Способ определения резистентности тромбоцитов к ацетилсалициловой кислоте

Изобретение относится к способу определения резистентности тромбоцитов к ацетилсалициловой кислоте (АСК) путем импедансного исследования агрегационной функции тромбоцитов in vitro, при котором исследуют агрегационную активность после инкубации образца биологического материала с АСК с использованием индуктора агрегации, причем агрегацию тромбоцитов индуцируют коллагеном в оптимальной концентрации 2 мг/мл и одновременно с измерением импеданса проводят определение динамики освобождения гранул тромбоцитов люминесцентным методом, где перед проведением агрегации пробы калибруются с помощью стандарта аденозинтрифосфата (АТФ), по полученным агрегатограммам определяют значения амплитуды агрегации в Омах и присваивают полученным значениям баллы: значения ≤6 соответствуют 0 баллов, значения 7-9 соответствуют 1 баллу, значения 10-12 соответствуют 2 баллам, значения >12 соответствуют 3 баллам; затем определяют интенсивность высвобождения АТФ из гранул тромбоцитов в нмолях и присваивают полученным значениям баллы: значения <0,5 соответствуют 0 баллам, значения 0,5-1,0 соответствуют 1 баллу, значения 1,0-1,5 соответствуют 2 баллам, значения >1,5 соответствуют 3 баллам, и далее рассчитывают индекс резистентности (ИР) по формуле, при этом значение показателя ИР более 4 указывает на наличие аспиринорезистентности тромбоцитов. Изобретение обеспечивает проведение быстрой комплексной диагностики резистентности тромбоцитов к АСК с оценкой функционального состояния гранул тромбоцитов до начала лечения и возможность предотвращения развития нежелательных тромботических или геморрагических осложнений. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к актуальной проблеме современной клинической и профилактической персонифицированной медицины - определению индивидуальных особенностей реакции тромбоцитов на лекарственные средства, а именно к методам превентивной in vitro диагностики резистентности тромбоцитов к ацетилсалициловой кислоте (АСК).

В связи с несомненной профилактической эффективностью при сердечнососудистых заболеваниях и ценовой доступностью АСК является самым часто назначаемым антитромботическим препаратом [Волков В.И., Рябуха В.В., Запровальная О.Е., Ладный А.И. Диагностика резистентности к аспирину у больных ишемической болезнью сердца. Укр. кардиол. журн., 6 января 2006 г. [он-лайн]. Найдено в Интернет: <URL: http://rq1.net.ua/cardio_j/2006/3/IMAG306/volkkov.gif>]. Однако известно, что достичь адекватного снижения агрегации тромбоцитов и предотвратить повторный тромбоз и возникновение сердечно-сосудистых катастроф удается не у всех пациентов, принимающих АСК [Ашихмин, Я.И. Феномен резистентности к антитромботическому действию аспирина и пути его преодоления / Я.И. Ашихмин О.М. Драпкина // Российские медицинские вести, 2008. - Т.13. - №2]. По данным ряда авторов такое явление, называемое «резистентностью» к АСК, распространено среди населения с частотой встречаемости от 5 до 48% [Hankey, G. Aspirin resistance / G. Hankey, J. Eikelboom // Lancet, 2006 - Vol.367]. Одной из важнейших проблем, возникающих при попытке каким-либо образом измерить (оценить) степень ингибирования функции тромбоцитов после воздействия фармакологических агентов состоит в том, что ни один из существующих лабораторных тестов не включает в себя оценку всей многогранности функции тромбоцитов [Бугаенко, В.В. Современные принципы антитромбоцитарной терапии у больных с ишемической болезнью сердца. Часть 2. Переносимость и возможные побочные эффекты / В.В. Бугаенко // Кардиологический журнал, 2009. - №5]. При этом in vitro диагностика эффективности АСК не оценивает механизмы снижения функции тромбоцитов, которые могут обусловливаться дефектами такого важного структурно-функционального компонента тромбоцитов как гранулы [Воробьев А.И. Руководство по гематологии / А.И. Воробьев. - М.: Медицина, 1985]. Нарушенное функционирование этих специфических органелл тромбоцитов является патогенетической основой ряда заболеваний, при которых прием АСК противопоказан. Известно, что при некоторых патологических состояниях кроветворения наблюдается неадекватная реакция тромбоцитов на прием ацетилсалициловой кислоты, выражающаяся в появлении геморрагии [Avram, S., Lupu, A. Abnormalities of platelet aggregation in chronic myeloproliferative disorders / S. Avram, A. Lupu // J. Cell. Mol. Med., 2001 - Vol 5]. Использование АСК вызывает повышенный риск желудочно-кишечных кровотечений и геморрагических инсультов [He J., Whelton P.К. Aspirin and risk of haemorrhagic stroke: a meta-analysis of randomized controlled trials // JAMA. 1998. Vol.280. P.1930-1935]. В связи с этим весьма актуальным является разработка диагностических тестов проводимых до начала приема препарата пациентом с целью прогноза индивидуальной реактивности тромбоцитов к действию АСК, в том числе включающей оценку секреторной активности.

