Оптимизированные с помощью вычислительных средств антигены с широким спектром реактивности для вирусов гриппа h5n1 и h1n1

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены рекомбинантный полипептид гемагглютинин (НА) вируса гриппа для вызова иммунного ответа на вирус гриппа H5N1, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 2-568 SEQ ID NO: 1, кодирующая его нуклеиновая кислота, содержащие предложенный полипептид слитый белок и вирусоподобная частица (VLP) для вызова ответа на вирус гриппа H5N1, вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, и выделенная клетка, его содержащая, композиция и способ вызова иммунного ответа против вируса гриппа H5N1, а также способ иммунизации субъекта. Предложенные белок, VLP и композиции способны вызывать иммунный ответ с широким спектром реактивности против вируса гриппа H5N1. Предложенная группа изобретений может быть использована в медицине для иммунизации против вируса гриппа H5N1. 10 н. и 9 з.п. ф-лы, 8 ил., 5 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА HA РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США № 61/617815, поданной 30 марта 2012 г., которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее раскрытие относится к оптимизированным белкам-гемагглютининам вируса гриппа, которые вызывают иммунный ответ с широким спектром реактивности в отношении вирусов гриппа H5N1 и H1N1, и к их применению в качестве вакцин.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вирус гриппа является представителем семейства Orthomyxoviridae. Существует три подтипа вирусов гриппа, обозначаемые как вирус гриппа A, вирус гриппа B и вирус гриппа C. Вирион вируса гриппа содержит геном, состоящий из сегментированной отрицательно-полярной нити РНК, который кодирует следующие белки: гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), матриксный белок (M1), белок протонного канала (M2), нуклеопротеин (NP), основный белок полимеразного комплекса 1 (PB1), основный белок полимеразного комплекса 2 (PB2), кислый белок полимеразного комплекса (PA) и неструктурный белок 2 (NS2). Белки HA, NA, M1 и M2 являются белками, ассоциированными с мембраной, тогда как NP, PB1, PB2, PA и NS2 являются белками, ассоциированными с нуклеокапсидом. Белок М1 является наиболее распространенным белком в частицах вируса гриппа. Белки HA и NA являются гликопротеинами оболочки, отвечающими за прикрепление вируса и проникновение вирусных частиц в клетку, а также являются источниками основных иммунодоминантных эпитопов для нейтрализации вируса и для защитного иммунитета. Как белок HA, так и белок NA считаются наиболее важными компонентами профилактических вакцин против гриппа.

Ежегодно сезонные вспышки гриппа являются причиной более 300000 случаев госпитализации и 36000 смертельных случаев только в США (Simonsen et al., Lancet Infect Dis 7:658-66, 2007). Появление нового вируса гриппа H1N1 в 2009 г. показало, насколько быстро пандемия нового вида гриппа может распространиться по всему миру.

В настоящее время в США лицензированы два типа подходов к вакцинации против гриппа – применение инактивированной сплит-вакцины и применение вакцины на основе живого ослабленного вируса. Инактивированные вакцины могут эффективно индуцировать гуморальные иммунные ответы, но, как правило, вызывают лишь слабый клеточные иммунные ответы. Вакцины на основе живого вируса не могут вводиться пациентам с ослабленным иммунитетом или беременным пациентам в связи с имеющимся у них повышенным риском развития инфекции. Таким образом, существует потребность в вакцине против вируса гриппа, обладающей широким спектром защитной активности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

В данном документе раскрывается получение оптимизированных с помощью вычислительных средств полипептидов HA вирусов гриппа H5N1 и H1N1, вызывающих иммунный ответ с широким спектром реактивности против вируса гриппа. Оптимизированные полипептиды HA разрабатывали путем проведения серии выравниваний последовательностей белков HA и последующего получения консенсусных последовательностей на основании строения определенных изолятов вирусов гриппа H5N1 и H1N1.

