Способ оценки токсической опасности антихолинэстеразных соединений

Изобретение относится к медицине, касается способа оценки токсической опасности антихолинэстеразных соединений (АнХЭС). Суть заявляемого способа заключается в определении антихолинэстеразного эффекта растворов исследуемых АнХЭС на препарат холинэстеразы - фермент пропионилхолинэстераза мозговой ткани кальмара (ПХЭ), а именно в оценке процента угнетения активности ПХЭ в растворах малой - 0,04 Е/мл и высокой - 4 Е/мл концентрации. Токсическую опасность растворов исследуемых АнХЭС определяют по различию их воздействия на активность ПХЭ в растворах малой и высокой концентрации. Если процент угнетения активности ПХЭ в растворе высокой концентрации падает до нуля или не превышает 5-10%, делают заключение о том, что анализируемый раствор содержит высокотоксичное АнХЭС 1 класса опасности. Если величина ингибирующего эффекта остается постоянной или падает не более чем на 10%, делают заключение о наличии малотоксичного АнХЭС. Использование заявленного способа позволяет в течение 30-60 минут оценить токсическую опасность АнХЭС в самых различных ситуациях, когда их состав не известен и они находятся в виде растворов неизвестной концентрации. 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии, касается способа оценки токсической опасности аптихолинэстеразных соединений (АнХЭС), и может быть использовано в непредвиденных чрезвычайных ситуациях (техногенные аварии, террористические акты и т.п.) для выявления чрезвычайно опасных для человека веществ.

В настоящее время АнХЭС находят широкое применение в медицине, сельском хозяйстве и других областях народного хозяйства. Некоторые из них относятся к первому классу опасности [1] и являются потенциальными отравляющими веществами нервно-паралитического типа действия. В этой связи, важное практическое значение имеет оценка токсической опасности подобных чрезвычайно опасных химических соединений и выявление их в условиях непредвиденных чрезвычайных ситуаций.

Известный и широко применяемый в настоящее время способ определения степени опасности любых веществ, в том числе и АнХЭС, основан на оценке показателей их токсичности (например, среднесмертельной дозы (ЛД₅₀)) и подразумевает использование биологических моделей, в качестве которых служат крысы, мыши, кошки, кролики и другие животные. Указанный способ принят в качестве способа-прототипа.

Способ-прототип имеет ряд существенных недостатков, не позволяющих использовать его в условиях непредвиденных чрезвычайных ситуаций. Так, очень важным условием способа-прототипа является необходимость использования исследуемого соединения в ходе экспериментов в чистом виде для того, чтобы затем приготовить его различные разведения и обеспечить введение подопытному животному точного количества токсиканта. В тех же случаях, когда в условиях чрезвычайных ситуаций имеются растворы неизвестных концентраций неизвестных по составу АнХЭС, провести эксперименты с использованием подопытных животных и определить показатели токсичности исследуемых соединений практически не представляется возможным. Определение показателей токсичности с использованием способа-прототипа становится возможным только после анализа качественного и количественного состава исследуемых растворов, то есть после проведения их химико-аналитической экспертизы.

Кроме того, при осуществлении способа-прототипа только для определения порядка уровня показателя токсичности требуется постановка ряда экспериментов с использованием достаточно большого количества подопытных животных [2, 3, 4]. При этом содержаться подопытные животные должны определенным образом, а исследования проводиться в условиях стационарной лаборатории с привлечением специально подготовленного персонала, что обуславливает их высокую трудоемкость, длительность осуществления (до 24 ч) и большие материальные затраты.

Как видно, использование способа-прототипа для оценки токсической опасности АнХЭС в условиях непредвиденных чрезвычайных ситуаций, когда исследуемые соединения находятся в виде растворов неизвестной концентрации и их составы не известны, практически не представляется возможным.

Таким образом, целью изобретения является разработка способа оценки токсической опасности соединений, обладающих антихолинэстеразным типом действия, в различных условиях, в том числе и в непредвиденных чрезвычайных ситуациях, когда их состав не известен и они находятся в виде растворов неизвестной концентрации, отличающегося простотой проведения и позволяющего в короткий срок выявить чрезвычайно опасные соединения.

Поставленная цель достигается за счет использования способа, основу которого составляет определение антихолинэстеразного эффекта исследуемого соединения на препарат холинэстеразы, в качестве которого используют фермент пропионилхолин-эстераза мозговой ткани кальмара (ПХЭ).

