 | <9 | 13 | |
| Т4-12 | 10-Y | <4 | 20 | 564 | 296 | <11 | 23 | 10 | 19 | |
| Т5-12 | 10-Y | <4 | <10 | 25 | 5 | * | 5 | <9 | 7 | |
| Т6-12 | 10-Y | <4 | <10 | 70 | 4 | * | 23 | 16 | 4 | |
| Т7-12 | 10-Y | 5 | 31 | 285 | 10 | 14 | 24 | 28 | 21 | |
| Т8-12 | 10-Y | 6 | <10 | <4 | 4 | * | <5 | 13 | 8 | |
| Т9-12 | 10-Y | <4 | <10 | 363 | 9 | * | 20 | 20 | 13 | |
| Т10-12 | 10-Y | <4 | 12 | 369 | 60 | * | 10 | <9 | 67 | |
| Т11-12 | 10-Y | <4 | <10 | 69 | 20 | * | 26 | 131 | 8 | |
| Т12-12 | 10-Y | <4 | <10 | 107 | <3 | * | 20 | <9 | 5 | |
| Т13-12 | 10-Y | <4 | <10 | 54 | 9 | * | 11 | 14 | 17 | |
| Т14-12 | 10-Y | <4 | <10 | 38 | 3 | * | 13 | <9 | 6 | |
| Т15-12 | 10-Y | <4 | <10 | 75 | 27 | 14 | 18 | 10 | 9 | |
| Т16-12 | 10-Y | <4 | <10 | 68 | 6 | <11 | 22 | <9 | 6 | |
| Т17-12 | 10-Y | <4 | <10 | <4 | 8 | * | 28 | <9 | 9 | |
| Т19-12 | 10-Y | <4 | <10 | 38 | 6 | 19 | 24 | <9 | 8 | |
| Т20-12 | 10-Y | <4 | <10 | 52 | 14 | <11 | 24 | 29 | 25 | |
| Группа III | Т1-12 | 20-O | <4 | <10 | 22 | 9 | <11 | <5 | <9 | 6 |
| Т3-12 | 20-O | <4 | 20 | 105 | 20 | * | 28 | 16 | 10 |
| Определяемый образец | IL-7 | IL-10 | IL-12 | TNFα | IL-9 | IL-13 | IL-15 | IL-17 | ||
| (Возраст - месяцы) | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | пг/мл | ||
| Т5-12 | 20-O | <4 | <10 | 128 | 7 | 103 | 39 | 45 | 14 | |
| Т6-12 | 20-O | 6 | <10 | 12 | 5 | * | <5 | 29 | 4 | |
| 17-12 | 20-O | <4 | <10 | 35 | 4 | * | 13 | <9 | 6 | |
| Т8-12 | 20-O | 7 | 43 | 190 | 15 | * | 24 | <9 | 61 | |
| Т12-12 | 20-O | <4 | <10 | 85 | 11 | * | 13 | 39 | 8 | |
| Т16-12 | 20-O | <4 | <10 | 135 | 44 | 658 | 31 | 21 | 34 | |
| Т17-12 | 20-O | 5 | 261 | 2,543 | 1,233 | * | 35 | 14 | 1,126 | |
| Группа IV | С1-12 | 20-O | <4 | 15 | 153 | 11 | 169 | 16 | 51 | 128 |
| С2-12 | 20-O | 10 | 48 | 175 | 23 | 187 | <5 | 20 | 43 | |
| С3-12 | 20-O | 274 | 29 | 999 | 111 | * | <5 | 449 | 276 | |
| С5-12 | 20-O | 11 | 92 | 2,628 | >10,000 | <11 | <5 | 32 | 841 | |
| С6-12 | 20-O | 200 | <10 | 103 | 8 | <11 | 16 | 160 | 15 | |
| С9-12 | 20-O | <4 | 33 | 208 | 91 | * | 11 | 27 | 183 | |
| С10-12 | 20-O | <4 | <10 | 141 | 7 | * | 12 | 56 | 11 | |
| Таблица 2В: | ||||||||||
| Адипокины | ||||||||||
| Определяемый образец | Инсулин | Лептин | tPAI-1 | Резистин | ||||||
| Группа II | С1-12 | 10 месяцев-Y | 840 | 6,229 | 1,486 | 3,334 | ||||