В данном документе представлены рекомбинантные полипептиды НА вируса гриппа, имеющие оптимизированную аминокислотную последовательность, вызывающие иммунный ответ с широким спектром реактивности в отношении вирусов гриппа H5N1 или H1N1, при этом полипептид НА включает или содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления в полипептиде НА вируса гриппа отсутствует N-концевой метиониновый остаток.

Молекулы выделенных нуклеиновых кислот и векторы, кодирующие рекомбинантные полипептиды НА, также представлены в настоящем раскрытии. Дополнительно представлены выделенные клетки, содержащие такие векторы.

Также представлены вирусоподобные частицы (VLP), сходные с частицами вируса гриппа, и слитые белки, содержащие оптимизированные полипептиды НА, раскрытые в данном документе.

Дополнительно представлены композиции, которые включают оптимизированные полипептиды НА вируса гриппа, слитые белки или VLP, раскрытые в данном документе, в фармацевтически приемлемом носителе. В настоящем раскрытии также представлены способы вызова иммунного ответа против вируса гриппа у субъекта путем введения раскрытых композиций, слитых белков или VLP.

Также представлены способы иммунизации субъекта против вируса гриппа путем введения субъекту композиции, содержащей VLP, которая содержит оптимизированный полипептид НА.

Вышеуказанные и другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными из последующего подробного описания, которое следует далее, ссылаясь на прилагаемые графические материалы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA с использованием 426 изолятов H5N1 человека из клад 0, 1, 2.1, 2.2, 2.3 и 7, которая называется в данном документе как “PATH H5N1 COBRA” HA.

Фиг. 2 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA с использованием 205 изолятов вируса гриппа H1N1 человека и свиньи, которая называется в данном документе как “PATH H1N1 COBRA” HA.

Фиг. 3 представляет собой диаграмму, на которой изображены титры HAI-антител в отношении штаммов клады 1 и клады 2 при контрольном заражении после вакцинации VLP, содержащими последовательность PATH H5N1 COBRA HA (SEQ ID NO: 1), VLP, содержащими последовательность COBRA HA вируса гриппа человека клады 2 (COBRA-2 человека), или VLP, содержащими HA вируса гриппа Whooper Swan (A/Whooper Swan/Mongolia/244/2005). Вакцинации (3 мкг) выполняли на 0 и 3 неделях с адъювантом (Imject^TM).

Фиг. 4 представляет собой график, на котором показана масса тела животных, вакцинированных VLP, содержащими последовательность PATH H5N1 COBRA HA (SEQ ID NO: 1), VLP, содержащими последовательность COBRA-2 HA человека, или VLP с Whooper Swan, и впоследствии подвергшихся контрольному заражению 5000 БОЕ вируса Indonesia клады 2.1 (A/Indonesia/5/2005). Вакцинации (3 мкг) выполняли на 0 и 3 неделях с адъювантом (Imject^TM); контрольное заражение вирусом осуществляли на протяжении 5 недели.

Фиг. 5 представляет собой график, на котором показана масса тела животных, вакцинированных VLP, содержащими последовательность PATH H5N1 COBRA HA (SEQ ID NO: 1), и впоследствии подвергшихся контрольному заражению 5000 БОЕ вируса Vietnam клады 1 (A/Vietnam/1203/2004). Вакцинации (3 мкг) выполняли на 0 и 3 неделях с адъювантом (Imject^TM); контрольное заражение вирусом осуществляли на протяжении 5 недели.

Фиг. 6 представляет собой график, на котором показана масса тела животных, вакцинированных VLP, содержащими последовательность PATH H5N1 COBRA HA (SEQ ID NO: 1), VLP, содержащими последовательность COBRA-2 HA человека, или VLP с Whooper Swan, и впоследствии подвергшихся контрольному заражению вирусом Vietnam клады 1. Единичную вакцинацию (3 мкг) выполняли на 0 неделе с адъювантом (Imject^TM) с последующим контрольным заражением вирусом на протяжении 4 недели.

