Способ прогнозирования ранней стадии апоптоза

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования ранней стадии апоптоза лимфоцитов. Для этого выделяют клетки, инкубируют их 48 часов при температуре 37°C и 5% содержании CO₂ с добавлением индуктора апоптоза дексаметазона в концентрации 10^-4 моль/мл. Жизнеспособность лимфоцитов определяют количественно по включению трипанового синего с последующим определением концентрации восстановленного и окисленного глутатионов в лизате лимфоцитов после предварительной инкубации в течение 30 минут с 10 мМ 2-винилпиридина. Раннюю стадию апоптоза лимфоцитов прогнозируют при одновременном комплексном снижении концентрации восстановленного глутатиона на 17% и более и увеличении концентрации окисленного глутатиона на 19% и более по сравнению с контролем. Использование предлагаемого способа в медицинской практике позволяет прогнозировать статус антиоксидантной системы организма при различных заболеваниях по оценке ранней стадии апоптоза лимфоцитов. 1 табл.

 

Известны способы прогнозирования апоптоза и разработки способов защиты клеток от апоптоза при активации антиоксидантной активности путем определения роста общего содержания SH-групп белков [Microtubule dynamics and glutathione metabolism in phagocytizing human polymorphonuclear leukocytes / B.R. Burchill, J.M. Oliver, С.В. Pearson et al. // J. of Cell Biology. - 1978. - Vol.76, №2. - P.439-447], но данная методика не позволяет оценить уровень восстановленного глутатиона, а следовательно, оценить эффективность прогнозирования апоптоза. Известен также способ косвенного определения содержания восстановленного глутатиона по активности глутатионпероксидазы [Медицинские лабораторные технологии: В 2-х томах. / Под ред. А.И. Карпищенко - Т.2 / А.И. Карпищенко. - СПб.: Интермедика. - 1999. - 656 с.], однако активность этого фермента зависит от конформации активного центра фермента. При изменении конформации активного центра фермента его активность меняется, что не позволяет с высокой точностью оценить уровень восстановленного глутатиона, а следовательно, прогнозировать апоптоз. Известен также способ косвенного определения концентрации восстановленного глутатиона по активности глутатионредуктазы [Медицинские лабораторные технологии: В 2-х томах. / Под ред. А.И. Карпищенко - Т.2 / А.И. Карпищенко. - СПб.: Интермедика. - 1999. - 656 с.], однако активность этого фермента зависит от конформации активного центра фермента. При изменении конформации активного центра фермента его активность меняется, что не позволяет достоверно в любой ситуации оценить с высокой точностью уровень восстановленного глутатиона, а следовательно, прогнозировать апоптоз.

Известен также способ оценки эффективности антиоксидантной активности при прогнозировании апоптоза по содержанию восстановленного глутатиона, предложенный М.Е. Anderson (1985) в модификации S. Kojima et al. (2004) [Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth / S. Kojima, K. Nakayama, H. Ishida // J. Radiat. Res. - 2004. - Vol.45, №1. - P.33-39], основанный на взаимодействии восстановленного глутатиона (GSH) с 5,5′-дитио-бис(2-нитробензойной) кислотой (ДТНБ). При этом образуется окисленный глутатион (GSSG), который затем восстанавливается и вновь взаимодействует с ДТНБ. Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату, и выбран в качестве прототипа.

Целью предлагаемого изобретения является повышение точности прогнозирования ранней стадии апоптоза лимфоцитов.

Поставленная цель достигается тем, что включает этапы выделения клеток, инкубации клеток 48 часов, при температуре 37°C и 5% содержании CO₂ с добавлением индуктора апоптоза дексаметазона в концентрации 10^-4 моль/мл, количественного определения жизнеспособности лимфоцитов по включению трипанового синего и биохимического определения концентрации восстановленного и окисленного глутатионов в лизате лимфоцитов после предварительной инкубации в течение 30 минут с 10 мМ 2-винилпиридина и при одновременном комплексном снижении концентрации восстановленного глутатиона на 17% и более и увеличении концентрации окисленного глутатиона на 19% и более по сравнению с контролем прогнозируют раннюю стадию апоптоза лимфоцитов».

Новым в предлагаемом в качестве изобретения способе является комплексное определение восстановленного и окисленного глутатиона после инкубации лимфоцитов, без которого невозможно прогнозирование ранней стадии апоптоза лимфоцитов.