| С2-12 | 10 месяцев-Y | 906 | 9,992 | 836 | 807 | |||||
| С3-12 | 10 месяцев-Y | 728 | 11,529 | 732 | 727 | |||||
| С4-12 | 10 месяцев-Y | 474 | 12,431 | 398 | 1,360 | |||||
| С5-12 | 10 месяцев-Y | 618 | 4,611 | 2,753 | 2,127 | |||||
| С6-12 | 10 месяцев-Y | 1,361 | 9,748 | 1,609 | 955 | |||||
| С7-12 | 10 месяцев-Y | 939 | 13,068 | 653 | 978 | |||||
| С8-12 | 10 месяцев-Y | 462 | 6,728 | 1,794 | 484 | |||||
| С9-12 | 10 месяцев-Y | 599 | 14,251 | 2,464 | 999 | |||||
| С10-12 | 10 месяцев-Y | 971 | 13,112 | 1,452 | 1,107 | |||||
| С11-12 | 10 месяцев-Y | 515 | 8,270 | 216 | 582 | |||||
| С12-12 | 10 месяцев-Y | 660 | 9,170 | 2,075 | 815 | |||||
| С-13 | 10 месяцев-Y | 564 | 13,499 | 2,378 | 1,035 | |||||
| С14-12 | 10 месяцев-Y | 1,213 | 11,812 | 1,954 | 736 | |||||
| С15-12 | 10 месяцев-Y | 1,116 | 6,027 | 503 | 1,149 | |||||
| С16-12 | 10 месяцев-Y | 632 | 6,772 | 2,289 | 680 | |||||
| С17-12 | 10 месяцев-Y | 574 | 11,722 | 2,927 | 1,565 | |||||
| С18-12 | 10 месяцев-Y | 316 | 813 | 3,880 | 714 | |||||
| С19-12 | 10 месяцев-Y | 686 | 2,170 | 1,244 | 266 | |||||
| С20-12 | 10 месяцев-Y | 761 | 6,536 | 706 | 668 | |||||
| Группа I | Т1-12 | 10 месяцев-Y | 1,158 | 4,674 | 1,047 | 498 | ||||
| Т2-12 | 10 месяцев-Y | 836 | 5,872 | 743 | 538 | |||||
| Т3-12 | 10 месяцев-Y | 1,226 | 3,919 | 1,170 | 690 | |||||
| Т4-12 | 10 месяцев-Y | 728 | 6,397 | 2,342 | 349 | |||||
| Т5-12 | 10 месяцев-Y | 840 | 3,402 | 843 | 830 | |||||
| Т6-12 | 10 месяцев-Y | 733 | 15,217 | 2,002 | 1,057 | |||||
| Т7-12 | 10 месяцев-Y | 1,417 | 12,485 | 1,521 | 1,261 | |||||
| Т8-12 | 10 месяцев-Y | 896 | 8,986 | 2,321 | 683 | |||||
| Т9-12 | 10 месяцев-Y | 843 | 6,250 | 1,758 | 313 | |||||
| Т10-12 | 10 месяцев-Y | 298 | 5,421 | 1,458 | 763 | |||||
| Т11-12 | 10 месяцев-Y | 916 | 7,344 | 329 | 330 |
| Определяемый образец | Инсулин | Лептин | tPAI-1 | Резистин | ||
| Т12-12 | 10 месяцев-Y | 449 | 3,687 | 1,702 | 123 | |
| Т13-12 | 10 месяцев-Y | 776 | 6,292 | 2,266 | 1,599 | |
| Т14-12 | 10 месяцев-Y | 430 | 6,428 | 1,894 | 970 | |
| Т15-12 | 10 месяцев-Y | 574 | 2,455 | 938 | 405 | |
| Т16-12 | 10 месяцев-Y | 1,085 | 2,852 | 478 | 351 | |
| Т17-12 | 10 месяцев-Y | 909 | 6,972 | 1,771 | 259 | |
| Т19-12 | 10 месяцев-Y | 646 | 3,716 | 1,229 | 430 | |
| Т20-12 | 10 месяцев-Y | 307 | 2,017 | <12 | 300 | |
| Группа III | Т1-12 | 20 месяцев-О | 847 | 4,785 | 1,839 | 315 |