Фиг. 7 представляет собой график, на котором показан процент выживания животных, вакцинированных VLP, содержащими последовательность PATH H5N1 COBRA HA (SEQ ID NO: 1), VLP, содержащими последовательность COBRA-2 HA человека, или VLP с Whooper Swan, и впоследствии подвергшихся контрольному заражению вирусом Vietnam клады 1. Единичную вакцинацию (3 мкг) выполняли на 0 неделе без адъюванта с последующим контрольным заражением вирусом на протяжении 4 недели.

Фиг. 8 представляет собой график, на котором показана масса тела животных, вакцинированных VLP, содержащими последовательность PATH H5N1 COBRA HA (SEQ ID NO: 1), VLP, содержащими последовательность COBRA-2 HA человека, или VLP с Whooper Swan, и впоследствии подвергшихся контрольному заражению вирусом Vietnam клады 1. Единичную вакцинацию в дозе 0,6 мкг выполняли на 0 неделе с адъювантом (Imject^TM) с последующим контрольным заражением вирусом на протяжении 4 недели.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Аминокислотные последовательности, перечисленные в прилагаемом перечне последовательностей, показаны с помощью трехбуквенного кода для аминокислот, как определено в §1.822 главы 37 Свода федеральных нормативных актов США. Перечень последовательностей представлен в виде текстового файла с кодировкой ASCII, созданного 7 февраля 2013 года, 10,0 KB, который включен в данный документ посредством ссылки. В прилагаемом перечне последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность COBRA для HA вируса гриппа H5N1 (“PATH H5N1 COBRA”).

SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность COBRA для HA вируса гриппа H1N1 (“PATH H1N1 COBRA”).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

I. Сокращения

COBRA: оптимизированный с помощью вычислительных средств антиген с широким спектром реактивности;

HA: гемагглютинин;

HAI: ингибирование гемагглютинации;

HRP: пероксидаза хрена;

M1: матриксный белок 1;

NA: нейраминидаза;

PFU: бляшкообразующая единица;

VLP: вирусоподобная частица.

II. Выражения и способы

Если не указано иное, технические выражения используются согласно традиционному способу употребления. Определения общепринятых выражений в области молекулярной биологии могут быть найдены в Benjamin Lewin, Genes V, опубликованном Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликованном Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Robert A. Meyers (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликованном VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Для того чтобы облегчить обзор различных вариантов осуществления настоящего раскрытия, представлены следующие объяснения конкретных выражений.

Адъювант. Вещество или среда, которые неспецифически усиливают иммунный ответ на антиген. Адъюванты могут включать суспензию минеральных веществ (квасцы, гидроксид алюминия или фосфат алюминия), на которой адсорбируется антиген; или эмульсию типа “вода-в-масле”, в которой раствор антигена эмульгирован в минеральном масле (например, неполный адъювант Фрейнда), иногда с включением убитых микобактерий (полный адъювант Фрейнда) для дополнительного усиления антигенных свойств. В качестве адъювантов можно также применять иммуностимулирующие олигонуклеотиды (как, например, содержащие мотив CpG) (например, см. патенты США №№6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116; 6339068; 6406705 и 6429199). Адъюванты также включают биологические молекулы, такие как костимулирующие молекулы. Иллюстративные биологические адъюванты включают IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L и 41 BBL.

Введение. Как применяется в данном документе, введение композиции субъекту означает предоставление субъекту, нанесение субъекту или приведение композиции в контакт с субъектом. Введение можно осуществлять любым из ряда путей, как, например, местным, пероральным, подкожным, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутривенным, подоболочечным и внутрикожным.

Антитело. Молекула иммуноглобулина, вырабатываемая B-лимфоцитами, с определенной аминокислотной последовательностью. Выработка антител у людей или других животных происходит под действием специфического антигена (иммуногена). Антитела характеризуются специфической реакцией с антигеном, происходящей некоторым очевидным образом, при этом каждое из выражений "антитело" и "антиген" определено относительно другого. Выражение "вызывать ответ с формированием антител" относится к способности антигена или другой молекулы индуцировать выработку антител.