Антиоксидантная система направлена на эффективную нейтрализацию гидроксирадикалов и снижение токсичной для организма гидроперекиси. Гидроксильный радикал (^.OH) участвует в микробицидном и цитотоксическом действии нейтрофилов, моноцитов и Т-лимфоцитов и других клеток [Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меньшикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков и соавт. - М.: Слово. - 2006. - 556 с.]. Есть два основных механизма синтеза ^.OH нейтрофилами: первый - образование из пероксида водорода в присутствии металлов переменной валентности в так называемой «реакции Фентона»: Fe²⁺+H₂O₂→Fe³⁺+^.OH+OH^- [Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий / В.И. Лущак // Биохимия. - 2001. - Т.66, вып.5. - С.592-609], второй - в ходе ряда реакций с участием гипогалоидов: $$HOCl+O_2^{.}{}^{-}\to {}^{.}OH+C{l}^{-}+O_2$$ ; или взаимодействие гипохлорита с ионами Fe²⁺ [Spin trapping evidence for myeloperoxidase-dependent hydroxyl radical formation by human neutrophils and monocytes // C.L. Ramos, S. Pou, B.Е. Britigan et al. // J. Biol. Chem. - 1992. - Vol.267. - P.8307-8312; Candeias, L.P. Formation of hydroxyl radicals on reaction of hypochlorous acid with ferrocyanide, a model iron (II) complex / L.P. Candeias, М.R.L. Stratford, P. Wardman // Free Radical Res. - 1994. - Vol.20. - P.241-249]. Следовательно, если в клетке нет металлов переменной валентности в свободном состоянии, для нее реакция Фентона и подобные реакции не будут опасными.

В клетках предусмотрен ряд защитных реакций по блокированию свободных ионов Fe²⁺ и Cu⁺. Например, активированные клетки синтезируют лактоферрин, связывающий свободное железо и переводящий его в каталитически неактивную форму, а также продуцируют высокие концентрации таурина, конъюгирующего с гипохлоритом и защищающего клетку от его токсичных эффектов [Taurine chloramines, a product of activated netrophils, inhibits in vitro the genetation of nitric oxide and other macrofage inflammatory mediators / J.Marcinkiewiez, A.Grabowska, J.Bereta et al. // J. Leukocyte Biol. - 1995. - Vol.58. - P.667-674].

Образование ^·ОН показано в ходе микросомального окисления, окисления арахидоновой кислоты, в реакциях с флавиновыми ферментами, убихиноном, пероксинитритом. В ряде исследований клеток in vitro получены свидетельства продукции 'ОН данными клетками [Hydroxylation of salicylate by activated neutrophils / W.B.Davis, B.S.Mohammed, D.C.Mays et al. // Biochem Pharmacol. - 1989. - Vol.38. - P.4013-4019]. Однако изучение этих реакций зачастую основывалось на использовании ингибиторов и измерении уровня вторичных продуктов. Следовательно, реакции, приписанные ^.ОН, могли быть вызваны другими оксидантами, в частности O₂ ^.- или гипохлорной кислотой [Do human neutrophils form hydroxyl radical. Evaluation of an unresolved controversy / M.S.Cohen, В.E.Britigan, D.J.Hassett et al. // Free Radic Biol Med. - 1988. - Vol.5. - P.81-90]. Ряд авторов считает, что in vitro за счет реакции Фентона клетки производят незначительные количества ^.ОН [Rosen, G.М. Free radicals and phagocytic cells / G.M.Rosen, S.Pou, C.L.Ramos // FASEB J. - 1995. - Vol.9. - P.200-211].