Суть заявляемого способа заключается в определении степени угнетения активности ПХЭ под воздействием раствора исследуемого соединения. Фермент ПХЭ используют в двух фиксированных концентрациях - малой (0,04 Е/мл) и высокой (4 Е/мл).

В ходе эксперимента сначала находят разведение раствора исследуемого соединения, которое обеспечивает 30-60% угнетение активности ПХЭ в растворе малой концентрации. Затем это же разведение раствора исследуемого соединения используют для определения эффекта его воздействия на активность ПХЭ в растворе высокой концентрации.

По различию воздействия исследуемого АнХЭС на активность ПХЭ в растворах малой и высокой концентрации определяют, относится исследуемое соединение к высокотоксичным или малотоксичным веществам. В том случае, если процент угнетения активности ПХЭ в растворе высокой концентрации падает до нуля или не превышает 5-10%, делают заключение о том, что анализируемый раствор содерхит высокотоксичное антихолинэстеразное соединение 1 класса опасности, то есть выявляют чрезвычайно опасное для человека соединение. Если же величина ингибирующего эффекта остается постоянной или падает не более чем на 10%, делают заключение о наличии малотоксичного АнХЭС.

Возможность достижения цели изобретения подтверждается результатами проведенных исследований, представленными в следующих примерах.

Пример 1. Реализация заявляемого способа оценки токсической опасности антихолинэстеразных соединений.

При осуществлении заявляемого способа определяют антихолинэстеразный эффект исследуемого соединения на фермент ПХЭ, а именно оценивают степень угнетения активности ПХЭ под воздействием раствора исследуемого соединения. При этом фермент ПХЭ используют в растворах двух концентраций, отличающихся по содержанию фермента в 100 раз. Готовят два раствора ПХЭ в 0,2 М фосфатном буфере pH 7,5 с активностью фермента 0,04 Е/мл и 4,0 Е/мл.

Используют также водный раствор ацетилтиохолинйодида (АТХЙ) в концептрации 5,78 мг/мл и раствор реактива Эллмана в концентрации 0,792 мг/мл.

В ходе эксперимента сначала находят разведение раствора исследуемого соединения, которое при смешивании с равным объемом раствора фермента малой концентрации (0,04 Е/мл) вызывает угнетение активности ПХЭ на 30-60%. Затем это же разведение исследуемого соединения используют для определения степени угнетения активности ПХЭ в его растворе высокой концентрации (4 Е/мл).

Для проведения исследований к 1 мл раствора фермента с активностью 0,04 Е/мл добавляют 1 мл раствора исследуемого соединения и выдерживают в течение 3 минут при комнатной температуре. Полученную смесь смешивают с заранее приготовленным раствором, содержащим 1 мл дистиллированной воды, 1 мл фосфатного буфера, 0,5 мл раствора АТХЙ и 0,5 мл раствора реактива Эллмана. Раствор перемешивают и через 3 минуты измеряют его оптическую плотность с помощью спектрофотометра при длине волны 412 нм. Параллельно готовят контрольную пробу, в которой вместо разведения раствора исследуемого соединения используют дистиллированную воду.

Расчет процента угнетения активности фермента (i %) проводят по формуле:

$$i\%=(1-\frac{D_{оп}}{D_{к}})\cdot \mathrm{100,}(1)$$

где D_оп - оптическая плотность опытной пробы;

D_к - оптическая плотность контрольной пробы.

Затем подбирают разведение раствора исследуемого соединения, которое вызывает угнетение активности ПХЭ на 30-60% при концентрации раствора фермента 0,04 Е/мл. Это же разведение раствора исследуемого соединения в дальнейшем используют для угнетения активности ПХЭ в растворе концентрации 4 Е/мл. С этой целью, к 1 мл раствора фермента с активностью 4 Е/мл добавляют 1 мл раствора исследуемого соединения и выдерживают в течение 3 минут при комнатной температуре. Затем отбирают 0,02 мл и выливают в заранее приготовленную смесь, содержащую 2,98 мл дистиллированной воды, 1 мл фосфатного буфера, 0,5 мл раствора АТХЙ и 0,5 мл раствора реактива Эллмана. Полученную смесь перемешивают и через 3 минуты измеряют ее оптическую плотность при длине волны 412 нм. Для расчета процента угнетения активности ПХЭ используют показатель оптической плотности параллельно проведенной контрольный пробы, в которой вместо разведения раствора исследуемого соединения используют дистиллированную воду.

