Сухая композиция трансглутаминазы

Группа изобретений касается сухой композиции трансглутаминазы, способа ее получения и стабилизации. Предлагается сухая композиция фактора XIII, получаемая посредством лиофилизации водной композиции, содержащей фактор XIII, соль и гистидин, где соль представляет собой хлорид натрия и ее концентрация в водной композиции находится в диапазоне 25-50 мМ, и фактор XIII представляет собой рекомбинантный фактор XIII. Способ получения сухой композиции и способ стабилизации композиции фактора XIII в процессе хранения в высушенной форме таким образом, чтобы уровень активированного непротеолитическим путем фактора XIII, измеренного непосредственно после растворения, составлял не более 1% от общего содержания фактора XIII, осуществляют посредством лиофилизации вышеописанной водной композиции. Использование группы изобретений обеспечивает получение стабильного препарата лиофилизированного фактора XIII, содержащего сниженное количество продуктов деградации фактора XIII, в частности, активированного непротеолитическим путем XIII (rFXIIIa⁰) - не более 1% от общего содержания фактора XIII. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 9 табл., 4 пр.

 

Данное изобретение касается композиций трансглутаминазы, в частности, стабильных лиофилизированных или высушенных распылением композиций XIII фактора свертывания крови, и также оно касается способов изготовления указанных композиций, восстановленных растворов, фармацевтических композиций и способов лечения.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Трансглутаминазы представляют собой Са²⁺ зависимые ферменты, которые катализируют образование изопептидных связей в белках между γ-карбоксамидной группой боковой цепи глутамина и ε-аминогруппой боковой цепи лизина. Трансглутаминазы обнаруживаются как внеклеточно, так и внутриклеточно. Примерами трансглутаминаз являются фактор XIII, эпидермальные трансглутаминазы, трансглутаминазы II типа (трансглутаминазы тканевого типа, трансглутаминазы печени) и трансглутаминазы I типа (трансглутаминазы кератиноцитов).

XIII фактор свертывания крови (FXIII) является плазменной трансглутаминазой, известной также как "фибринолигаза" и "фибрин-стабилизирующий фактор", циркулирующей в плазме в концентрации 20 мкг/мл. Этот белок существует в плазме в виде тетрамера, состоящего из двух субъединиц А и двух субъединиц В (А₂В₂). Каждая субъединица имеет молекулярный вес приблизительно 80000 Да, а весь белок имеет молекулярный вес приблизительно 330000 Да. Субъединицы А содержат каталитический сайт трансглутаминазы, тогда как субъединицы В не обладают каталитической активностью, но играют роль структурного белка, препятствуя клиренсу субъединицы А.

Для активации фактора XIII необходимы тромбин и Са²⁺. Тромбин разрезает субъединицы А по Arg37 (в С-концевом положении по отношению к нему), таким образом, отщепляя пептид активации (остатки 1-37 субъединицы А) и субъединицы В с образованием активной формы димера А₂. Активированная субъединица FXIII А₂ (FXMIa) является каталитически активной формой FXIII.

Фермент FXIII является ферментом коагуляционного каскада, активация которого происходит в последнюю очередь, а его функция состоит в поперечном связывании α- и γ-цепей фибрина, что в результате приводит к образованию прочного тромба с повышенной устойчивостью к фибринолизу. Кроме того, к тромбу присоединяются ряд антифибринолитических, прокоагуляционных и адгезивных белков, что придает фибрину структурную прочность и повышенную механическую устойчивость к растворению под действием плазмина и других протеолитических ферментов.

В коммерчески доступные очищенные или частично очищенные препараты трансглутаминазы, или фактора XIII, во многих случаях добавляют стабилизаторы, такие как альбумин сыворотки человека (HSA). Применение белковых стабилизаторов может быть связано с проблемами, поскольку приводит к снижению специфической активности белка, повышает содержание белка при введении пациентам и может мешать определению степени чистоты препарата. Кроме того, это может стать причиной иммуногенности белкового препарата. Эти недостатки белковых стабилизаторов делают их применение особенно нежелательным для стабилизации высокоочищенных белков, таких как рекомбинантные белки. Кроме того, применение белковых стабилизаторов может стать причиной контаминации вирусными антигенами, например, когда добавляется альбумин.

FXIII, выделенный из плаценты или плазмы, или находящийся в форме свежезамороженной плазмы, применяли в течение многих лет для лечения дефицита XIII фактора. Однако недостатком таких препаратов является присутствие в них чужеродных белков и все связанные с этим проблемы, такие как нежелательная иммуногенность.

В настоящее время возможно получать трансглутаминазы и фактор XIII с применением технологии рекомбинантных ДНК. В данном описании rFXIII означает рекомбинантный фактор XIII. Однако до настоящего времени на рынке не существует коммерчески доступного продукта rFXIII.

Композиция и активность белковых препаратов, применяемых для терапии, должны быть стабильны в течение относительно долгих периодов времени. Такие продукты зачастую поступают на рынок в сухой форме по той причине, что добиться такой стабильности для растворов удается только изредка. Сублимационная сушка в мягких условиях (лиофилизация) является одним из способов выбора для высушивания таких продуктов. Однако, даже при применении такого способа, трудно получить стабильные препараты, соответствующие требованиям по своей надежности и долговечности.

Сублимационная сушка растворов трансглутаминазы или фактора XIII может, например, привести к выраженному снижению активности и потере чистоты. Еще одна проблема сублимационной сушки, например, фактора XIII, связана с продуктом деградации фактора XIII, так называемыми активированными непротеолитическим путем формами (FXIIIa⁰), также обозначаемым преактивированным фактором XIII. Считается, что FXIIIa⁰ представляет высокий риск токсичности и его инъекции могут приводить к возможным нежелательным побочным эффектам. Таким образом, желательно стабилизировать препараты трансглутаминазы, или фактора XIII, предотвращая формирование активированных непротеолитическим путем продуктов.

Известны различные аналоги сухих композиций FXIII. Ниже приводятся примеры описаний лиофилизированных композиций FXIII. В WO 2002/36155 показано, что лиофилизированная композиция FXIII может быть приготовлена с добавлением 1 мМ EDTA, 10 мМ глицина, 2% сахарозы в воде или 20 мМ гистидина, 3% (вес/объем) сахарозы, 2 мМ глицина и 0,01% (вес/объем) полисорбата, pH 8,0. US 6204036 (Aventis Behring) касается стабильного лиофилизированного препарата трансглутаминазы, содержащего по меньшей мере одну добавку, выбранную из группы D- и L-аминокислот и их солей, производных, гомологов и димеров, углеводов и многоатомных спиртов, поверхностно активных компонентов и восстанавливающих агентов с той оговоркой, что добавка не является глицином или аргинином, причем препарат не содержит белкового стабилизатора и причем указанный препарат растворяется без появления мутности в водном растворителе, подходящем для парентерального введения.

Такие препараты, упомянутые выше, тем не менее, могут иметь описанный выше недостаток, а именно высокий уровень активированного непротеолитическим путем фактора XIII, что считается препятствием для возможности клинической и коммерческой реализации этих препаратов. Таким образом, очевидно, что существует большая потребность в стабильных сухих препаратах трансглутаминазы и фактора XIII с низким уровнем активированных непротеолитическим путем продуктов. Более того, такие препараты не должны нуждаться в добавлении белковых стабилизаторов, например, HSA.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение основано на неожиданном открытии, заключающемся в том, что соли, например моновалентные соли, оказывают существенный стабилизирующий эффект на сухую трансглутаминазу, например на композиции фактора XIII, в отношении степени ее чистоты и формирования преактивированной трансглутаминазы. Показано, что данный эффект является специфичным для сухого состояния и имеет особенную значимость для получения стабильного коммерческого продукта.

В одном аспекте данного изобретения предлагается сухая композиция трансглутаминазы, которая может быть получена посредством лиофилизации или высушивания распылением водной композиции, содержащей трансглутаминазу, соль и по меньшей мере один из следующих компонентов, выбранных из группы, состоящей из углевода, аминокислоты и буфера, причем концентрация соли в водной композиции находится в диапазоне от 5 до 100 мМ.

В других аспектах данного изобретения предлагается способ получения указанной сухой композиции трансглутаминазы, восстановленного раствора, фармацевтической композиции и способ лечения.

Иные предметы, признаки и преимущества данного изобретения станут более понятны из следующего подробного описания. Однако следует иметь в виду, что подробное описание и конкретные примеры, указывающие на предпочтительные воплощения изобретения, приводятся только в иллюстративных целях, поскольку специалистам будут очевидны различные изменения и модификации, остающиеся в рамках изобретения, исходящие из этого подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1: Оценка уровня сахарозы и NaCl. Анализ влияния 25 мМ NaCl на степень чистоты образцов, хранившихся при 40°С, определяемую посредством анионообменной ВЭЖХ, выполненный в программе Modde.