Известен способ определения резистентности к АСК посредством измерения параметров светопропускания при индуцированной агрегации тромбоцитов в плазме крови [Патент РФ №2413953C1, G01N 33/86 (2006.01). Опубл. 10.03.2011. Бюл. №7]. Метод позволяет количественно оценивать амплитуду процесса агрегации in vitro. Для изучения антиагрегационных свойств в пробирку с обогащенной тромбоцитами плазмой предварительно вносили раствор АСК и инкубировали. Затем вносился индуктор - АДФ и регистрировалась амплитуда агрегации. Результаты сравнивались с показателями агрегации, вызванной индуктором без предварительного воздействия АСК, с вычислением коэффициента ингибирования агрегации (КИА).

Диагностическая ценность этого способа ограничена очевидными недостатками: 1) длительность, трудоемкость и недостаточная стандартизация процесса приготовления богатой тромбоцитами плазмы; 2) в ходе центрифугирования кровяные пластинки подвергаются значительным механическим воздействиям, которые существенно изменяют их функциональную состоятельность; 3) на этапе пробоподготовки нарушается естественное окружение тромбоцитов, что не позволяет учитывать влияние на них других форменных элементов крови, модулирующих функции тромбоцитов; 4) увеличивается вероятность значительного снижения концентрации лабильных медиаторов к моменту измерения. Все это не позволяет создать оптимальные стандартные условия, необходимые для обеспечения полной реализации функций тромбоцитов после стимулирования индуктором. Существенным недостатком оптической агрегатометрии является также невозможность исследовать кровь больных с выраженной гиперлипидемией, часто встречающейся в кардиологической практике. Кроме того, измерение вышеуказанным методом пропускает 67% пациентов с дефектом накопления гранул и угрозой геморрагических осложнений при терапии [Научное общество "Клиническая гемостазиология". Диагностика [он-лайн]. Найдено в Интернет: <URL:http://www.hemostas.ru/society/diagnostics/ecomeds/index.shtml>].

Известен другой способ диагностики резистентности к АСК, который заключается в исследовании функциональной активности тромбоцитов до и после инкубации образца биологического материала с ацетилсалициловой кислотой, при этом агрегационную активность тромбоцитов определяют в цельной крови импедансным методом с вычислением ингибирующей способности АСК в процентах [Патент РФ №2379684 C2, G01N 33/48 (2006.01). Опубл. 20.01.2010. (прототип)]. Данный способ позволяет прогнозировать резистентность к АСК до начала терапии, однако не дает информации о состоянии гранулярного аппарата тромбоцитов, важного для их функционирования в системе гемостаза.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в проведении быстрой комплексной диагностики резистентности тромбоцитов к АСК с оценкой функционального состояния гранул тромбоцитов до начала лечения и возможности предотвращении развития нежелательных тромботических или геморрагических осложнений.

Технический результат достигается тем, что в способе определения резистентности тромбоцитов к ацетилсалициловой кислоте (АСК) путем импедансного исследования агрегационной функции тромбоцитов in vitro, при котором исследуют агрегационную активность после инкубации образца биологического материала с АСК с использованием индуктора агрегации новым является то, что агрегацию тромбоцитов индуцируют коллагеном в оптимальной концентрации 2 мг/мл и одновременно с измерением импеданса проводят определение динамики освобождения гранул тромбоцитов люминесцентным методом, где перед проведением агрегации пробы калибруются с помощью стандарта аденозинтрифосфата (АТФ), по полученным агрегатограммам определяют значения амплитуды агрегации в Омах и присваивают полученным значениям баллы: значения <6 соответствуют 0 баллов, значения 7-9 соответствуют 1 баллу, значения 10-12 соответствуют 2 баллам, значения >12 соответствуют 3 баллам; затем определяют интенсивность высвобождения АТФ из гранул тромбоцитов в нмолях и присваивают полученным значениям баллы: значения <0,5 соответствуют 0 баллам, значения 0,5-1.0 соответствуют 1 баллу, значения 1,0-1,5 соответствуют 2 баллам, значения >1,5 соответствуют 3 баллам, и далее рассчитывают индекс резистивности (ИР) по формуле:

ИР=Б_и+Б_л,

где Б_и и Б_л - степень чувствительности к АСК в баллах в импедансном и люминесцентном тестах соответственно, при этом значение показателя ИР более 4 указывает на наличие аспиринорезистентности тромбоцитов.