| Т3-12 | 20 месяцев-О | 492 | 135 | 2,457 | 613 | |
| Т5-12 | 20 месяцев-О | 449 | 2,736 | 369 | 425 | |
| Т6-12 | 20 месяцев-О | 728 | 2,177 | 216 | 218 | |
| Т7-12 | 20 месяцев-О | 564 | 1,738 | 940 | 343 | |
| Т8-12 | 20 месяцев-О | 278 | 67 | 2,065 | 613 | |
| Т12-12 | 20 месяцев-О | 443 | 1,494 | 249 | 340 | |
| Т16-12 | 20 месяцев-О | 402 | 1,013 | 778 | 432 | |
| Т17-12 | 20 месяцев-О | 456 | 2,143 | 1,206 | 1,043 | |
| Группа IV | С1-12 | 20 месяцев-О | 258 | 1,688 | 1,049 | 513 |
| С2-12 | 20 месяцев-О | 258 | 2,663 | 2,400 | 521 | |
| С3-12 | 20 месяцев-О | 341 | 9,421 | 1,419 | 624 | |
| С5-12 | 20 месяцев-О | 803 | 4,347 | 1,293 | 516 | |
| С6-12 | 20 месяцев-О | 919 | 4,431 | 1,835 | 335 | |
| С9-12 | 20 месяцев-О | 521 | 5,676 | 1,517 | 340 | |
| С10-12 | 20 месяцев-О | 521 | 291 | 1,210 | 210 | |
| Таблица 2С. | ||||||
| Адипонектин | ||||||
| Определяемый образец | Мышиный адипонектин | |||||
| С1-12 | Группа II | 10 месяцев-Y | 8,6 | |||
| С2-12 | 10 месяцев-Y | недост. кол-во | ||||
| С3-12 | 10 месяцев-Y | 13,2 | ||||
| С4-12 | 10 месяцев-Y | 13,0 | ||||
| С5-12 | 10 месяцев-Y | 11,3 | ||||
| С6-12 | 10 месяцев-Y | 10,4 | ||||
| С7-12 | 10 месяцев-Y | 13,4 | ||||
| С8-12 | 10 месяцев-Y | 7,4 | ||||
| С9-12 | 10 месяцев-Y | 10,7 | ||||
| С10-12 | 10 месяцев-Y | 10,0 | ||||
| С11-12 | 10 месяцев-Y | 9,3 | ||||
| С12-12 | 10 месяцев-Y | 11,9 | ||||
| С-13 | 10 месяцев-Y | 10,3 | ||||
| С14-12 | 10 месяцев-Y | 13,3 | ||||
| С15-12 | 10 месяцев-Y | 13,0 | ||||
| С16-12 | 10 месяцев-Y | 8,3 | ||||
| С17-12 | 10 месяцев-Y | 12,7 | ||||
| С18-12 | 10 месяцев-Y | 5,3 | ||||
| С19-12 | 10 месяцев-Y | 9,4 | ||||
| С20-12 | 10 месяцев-Y | 13,8 | ||||
| Т1-12 | Группа I | 10 месяцев-Y | 13,2 | |||
| Т2-12 | 10 месяцев-Y | 8,4 | ||||
| Т3-12 | 10 месяцев-Y | 11,7 |
| Определяемый образец | Мышиный адипонектин | |||
| Т4-12 | 10 месяцев-Y | 8,9 | ||
| Т5-12 | 10 месяцев-Y | 11,4 | ||
| Т6-12 | 10 месяцев-Y | 9,1 | ||
| Т7-12 | 10 месяцев-Y | 7,3 | ||
| Т8-12 | 10 месяцев-Y | 8,6 | ||
| Т9-12 | 10 месяцев-Y | 9,3 | ||
| Т10-12 | 10 месяцев-Y | 7,7 | ||
| Т11-12 | 10 месяцев-Y | 10,0 | ||
| Т12-12 | 10 месяцев-Y | 14,7 | ||
| Т13-12 | 10 месяцев-Y | 10,3 | ||
| Т14-12 | 10 месяцев-Y | 14,1 | ||
| Т15-12 | 10 месяцев-Y | 9,2 | ||
| Т16-12 | 10 месяцев-Y | 12,9 | ||
| Т17-12 | 10 месяцев-Y | 12,7 | ||