Генерация ^.ОН стимулированными клетками в очаге воспаления может существенно лимитироваться отсутствием в среде ионов железа Исследование реакции Фентона в клетках выявило, что блокирование ионов железа лактоферрином ингибирует непосредственно саму реакцию [Rosen, G.М. Free radicals and phagocytic cells / G.M.Rosen, S.Pou, C.L.Ramos // FASEB J. - 1995. - Vol.9. - P.200-211], а утилизация H₂O₂ миелопероксидазой ограничивает реакцию, даже если железо доступно [Winterbourn, С.С.Myeloperoxidase as an effective inhibitor of hydroxyl radical production: Implications for the oxidative reactions of neutrophils / С.C.Winterbourn // J. Clin. Invest. - 1986. - Vol.78. - P.545-557]. Хотя большинство биологических форм железа каталитически неактивно, показана способность клеток к продукции ^.ОН в присутствии трансферрина, подверженного протеолитической деградации [Phagocyte-derived free radicals stimulated by ingestion of ironrich Staphylococcus aureus: Aspin-trapping study / M.S.Cohen, В.E.Britigan, Y.S.Chai et al. // J. Infect Dis. - 1991. - Vol.163. - 819-826], или железа в составе Pseudomonas aeruginosa, содержащего сидерофор пиохелин [Possible role of bacterial siderophores in inflammation-Iron bound to the pseudomonas siderophore pyochelin can function as a hydroxyl radical catalyst / T.J.Coffrnan, C.D.Cox, B.L.Edeker et al. / J.Clin. Invest. - 1990. - Vol.86. - P.1030-1038]. Однако M.S.Cohen и соавторы обнаружили, что внутриклеточное железо не всегда доступно: в их экспериментах повышенного образования радикала ^.ОН не отмечалось, даже если клетки поглощали Staphylococcus aureus, который был преинкубирован с Fe²⁺ [Phagocyte-derived free radicals stimulated by ingestion of ironrich Staphylococcus aureus: Aspin-trapping study / M.S.Cohen, В.E.Britigan, Y.S.Chai et al. // J. Infect Dis. - 1991. - Vol.163. - 819-826].

С помощью чувствительных спиновых меток обнаружена наработка гидроксил-радикала клетки in vitro в результате реакции НОCl и O₂ ^.-, причем преобразованию в ^.ОН подверглась очень небольшая часть использованного клетками кислорода [Free hydroxyl radicals are formed on reaction between the neutrophilderived species superoxide and hypochlorous acid / L.P.Candeias, К.B.Patel, M.R.L.Stratford et al. // FEBS Lett. - 1993. -Vol.333. - P.151-159]. Вопрос о том, достаточно ли такого количества ^.ОН, чтобы играть существенную роль в цитотоксичности, до сих пор остается открытым. Здесь необходимо учитывать, что гораздо большей бактерицидной способностью ^.ОН обладает в присутствии Cl [Radiation induced generation of chlorine derivatives in NaO-saturated phosphate buffered saline: Toxic effects on Escherichia coli cells / G.Czapski, S.Goldstein, N.Andorn et al. // Free Radic. Biol. Med. - 1992. - Vol.12. - P.353-361], вероятно, вследствие реакции между ними с образованием гипохлорита [Bactericidal potency of hydroxyl radical in physiological environments / R.G.Wolcott, B.S.Franks, D.M.Hannum et al. // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol.269. - P.9721-9734].

Гидроксильный радикал представляет собой один из наиболее реакционно-способных окислителей и может взаимодействовать почти с любой молекулой клетки. Он модифицирует дезоксирибозу и азотистые основания ДНК, окисляет молекулы белков, углеводов и липидов. Особенно активно ^.ОН в ходе реакций перекисного окисления липидов атакует фосфолипиды, содержащие в жирнокислотных радикалах ненасыщенные связи, что ведет к образованию гидроперекисей [Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико-биохимические аспекты / Е.Е.Дубинина. - СПб.: Медицинская пресса, 2006. - 400 с.; Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б.Меньшикова, В.З.Панкин, Н.К.Зенков и соавт. - М.: Слово. - 2006. - 556 с.]. Основным компонентом антиоксидантной системы является восстановленная форма глутатиона.

Глутатион - трипептид (L-γ-глутамил-L-цистеилглицин) с молекулярной массой 307 Da занимает особое место среди SH-содержащих соединений. Наличие γ-глутамильной связи защищает трипептид от ферментативной деградации. В организме глутатион присутствует в двух формах: окисленной - GSSG и восстановленной - GSH, причем содержание GSH в клетках на несколько порядков выше, чем GSSG [Колесниченко Л.С., 1989; Wu G. et al., 2004; Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005; Марри Р. и соавт., 2009]. По данным P. Pietarinen-Runtti et al. (2000) концентрация GSH в клетках составляет около 5 нмоль/мг белка. Содержание глутатиона в сыворотке крови здоровых людей незначительно, поэтому клетки основную потребность в GSH обеспечивают путем нематричного синтеза [Wu G. et al., 2004] в ходе двух последовательных реакций, катализируемых γ-глутамилцистеин-синтетазой (КФ 6.3.2.2) и глутатион-синтетазой (КФ 6.3.2.3) [Кулинский В.И., 1990; Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005; Марри Р. и соавт., 2009]. Лимитирующим звеном синтеза является образование γ-глутамилцистеина, зависящее от наличия L-цистеина и его способности окисляться в L-цистин [Зенков Н.К. и соавт., 2001]. В то же время недостаточность глутатион-синтетазы способствует развитию окислительных повреждений в нейтрофилах [Spielberg S.P. et al., 1979].