Фиг. 2: Полный факторный анализ уровней NaCl и гистидина. Анализ данных, полученных для rFXIIIa° при 25°С, выполненный в программе Modde.

Фиг. 3: Полный факторный анализ уровней NaCI и гистидина. Анализ данных, полученных при определении степени чистоты при помощи анионообменной ВЭЖХ, выполненный в программе Modde.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термины "преактивированная" или "активированная непротеолитическим путем" трансглутаминаза, в отношении данного изобретения, означает трансглутаминазу, которая подверглась непротеолитической активации, например, в случае, когда фактор XIII становится активированным в отсутствии тромбина (тромбин обладает способностью протеолитически расщеплять FXIII), говорят, что произошла его непротеолитическая активация; см., например, Polgar J., et al. Biochem J 1990; 267: 557-60. Muszbek L, et al. Thrombosis Research 94 (1999) 271-305. Активированный непротеолитическим путем фактор XIII (FXIII°), который представляет собой продукт деградации FXIII, представляет собой опасность для фармацевтической композиции FXIII, поскольку считается продуктом деградации с высоким риском токсичности.

Термин "биологически активный" здесь означает обладающий активностью в живом организме, например, важный в медицинских, сельскохозяйственных или косметических целях.

Термин "водная композиция" в отношении данного изобретения означает композицию, содержащую воду в жидком состоянии. Такая композиция обычно представляет собой раствор или суспензию. Термин "водная композиция", употребляемый в контексте данного изобретения, относится к препарату, содержащему по меньшей мере 50% воды в весовом отношении (вес/вес).

Термин "разбавитель" в отношении данного изобретения относится к жидкому раствору или суспензии. Термин "разбавитель", употребляемый в контексте данного изобретения, обозначает раствор или суспензию, содержащие по меньшей мере 50% воды в весовом отношении (вес./вес.). В контексте данного изобретения разбавитель применяют для растворения («восстановления») сухой композиции трансглутаминазы.

Все ссылки, включая публикации, заявки на патенты и патенты, цитируемые здесь, включены сюда во всей полноте посредством ссылки, в той же степени, как если бы для каждой ссылки отдельно и специально было указано, что она включена сюда во всей своей полноте путем ссылки (в наибольшей степени, допустимой существующим законодательством).

Все заголовки и подзаголовки использованы здесь только для удобства и не должны рассматриваться как ограничивающие изобретение каким-либо образом.

Применение каждого и любого из примеров или примеров формулировок (например, "такой как") в данном описании предназначено попросту для лучшего разъяснения изобретения и не ограничивает рамки изобретения, если это не указано иначе. Ни одна формулировка в описании не должна рассматриваться как указание на то, что какой-либо незаявленный элемент является незаменимым для осуществления изобретения.

Упоминание и включение посредством ссылки патентных документов здесь производится только для удобства и не отражает никоим образом действительность, патентоспособность и/или законность таких патентных документов.

Данное изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта изобретения, упомянутые в прилагаемых пунктах формулы изобретения, согласно существующему законодательству.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ

ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении предлагаются композиции трансглутаминазы, в частности, стабильные лиофилизированные или высушенные распылением композиции трансглутаминаз, например, XIII фактора свертывания крови (FXIII). В изобретении также предлагаются способы изготовления упомянутых сухих композиций трансглутаминазы, восстановленных растворов, фармацевтических композиций и способы лечения.

В данном изобретении предлагается продукт, содержащий трансглутаминазу, например, фактор XIII, имеющий уровень чистоты и уровень преактивации, остающиеся приемлемыми в течение всего производственного процесса, хранения и периода применения продукта трансглутаминазы.

Композиции по настоящему изобретению, обеспечивающие улучшенную стабильность в отношении уровня преактивации и общей чистоты, содержат сухую композицию трансглутаминазы, причем указанную композицию можно получать посредством лиофилизации или высушивания распылением водной композиции, содержащей трансглутаминазу, соль и по меньшей мере один из следующих компонентов, выбранных из группы, состоящей из углевода, аминокислоты и буфера, причем концентрация соли в водной композиции находится в диапазоне от 5 до 100 мМ.

В одном воплощении сухая композиция по данному изобретению содержит сухую композицию трансглутаминазы, указанную композицию можно получать посредством лиофилизации или высушивания распылением водной композиции, содержащей трансглутаминазу, соль и по меньшей мере один из следующих компонентов, выбранных из группы, состоящей из углевода, аминокислоты и буфера, причем концентрация соли в водной композиции находится в диапазоне от 5 до 100 мМ, с той оговоркой, что композиция не является сухой композицией фактора XIII, полученной посредством лиофилизации раствора фактора XIII, содержащего 0,5% NaCl и 2,25% глицина.

В одном воплощении сухая композиция по данному изобретению не содержит каких-либо белковых стабилизаторов, таких как альбумин.

Описанные ниже воплощения и примеры главным образом описывают и раскрывают композиции рекомбинантного FXIII (rFXIII), но данное изобретение не ограничивается этими воплощениями и примерами, но может также относиться к композициям любых трансглутаминаз, известных в настоящее время или тех, что будут открыты в будущем.

Компоненты композиции

Композиция по данному изобретению содержит трансглутаминазу. Примеры трансглутаминаз, которые могут быть стабилизированы препаратами по данному изобретению, включают фактор XIII, эпидермальные трансглутаминазы, трансглутаминазы II типа (трансглутаминазы тканевого типа, трансглутаминазы печени) и трансглутаминазы I типа (трансглутаминазы кератиноцитов), но не ограничиваются ими.

Фактор XIII

В одном воплощении водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, содержит соединение фактора XIII. Соединение фактора XIII может, например, быть естественным путем образованным фактором XIII дикого типа и естественным путем образованными аллельными вариантами фактора XIII. Эти соединения FXIII могут иметь, например, человеческое или животное происхождение, например, быть человеческим FXIII, свиным FXIII и бычьим FXIII. Последовательности человеческого фактора XIII дикого типа могут быть найдены, например, в ЕР 268772 и ЕР 236978. Соединение фактора XIII по данному изобретению включает тетрамер зимогена полного фактора XIII (А₂В₂) и фактор ХIIIа, а также их субъединицы, включая субъединицу А и димеры А₂.

Соединение фактора XIII по данному изобретению, может, например, представлять собой биологически активные фрагменты, производные или варианты фактора XIII, сохраняющие по меньшей мере часть характерной активности фактора XIII дикого типа, обеспечивающей поперечное сшивание. Такая активность, обеспечивающая поперечное сшивание, может быть измерена способами, известными в данной области техники.

В некоторых воплощениях биологически активные фрагменты, производные или варианты фактора XIII сохраняют 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% обеспечивающей поперечное сшивание активности фактора XIII дикого типа.

Фрагменты, производные и варианты фактора XIII включают варианты с заменами, инсерциями и делециями. Варианты с инсерциями содержат сшивки по амино- и/или карбокси-концу, а также инсерции внутри последовательности одного или нескольких аминокислотных остатков. Инсерции могут, например, быть произведены внутри зрелой кодирующей последовательности белка фактора XIII дикого типа. Варианты с делециями характеризуются удалением одного или нескольких аминокислотных остатков из белка фактора XIII дикого типа. Такие варианты обычно получают посредством сайт-специфического мутагенеза нуклеотидов ДНК, кодирующей белок, таким образом, получая ДНК, кодирующую вариант, и затем экспрессируя ДНК в культуре рекомбинантных клеток. Однако, фрагменты вариантов белков могут также быть получены посредством синтеза in vitro. Тогда как сайт введения варианта аминокислотной последовательности обычно является предопределенным, сама мутация не обязательно должна быть предопределена. Например, с целью оптимизации внедрения мутации в заданном сайте может быть произведен случайный мутагенез целевого кодона или участка и проведен скрининг экспрессированных вариантов белков для выявления оптимальной комбинации желаемой активности. Методы для проведения замещающих мутаций в предопределенных сайтах ДНК с известной последовательностью хорошо известны, например, мутагенез с праймером М13. Варианты замен представляют собой те, в которых по меньшей мере один аминокислотный остаток в последовательности был удален и на его место вставлен другой аминокислотный остаток. Аминокислотные замены, как правило, затрагивают один аминокислотный остаток; инсерции обычно составляют порядка от 1 до 10 аминокислотных остатков; а делеции варьируют в пределах от 1 до 30 аминокислотных остатков. Делеции или инсерции могут, например, выполняться в смежных парах, т.е. делеции 2 аминокислотных остатков или инсерции 2 аминокислотных остатков. Для получения окончательной конструкции можно комбинировать замены, делеции, инсерции или любые их сочетания. Очевидно, что мутации, которые будут выполнены в ДНК, кодирующей вариант белка, не должны помещать последовательность за пределы рамки считывания и предпочтительно не должны создавать комплементарные участки, которые могут вызывать формирование вторичной структуры мРНК. Примером варианта фактора XIII, полученного при помощи генетической инженерии, является вариант Val34Leu человеческого фактора XIII дикого типа (т.е. вариант, в котором остаток Val в положении 34 в аминокислотной последовательности человеческого фактора XIII дикого типа заменен на остаток лейцина).