Антиген. Соединение, композиция или вещество, которое может стимулировать выработку антител или Т-клеточный ответ у животного, в том числе композиции, инъецируемые животному или поглощаемые им. Антиген реагирует с продуктами специфических гуморальных или клеточных иммунных реакций, в том числе с таковыми, индуцируемыми гетерологичными иммуногенами. В некоторых вариантах осуществления раскрытых композиций и способов антиген представляет собой белок НА вируса гриппа.

Подвергнутый оптимизации кодонов. Выражение "нуклеиновая кислота, подвергнутая оптимизации кодонов" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая была изменена таким образом, что кодоны являются оптимальными для экспрессии в конкретной системе (такой как конкретный вид или группа видов). Например, последовательность нуклеиновой кислоты может быть оптимизирована для экспрессии в клетках млекопитающих. Оптимизация кодонов не изменяет аминокислотную последовательность кодируемого белка.

Слитый белок. Белок, полученный путем экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, сконструированной из последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют по меньшей мере часть двух различных (гетерологичных) белков. Для создания слитого белка последовательности нуклеиновых кислот должны находиться в одной той же рамке считывания и не содержать внутренних стоп-кодонов. Например, слитый белок может включать НА вируса гриппа, слитый с гетерологичным белком.

Гемагглютинин (HA). Поверхностный гликопротеин вируса гриппа. HA опосредует связывание вирусной частицы с клетками-хозяевами и последующее проникновение вируса в клетку-хозяина. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности множества белков HA вируса гриппа известны в данной области техники и публично доступны, как, например, через базу данных ресурсов по вирусам гриппа NCBI (Bao et al., J Virol 82:596-601, 2008). HA (наряду с NA) является одной из двух основных антигенных детерминант вируса гриппа.

Иммунный ответ. Ответ клетки иммунной системы, такой как В-клетка, Т-клетка, макрофаг или полиморфноядерный лейкоцит, на стимул, такой как антиген или вакцина. Иммунный ответ может затрагивать любую клетку тела, участвующую в защитной реакции организма-хозяина, включая, например, эпителиальную клетку, которая секретирует интерферон или цитокин. Иммунный ответ включает без ограничений врожденный иммунный ответ или воспаление. Как применяется в данном документе, защитный иммунный ответ относится к иммунному ответу, который защищает субъект от инфекции (предупреждает инфекцию или предупреждает развитие заболевания, ассоциированного с инфекцией). Способы оценки иммунных ответов хорошо известны в данной области техники и включают, например, оценку пролиферации и/или активности лимфоцитов (таких как B- или Т-клетки), секреции цитокинов или хемокинов, воспаления, выработки антител и т. п.

Иммуноген. Соединение, композиция или вещество, которое в соответствующих условиях способно стимулировать иммунный ответ, такой как выработка антител или Т-клеточный ответ, у животного, в том числе композиции, инъецируемые животному или поглощаемые им. Как применяется в данном документе, “иммуногенная композиция” представляет собой композицию, которая содержит иммуноген (например, полипептид HA).

Иммунизировать. Предоставлять субъекту защиту от инфекционного заболевания, например, путем вакцинации.

Вирус гриппа. Вирус с сегментированной отрицательно-полярной нитью РНК, который принадлежит к семейству Orthomyxoviridae. Существует три типа вирусов гриппа: А, В и С. Вирусы гриппа А инфицируют большое число видов птиц и млекопитающих, в том числе людей, лошадей, морских млекопитающих, свиней, хорьков и кур. У животных большинство вирусов гриппа А вызывают локализованные инфекции дыхательных путей и кишечника в легкой форме. Тем не менее, высокопатогенные штаммы вируса гриппа А, такие как H5N1, вызывают системные инфекции домашней птицы, при которых смертность может достигать 100%. В 2009 г. вирус гриппа H1N1 был наиболее частой причиной заболевания людей гриппом. Новый штамм H1N1, источником которого являлись свиньи, появился в 2009 г. и был объявлен Всемирной организацией здравоохранения пандемическим. Этот штамм был назван "вирусом свиного гриппа". Вирусы гриппа A H1N1 также были причиной пандемии испанского гриппа в 1918 г., вспышки заболевания в Форт-Дикс в 1976 г. и эпидемии гриппа в России в 1977-1978 гг.