| Т19-12 | 10 месяцев-Y | 11,8 | ||
| Т20-12 | 10 месяцев-Y | 7,7 | ||
| Т1-12 | Группа III | 20 месяцев-О | 16,2 | |
| Т3-12 | 20 месяцев-О | 9,1 | ||
| Т5-12 | 20 месяцев-О | 13,9 | ||
| Т6-12 | 20 месяцев-О | 19,1 | ||
| Т7-12 | 20 месяцев-О | 17,7 | ||
| Т8-12 | 20 месяцев-О | 9,6 | ||
| Т12-12 | 20 месяцев-О | 13,1 | ||
| Т16-12 | 20 месяцев-О | 19,3 | ||
| Т17-12 | 20 месяцев-О | 14,3 | ||
| С1-12 | Группа IV | 20 месяцев-О | 8,7 | |
| С2-12 | 20 месяцев-О | 8,0 | ||
| С3-12 | 20 месяцев-О | 10,3 | ||
| С5-12 | 20 месяцев-О | 9,6 | ||
| С6-12 | 20 месяцев-О | 19,5 | ||
| С9-12 | 20 месяцев-О | 13,3 | ||
| С10-12 | 20 месяцев-О | 10,8 |
В соответствии с данными, приведенными в таблицах 2А, 2В и 2С, показано, что модифицированный режим питания снижает воспаление [р≤0,05] у мышей. Про-воспалительные цитокины IL-6 [Y] и IL-12 [О] снижены; воспалительные медиаторы IL-7 [Y,0], IL-15 [О] и IL-17 [О] снижены; противовоспалительные цитокины IL-10 [О] и IL-13 [О] увеличены. «О» означает, что достоверные значения получены только для старых мышей, «Y» означает, что достоверные значения получены только для группы молодых мышей, и «OY» означает, что достоверные значения получены как для молодых, так и для старых мышей. Фенотипически, у более старых мышей в анализируемой группе реже, по сравнению с контрольными группами, встречаются случаи атопического дерматита, что указывает на ослабление воспалительного процесса, который представляет собой типичный процесс при старении. Про-воспалительные цитокины IL-6 и IL-12 снижены в группах I и III, соответственно. Снижены цитокины, которые считают воспалительными медиаторами (IL-7, IL-15, и IL-17). IL-7 снижен в группах I и III, тогда как IL-15 и IL-17 снижены в группе III. Противовоспалительные цитокины IL-10 и IL-13 увеличены в группе III, что согласуется с описанным выше наблюдением, касающимся воспаления. Модифицированный режим питания обращает резистентность к инсулину [р≤0,05]. У мышей в группе III наблюдали увеличение в уровне адипонектина. У мышей в группе I, наблюдали снижение как резистина, так и лептина. Ясно, что анализируемая диета снижает воспаление и обращает резистентность к инсулину, причем оба эти параметра связаны с признаками, типичными для старческого возраста. Данные также показывают, что для анализа состояния здоровья животных могут быть применены различные биомаркеры.