Глутатион при физиологических значениях pH имеет две анионные карбокси-группы, положительно заряженную аминогруппу и SH-группу цистеинового остатка, которая придает GSH свойства восстановителя и способность быстро обезвреживать свободные радикалы и АФК [Day R.M., 2005; Zhu Y., 2007; Circu C.L. et al, 2009]. Глутатин является типичным тиолом и, участвуя в одноэлектронных восстановительных реакциях, становится GS', который димеризуется до GSSG, легко реагирующего со свободными SH-группами. Второй тип окислительно-восстановительных превращений с участием GSH - это реакции тиолдисульфидного обмена, которые известны как основной путь образования смешанных дисульфидов глутатиона с белками (белок-SSG) и играют роль в регуляции биологических процессов [Chai Y.C. et al., 1994]. В реакциях третьего типа происходит двухэлектронное окисление глутатиона с образованием интермедиата, который реагирует со второй молекулой GSH (получение GSSG) или иной молекулой (синтез смешанного дисульфида) [Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005].

GSH является стабилизатором мембран [Биленко М.В, 1989; Udupi V., 1992; Trudel S. et al., 2009]. Он защищает клеточные структуры от высокотоксичного OCI- [Carr A.C., Winterbourn С.С., 1997], при этом GSH превращается в глутатион-сульфонамид и дегидроглутатион [Harwood D.T. et al., 2006]. Связывая NO, глутатион образует токсичные для клетки нитрозильные комплексы. Моно-нитрозоглутатион может активировать апоптоз [Turpaev К.Т. et al., 1997].

Не всегда восстановительного потенциала GSH достаточно для полной нейтрализации прооксидантов. Существует мнение, что взаимодействие GSH с органическими радикалами эффективно только в условиях удаления O₂ ^.-, поэтому глутатион образует с супероксиддисмутазой своеобразную антиоксидантную систему, ибо в противном случае развиваются реакции образования Н₂О₂ и GS^. [Ланкин В.З. и соавт., 1997; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006]. В сочетании с витамином В₁₂ глутатион, а также N-ацетилцистеин, могут потенцировать прооксидантное и цитотоксическое действие на клетку [Соловьева М.Е. и соавт., 2007].

Основной антиоксидантный эффект GSH реализует посредством участия в работе ферментов. Глутатион выступает донором водорода при восстановлении Н₂О₂ и перекисей липидов глутатион-пероксидазами и глутатион-S-трансферазами (ГТ) [Hirayama К., 1989; Sies Н. et al., 1997; Кулинский В.И., 1990; Hayes J.D. et al., 2005; Зенков H.K. и соавт., 2009; Liu G. et al., 2010]. Высокая активность глутатион-редуктазы и накопление GSH оказывает протекторный эффект в отношении альвеолярных макрофагов, инкубируемых с прооксидантами in vitro [Pietarinen Р.К. 1995] и других клеток.

С изменением окислительно-восстановительного баланса сопряжено большое количество реакций, поэтому поддержание оптимального редокс-состояния цитозоля выступает важным условием нормальной жизнедеятельности клеток. Высокая концентрация глутатиона в цитоплазме, его редокс-активность и возможность поддержания в восстановленном состоянии делают систему GSH/GSSG важнейшим внутриклеточным редокс-буфером [Reed М.С. et al., 2008]. Концентрация GSH в клетке в 500-1000 раз превышает уровень НАДФН и других внутриклеточных редокс-систем, поэтому изменения соотношения GSH/GSSG прямо отражают изменения редокс-статуса клетки [Кулинский В.И., 2007; Asian М., Canatan D., 2008; Reed М.С., 2008]. Считают, что буферная емкость системы глутатиона защищает репликативную систему клетки, а дефицит GSH приводит к снижению синтеза ДНК и белков [Poot М., 1991; Ланкин В.З., 1997; Day R.M., Suzuki Y.J., 2005; Liu G. et al., 2010], а затем и к апоптозу.