Выделенный. "Выделенный" биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота, белок или вирус) был практически отделен или очищен от других биологических компонентов (таких как клеточный детрит или другие белки или нуклеиновые кислоты). Биологические компоненты, которые были "выделены", включают компоненты, очищенные с помощью стандартных способов очистки. Это выражение также охватывает рекомбинантные нуклеиновые кислоты, белки или вирусы (или VLP), а также химически синтезированные нуклеиновые кислоты или пептиды.

Линкер. Одна или несколько аминокислот, которые служат в качестве спейсера между двумя полипептидами слитого белка.

Матриксный белок (M1). Структурный белок вируса гриппа, обнаруженный в оболочке вируса. Полагают, что M1 участвует в сборке и отпочковании.

Нейраминидаза (NA). Мембранный гликопротеин вируса гриппа. NA участвует в разрушении клеточного рецептора к вирусному НА за счет отщепления концевых остатков сиаловой кислоты от углеводных фрагментов, расположенных на поверхности инфицированных клеток. NA также отщепляет остатки сиаловой кислоты от вирусных белков, предотвращая агрегацию вирусов. NA (наряду с HA) является одной из двух основных антигенных детерминант вируса гриппа.

Функционально связанный. Первая последовательность нуклеиновой кислоты является функционально связанной со второй последовательностью нуклеиновой кислоты в том случае, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты размещена в функциональной взаимосвязи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если этот промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Как правило, функционально связанные последовательности ДНК являются смежными и при необходимости соединения двух участков, кодирующих белок, находятся в одной и той же рамке считывания.

Оптимизированный белок HA вируса гриппа. Как применяется в данном документе, “оптимизированный белок HA вируса гриппа” относится к консенсусной последовательности белка HA, полученной с помощью выравниваний последовательностей изолятов вирусов гриппа H5N1 и H1N1 (как описано в примерах 1 и 2 ниже). Нуклеотидные последовательности, кодирующие оптимизированные белки HA, дополнительно оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих посредством оптимизации кодонов и оптимизации РНК (так, чтобы повысить стабильность РНК). Оптимизированные белки HA вируса гриппа, раскрытые в данном документе (и приведенные в данном документе как SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2) также называют последовательностями “COBRA” (оптимизированного с помощью вычислительных средств антигена с широким спектром реактивности). Оптимизированные полипептиды HA предназначены для того, чтобы вызывать у субъекта иммунный ответ с широким спектром реактивности. В контексте настоящего раскрытия “с широким спектром реактивности” означает, что белковая последовательность вызывает такой иммунный ответ у субъекта, который является достаточным для ингибирования, нейтрализации или предупреждения инфицирования широким спектром вирусов гриппа (таких как большинство или все вирусы гриппа в рамках определенного подтипа). В некоторых случаях оптимизированный белок HA вируса гриппа способен вызывать иммунный ответ, такой как защитный иммунный ответ, в отношении большинства или всех изолятов вируса гриппа H5N1 или большинства или всех изолятов вируса гриппа H1N1.

Вспышка. Как применяется в данном документе, “вспышка” вируса гриппа относится к накоплению изолятов вируса внутри отдельной страны в определенный год.

Фармацевтически приемлемые среды. Фармацевтически приемлемые носители (среды), применимые в настоящем раскрытии, являются традиционными. В Remington’s Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975) описаны композиции и составы, пригодные для фармацевтической доставки одной или нескольких терапевтических композиций, таких как одна или несколько вакцин против гриппа, и дополнительные фармацевтические средства.