Фактор XIII по данному изобретению может быть выделен из разнообразного биологического материала, включая лизаты, гомогенизаты или экстракты клеток, которые продуцируют фактор XIII естественным образом, но также из клеток, которые были генетически модифицированы для выработки фактора XIII, таких как дрожжи, трансформированные ДНК, кодирующей фактор XIII. Пример способа очистки фактора XIII описан в WO/2006/021584.

Фактор XIII по данному изобретению может, например, быть получен при помощи технологии рекомбинантных ДНК. Способы получения рекомбинантного фактора XIII известны в области техники. См., например, Davie et al., ЕР 268.772; Grundmann et al., AU-A-69896/87; Bishop et al., Biochemistry 1990, 29: 1861-1869; Board et al., Thromb. Haemost. 1990, 63: 235-240; Jagadeeswaran et al., Gene 1990, 86: 279-283; and Broker et al., FEBS Lett. 1989, 248: 105-110. В одном воплощении димер А₂ фактора XIII вырабатывается в цитоплазме дрожжей Saccharomyces cerevisiae, согласно описанию в заявке на патент США Ser. No. 07/741263. Клетки собирают и лизируют и получают просветленный лизат. Лизат фракционируют при помощи анионо-обменной хроматографии при значениях pH от нейтральных до слегка щелочных при помощи колонки с производными агарозы, такими как DEAE Fast-Flow Sepharose™ (Pharmacia) или им подобными. Затем фактор XIII осаждают из элюируемого с колонки материала путем концентрации элюата и доведения pH до 5,2-5,5, например, путем диафильтрации против буферного раствора сукцината аммония. Затем преципитат растворяют и выполняют дальнейшую очистку при помощи обычных хроматографических методов, таких как гель-фильтрация и хроматография гидрофобного взаимодействия.

В одном воплощении данного изобретения фактор XIII представляет собой рекомбинантный фактор XIII. В одном воплощении данного изобретения фактор XIII представляет собой человеческий фактор XIII. В одном воплощении данного изобретения фактор XIII представляет собой рекомбинантный человеческий фактор XIII. В одном воплощении данного изобретения фактор XIII представляет собой димер А субъединиц.

Концентрация фактора XIII в водных композициях, подлежащих лиофилизации или высушиванию распылением, может, например, варьировать в широком диапазоне, и в одном воплощении находится в диапазоне 0,003-100 мг/мл, в другом воплощении в диапазоне 1-30 мг/мл, и в следующем воплощении в диапазоне 2-15 мг/мл.

Соли

Водная композиция по изобретению содержит соль или смесь солей. Соль применяют для улучшения стабильности сухой композиции в отношении преактивации и в отношении общей степени чистоты. Разбавитель по изобретению может, например, содержать соль или смесь солей. В некоторых воплощениях соль представляет собой моновалентную соль. Примеры моновалентных солей, которые могут применяться, включают, например, хлорид натрия, хлорид калия, ацетат натрия, сульфат натрия, глюконат натрия и их смеси, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях соль представляет собой дивалентную соль. В некоторых воплощениях соль представляет собой дивалентную соль, с той оговоркой, что дивалентная соль не является солью Са (II).

Концентрация применяемой соли, например, NaCI, может, например, варьировать в определенном диапазоне и в одном воплощении находится в диапазоне 5-100 мМ, в следующих воплощениях в диапазонах 5-99 мМ, 7-95 мМ, 8-90 мМ, 10-80 мМ, 15-70 мМ, 25-75 мМ и 20-60 мМ, а в других воплощениях в диапазоне 25-50 мМ.

Углеводы и многоатомные спирты

В некоторых воплощениях данного изобретения водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением содержит один или несколько углеводов или многоатомных спиртов. Разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, может, например, содержать один или несколько углеводов или многоатомных спиртов. Углеводы или многоатомные спирты могут применяться для стабилизации белков в сухой композиции по изобретению во время сублимационной сушки для предотвращения физических/химических дестабилизирующих эффектов (например, разворачивания). Примеры углеводов или многоатомных спиртов, которые могут применяться, включают, например, сахарозу, маннит, трегалозу, лактозу, мальтозу, сорбит, раффинозу, декстрины, циклодекстрины и их производные, гомологи и смеси, но не ограничиваются ими.

Концентрация применяемого углевода или многоатомного спирта может, например, варьировать в широком диапазоне, и в одном воплощении находится в диапазоне 0,1-15% (в объемном отношении), в следующих воплощениях в диапазоне 0,1-8,5% (в объемном отношении), а в других воплощениях в диапазоне 0,5-5,0% (в объемном отношении).

Аминокислоты

В некоторых воплощениях данного изобретения водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, содержит одну или несколько аминокислот. В некоторых воплощениях данного изобретения разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, может содержать одну или несколько аминокислот. Аминокислоты могут, например, применяться для улучшения стабильности лиофилизированной или высушенной распылением композиции. В одном воплощении одну или несколько аминокислот применяют для уменьшения формирования агрегатов трангслутаминазы, например, FXIII, во время хранения композиции. Примеры аминокислот, которые могут применяться, включают глицин, гистидин, аргинин, глутаминовую кислоту, метионин, треонин, лизин, аланин, изолейцин и цистеин (Gly, His, Arg, Glu, Met, Thr, Lys, Ala, Ilе и Cys) и их соли, производные, гомологи, димеры, олигомеры и их смеси, но не ограничиваются ими.

Подходящие производные и гомологи хорошо известны. Подходящие производные включают: эфиры, тиоэфиры и амиды карбоксильной группы; ацилированные производные аминогруппы, включая производные уретана; а также простые эфиры, амиды и сложные эфиры боковых функциональных групп, но не ограничиваются ими. Походящие гомологи включают, например, орнитин (гомолог лизина), гомосерин и α-аминобутировую кислоту. Физиологически приемлемые соли также хорошо известны в области техники и описаны, например, Remington’s Pharmaceutical Science: Drug Receptors and Receptor Theory, (18 th ed.), Mack Publishing Co., Easton Pa. (1990).

Концентрации применяемых аминокислот могут, например, находиться в диапазоне 0,01-10% (в объемном отношении), или в диапазоне 0,1-3% (в объемном отношении).

Буферы

В некоторых воплощениях данного изобретения водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, и/или разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, содержит буфер. Буфер представляет собой раствор, содержащий вещество, способное предупреждать существенные изменения pH растворов, к которому добавлены кислоты или основания в малых количествах, что таким образом поддерживает в значительной степени исходную степень кислотности или основности раствора. Буфер, как правило, содержит слабую кислоту или слабое основание и их соль.

pH водных композиций может быть в диапазоне от 2 до 10, в частности, между 7 и 8. Для получения буферного эффекта могут применяться аминокислоты, описанные выше, или буферы, имеющие pH в диапазоне от 2 до 10. Примеры буферов, которые могут применяться, включают, например, ацетатные буферы, карбонатные буферы, цитратные буферы, глицилглициновые буферы, гистидиновые буферы, глициновые буферы, лизиновые буферы, аргининовые буферы, фосфатные буферы (содержащие, например, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат натрия или фосфат натрия), TRIS [трис(гидроксиметил)аминометановые] буферы, бициновые буферы, трициновые буферы, малатные буферы, сукцинатные буферы, малеатные буферы, фумарантые буферы, тартратные буферы, аспартатные буферы и их смеси, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях применяют цитратные буферы, гистидиновые буферы, натрий-фосфатные буферы, сукцинатные буферы и TRIS-буферы. В одном воплощении применяют гистидин.

Концентрации применяемых буферов могут, например, быть в диапазоне 0-50 мМ, или в диапазоне 0-25 мМ.

Другие соединения

Водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, и/или разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, могут также иметь в своем составе один или несколько других соединений. Такие дополнительные ингредиенты включают неионные сурфактанты, восстанавливающие агенты, хелатирующие агенты, антиоксиданты, консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы, наполнители, модифицирующие тоничость агенты (агенты для регулирования тоничности), жировые основы, белки (например, альбумин сыворотки человека, желатин или другие белки) и амфотерные вещества (например, бетаин, таурин или аминокислоту, такую как аргинин, глицин, лизин или гистидин), но не ограничиваются ими. Такие дополнительные ингредиенты конечно не должны неблагоприятно влиять на общую стабильность водной композиции или сухой композиции по данному изобретению. С учетом этого приводится ссылка: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.