Пример 2
Разработка и оптимизация мультипараметрического способа анализа
Материалы и Способы: Разработку мультипараметрических способов анализа проводят в три стадии: [1] Получение/характеристика реагентов: получают антитела, специфические к молекулам собаки для анализов у собак, разрабатывают иммунохимический сэндвич-анализ и описывают его характеристики и комбинируют с разработкой панели для мультипараметрических анализов, как показано для анализа для собак; [2] Разработка способа: индивидуальные анализы затем оптимизируют для исключения перекрестной реактивности, усиления чувствительности и динамического диапазона; и [3] Предварительная проверка: панели мультипараметрических анализов затем проверяю с помощью (а) нормальной сыворотки и плазмы от здоровых собак, (b) культуральных супернатантов [C/S] от МКПК собак, которые стимулировали липополисахаридами [ЛПС]. Анализ для собак - [Панель; цитокины/хемокины; анализируемое вещество: GMCSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-18, IFNγ, IP-10, TNF-α, MCP-1, IL-15, КС.Панель; эндокринная; анализируемое вещество: GLP-1, глюкагон, инсулин, лептин. Панель; адипокин; анализируемое вещество: адипонектин, резистин.] Результаты показаны в таблице 3.
Результаты и обсуждение: [1] Получение/характеристика реагентов: в качестве мишеней выбирают 20 молекул собаки, охватывающих различные ключевые области, представляющие интерес для проблем питания и для лечения. Проводят скрининг некоторого числа пар антител, специфических для этих молекул. Они включают антитела, специфические для собак, а в случае, если антитела, специфические для собак, не доступны, то проводят скрининг антител, полученных к молекулам мышей, грызунов или человека. Пары антител, для которых получают наилучший сигнал с белками собаки, отбирают для создания иммунохимических сэндвич-анализов с применением бусин [платформа Luminex xMAP]. [2] Разработка способа: Анализы, отобранные по результатам, полученным на стадии [1], дополнительно оптимизируют в отношении перекрестной реактивности, чувствительности и динамического диапазона и получают конечные мультипараметрические панели. После оптимизации среди этих мультипараметричесюих панелей наблюдается пренебрежимо низкая перекрестная реактивность. Для построения «стандартных кривых» применяют различные концентрации анализируемых веществ в «сывороточной матрице». Анализ стандартных кривых для IL-4 и IL-18 [панель цитокинов собаки] и лептина и инсулина [панель эндокринных гормонов] показал, что они обладают слегка сниженной чувствительностью по сравнению с остальными анализируемыми веществами. Вероятно, антитела для IL-8 дают более высокий базовый сигнал по сравнению с другими цитокинами. Однако эти параметры анализа не мешают измерениям физиологических уровней, поскольку нормальные уровни большинства из этих анализируемых веществ находятся в диапазоне, равном пг/мл. [3] Проверка: Предварительную проверку этих мультипараметрических панелей проводят, применяя нормальную сыворотку/плазму. В таблице ЗА суммированы данные, касающиеся цитокинов и хемокинов [39 здоровых собак, немецкая овчарка, Лабрадор ретривер, шнауцер, сибирский хаски, возраст от 2-х до 6-ти лет]. В таблице 3 В суммированы данные, касающиеся эндокринных гормонов собаки в двух образцах сыворотки, содержащих ингибиторы для предотвращения деградации GLP-1. В таблице 3С суммированы данные, полученные с помощью панели адипокинов [образцы сыворотки от 17-ти биглей и нечистопородных собак].