К природным антиоксидантам относят также аскорбиновую кислоту, которая играет важную роль в развитии окислительного стресса в организме.

Аскорбиновая кислота реализует свое антиоксидантное действие в плазме, межклеточной жидкости и на внеклеточном уровне. В организме человека аскорбиновая кислота преимущественно представлена в L-форме. Стрессовые ситуации увеличивают количество метаболитов витамина C в виде дегидроаскорбиновой кислоты.

Аскорбиновая кислота и дегидроаскорбиновая кислота играют активную роль в нескольких процессах, включая защиту от инфекции, повышении иммунности, в процессах заживления ран, а также принимая участие в образовании антистрессовых гормонов. Аскорбат является кофактором дофамин-β-гидроксилазы, которая катализирует синтез норадреналина и других катехоламинов. Аскорбиновая кислота является восстановителем для L-пролингидроксилазы, которая необходима для синтеза коллагена и соединительной ткани в целом. В организме с участием аскорбиновой кислоты происходит регенерация α-токоферола из токофероксильного радикала. Окислительный стресс коррелирует с ухудшением секреции инсулина, а терапия аскорбиновой кислотой прерывает повреждающее действие свободных радикалов, уменьшает степень проявления инсулиновой резистентности [М.И.Балаболкин и соавт., 2003]. Ионы аскорбата являются одним из активных элементов системы антиоксидантной защиты, предохраняя липиды от окисления их пероксидными радикалами. Антиоксидантный эффект аскорбата проявляется при достаточном количестве других антиоксидантов, таких как α-токоферол и глутатион. Глутатион восстанавливает дегидроаскорбиновую кислоту прямым и неферментативным путем до аскорбиновой кислоты. Эта реакция является одним из основных механизмов антиоксидантной системы, часто описываемых как восстановительные циклы - глутатион/глутатиондисульфид и аскорбиновая/дегидроаскорбиновая кислота. При этом клетки периферических тканей поглощают экзогенную дегидроаскорбиновую кислоту и в присутствии глутатиона конвертируют ее в цитоплазме в аскорбиновую кислоту. Восстановление глутатиондисульфида в глутатион катализируется глутатион редуктазой и требует участия NADPH в качестве кофактора. Недостаточность глутатиона снижает содержание аскорбиновой кислоты в тканях и одновременно повышает концентрацию дегидроаскорбиновой кислоты.

При недостатке α-токоферола и глутатиона может превалировать прооксидантный эффект аскорбата и его метаболитов. Прооксидантный эффект аскорбиновой кислоты может наблюдаться не только при недостатке α-токоферола и глутатиона, но и при применении высоких доз аскорбиновой кислоты. Избежать прооксидантного эффекта аскорбиновой кислоты можно в случае создания адекватного внутриклеточного уровня восстановленного глутатиона.

Каждый вновь введенный в формулу изобретения признак выполняет функцию повышения точности и эффективности способа: комплексное определение восстановленного и окисленного глутатиона после инкубации клеток для последующего прогнозирования ранней стадии апоптоза.

Роль антиоксидантной системы клетки заключается в снижении токсического эффекта свободных радикалов, в том числе и гидроперекисей липидов.

Антиоксидантную защиту обеспечивает широкий круг веществ, различных по происхождению, физико-химической природе и механизмам действия. Общим их свойством, по определению J.M.Gutteridge (1992), является способность, присутствуя в низких по сравнению с окисляемым субстратом концентрациях, существенно задерживать или ингибировать его окисление. Постоянное образование прооксидантов должно быть уравновешено их инактивацией, поэтому для поддержания гомеостаза необходима адекватная ситуации непрерывная регенерация антиоксидантной способности клеток [Зенков Н.К. и соавт, 2001; Blokhina О. et al, 2003].