Неионные сурфактанты

В некоторых воплощениях данного изобретения водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, и/или разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, содержит неионный сурфактант. Ионные сурфактанты представляют собой поверхностно-активные агенты, проявляющие свой эффект посредством защиты белков от контакта с критическими поверхностями (например, посредством их упаковки). Ионные сурфактанты могут, например, применяться для улучшения стабильности лиофилизированной или высушенной распылением композиции. Примеры неионных сурфактантов, которые могут применяться, включают, например, Твин 80, Твин 20, ПЭГ, ацетиловый спирт, PVP, PVA, ланолиновый спирт, сорбитан моноолеат, полоксамеры и алкилированные эфиры полиоксиэтилена, но не ограничиваются ими. В одном воплощении применяется Твин 20.

Концентрации применяемых неионных сурфактантов могут, например, быть в диапазоне 0,00001-5% (в объемном отношении), или в диапазоне 0,0002% и 0,1% (в объемном отношении).

Восстанавливающие агенты

В некоторых воплощениях данного изобретения водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, и/или разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, содержит восстанавливающий агент. Восстанавливающие агенты, такие как антиоксиданты, применяют для удаления свободных радикалов, которые могут дестабилизировать белки. Примеры восстанавливающих агентов, которые могут применяться, включают, например, цистеин, N-ацетил-цистеин, тиоглицерол, сульфид натрия, токоферолы и глутатион, но не ограничиваются ими.

Хелатирующие агенты

В некоторых воплощениях данного изобретения водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, и/или разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, содержит а хелатирующий агент. Хелатирующие агенты применяют для удаления из препарата металлов (железо, медь) и, как правило, это приводит к защите белков от реакций, катализируемых металлами. Примеры хелатирующих агентов, которые могут применяться, включают, например, соли ЭДТА, лимонную кислоту и аспарагиновую кислоту и их смеси, но не ограничиваются ими. В одном воплощении данного изобретения хелатирующий агент находится в концентрации от 0,1 мг/мл до 5 мг/мл. В одном воплощении данного изобретения хелатирующий агент находится в концентрации от 0,1 мг/мл до 2 мг/мл. В следующем воплощении данного изобретения хелатирующий агент находится в концентрации от 2 мг/мл до 5 мг/мл.

Антиоксиданты

В некоторых воплощениях данного изобретения водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, и/или разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, содержит антиоксидант. В одном воплощении водная композиция содержит метионин (или другую серосодержащую аминокислоту или аналог аминокислоты) для ингибирования окисления остатков метионина в форму их сульфоксида, в случаях когда трансглутаминаза, например, FXIII, представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере один остаток метионина, подверженный такому окислению. Термин "ингибировать окисление" употребляется для обозначения уменьшения накопления окисленных форм (метионина) с течением времени. Ингибирование окисления метионина приводит к лучшему сохранению полипептида в надлежащей молекулярной форме. Может применяться любой стереоизомер метионина (например, L, D или изомер DL) или их сочетания. Добавляемое количество должно быть количеством, достаточным для ингибирования окисления остатков метионина, так чтобы количество метионина в форме сульфоксида было приемлемым, согласно требованиям регулятивных органов. Как правило, это означает, что композиция содержит не более чем приблизительно от 10% до приблизительно 30% метионина в форме сульфоксида. В общем, этого можно добиться путем добавления метионина так, чтобы молярное соотношение добавленного метионина к остаткам метионина варьировало от приблизительно 1:1 до приблизительно 1000:1, например, от 10:1 до приблизительно 100:1.

Консерванты

В некоторых воплощениях данного изобретения водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, и/или разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, содержит консервант. Согласно нормативным требованиям, консерванты можно добавлять в контейнеры для многократного дозирования. Консерванты применяют в качестве противомикробных агентов для защиты от микробной контаминации во время многократного забора из флаконов при дозировании. Примеры консервантов, которые могут применяться, включают, например, фенол, о-крезол, m-крезол, р-крезол, хлоркрезол, метил р-гидроксибензоат, этил р-гидроксибензоат, пропил р-гидроксибензоат, бутил р-гидроксибензоат, 2-феноксиэтанол, 2-фенилэтанол, бензиловый спирт, хлоробутанол, тимеросал, бронопол, бензойную кислоту, имидомочевину, хлорогексидин, дегидроацетат натрия, бензетоний хлорид, хлорфенезин (3р-хлорфеноксипропан-1,2-диол) и их смеси, но не ограничиваются ими. Консервант может, например, находиться в концентрации от 0,1 мг/мл до 20 мг/мл. В одном воплощении данного изобретения консервант находится в концентрации от 0,1 мг/мл до 5 мг/мл. В следующем воплощении данного изобретения консервант находится в концентрации от 5 мг/мл до 10 мг/мл. В следующем воплощении данного изобретения консервант находится в концентрации от 10 мг/мл до 20 мг/мл.

Специалист сможет применить описанные ниже способы для анализа эффектов одного или нескольких компонентов, добавленных в сухую композицию или водную композицию по изобретению, на стабильность, преактивацию и степень чистоты в ходе обычных экспериментов.

Сухая композиция - порошок

После лиофилизации или высушивания распылением композиция по изобретению окажется в сухой форме. Сухая композиция по изобретению может, например, быть твердым, порошкообразным или гранулированным материалом. В одном воплощении сухая композиция по изобретению представляет собой порошок. Уровень остаточной влаги в этой сухой композиции имеет важное значение для стабильности сухой трансглутаминазы, например, FXIII, во время хранения. В одном воплощении изобретения сухая композиция содержит менее 3% остаточной влаги. В следующем воплощении сухая композиция содержит менее 1% остаточной влаги.

Способы высушивания и растворение

Лиофилизация и высушивание распылением водной композиции по данному изобретению может выполняться при помощи способов лиофилизации и высушивания распылением, хорошо известных специалистам: в отношении лиофилизации см., например, Williams and Polli (1984), J.Parenteral Sci. Technol. 38:48-59; в отношении высушивания распылением, см., например, Masters in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essex, U.K., 1991), pp.491-676; Broadhead etal. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; и Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20. Могут применяться также другие методы высушивания, такие как воздушная сушка, см. Carpenter and Crowe (1988), Cryobiology 25:459-470; и Roser(1991) Biopharm. 4:47-53.

В отношении данного изобретения, когда делается ссылка на лиофилизацию и высушивание распылением, также предполагается, что могут быть использованы и другие способы высушивания. Например, выражение "водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением", в отношении данного изобретения также подразумевает "водную композицию, подлежащую высушиванию при помощи других способов высушивания".

В одном воплощении сухую композицию по данному изобретению получают посредством лиофилизации. Процесс лиофилизации обычно включает следующие этапы: этап замораживания, этап первичной сушки и этап вторичной сушки. На этапе замораживания водную композицию охлаждают. Температуру и длительность этапа замораживания выбирают таким образом, чтобы все компоненты композиции были полностью заморожены. Например, подходящая температура замораживания составляет приблизительно -40°С. На этапе первичной сушки лед, образовавшийся во время замораживания удаляют посредством сублимации под вакуумом при температурах ниже окружающей. Например, давление в камере, применяющееся для сублимации, может, например, составлять приблизительно от 40 миллиторр до 400 миллиторр, а температура может, например, составлять от -30°С до -5°С. После первичной сушки любое остаточное количество жидкости, которое не было удалено посредством сублимации, удаляется в ходе вторичной сушки, т.е. десорбции. Температура во время вторичной сушки приблизительно равна или выше температуры окружающей среды.

В одном воплощении изобретения в этап замораживания во время лиофилизации вводят отжиг (этап нагревания). Это нагревание выполняют до температур ниже точки замерзания препарата. Такой отжиг (этап нагревания) может способствовать дальнейшей стабилизации сухой композиции по изобретению.

Растворение (восстановление)

На желаемом этапе, например, когда пациенту требуется ввести трансглутаминазу, например FXIII, сухую композицию по изобретению можно растворить разбавителем. Растворение обычно происходит при температуре около 25°С для обеспечения полной гидратации, хотя по желанию могут применяться и другие температуры. Время, требующееся для растворения, будет зависеть, например, от типа разбавителя и количества трансглутаминазы и других компонентов.

В одном воплощении изобретения разбавителем является дистиллированная вода. Применение дистиллированной воды может оказаться, например, преимуществом, поскольку не требуется производство отдельного специализированного разбавителя.

В одном воплощении изобретения разбавителем является этанол.

В одном воплощении изобретения разбавитель может, например, содержать один или несколько таких компонентов, как соли, углеводы, аминокислоты, буферы, неионные сурфактанты, восстанавливающие агенты, хелатирующие агенты, антиоксиданты, консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы, наполнители, агенты для регулирования тоничности, жировые основы, белки (например, альбумин сыворотки человека, желатин или другие белки) и амфотерные вещества. Выбор компонентов для включения в состав разбавителя и количество этих компонентов определяется желаемым эффектом, который требуется достигнуть при помощи этих компонентов. Примеры разбавителей включают бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), забуференный раствор, поддерживающий pH (например, фосфатно-солевой буфер), стерильный физиологический раствор и раствор декстрозы, но не ограничиваются ими.