| Таблица 3А: Цитокины в нормальной сыворотке и плазме собаки (концентрация в пг/мл) | ||||||||
| Цитокин | Сыворотка | Плазма | ||||||
| Среднее | Мин | Макс | Детектирование % | Среднее | Мин | Макс | Детектирование % | |
| TNFα | 2,2 | ND | 885,5 | 79,5 | 1,1 | ND | 221,4 | 56,4 |
| GMCSF | 289,0 | 61,0 | 40112,0 | 100,0 | 151,0 | ND | 31654,0 | 100,0 |
| IL-4 | 306,3 | ND | 5020,4 | 69,2 | 226,0 | ND | 1859,0 | 66,7 |
| МСР-1 | 349,0 | 144,2 | 24484,2 | 100,0 | 161,7 | 68,4 | 6422,0 | 100,0 |
| КС | 620,3 | 94,0 | 1201,5 | 100,0 | 32,3 | ND | 828,1 | 94,9 |
| IL-8 | 395,5 | 9,6 | 19832,9 | 100,0 | 556,8 | 9,1 | 2292,4 | 100,0 |
| IFNγ | ND | ND | 1980,0 | 28,2 | ND | ND | 1264,0 | 10,3 |
| Лептин | 2024,5 | ND | 57755,0 | 71,8 | 1764,0 | ND | 17905,0 | 76,9 |
| IL-10 | ND | ND | 8744,0 | 23,1 | ND | ND | 5204,9 | 12,8 |
| IP-10 | 35,0 | 7,0 | 1292,0 | 100,0 | 21,0 | ND | 541,0 | 84,6 |
| Глюкагон | 91,4 | 5,3 | 1080,8 | 100,0 | 35,4 | ND | 1525,4 | 84,6 |
| IL-02 | 157,0 | ND | 17472,0 | 69,2 | ND | ND | 63072,0 | 48,7 |
| IL-6 | ND | ND | 18955,0 | 53,8 | ND | ND | 12768,0 | 38,5 |
| IL-7 | 270,0 | 46,0 | 26273,0 | 97,4 | 155,0 | ND | 65201,0 | 100,0 |
| IL-15 | 166,0 | 27,0 | 79521,0 | 97,4 | 116,0 | ND | 22939,0 | 87,2 |
| IL-18 | 3703,0 | 508,0 | 96292,0 | 100,0 | 3191,0 | 353,0 | 89725,0 | 100,0 |
| Инсулин | 864,1 | 280,4 | 12469,0 | 100,0 | 591,4 | 49,0 | 5946,1 | 100,0 |
ND - не определяли
| Таблица 3 В: Гормоны в образцах нормальной сыворотки собаки | ||||
| Образец | Лептин (нг/мл) | Глюкагон (пг/мл) | GLP-1 (пМ) | Инсулин (нг/мл) |
| Morgan | 10,12 | 148,37 | 80,94 | 1,30 |
| Stoli | ND | 94,96 | ND | 1,50 |
| Таблица 3С: Адипонектин (Acrp 30) и резистин в образцах нормальной сыворотки собаки | ||
| N=17 | Acrp 30 (нг/мл) | Резистин (нг/мл) |
| Мин | 3,08 | 5,10 |
| Макс | 32,37 | 253,05 |
| Среднее | 14,90 | 15,03 |
Проводят также эксперименты для подтверждения того, что эти панели обнаруженных цитокинов, секретируются МКПК, после стимуляции с помощью ЛПС. Типичные данные представлены на фигуре 2. Можно ясно видеть зависящую от концентрации ЛПС и времени секрецию следующих веществ IL-6, TNF-α, IL-8 и IL-18.
Заключения: Успешно разработана мультипараметрическая панель, с помощью которой можно определить 20 различных белков собаки в сыворотке, плазме и супернатантах культуры тканей. Панель включает анализы для некоторого числа белков, способы анализа которых ранее были не доступны. Предварительная проверка панели с образцами нормальной сыворотки/плазмы показывает, что существует возможность с помощью панели проводить измерения этих молекул в сыворотке/плазме. Анализы, проведенные с использованием культуральных супернатантов от МКПК, обработанных ЛПС, показали, что с помощью анализов в панели возможно проводить детектирование цитокинов, секрецию которых ожидают в ответ на стимуляцию ЛПС, а именно IL-6, TNF-α, IL-8 и IL-18 в зависимости от времени, а также от концентрации ЛПС. Дополнительно, в настоящее время разрабатывают проверочные эксперименты для соответствующих исследований, имеющих отношение к кормлению, и для соответствующих клинических исследований. В сочетании с соответствующими способами распознавания образов и алгоритмами анализа эти панели помогут предсказывать/оценивать функциональные последствия физиологических факторов, вызывающих стресс и воздействующих на организм.