Предложенный способ отличается от прототипа тем, что определение резистентности к АСК проводят in vitro путем исследования функциональной активности тромбоцитов только после инкубации образца биологического материала с АСК, при этом агрегационную активность тромбоцитов и состояние их гранул определяют в цельной крови комплексным импеданс-люминесцентным методом, что позволяет получать дополнительный диагностический параметр - степень влияния АСК на показатели высвобождения содержимого тромбоцитарных гранул и позволяет более объективно подходить к оценке индивидуальной чувствительности пациента к препарату АСК.

Таким образом, перечисленные выше отличительные от прототипа признаки позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна». Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критерию «изобретательский уровень».

Сущность изобретения поясняется с помощью графических материалов:

На фиг. 1 представлены кривые коллаген-индуцированной агрегации и кривые высвобождения гранул тромбоцитов в цельной крови до (1-2) и после (3-4) инкубации проб с АСК для индивидуума, чувствительного к АСК.

На фиг. 2 представлены кривые коллаген-индуцированной агрегации и кривые высвобождения гранул тромбоцитов в цельной крови до (1-2) и после (3-4) инкубации проб с АСК для индивидуума, резистентного к АСК (1 - исходная кривая агрегации, 2 - исходная кривая интенсивности высвобождения гранул, 3 - кривая агрегации после инкубирования с АСК, 4 - кривая интенсивности высвобождения гранул после инкубации проб крови с АСК).

Способ осуществляется следующим образом.

Образцы крови получают из локтевой вены и стабилизируются 3,8% раствором цитрата натрия в объемном отношении 9:1. В процессе исследования кровь сохраняют в закрытых пластиковых пробирках при комнатной температуре с соблюдением общепринятых мер предосторожности при работе с клетками крови.

Анализ функциональной активности тромбоцитов осуществляют не ранее чем через 15 минут и не позднее чем через 3 часа после получения крови с помощью люми-агрегометра при 37°C и перемешивании содержимого кювет со скоростью вращения мешалки 1000 об/мин. Соотношение объемов пробы крови и индуктора при этом составляет 100:1.

Перед проведением агрегации люминесцентным методом пробы калибруются с помощью стандарта АТФ. При этом устанавливается индивидуальное для пациента усиление (в %) реакции люминесценции. Далее регистрируется интенсивность высвобождения АДФ из гранул тромбоцитов (в нмоль) с одновременной регистрацией параметров импеданса индуцированной агрегации тромбоцитов в этой же кювете.

Для индуцирования агрегации используют раствор коллагена в конечной концентрации 2,0 мг/мл, поставляющийся готовым к использованию.

Исследования функциональной активности тромбоцитов у каждого пациента проводят в одной пробе - после предварительной инкубации крови с АСК.

Инкубацию проводят в течение 15 минут при температуре 37°C. При этом в опытную пробу цельной крови добавляют 40 мкл 3,36 мМ раствора АСК.

Обработка агрегатограмм производится по общепринятым характерным точкам кривых агрегации с определением максимальной амплитуды нарастания импеданса в Омах к 5-й минуте от момента внесения в измерительную ячейку индуктора - коллагена и с определением интенсивности люминесценции при высвобождении АТФ из гранул тромбоцитов в нмолях. Выявление исходно низких показателей высвобождения гранул может свидетельствовать о патологии тромбоцитов и противопоказании к назначению АСК. Наряду с рутинными параметрами оценки агрегатограммы рассчитывается индекс резистентности (ИР). Данный параметр представляет собой сумму баллов, характеризующих степень чувствительности пациента в импедансном тесте и люминесцентном тесте по максимальным амплитудам агрегации и высвобождения гранул, и рассчитывается по формуле: ИР=Б_и+Б_л, где Б_и и Б_л - степень чувствительности к АСК в баллах в импедансном и люминесцентном тесте соответственно. Этот параметр характеризует итоговую степень индивидуальной чувствительности к АСК и включает в себя совокупную оценку ингибирующего действия АСК на процесс накопления АТФ, интенсивности высвобождения гранул, динамику мембранного потенциала тромбоцитов и агрегационно-адгезивную способность. ИР позволяет определить индивидуальную чувствительность пациента к АСК в абсолютных единицах шкалы, что может служить критерием для выявления лиц как с повышенной, так и с пониженной реакцией на препарат. Это позволит назначать терапию аспирином, обоснованную своевременной предиктивной лабораторной оценкой, и избежать нежелательных последствий неадекватного лечения.