Концентрация белка в восстановленном растворе составляет по меньшей мере 5 мг/мл, например приблизительно от 10 мг/мл до приблизительно 400 мг/мл, приблизительно от 20 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл или приблизительно от 30 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. Считается, что высокие концентрации белка в восстановленном растворе могут быть особенно нужны в тех случаях, когда предполагается подкожное введение восстановленного раствора. Однако, для других способов введения, таких как внутривенное введение, могут требоваться более низкие концентрации белка в восстановленном растворе (например, приблизительно 5-50 мг/мл или приблизительно 10-40 мг/мл белка в восстановленном растворе). В определенных воплощениях концентрация белка в восстановленном растворе существенно выше, чем концентрация в препарате перед высушиванием. Например, концентрация белка в восстановленном растворе может быть приблизительно в 2-40 раз, в 3-10 раз и/или в 3-6 раз (например, по меньшей мере в три раза или по меньшей мере в четыре раза) выше, чем в водной композиции перед высушиванием.

В одном воплощении данного изобретения сухая композиция трансглутаминазы, например, содержащая фактор XIII, является стабильной в течение более чем 3 лет хранения, а восстановленный раствор стабилен в течение более 6 недель применения. В одном воплощении данного изобретения сухая композиция трансглутаминазы, например, содержащая фактор XIII, является стабильной в течение более чем 2 лет хранения, а восстановленный раствор стабилен в течение более 4 недель применения. В одном воплощении данного изобретения сухая композиция трансглутаминазы, например, содержащая фактор XIII, является стабильной в течение более чем 1 года хранения, а восстановленный раствор стабилен в течение более 2 недель применения. В одном воплощении данного изобретения, не более чем 1% восстановленной композиции фактора XIII, представляет собой активированный непротеолитическим путем фактор XIII. В одном воплощении данного изобретения, не более чем 0,5% восстановленной композиции фактора XIII, представляет собой активированный непротеолитическим путем фактор XIII.

Приводимые в качестве примера варианты

В таблицах 1 и 2 указан перечень приводимых в качестве примеров вариантов изобретения, не являющийся исчерпывающим.

Таблица 1
Перечень приводимых в качестве примеров вариантов, не являющийся исчерпывающим
	Композиция	Концентрация заполняющего раствора (мМ)	Твердые вещества в заполняющем растворе (мг/мл)	Осмоляльность восстановленного раствора (мМ)
5 мл заполняющего раствора; растворение в 2,5 мл
Белок	2,5	0	2,5	0
Сахароза	26 мг/мл	75	26	150
Гистидин	20 мМ	20	3,1	40
NaCl	25 мМ	25	1,45	100
Полисорбат 20	0,01%	0	0	0
			33,05	290
6 мл заполняющего раствора; растворение в 3 мл
Белок	2,5	0	2,5	0
Сахароза	26 мг/мл	75	26	150
Гистидин	20 мМ	20	3,1	40
NaCl	25 мМ	25	1,45	100
Полисорбат 20	0,01%	0	0	0
			33,05	290
3 мл
заполняющего
раствора;
растворение
в 3 мл
Белок	5,0 мг/мл	0	5	0
Сахароза	55 мг/мл	160	55	160
Гистидин	20 мМ	20	3,1	20
NaCl	50 мМ	50	2,9	100
Полисорбат 20	0,01%	0	0	0
			66	280
3 мл
заполняющего
раствора;
растворение
в 3 мл
Белок	5,0 мг/мл	0	5	0
Сахароза	72 мг/мл	210	72	210
Гистидин	20 мМ	20	3,1	20
NaCl	25 мМ	25	1,45	50
Полисорбат 20	0,01%	0	0	0
			81,55	280
3 мл
заполняющего
раствора;
растворение
в 3 мл
Белок	5,0 мг/мл	0	5	0
Сахароза	48 мг/мл	140	48	140
Гистидин	40 мМ	40	6,2	40
NaCl	50 мМ	50	2,9	100
Полисорбат 20	0,01%	0	0	0
			62,1	280
4 мл
заполняющего
раствора;
растворение в 2 мл
Белок	5,0 мг/мл	0	5	0
Сахароза	26 мг/мл	76	26	152
Гистидин	20 мМ	20	3,1	40
NaCl	25 мМ	25	1,45	100
Полисорбат 20	0,01%	0	0	0
			35,55	292
2 мл
заполняющего
раствора;
растворение
в 3 мл
Белок	7,5	0	7,5	0
Сахароза	85 мг/мл	250	57	166
Гистидин	20 мМ	20	3,1	13
NaCI	50 мМ	50	2,9	33
Полисорбат 20	0,01%	0	0	0
			70,5	212

Таблица 2
Приводимый в качестве примера вариант, не являющийся исчерпывающим
Ампула 12 мл, заполненная 3 мл заполняющего раствора, лиофилизированная и затем растворенная в 3 мл воды
Заполняющий раствор	Ампула с лиофилизатом (порошок)	Ампула после растворения
5 мг/мл rFXIII	15 мг	5 мг/мл
55 мг/мл сахарозы	165 мг	55 мг/мл
20 мМ гистидина	9,3 мг	20 мМ
0,01% Полисорбат 20	0,3 мг	0,01%
50 мМ NaCl	8,7 мг	50 мМ
pH=8	-	pH=8

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ

В данном изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая трансглутаминазу, например, фактор XIII. Эта фармацевтическая композиция содержит либо восстановленный раствор, либо сухую композицию по данному изобретению.

В одном воплощении фармацевтическая композиция представляет собой сухую композицию (например, лиофилизированную или высушенную распылением композицию), предназначенную для растворения врачом или пациентом перед применением посредством добавления разбавителя.

Фармацевтические композиции по данному изобретению, содержащие трансглутаминазу, например, фактор XIII, могут быть введены пациенту, нуждающемуся в таком лечении, различными путями, например, местно (например, посредством аппликаций на кожу или на слизистую оболочку), путями, при которых отсутствует абсорбция (например, введением в артерию, в вену или в сердце) и путями, при которых абсорбция существует (например, введением внутрикожно, подкожно, внутримышечно или в брюшную полость).

Введение фармацевтических композиций согласно данному изобретению может осуществляться пациентам, нуждающемся в них, может осуществляться через несколько путей введения, например, лингвальный, сублингвальный, буккальный, оральный, в желудок или кишечник, назальный, пульмональный (например, через бронхиолы и альвеолы или и то и другое), эпидермальный, дермальный, трансдермальный, вагинальный, ректальный, окулярный (например, через конъюнктиву), уретральный или парентеральный.

Фармацевтические композиции по данному изобретению могут вводиться в виде различных форм дозирования, например, в виде растворов, суспензий, эмульсий, микроэмульсий, множественных эмульсий, пен, бальзамов, паст, пластырей, мазей, таблеток, таблеток с оболочкой, средств для полоскания, капсул (например, твердых желатиновых капсул или мягких желатиновых капсул), суппозиториев, ректальных капсул, капель, гелей, спреев, порошков, аэрозолей, ингаляторов, глазных капель, офтальмологических мазей, жидкостей для промывания глаз, вагинальных суппозиториев, вагинальных колец, вагинальных мазей, растворов для инъекций, трансформируемых in situ растворов (например, желатинизируемых in situ, затвердевающих in situ, преципитирующих in situ или кристаллизующихся in situ), растворов для инфузий или в виде имплантов.

Фармацевтические композиции по данному изобретению могут также быть соединены или связаны или конъюгированы (например, посредством ковалентного, гидрофобного или электростатического взаимодействий) с носителем лекарственного препарата, системой доставки лекарственного препарата или усовершенствованной системой доставки лекарственного препарата для дальнейшего повышения стабильности трансглутаминазы, например, фактора XIII, повышения биодоступности, повышения растворимости, уменьшения нежелательных эффектов, достижения эффекта хронотерапии, хорошо известной специалистам, и/или повышения комплаентности пациентов. Примеры носителей, систем доставки лекарственных препаратов и усовершенствованных систем доставки лекарственных препаратов включают полимеры, например, целлюлозу и ее производные, другие полисахариды (например, декстран и его производные, крахмал и его производные), поливиниловый спирт), полимеры акрилата и метакрилата, полимолочную кислоту и полигликолевую кислоту и их блок-сополимеры, полиэтиленгликоли, белки носители (например, альбумин), гели (например, термогелевые системы, такие как блок-сополимеры, хорошо известные специалистам), мицеллы, липосомы, микросферы, наночастицы, жидкие кристаллы и их дисперсии, фазы L2 и их дисперсии, хорошо известные специалистам, знающим свойства фазы в системах липиды-вода, полимерные мицеллы, множественные эмульсии (само-эмульгирующиеся и само-микроэмульгирующиеся), циклодекстрины и их производные, а также дендримеры, но не ограничиваются ими.