Общепринятой номенклатуры антиоксидантов в настоящее время не существует, хотя ряд авторов [Dimascio Р., 1990; Kalra V. et al, 2001; Зайцев В.Г. и соавт., 2003] выделяет два класса: превентивные, снижающие скорость инициации цепной реакции окисления, и гасящие (прерывающие цепь), препятствующие развитию цепной реакции. К превентивным относят каталазу и пероксидазы, разрушающие ROOH, а также агенты, образующие хелатные комплексы с металлами переменной валентности, к прерывающим цепь - фенолы, ароматические амины. В условиях in vivo главными гасящими антиоксидантами являются: витамин Е, нейтрализующий ROO^. в липидной фазе мембран [Jore D. et al, 1990; Hong J.H. et al, 2004], фермент СОД, улавливающий O₂ ^.- в водной фазе клетки [Fridovich I., 1989; Dimascio Р., 1990; Ciurea D., 1992], и церулоплазмин - белок острой фазы, выполняющий антирадикальную функцию в крови [Marklund S.L., 1987; Atanasiu RL. et al, 1998].

Более известно деление антиоксидантов на ферменты и соединения неферментативной природы. Последние в определенных концентрациях всегда присутствуют в липидной фазе мембран и водных средах организма и расходуются первыми при устранении проявлений окислительного стресса [Droge W, 2002; Blokhina О, 2003]. Ферменты наиболее активно присоединяются к антиоксидантной защите (АОЗ) после включения механизмов индукции [Лущак В.И., 2001]. При возникновении окислительного стресса (ОС) расход антиоксидантов возрастает и меняется экспрессия генов, кодирующих белковые компоненты АОЗ [Дубинина Е.Е, 2006]. Между ферментами и неферментативными элементами АОЗ существует равновесие, причем последние при ряде патологических состояний организма могут выступать в качестве прооксидантов [Зенков Н.К. и др., 2001].

Главную роль среди неферментативных антиоксидантных систем защиты отводят глутатиону.

Функционирование клеток связано с уровнем белково-связанного глутатиона. Определение белково-связанного глутатиона основано на способности боргидрата натрия (NaBH₄) высвобождать из связи с белками глутатион, который при взаимодействии с ДТНБ образует окрашенное соединение, а именно тио-2-нитробензойную кислоту, водный раствор которой имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм [Burchill, B.R. Microtubule dynamics and glutathione metabolism in phagocytizing human polymorphonuclear leukocytes [Text] / B.R.Burchill, J.M.Oliver, C.B.Pearson et al. // J. of Cell Biology. - 1978. - Vol.76, №2. - P.439-447].

В настоящее время крайне важно определить уровень белково-связанного глутатиона для оценки эффективности защиты клеток от апоптоза.

В лабораторной практике наиболее распространен способ защиты клеток от апоптоза и переокисления с помощью определения концентрации белково-связанного и восстановленного глутатиона.

Содержание восстановленного глутатиона определяют методом, предложенным М.Е.Anderson (1985) в модификации S.Kojima et al. (2004) [Kojima, S. Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth / S.Kojima, K.Nakayama, H. Ishida // J. Radiat. Res. - 2004. - Vol.45, №1. - P.33-39]. Принцип метода основан на взаимодействии GSH с 5,5'-дитио-бис(2-нитробензойной) кислотой (ДТНБ) с образованием тио-2-нитробензойной кислоты, водный раствор которой имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм. При этом образуется GSSG, который восстанавливается глутатионредуктазой до GSH и вновь взаимодействует с ДТНБ. Скорость образования окрашенного продукта пропорциональна содержанию общего глутатиона. Для определения содержания GSSG пробы прединкубируются с блокатором SH-групп 2-винилпиридином («Wako», Япония), который необратимо связывает GSH и, следовательно, скорость образования окрашенного продукта пропорциональна содержанию GSSG.

Лизат клеток готовят на 5% сульфосалициловой кислоте, которая осаждает белки, но не ингибирует активность глутатионредуктазы.

Концентрацию белка в клетках определяют методом [A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Analyt. Biochem. - 1976. - Vol.7, №1, 2. - P.248-254], основанным на взаимодействии Кумасси голубого G-250 с остатками аргинина и лизина в белках. Свободный краситель красного цвета (максимум поглощения - 495 нм) при образовании комплекса с белком переходит в синюю форму (максимум поглощения - 595 нм).

К 0,1 мл лизата клеток добавляют 1,0 мл раствора Кумасси голубого (100 мг красителя, 50 мл 96° этанола, 100 мл 85% Н₃РО₄, Н₂O до 1,0 л), перемешивают, инкубируют 3 мин при комнатной температуре и измеряют оптическую плотность проб (длина волны 595 нм) против контроля, содержащего 0,1 мл воды и 1,0 мл раствора Кумасси голубого. Содержание белка рассчитывают по калибровочной кривой, построенной по разведениям стандартного раствора альбумина (1,0 мг/мл) и выражают в мг/мл.