Примеры получаемых агрегатограмм с оценкой индивидуальной резистентности к АСК приведены на фиг. 1-2.

Степень резистентности определяют в соответствии с предложенной шкалой:

В таблице 1 представлены результаты обследования 13 клинически здоровых людей, проведенного на базе Красноярского филиала ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России. По предлагаемому способу определяли величину ИР. В пробах десяти пациентов значение этого показателя было ниже 4. У трех человек по результатам тестирования ИР был равен или более 4.

Поскольку у здоровых лиц, не принимавших АСК, значения ИР исходно без проведения инкубации с АКС были равны или более 4, то данный уровень значений ИР был принят как критерий резистентности. После того, как пациентами была принята per os разовая доза АСК в количестве 125 мг/сут, на следующий день вновь определяли показатели агрегации в пробе свежей крови без предварительных инкубаций. У трех пациентов выявленных по результатам предварительного тестирования с инкубацией in vitro ИР вновь был более 4, как и до приема препарата. Это подтверждает, что предлагаемое техническое решение позволяет выявлять пациентов с резистентностью к антитромбоцитарному действию АСК. Напротив, среди лиц, имеющих показатель ИР менее 4, разовый прием 125 мг АСК вызывал существенное ингибирование показателей агрегации, что свидетельствует об их чувствительности к данному препарату.

Полученный результат свидетельствует о высоких диагностических возможностях предлагаемого способа и клинической пользе использования превентивного определения антитромботического действия АСК in vitro комплексным импеданс-люминисцентным методом.

Таблица 1
Результаты исследования степени резистентности к АСК
№ п/п	В тесте IN VITRO	В тесте IN VIVO	Прогноз
Амплитуда, Ом	Высвобождение гранул, нмоль	Би	Бл	ИР	ИР
1	2	0,3	0	0	0		чувствительный
2	4	0,66	0	1	1		чувствительный
3	4	0,64	0	1	1		чувствительный
4	6	0,92	0	1	1		чувствительный
5	7	0,34	1	0	1		чувствительный
6	9	0,69	1	1	2		чувствительный
7	6	1,08	0	2	2		чувствительный
8	10	0,92	1	1	2	1	чувствительный
9	10	0,75	1	1	2	1	чувствительный
10	6	1,7	0	3	3		чувствительный
11	16	0,58	3	1	4	6	резистентный
12	13	0,73	3	1	4	6	резистентный
13	16	2,24	3	3	6	6	резистентный

Способ определения резистентности тромбоцитов к ацетилсалициловой кислоте (АСК) путем импедансного исследования агрегационной функции тромбоцитов in vitro, при котором исследуют агрегационную активность после инкубации образца биологического материала с АСК с использованием индуктора агрегации, отличающийся тем, что агрегацию тромбоцитов индуцируют коллагеном в оптимальной концентрации 2 мг/мл и одновременно с измерением импеданса проводят определение динамики освобождения гранул тромбоцитов люминесцентным методом, где перед проведением агрегации пробы калибруются с помощью стандарта аденозинтрифосфата (АТФ), по полученным агрегатограммам определяют значения амплитуды агрегации в Омах и присваивают полученным значениям баллы: значения ≤6 соответствуют 0 баллов, значения 7-9 соответствуют 1 баллу, значения 10-12 соответствуют 2 баллам, значения >12 соответствуют 3 баллам; затем определяют интенсивность высвобождения АТФ из гранул тромбоцитов в нмолях, и присваивают полученным значениям баллы: значения <0,5 соответствуют 0 баллам, значения 0,5-1,0 соответствуют 1 баллу, значения 1,0-1,5 соответствуют 2 баллам, значения >1,5 соответствуют 3 баллам, и далее рассчитывают индекс резистивности (ИР) по формуле:
ИР=Б_и+Б_л,
где Б_и и Б_л - степень чувствительности к АСК в баллах в импедансном и люминесцентном тестах соответственно, при этом значение показателя ИР более 4 указывает на наличие аспиринорезистентности тромбоцитов.