Фармацевтические композиции по данному изобретению подходят для применения при изготовлении твердых веществ, полутвердых веществ, порошков и растворов для введения в легкие, с применением, например, дозирующего ингалятора, порошкового ингалятора или небулайзера, все из которых являются приспособлениями, хорошо известными специалистам.

Фармацевтические композиции по данному изобретению подходят для применения при изготовлении систем доставки лекарств с контролируемым, длительным, продленным, замедленным или медленным высвобождением. Фармацевтические композиции по данному изобретению, например, могут применяться в изготовлении систем для парентерального введения с контролируемым и длительным высвобождением (обе системы позволяют добиться многократного снижения количества введений), хорошо известных специалистам, таких как системы с контролируемым и длительным высвобождением для подкожного введения. Примерами систем с контролируемым высвобождением и композиций, которые могут применяться, не ограничивая рамки данного изобретения, являются гидрогели, масляные гели, жидкие кристаллы, полимерные мицеллы, микросферы, наночастицы. Способы получения систем с контролируемым высвобождением, пригодные для фармацевтических композиций по данному изобретению, включают кристаллизацию, конденсацию, ко-кристаллизацию, преципитацию, ко-преципитацию, эмульсификацию, дисперсию, гомогенизацию высокого давления, инкапсуляцию, распылительную сушку, микроинкапсуляцию, коацервацию, фазовое расслоение, испарение растворителя для получения микросфер, экструзию и процессы с применением сверхкритических флюидов, но не ограничиваются ими. Приводится общая ссылка на Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000) и Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000).

Парентеральное введение может осуществляться посредством подкожной, внутримышечной, интраперитонеальной или внутривенной инъекции посредством шприца, например, приспособления типа шприца-ручки. В альтернативном случае, парентеральное введение, например, может осуществляться посредством инфузионного насоса. Следующим вариантом введения фармацевтической композиции по данному изобретению в форме раствора или суспензии является введение в форме назального или пульмонального спрея. Как еще один вариант, фармацевтические композиции по данному изобретению могут быть адаптированы для транс-дермального введения, например, посредством безыгольной инъекции, посредством наложения электрода (такого как ионофоретического электрода) или посредством чресслизистого (например, буккального) введения.

Термин "лечение" в его различных грамматических формах в отношении данного изобретения означает излечение, обратное развитие, ослабление, облегчение, улучшение, ингибирование, сокращение, подавление или прекращение (1) разрушительного действия заболевания, (2) прогрессирования заболевания или (3) действия этиологических факторов заболевания.

В контексте данного изобретения "эффективное количество" фармацевтической композиции определяется как количество фармацевтической композиции, например, фактора XIII, которого достаточно для предотвращения, излечения, обратного развития, ослабления, облегчения, улучшения, ингибирования, сокращения, подавления или прекращения (1) разрушительного действия заболевания, (2) прогрессирования заболевания или (3) действия этиологических факторов заболевания, в отдельности или в комбинации с введением других терапевтических агентов.

Было показано, что фактор XIII может применяться в лечении или предупреждении эпизодов кровоточивости у пациентов, имеющих врожденный дефицит фактора XIII, а также у пациентов, не имеющих врожденного дефицита фактора XIII, см., например, US 5.1 14.916, US 5.607.917, WO 2002038167, WO 2002036155, WO 200267981 и WO 200267980.

В данном изобретении предложен способ лечения или предупреждения эпизодов кровоточивости, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции по данному изобретению, содержащей FXIII, нуждающемуся в этом субъекту. Следующее воплощение данного изобретения касается способа сокращения времени свертывания у субъекта, включающего введение фармацевтической композиции по данному изобретению нуждающемуся в этом субъекту. Следующее воплощение данного изобретения касается способа увеличения времени лизиса тромба в плазме млекопитающих, включающего введение фармацевтической композиции по данному изобретению нуждающемуся в этом субъекту. Следующее воплощение данного изобретения касается способа повышения прочности тромба в плазме млекопитающих, включающего введение эффективного количества фармацевтической композиции по данному изобретению нуждающемуся в этом субъекту. Следующее воплощение данного изобретения касается способа усиления формирования фибринового тромба в плазме млекопитающих, включающего введение эффективного количества фармацевтической композиции по данному изобретению нуждающемуся в этом субъекту. Следующее воплощение данного изобретения касается способа предупреждения внутрижелудочковых кровоизлияний у недоношенных новорожденных, включающего введение эффективного количества фармацевтической композиции по данному изобретению нуждающемуся в этом субъекту. Следующее воплощение данного изобретения касается способа снижения операционной кровопотери у субъектов во время или после операции, включающего введение эффективного количества фармацевтической композиции по данному изобретению нуждающемуся в этом субъекту. Следующее воплощение данного изобретения касается способа лечения гемофилии А, включающего введение эффективного количества фармацевтической композиции по данному изобретению нуждающемуся в этом субъекту. Следующее воплощение данного изобретения касается способа лечения гемофилии В, включающего введение эффективного количества фармацевтической композиции по данному изобретению нуждающемуся в этом субъекту. Следующее воплощение данного изобретения касается способа лечения тромбоцитарных нарушений, включающего введение эффективного количества фармацевтической композиции по данному изобретению нуждающемуся в этом субъекту. Следующее воплощение данного изобретения касается способа лечения болезни Виллебранда, включающего введение эффективного количества фармацевтической композиции по данному изобретению нуждающемуся в этом субъекту.

Фармацевтическая композиция по данному изобретению, содержащая FXIII, может также найти применение при системном или локальном применении для лечения заболеваний, включающих заживление костей или ран, язвенного колита, склеродермии, пурпуры Шенлейна-Геноха, субарахноидальных кровоизлияний, внутрижелудочковых кровоизлияний, и кровотечений неясного генеза.

В следующем воплощении этих способов фармацевтическую композицию по данному изобретению, например, содержащую фактор XIII, вводят в комбинации с эффективным количеством фактора VIIa, согласно описанию в WO 200185198.

В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция по данному изобретению является единственным агентом, который вводят субъекту, которому предписано лечение.

В одном воплощении субъектом, которому проводят лечение, является человек; в одном воплощении субъект имеет нарушенное образование тромбина; в одном воплощении субъект имеет сниженную концентрацию фибриногена в плазме (например, в случае множественных трансфузий).

Данное изобретение, описанное в общих чертах, будет более понятно при рассмотрении следующих примеров, которые приводятся в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения данного изобретения.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

При создании композиций по данному изобретению были исследованы различные композиции, а также их эффекты на последующую стабильность композиций во время хранения.

Пример 1. Лиофилизация и растворение фактора XIII

Эксперименты с сублимационной сушкой проводили на коммерчески доступных лиофилизаторах. Растворы рекомбинантного фактора XIII, полученного путем экспрессии в клетках дрожжей, вместе с дополнительными компонентами высушивали в соответствии с подходящей программой сублимационной сушки. Затем лиофилизаты растворяли при помощи дистиллированной воды.

Пример 2: Стабильность сухих композиций фактора XIII

Ряд сухих композиций rFXIII приготовили посредством лиофилизации, согласно Примеру 1, и затем провели исследование их стабильности, при котором степень чистоты измеряли посредством анионообменной ВЭЖХ (AIE-HPLC), а наличие агрегатов оценивали посредством эксклюзионной ВЭЖХ (SEC-HPLC). В этом тесте исследовали три концентрации NaCl, добавленного в водный заполняющий раствор: 0 мМ, 12,5 мМ и 25 мМ NaCl, и четыре концентрации сахарозы, что представлено в Таблицах 3 и 4.