Следует понимать, что различные изменения и модификации предпочтительных воплощений, описанных в этом документе, понятны специалистами в этой области техники. Такие изменения и модификации могут быть выполнены без отступлений от сущности и объема настоящего предмета изобретения и без преуменьшения его предполагаемых преимуществ. Следовательно, следует понимать, что такие изменения и модификации охвачены прилагаемой формулой изобретения.
Все патенты, патентные заявки, публикации и другие ссылки, процитированные или упомянутые в этом документе, включены в этот документ путем отсылок в той степени, в которой это позволено законом. Обсуждение этих ссылок дано с единственной целью суммировать сделанные в них утверждения. Не было сделано ни одного признания того, что любой из таких патентов, патентных заявок, публикаций и других ссылок, или любая их часть, представляет собой релевантный уровень техники для настоящего изобретения, и определенно сохраняется право оспорить точность и значимость таких патентов, патентных заявок, публикаций и других ссылок.
1. Способ оценки воспаления и/или резистентности к инсулину у животного путем количественного определения присутствия анализируемого вещества в сыворотке или плазме, включающий следующие стадии:
получение биологического образца животного; причем указанный образец предположительно содержит заранее заданный набор представляющих интерес анализируемых веществ, где набор включает, по меньшей мере, цитокин, хемокин, гормон и адипокин;
взаимодействие образца с коллекцией молекулярных зондов, иммобилизованных отдельно друг от друга к панели для мультипараметрического анализа для определения присутствия каждого вещества из заданного набора анализируемых веществ, где для каждого анализируемого вещества в наборе коллекция молекулярных зондов включает, по меньшей мере, один зонд, подходящий для детектирования присутствия этого анализируемого вещества, причем каждый зонд способен производить независимо детектируемый сигнал, если анализируемое вещество присутствует в образце;
детектирование независимо детектируемых сигналов, полученных после взаимодействия образца с коллекцией,
установление корреляции между детектируемыми сигналами и относительным присутствием каждого вещества из заданного набора анализируемых веществ в образце;
установление корреляции между относительным присутствием каждого вещества из заданного набора анализируемых веществ в образце и известными параметрами состояния здоровья; и
оценка состояния здоровья животных в соответствии с полученными результатами.
2. Способ по п.1, где набор анализируемых веществ включает один или более MIP-1α, GM-CSF, МСР-1, КС, RANTES, IFN-γ, IL-1β, IL-1α, G-CSF, IP-10, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, TNF-α, IL-9, IL-13, IL-15, IL-17, глюкагон, инсулин, лептин, tPAI-1, резистин и адипонектин.
3. Способ по п.1, в котором детектируемые зонды являются специфичными для детектирования присутствия каждого из анализируемых веществ в наборе анализируемых веществ.
4. Способ по п.3, в котором детектируемые зонды представляет собой антитела, фрагменты антител, лиганды, рецепторы или связывающие белки.
5. Способ по п.1, в котором заданный набор анализируемых веществ включает каждое из следующих веществ: IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-18, IFN γ, IP-10, TNF-α, MCP-1, GLP-1, глюкагон, инсулин, адипонектин и резистин.
6. Способ по п.5, в котором животное представляет собой человека, мышь, обезьяну, собаку или кошку.
7. Способ по п.5, в котором заданный набор анализируемых веществ дополнительно включает один или более из следующих веществ: IL-15, КС или лептин.
8. Способ по п.6, в котором анализируемые вещества происходят из собаки, и зонды представляют собой антитела.
9. Способ по п.8, в котором коллекция молекулярных зондов позволяет проводить количественное определение присутствия каждого анализируемого вещества.
10. Способ по п.9, в котором каждый зонд прикреплен к матрице, на которой каждый такой прикрепленный зонд остается способным обеспечивать количественное определение присутствия экспрессии анализируемого вещества, соответствующего этому зонду, в образце, приведенном в контакт с матрицей.
11. Способ по п.10, дополнительно включающий взаимодействие образца и коллекции молекулярных зондов с набором вторичных антител, включающих одно или несколько антител для того, чтобы способствовать детектированию путем увеличения специфичности или усиления детектируемого сигнала.