В целом, природа носителя будет зависеть от конкретного используемого способа введения. Например, составы для парентерального применения обычно содержат инъекционные жидкости, которые в качестве среды включают фармацевтически и физиологически приемлемые жидкости, такие как вода, физиологический раствор, сбалансированные солевые растворы, водный раствор декстрозы, глицерин или подобные. В случае твердых композиций (например, в форме порошка, драже, таблеток или капсул) обычные нетоксичные твердые носители могут включать, например, маннит, лактозу, крахмал или стеарат магния фармацевтической степени чистоты. Вводимые фармацевтические композиции в дополнение к биологически нейтральным носителям могут содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие средства, консерванты и буферные средства, поддерживающие pH, и подобные вещества, например, ацетат натрия или сорбитанмонолаурат.

Полипептид. Полимер, мономерами в котором являются аминокислотные остатки, соединенные друг с другом посредством амидных связей. Если аминокислоты представляют собой альфа-аминокислоты, то можно применять либо L-оптический изомер, либо D-оптический изомер. Выражения “полипептид” или “белок”, применяемые в данном документе, предназначены охватывать любую аминокислотную последовательность и включать модифицированные последовательности, такие как гликопротеины. Выражение “полипептид” конкретно предназначено охватывать белки, встречающиеся в природе, а также белки, полученные рекомбинантным или синтетическим путем. Выражение “остаток” или “аминокислотный остаток” включает ссылку на аминокислоту, которая встроена в белок, полипептид или пептид.

Предупреждение, лечение или уменьшение интенсивности заболевания. “Предупреждением” заболевания называют ингибирование полного развития заболевания. “Лечением” называют терапевтическое вмешательство, которое уменьшает интенсивность признака или симптома заболевания или патологического состояния после начала его развития. “Уменьшением интенсивности” называют снижение числа или уменьшение степени тяжести признаков или симптомов заболевания.

Промотор. Промотор представляет собой совокупность контрольных последовательностей нуклеиновых кислот, управляющих транскрипцией нуклеиновой кислоты. Промотор включают необходимые последовательности нуклеиновых кислот, располагающиеся возле сайта инициации транскрипции. Промотор также необязательно включает дистальные энхансерные или репрессорные элементы. “Конститутивный промотор” представляет собой промотор, который является постоянно активным и не подвергается регуляции внешними сигналами или молекулами. В отличие от него, активность “индуцибельного промотора” регулируется внешними сигналами или молекулами (например, фактором транскрипции). В некоторых вариантах осуществления, представленных в данном документе, промотор представляет собой промотор CMV.

Очищенный. Выражение “очищенный” не подразумевает абсолютную чистоту; его скорее предполагается использовать как относительное выражение. Таким образом, например, очищенные пептид, белок, вирус, VLP или другое активное соединение представляют собой таковые, которые отделены полностью или частично от белков и других примесей, которые в естественных условиях ассоциированы с ними. В некоторых вариантах осуществления выражение “практически очищенный” относится к пептиду, белку, вирусу, VLP или другому активному соединению, выделенным из клетки, среды для культивирования клеток или другого неочищенного препарата и подвергнутым фракционированию для удаления различных компонентов из исходного препарата, таких как белки, клеточный детрит и другие компоненты.

Рекомбинантный. Рекомбинантные нуклеиновая кислота, белок, вирус или VLP представляют собой таковые, имеющие последовательность, которая не встречается в природе, или имеющие последовательность, полученную путем искусственного объединения двух сегментов последовательности, которые в остальных случаях отделены друг от друга. Это искусственное объединение часто выполняют путем химического синтеза или путем искусственного воздействия на выделенные сегменты нуклеиновых кислот, например, при помощи методик генной инженерии.

Субъект. Живые многоклеточные позвоночные организмы - это категория, которая включает как человека, так и млекопитающих, отличных от человека, таких как приматы, отличные от человека.