Таблица 3
Композиции, исследованные в присутствии и в отсутствие NaCl
		Исследованные композиции
	DP заполняющего раствора для обозначения CD	состав 1	состав 2	состав 3	состав 4
rFXIII, мг/мл	2,5	5,0	5,0	5,0	5,0
Сахароза, мг/мл	42,5	80	40	20	0
Гистидин, мМ	20	20	20	20	20
Полисорбат 20	0,01%	0,01%	0,01%	0,01%	0,01%
Соотношение	17	16	8	4	0
сахароза - белок

Таблица 4
Содержание сахарозы и NaCl
Обозначение эксперимента	Сахароза	NaCl
N1	0	0
N2	20	0
N3	40	0
N4	80	0
N5	0	25
N6	20	25
N7	40	25
N8	80	25
N9	0	12,5
N10	0	12,5
N11	0	12,5
N12	0	12,5

Таблица 5
Таблица результатов
№	AIE	AIE	SEC	SEC	SEC	AIE	SEC	SEC
	чистота	чистота	% агр	% агр	% агр	чистота	% агр	% агр
	0	1М40	0	М40	М40	2М40	3М40	3М25
N1	3,87	3,95	0,2	0,6	0,9	61	1	0,5
N2	74,75	65,87	0,05	0,1	0,1	61	0,1	0,1
N3	74,48	66,47	0,05	0,1	0,1	64,4	0,1	0,1
N4	74,75	69,74	0,1	0,1	0,1	66,2	0,1	0,1
N5	73,39	71,67	4,1	1,6	1,8	66,9	2,3	1,9
N6	75,11	72,42	0,1	0,1	0,1	68,5	0,1	0,1
N7	75,13	72,32	0,1	0,1	0,1	68,9	0,1	0,1
N8	74,05	72,61	0,1	0,1	0,1	69,5	0,1	0,1
N9	72,63	69,14	1,8	1,3	1,5	65,8	1,6	1,2
N10	72,33	69,57	1,7	1,4	1,4	66,6	1,5	1,2
N11	72,79	69,71	1,7	1,2	1,5	65,7	1,7	1,2
N12	72,74	69,05	1,7	1,4	1,5	66,8	1,3	1,2

Результаты, представленные в Таблице 5 и на Фиг.1, показывают, что существует статистически значимое взаимоотношение между NaCl и определяемой при помощи анионообменной ВЭЖХ (AIE-HPLC) степенью чистоты, образцов, хранившихся при 40°С. Эффект не распространяется на исходную чистоту образцов. Следовательно, делается вывод, что NaCl оказывает специфичное воздействие в сухом состоянии, т.е. на сухую композицию, таким образом, существенно улучшая стабильность при хранении сухих композиций rFXIII.

Пример 3: Полный факторный анализ

Целью исследования было проведение предварительного скрининга лиофилизированных препаратов rFXIII для изучения эффектов гистидина и хлорида натрия на формирование rFXIIIa° при лиофилизации. Для оценки концентрации гистидина в диапазоне 20-60 мМ и концентрации NaCl в диапазоне 0-50 мМ в сухих композициях rFXIII использовали полную факторную модель эксперимента.

Таблица 6
Экспериментальные Факторы
№	NaCl	Гистидин
N1	0	20
N2	25	20
N3	50	20
N4	0	40
N5	25	40
N6	50	40
N7	0	60
N8	25	60
N9	50	60
N10	25	40
N11	25	40
N12	25	40

Таблица 7
Таблица результатов
№	% акт исх	% акт 2М25	AIE чистота 2М25	SEC 2М25	% акт 1М40	% акт 4М25
N1	0,4	1,1	67,4	0,1	2,6	1,8
N2	0,4	0,7	70,3	0,1	1,6	1,2
N3	0,4	0,7	71	0,1	1,5	1,1
N4	0,4	1,1	67,8	0,1	2,3	2
N5	0,5	0,8	70,3	0,2	1,8	1,2
N6	0,4	0,7	71	0,2	1,3	1
N7	0,4	1,2	68,4	0,1	2,3	2
N8	0,4	0,9	70,3	0,2	1,6	1,3
N9	0,5	0,8	70,8	0,2	1,3	1
N10	0,6	0,9	70,5	0,1	1,7	1,2
N11	0,4	1	70,2	0,1	1,7	1,3
N12	0,4	0,8	70,2	0,5	1,5	1,1
№	AIE чистота 4М25	SEC 4М25	% акт 6М25	SEC 6М25	AIE чистота 6М25	AIE чистота исх
N1	65,1	0,1	2,2	0,1	63,5	72,1
N2	69,2	0,1	1,4	0,1	68	72,4
N3	70,2	0,1	1,1	0,1	69,5	72,3
N4	66	0,1	2,2	0,1	64,6	71,8
N5	69	0,2	1,4	0,2	68,3	72,1
N6	70	0,2	1,1			72,2
N7	67,1	0,1	2	0,1	65,3	71,9
N8	69,8	0,2	1,5	0,2	68,6	72,2
N9	70	0,2	1,3	0,2	69,6	72,3
N10	69,5	0,1	1,3	0,1	68,9	72,3
N11	69,6	0,1	1,4	0,1	69	72,3
N12	69,2	0,1	1,4	0,1	68,9	72,3

Результаты, представленные в Таблице 7 и на Фиг. 2 и 3, демонстрируют, что добавление NaCl оказывает существенный стабилизирующий эффект на степень чистоты и на формирование rFXIIIa⁰ в образцах, хранившихся при 40°С и 25°С в течение 1 и 2 месяцев, соответственно. Добавление NaCl не оказывает существенного эффекта на образцы в исходной точке времени. Уровни NaCl и гистидина, исследованные здесь, не оказывают значимого эффекта на уровень агрегатов, оцениваемый посредством эксклюзионной ВЭЖХ (SE-HPLC), по истечении 2 месяцев при 25°С. Данное исследование показывает, что добавление NaCl в сухую композицию rFXIII существенно улучшает стабильность композиции в процессе хранения, применительно к % чистоты и % rFXIIIa⁰.

Пример 4: Исследование растворения

Данный эксперимент был проведен для проверки специфичности стабилизирующего эффекта NaCl в отношении сухого состояния, т.е. сухой композиции. В этом эксперименте содержимое ампулы с лиофилизированной композицией rFXIII растворяли в воде, и затем разделяли на две равные части, к одной из которых добавляли NaCl. Затем растворы хранили при комнатной температуре в течение 24 часов и анализировали содержание rFXIIIa°. Исследовали три концентрации NaCl. Дизайн эксперимента представлен в Таблице 8.

Таблица 8
Дизайн эксперимента: эффект NaCl на формирование rFXIIIa° в растворе
12 мл ампула, содержащая порошок препарата rFXIII
Ампула #1. Растворение в 2,5 мл воды	Ампула #2. Растворение в 2,5 мл воды	Ампула #3. Растворение в 2,5 мл воды
ОмМ NaCl	25 мМ NaCl	ОмМ NaCl	50 мМ NaCl	ОмМ NaCl	75 мМ NaCl
Хранение раствора при комнатной температуре в течение 24 ч, затем проведение анализа	Хранение раствора при комнатной температуре в течение 24 ч, затем проведение анализа	Хранение раствора при комнатной температуре в течение 24 ч, затем проведение анализа

Таблица 9
Эффективность NaCl по результатам исследования растворения
Образец	Концентрация NaCl (мМ)	Общий rFXIII (IU/мл)	rFXIIIa (IU/мл)	% rFXIIIa (анализ через 24 ч после растворения)
1а	0	957	5,0	0,5
1б	25	854	5,6	0,7
2а	0	889	4,4	0,5

2б	50	887	5,1	0,6
3а	0	990	4,1	0,4
3б	75	837	5,7	0,7

Результаты, представленные в Таблице 9, показывают, что в образцах, содержащих NaCl, уровень rFXIIIa° через 24 ч немного выше, чем в соответствующих растворах для сравнения, не имеющих NaCl. Эти результаты показывают, что в диапазоне концентраций 25-75 мМ NaCl в водной композиции не имеет стабилизирующего эффекта применительно к формированию rFXIIIa°. Следует вывод, что стабилизирующий эффект NaCl в лиофилизированной композиции rFXIII, продемонстрированный данными приведенных выше Примеров, является специфичным в отношении сухого состояния (сухой композиции). Этот эффект является неожиданным и до сих пор неизвестным.

ТЕСТЫ

Тест (I): Способ измерения FXIIIa°

Для изучения эффектов лиофилизации на количество FXIIIa°, очищенный рекомбинантный фактор XIII можно исследовать в тестах с определением ферментативной активности FXIII, в которых активность FXIIIa0 измеряется путем сравнения активности аликвоты образца без предварительной активации тромбином, с активностью другой аликвоты того же образца с добавлением тромбина. % FXIIIa° рассчитывают как 100*[активность образца без тромбина]/[активность образца с тромбином].

Тест (II): Способ измерения чистоты FXIII

Для изучения эффектов лиофилизации на степень чистоты FXIII, очищенный рекомбинантный фактор FXIII можно исследовать посредством анионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии (AIE-HPLC).

Тест (III): Способы измерения активности FXIII

Способы измерения активности FXIII, обеспечивающей образование поперечных связей, хорошо известны. Активность FXIII можно измерить при помощи коммерчески доступных наборов, таких как Berichrom FXIIIR.

Тест (IV): Способ измерения содержания влаги

Для изучения содержания влаги в сухой трансглутаминазе, например, композиции FXIII, может применяться титрование по методу Карла Фишера.

Предпочтительные признаки изобретения:

1. Сухая композиция трансглутаминазы, которая может быть получена посредством лиофилизации или высушивания распылением водной композиции, содержащей трансглутаминазу, соль и по меньшей мере один из следующих компонентов, выбранных из группы, состоящей из углевода, аминокислоты и буфера, причем концентрация соли в водной композиции находится в диапазоне от 5 до 100 мМ.