В настоящее время крайне важно для прогнозирования ранней стадии апоптоза оценить концентрацию различных форм глутатиона.

Все сказанное свидетельствует о крайней важности разработки способа прогнозирования ранней стадии апоптоза лимфоцитов.

Популярность указанного выше способа обоснована его высокой чувствительностью, простотой осуществления и достаточной адекватностью получаемых результатов, лежащих в основе определения концентрации глутатиона в среде инкубации лимфоцитов.

Существенные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявленной совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области, и не являются очевидными для специалиста.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено при изучении патентной и научной медицинской литературы.

Данное изобретение может быть использовано в медицинской практике для повышения точности и эффективности прогнозирования ранней стадии апоптоза при различных заболеваниях. Этот способ является одним из основных при оценке жизнеспособности клеток при трансплантации органов и тканей. Таким образом, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности: «новизна», «изобретательский уровень», «промышленная применимость».

Метод основан на определении концентрации белково-связанного и восстановленного глутатиона.

Способ осуществляется следующим образом поэтапно:

1. Выделение культуры клеток линии Jurkat.

Культивирование и исследование клеток на апоптоз проводилось в луночных планшетах (2,0×10⁴ клеток на лунку) в питательной среде RPMI-1640 при инкубации 48 часов, температуре 37°C и 5% содержании CO₂ с добавлением минимальной концентрации индуктора апоптоза - синтетического глюкокортикоида дексаметазона (″KRCA″, Словения), составлявшего 10^-4 моль/мл. Затем проводилась оценка количества апоптотических клеток с использованием FITC - меченного аннексина V и пропидиума йодида (PI) методом проточной лазерной цитометрии, а также проводилось определение жизнеспособности клеток по включению трипанового синего. В контроле количество клеток в апоптозе составило 7,06 (6,00-8,71)%, а после инкубации 28,2 (25,1-31,4)% (четырехкратное увеличение)

2. Количественное определение численности жизнеспособных клеток после их инкубации с помощью окраски трипановым синим («Serva», CUlA) микроскопическим методом.

Клетки ресуспендируют в 1 мл клеточной взвеси. Отбирают 100 мкл ресуспендированной клеточной суспензии и добавляют 100 мкл 0,1% раствора трипанового синего на физ. растворе, хорошо перемешивают и заполняют камеру Горяева. Предварительно к камере притирают покровное стекло так, чтобы появлялись радужные, ньютоновые кольца (только при этих условиях соблюдался правильный объем камеры). Каплю клеточной взвеси с красителем вносят под притертое покровное стекло. Подсчет клеток производят в 5-ти больших квадратах по диагонали камеры Горяеева. Расчет жизнеспособных клеток по содержанию «мертвых» клеток, окрашенных в синий цвет, производят по формуле:

А×10⁶=(число клеток)/4,

где A - клеточность лимфоцитов крови.

3. Биохимическое исследование белково-связанного, восстановленного и окисленного глутатиона.

Лизат лимфоцитов готовят на 5% сульфосалициловой кислоте, которая осаждает белки, но не ингибирует активность глутатионредуктазы. Количество общего глутатиона (GSH и GSSG) определяют в пробе, содержащей 0,1 М Na-фосфатный буфер (pH=7,5) с 1 мМ ЭДТА, 0,4 мМ НАДФН2, 0,3 мМ ДТНБ и 1 U/мл глутатионредуктазы («Wako», Япония). Окисленный глутатион определяют аналогичным способом в клеточном лизате после предварительной инкубации пробы в течение 30 мин с 10 мМ 2-винилпиридином. Расчет содержания общего и окисленного глутатиона производят с помощью калибровочных графиков, для построения которых используют растворы GSH и GSSG («МР», США) в концентрации от 3 до 100 мкМ, обработанные аналогично опытным пробам. Концентрацию GSH рассчитывают как разницу между концентрацией общего глутатиона и GSSG, выражая результат в нмоль/мг белка.

Определение белково-связанного глутатиона.