В том случае, если процент угнетения активности ПХЭ в растворе высокой концентрации падает до пуля или не превышает 5-10%, делают заключение о том, что анализируемый раствор содержит высокотоксичное антихолинэстеразное соединение 1 класса опасности, то есть выявляют чрезвычайно опасное для человека соединение. Если же величина ингибирующего эффекта остается постоянной или падает не более чем па 10%, делают заключение о наличии малотоксичного АнХЭС.

Как видно, заявляемый способ довольно просто осуществить, причем в самых различных условиях. Для проведения исследований затрачивается не более 30-60 минут. В отличие от способа-прототипа исключается длительное, трудоемкое и дорогостоящее определение показателей токсичности с использованием большого количества подопытных животных.

Пример 2. Оценка токсической опасности антихолинэстеразных соединений с применением заявляемого способа.

При использовании заявляемого способа проведена оценка токсической опасности различных антихолинэстеразных соединений, в том числе:

- O-изопропил-метил-фтор-фосфонат (вещество 1);

- O-пинаколил-метил-фтор-фосфонат (вещество 2);

- O-этил-S-диизопропил-аминоэтил-метил-тио-фосфоиат (вещество 3);

- O-изобутил-S-диэтил-аминоэтил-метил-тио-фосфонат (вещество 4);

- O,O-диметил-O,2,2-дихлорвинил-фосфат (ДДВФ);

- O-паранитрофенил-O,O-диэтилфосфат (фосфакол);

- О-паранитрофенил-O-этил-этилфосфонат (армии);

- Дихлоргидрат-N,N-диметил-(2-диметиламиноэтил-пиридил-3) карбамат (аминостигмин);

- N-метил-N-децил-(2-N,N-диметил-амино-метил-пиридил-3) карбамат (оксалат) (ИХ-118);

- 1,3A,8-триметил-2-3-a,8a-тетрагидропирроло[3'2b]-индол-5ил-N-метил-карбамат салициловокислый (эзерин).

Включение в эксперимент указанных широко известных соединений связано прежде всего с тем, что в литературе имеются сведения по оценке их токсичности с использованием способа-прототипа [5, 6, 7, 8]. Кроме того, известно, что согласно требованиям ГОСТ [9] при токсичности 0,1 мг/кг и ниже соединение относится к первому классу опасности, а при токсичности 1,1-10,0 мг/кг - к третьему классу. Сведения по оценке опасности всех рассматриваемых соединений на основании оценки показателей их токсичности в доступных источниках информации также имеются. Так, известно, что вещества 1-4 являются высокотоксичными и относятся к 1 классу опасности, а остальные используемые в эксперименте соединения - малотоксичные вещества 3 класса опасности.

Результаты оценки токсической опасности антихолинэстеразных соединений с применением заявляемого способа свидетельствуют о том, что растворы веществ 1, 2, 3 4 следует отнести к чрезвычайно опасным АнХЭС 1 класса опасности, так как они вызывают угнетение активности ПХЭ в растворах малой концентрации (0,04 Е/мл) на 30-60%. Степень же угнетения ими активности ПХЭ в растворах высокой концентрации (4 Е/мл) составляет 5-8%. Такая оценка полностью подтверждает имеющиеся сведения по токсичности и опасности рассматриваемых высокотоксичных веществ.

В то же самое время, остальные используемые в эксперименте антихолинэстеразные соединения более значительно угнетают активность ПХЭ и растворах высокой концентрации (4 Е/мл) - на 28-42%, Падение же ингибирующей активности для таких соединений (по сравнению с растворами малой концентрации - 0,04 Е/мл) не превышало 10%. Это свидетельствует о том, что указанные соединения не относятся к 1 классу опасности, что также совпадает с имеющимися сведениями об указанных малотоксичных веществах, относящихся к 3 классу опасности (таблица).

Таким образом, заявляемый способ позволяет быстро оценить токсическую опасность антихолинэстеразных соединений неизвестного состава, находящихся в виде растворов неизвестных концентраций, что практически невозможно осуществить в экспериментах на животных с использованием способа-прототипа. При этом заявляемый способ достаточно прост в проведении и может быть использован в самых различных ситуациях, в том числе и в непредвиденных чрезвычайных (техногенные аварии, террористические акты и т.п.).

Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию «новизна», так как впервые для оценки токсической опасности и выявления чрезвычайно опасных веществ антихолинэстеразного типа действия предложено использовать способ, предусматривающий определение степени угнетения растворами антихолинэстеразных соединений активности фермента пропионилхолинэстераза мозговой ткани кальмара, взятого в двух различных концентрациях.

Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию «изобретательский уровень», так как в известных и доступных источниках информации, содержащих описания способов определения токсической опасности антихолинэстеразных соединений, нет сведений, указывающих на возможность и целесообразность определения для этой цели антихолинэстеразных эффектов на фермент пропионилхолинэстераза мозговой ткани кальмара, и использование при этом растворов фермента двух концентраций.

Соответствие критерию «пригодность для применения» подтверждается результатами проведенного исследования, показавшими, что предлагаемый способ достаточно прост в проведении, позволяет в любых условиях быстро и надежно различить высокотоксичные и малотоксичные антихолинэстеразные соединения и выявить чрезвычайно опасные для человека вещества.

Способ оценки токсической опасности антихолинэстеразных соединений

Таблица.

Оценка токсической опасности антихолинэстеразных соединений с применением заявляемого способа

Исследуемое антихолинэстеразное соединение	Процент угнетения активности фермента ПХЭ в растворе концентрации	Класс токсической опасности
0,04 Е/мл	4,0 Е/мл
Вещество 1	60	8	1
Вещество 2	55	5	1
Вещество 3	60	0	1
Вещество 4	40	0	1
ДДВФ	44	34	3
Фосфакол	38	30	3
Армин	30	28	3
Аминостигмин	44	34	3
ИХ-118	40	42	3
Эзерин	52	42	3

ЛИТЕРАТУРА

1. ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества, классификация и общие требования безопасности». М.: ФГУП «Стаидартинформ». - 2007. - 6 с.

2. Прозоровский В.Б. Практическое пособие по ускоренному определению средних эффективных доз и концентраций биологически активных веществ. Институт Экологической Токсикологии, МООСПР РФ, г. Байкальск. - 1994. - 46 с.

3. Прозоровский В.Б., Козяков В.П. Скорость наступления эффекта - токсикомет-рический критерий воздействия яда в малых дозах. Токсикологический вестник. - 2002. №2, март-апрель. - С.18-20.

4. «Руководство по токсикологии отравляющих веществ». Под ред. академика С.Н. Голикова. М: Изд-во Медицина. - 1972. - 472 с.

5. Прозоровский В.Б. Саватеев Н.В. Неантихолинэстеразные механизмы действия антихолинэстеразных средств. Л: Медицина. - 1976. - 160 с.

6. Прозоровский В.Б., Павлова Л.В., Суслова И.М. Фармакологическая характеристика нового антихолинэстеразного средства амипостигмина // Эксперим. и клин. фармакол. - 1992. №1. - С.13-16.

7. Колла В.Э., Сыропятов Б.Я. Дозы лекарственных средств и химических соединений для лабораторных животных. М: Медицина. - 1998. - 263 с.

8. Справочник по пестицидам (Гигиена применения и токсикология). Под редакцией академика АМН СССР Л.И. Медведя. Киев: Изд-во Урожай. - 1974. - 448 с.

9. ГОСТ 12.1.005-88 «Общие сапитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны». М.: ФГУП «Стандартинформ». - 1988. - 49 с.

Способ оценки токсической опасности антихолинэстеразных соединений, отличающийся тем, что определяют антихолинэстеразный эффект растворов исследуемых соединений с антихолинэстеразным типом действия на препарат холинэстеразы, в качестве которого используют фермент пропионилхолинэстераза мозговой ткани кальмара, а именно оценивают процент угнетения активности фермента, который используют в растворах двух концентраций - 0,04 Е/мл и 4 Е/мл, для чего сначала подбирают разведение раствора исследуемого соединения, которое обеспечивает 30-60% угнетение активности пропионилхолинэстеразы в растворе малой концентрации, составляющей 0,04 Е/мл, а затем это же разведение раствора исследуемого соединения используют для оценки процента угнетения активности пропионилхолинэстеразы в растворе высокой концентрации, составляющей 4 Е/мл, причем токсическую опасность растворов исследуемых антихолинэстеразных соединений определяют по различию их воздействия на активность пропионилхолинэстеразы в растворах малой и высокой концентрации, и в том случае, если процент угнетения активности пропионилхолинэстеразы в растворе высокой концентрации падает до нуля или не превышает 5-10%, делают заключение о том, что анализируемый раствор содержит высокотоксичное антихолинэстеразное соединение 1 класса опасности, а если величина ингибирующего эффекта остается постоянной или падает не более чем на 10%, делают заключение о наличии малотоксичного антихолинэстеразного соединения.