2. Композиция по п.1, в которой трансглутаминаза представляет собой соединение фактора XIII.

3. Композиция по п.2, в которой соединение фактора XIII представляет собой человеческий фактор XIII.

4. Композиция по любому из п.п.2-3, в которой соединение фактора XIII представляет собой рекомбинантный фактор XIII.

5. Композиция по любому из п.п.2-4, в которой соединение фактора XIII представляет собой димер субъединиц А.

6. Композиция по п.2, в которой соединение фактора XIII выбрано из группы, состоящей из фактора XIII и его биологически активных фрагментов, производных и вариантов, сохраняющих по меньшей мере часть характерной активности фактора XIII дикого типа, обеспечивающей образование поперечных связей.

7. Композиция по любому из пп.1-6, в которой концентрация указанного соединения фактора XIII находится в диапазоне от 1 до приблизительно 100 мг/мл.

8. Композиция по любому из пп.1-7, в которой соль является моновалентной солью.

9. Композиция по п.8, в которой моновалентная соль является хлоридом натрия.

10. Композиция по любому из пп.1-9, в которой концентрация указанной соли в водной композиции находится в диапазоне от 10 до 75 мМ.

11. Композиция по п.10, в которой концентрация указанной соли в водной композиции находится в диапазоне от 20 до 60 мМ.

12. Композиция по любому из пп.1-11, отличающаяся тем, что водная композиция содержит углевод, и указанный углевод представляет собой углевод или многоатомный спирт, выбранный из группы сахарозы, маннита, трегалозы, лактозы, мальтозы, сорбита, раффинозы, декстрина, циклодекстрина и их производных, гомологов и их смесей.

13. Композиция по п.12, в которой концентрация указанного углевода и многоатомного спирта находится между 0,1% и 8,5% (в объемном отношении).

14. Композиция по любому из пп.1-13, отличающаяся тем, что водная композиция содержит аминокислоту, и указанная аминокислота выбрана из группы глицина, гистидина и аргинина.

15. Композиция по любому из пп.1-14, отличающаяся тем, что водная композиция содержит буфер, и указанный буфер выбран из группы цитрата, гистидина, фосфата натрия, сукцината и TRIS.

16. Композиция по любому из пп.1-15, отличающаяся тем, что водная композиция также содержит один или несколько из следующих компонентов, выбранных из группы, состоящей из неионного сурфактанта, восстанавливающего агента, хелатирующего агента, антиоксиданта, консерванта, смачивающего агента, эмульгатора, наполнителя, модифицирующего тоничость агента и амфотерного вещества.

17. Композиция по любому из пп.1-16, отличающаяся тем, что композиция находится в форме порошка.

18. Композиция по любому из пп.1-17, отличающаяся тем, что сухая композиция содержит менее 3% влаги.

19. Композиция по п.18, отличающаяся тем, что сухая композиция содержит менее 1% влаги.

20. Способ получения сухой композиции по любому из пп.1-19 посредством высушивания водной композиции, содержащей трансглутаминазу, соль и по меньшей мере один из следующих компонентов, выбранных из группы, состоящей из углевода, аминокислоты и буфера, причем концентрация соли в водной композиции находится в диапазоне от 5 до 100 мМ.

21. Способ по п.20, в котором высушивание водной композиции выполняется посредством лиофилизации или высушивания распылением.

22. Способ по любому из пп.20-21, отличающийся тем, что способ применяют для получения композиции фактора XIII, которая после растворения содержит не более 1% активированного непротеолитическим путем фактора XIII.

23. Восстановленный раствор, содержащий трансглутаминазу, отличающийся тем, что указанный раствор получают посредством растворения сухой композиции по любому из пп.1-19 разбавителем.

24. Раствор по п.23, в которой разбавителем является дистиллированная вода.

25. Раствор по п.23, в котором указанный разбавитель представляет собой разбавитель, содержащий один или несколько из следующих компонентов, выбранных из группы, состоящей из соли, углевода, аминокислоты, буфера, неионного сурфактанта, восстанавливающего агента, хелатирующего агента, антиоксиданта, консерванта, смачивающего агента, эмульгатора, наполнителя, модифицирующего тоничость агента, жировой основы, белка и амфотерного вещества.

26. Раствор по любому из пп.23-25, в котором трансглутаминаза представляет собой соединение фактора XIII.

27. Раствор по п.26, в котором не более 1% указанного соединения фактора XIII представляет собой активированный непротеолитическим путем фактор XIII.

28. Раствор по п.27, в котором не более 0,5% указанного соединения фактора XIII представляет собой активированный непротеолитическим путем фактор XIII.

29. Фармацевтическая композиция, содержащая раствор по любому из пп.23-28 или сухую композицию по любому из пп.1-19.

30. Фармацевтическая композиция по п.29 для уменьшения потери крови.

31. Фармацевтическая композиция по п.29 для предупреждения внутрижелудочковых кровоизлияний у недоношенных новорожденных.

32. Фармацевтическая композиция по п.29 для уменьшения операционной кровопотери у пациентов во время или после операции.

33. Фармацевтическая композиция по п.29 для лечения гемофилии А.

34. Фармацевтическая композиция по п.29 для лечения гемофилии В.

35. Фармацевтическая композиция по п.29 для лечения тромбоцитарных нарушений.

36. Фармацевтическая композиция по п.29 для лечения болезни Виллебранда.

37. Способ лечения или предупреждения эпизодов кровоточивости, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции по п.29 нуждающемуся в этом субъекту.

38. Способ сокращения времени свертывания у субъекта, включающий введение фармацевтической композиции по п.29 нуждающемуся в этом субъекту.

39. Способ сокращения времени свертывания у субъекта, включающий введение фармацевтической композиции по п.29 нуждающемуся в этом субъекту.

40. Способ повышения прочности тромба, включающий введение фармацевтической композиции по п.29 нуждающемуся в этом субъекту.

41. Способ усиления формирования фибринового тромба, включающий введение фармацевтической композиции по п.29 нуждающемуся в этом субъекту.

42. Способ предупреждения внутрижелудочковых кровоизлияний у недоношенных новорожденных, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции по п.29 нуждающемуся в этом субъекту.

43. Способ уменьшения операционной кровопотери у субъекта во время или после операции, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции по п.29 нуждающемуся в этом субъекту.

44. Способ лечения гемофилии А, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции по п.29 нуждающемуся в этом субъекту.

45. Способ лечения гемофилии В, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции по п.29 нуждающемуся в этом субъекту.

46. Способ лечения тромбоцитарных нарушений, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции по п.29 нуждающемуся в этом субъекту.

47. Способ лечения болезни Виллебранда, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции по п.29 нуждающемуся в этом субъекту.

48. Способ стабилизации композиции трансглутаминазы в процессе хранения в высушенной форме таким образом, чтобы уровень активированной непротеолитическим путем трансглутаминазы, измеренной непосредственно после растворения, составлял не более 1% от общего содержания трансглутаминазы, при котором стабилизирующий эффект обеспечивается за счет высушивания водной композиции, содержащей трансглутаминазу, соль и по меньшей мере один из следующих компонентов, выбранных из группы, состоящей из углевода, аминокислоты и буфера, причем концентрация соли в водной композиции находится в диапазоне от 5 до 100 мМ.

49. Способ по п.48, в котором композиция трансглутаминазы представляет собой композицию фактора XIII.

1. Сухая композиция фактора XIII, получаемая посредством лиофилизации водной композиции, содержащей фактор XIII, соль и гистидин, где соль представляет собой хлорид натрия и ее концентрация в водной композиции находится в диапазоне 25-50 мМ, и фактор XIII представляет собой рекомбинантный фактор XIII.

2. Композиция по п.1, в которой фактор XIII представляет собой человеческий фактор XIII.

3. Композиция по любому из пп.1-2, отличающаяся тем, что композиция находится в форме порошка.

4. Способ получения сухой композиции согласно любому из пп.1-3, который осуществляют посредством лиофилизации водной композиции, содержащей фактор XIII, соль и гистидин, где соль представляет собой хлорид натрия и ее концентрация в водной композиции находится в диапазоне 25-50 мМ, и фактор XIII представляет собой рекомбинантный фактор XIII.

5. Способ стабилизации композиции фактора XIII в процессе хранения в высушенной форме таким образом, чтобы уровень активированного непротеолитическим путем фактора XIII, измеренного непосредственно после растворения, составлял не более 1% от общего содержания фактора XIII, где стабилизирующий эффект обеспечивают тем, что высушивают посредством лиофилизации водную композицию, содержащую фактор XIII, соль и гистидин, где соль представляет собой хлорид натрия и ее концентрация в водной композиции находится в диапазоне 25-50 мМ, и фактор XIII представляет собой рекомбинантный фактор XIII.