После инкубации в экспериментальных условиях (5% и 20% кислорода) в присутствии или отсутствии NEM, DTE, NAC клетки центрифугируют 5 минут при 4°С и 1500 об/мин для их осаждения. Удаляют супернатант. Добавляют 1 мл охлажденного PBS (pH 7,4). Ресуспендируют на вортексе. Центрифугируют 5 минут при 4°C и 1500 об/мин. Удаляют супернатант. Осадок клеток ресуспендируют в 1 мл 5% сульфосалициловой кислоты для получения клеточного лизата. Центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин. 1,0 мл осадка белка инкубируют 1 ч при 50°C с 1,0 мл 1% NaBH₄. Далее оставшийся белок осаждают добавлением 0,4 мл 30% ТХУ. Пробу инкубируют 15 мин при 50°C. Затем пробу охлаждают 5 мин (0°C). Центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Супернатант смешивают с 2,5 мл PBS (pH 7,4) и добавляют 2,0 мл ацетона для полного окисления NaBH₄. Перемешивают. Центрифугировают 10 мин при 3000 об/мин. Удаляют верхнюю фазу. К нижней фазе добавляют равный объем диэтилового эфира (для удаления ТХУ). Перемешивают. Центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Затем снова удаляют верхнюю фазу. Далее процедуру отмывки пробы от ТХУ с помощью диэтилового эфира производят 4-кратно. Затем отбирают 0,1 мл жидкости (из нижней фазы) и смешивают с 0,4 мл 0,01 М фосфатного буфера (pH=7,0). В пробу добавляют 0,1 мл 0,4 мг/мл ДТНБ. Пробу спектрофотометрируют при 412 нм против контроля, содержащего воду вместо раствора осажденного белка.

Расчет производят с учетом коэффициента молярной экстинкции 13·10³ М^-1 см^-1. Результаты определения концентрации белково-связанного глутатиона выражают в нмоль/мг белка.

Оценка способа прогнозирования ранней стадии апоптоза лимфоцитов по способу-прототипу и предлагаемому способу выполнялось 40 раз. Результаты исследования обработаны статистически с использованием пакета программ Stat Soft Statistica 6.0.

При проведении исследования по способу-прототипу уровень восстановленного глутатиона в среде инкубации клеток в норме составил 2.05±0.19 нмоль/мг белка и окисленного глутатиона 0.18±0.02 нмоль/мг белка, а при оценке по предлагаемому способу в случае эффективного прогнозирования ранней стадии апоптоза уровень восстановленного глутатиона составил 1.7±0.13 нмоль/мг белка и окисленного глутатиона 0.26±0.02 нмоль/мг белка. В случае неэффективного прогнозирования ранней стадии апоптоза лимфоцитов уровень восстановленного глутатиона составил 2.0±0.2 нмоль/мг белка и окисленного глутатиона 0.21±0.01 нмоль/мг белка (табл.1).

То есть при эффективном прогнозировании ранних стадий апоптоза лимфоцитов уровень восстановленного глутатиона снижался на 17% и более, а окисленного глутатиона увеличивался на 19% и более. При неэффективном прогнозировании ранних стадий апоптоза лимфоцитов уровень восстановленного глутатиона увеличивался на 5% и менее, а окисленного глутатиона увеличивался на 6% и более.

Полученные результаты уровня глутатиона в среде инкубации лимфоцитов соответствуют данным литературы [Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005].

Итак, при применении способа-прототипа был получен недостаточно точный результат, не позволивший установить эффективное прогнозирование ранней стадии апоптоза лимфоцитов, что связано с отсутствием комплексного биохимического исследования различных форм глутатиона, а наиболее эффективным и точным был предлагаемый способ.

При этом предлагаемый способ прост в исполнении и интерпретации полученных результатов.

Способ прогнозирования ранней стадии апоптоза лимфоцитов, включающий этапы выделения клеток, инкубацию клеток 48 часов при температуре 37°C и 5% содержании CO₂ с добавлением индуктора апоптоза дексаметазона в концентрации 10^-4 моль/мл, количественное определение жизнеспособности лимфоцитов по включению трипанового синего и биохимическое определение концентрации восстановленного и окисленного глутатионов в лизате лимфоцитов после предварительной инкубации в течение 30 минут с 10 мМ 2-винилпиридина и при одновременном комплексном снижении концентрации восстановленного глутатиона на 17% и более и увеличении концентрации окисленного глутатиона на 19% и более по сравнению с контролем прогнозируют раннюю стадию апоптоза лимфоцитов.