Терапевтически эффективное количество. Количество определенного средства, достаточное для достижения необходимого эффекта у субъекта, подвергающегося лечению с помощью этого средства. Например, это может быть количество вакцины против вируса гриппа, пригодное для вызова иммунного ответа у субъекта и/или предупреждения инфекции или заболевания, вызываемых вирусом гриппа. Идеально, в контексте настоящего раскрытия, терапевтически эффективным количеством вакцины против гриппа является количество, достаточное для повышения резистентности к инфекции, вызываемой вирусом гриппа, ее предупреждения, уменьшения интенсивности и/или лечения у субъекта, которое при этом не вызывает значительный цитотоксический эффект у субъекта. Эффективное количество вакцины против гриппа, пригодное для повышения резистентности к инфекции, ее предупреждения, уменьшения интенсивности и/или лечения у субъекта, будет зависеть, например, от субъекта, подвергающегося лечению, способа введения терапевтической композиции и других факторов.

Трансформированный. Трансформированная клетка представляет собой клетку, в которую ввели молекулу нуклеиновой кислоты при помощи методик молекулярной биологии. Как применяется в данном документе, выражение “трансформация” охватывает все способы, при помощи которых молекулу нуклеиновой кислоты можно вводить в такую клетку, в том числе трансфекцию с применением вирусных векторов, трансформацию с применением плазмидных векторов и введение “голой” ДНК путем электропорации, липофекции и ускорения частиц при помощи генной пушки.

Вакцина. Препарат на основе иммуногенного материала, способного стимулировать иммунный ответ, вводимый для предупреждения, уменьшения интенсивности или лечения заболевания, такого как инфекционное заболевание. Иммуногенный материал может включать, например, ослабленные или убитые микроорганизмы (например, ослабленные вирусы) или антигенные белки (в том числе VLP), пептиды или ДНК, полученные из них. Вакцины могут вызвать как профилактический (предупредительный), так и терапевтический ответ. Способы введения варьируют в зависимости от вакцины, но могут включать прививку, проглатывание, ингаляцию или другие формы введения. Прививки можно проводить с помощью ряда различных путей, включая парентеральный, например, внутривенный, подкожный или внутримышечный. Вакцины можно вводить с адъювантом, чтобы усилить иммунный ответ.

Вектор. Вектор представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая позволяет производить вставку чужеродной нуклеиновой кислоты без нарушения способности вектора к репликации в клетке-хозяине и/или интеграции в клетку-хозяина. Вектор может включать последовательности нуклеиновых кислот, которые позволяют ему реплицироваться в клетке-хозяине, например, точку начала репликации. Инсерционный вектор способен вставляться в нуклеиновую кислоту хозяина. Вектор также может включать один или несколько селектируемых маркерных генов и других генетических элементов. Вектор экспрессии представляет собой вектор, который содержит необходимые регуляторные последовательности для осуществления транскрипции и трансляции вставленного гена или генов. В некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия вектор кодирует белок HA, NA или М1 вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор экспрессии pTR600 (публикация заявки на патент США № 2002/0106798; Ross et al., Nat Immunol. 1(2):102-103, 2000; Green et al., Vaccine 20:242-248, 2001).

Вирусоподобная частица (VLP). Вирусные частицы, образованные одним или несколькими структурными белками вируса, но не имеющие вирусного генома. Поскольку VLP не имеют вирусного генома, они являются неинфекционными. Кроме того, VLP часто могут быть получены путем гетерологичной экспрессии и легко могут быть очищены. Большинство VLP содержат по меньшей мере коровый вирусный белок, который управляет отпочкованием и высвобождением частиц из клетки-хозяина. Одним из примеров такого сердцевинного белка является M1 вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления, описываемых в данном документе, VLP, сходная с частицей вируса гриппа, содержит белки HA, NA и/или М1. VLP, сходные с частицами вируса гриппа, могут быть получены путем трансфекции клеток-хозяев с помощью плазмид, кодирующих белки HA и NA и необязательно белок М1. После инкубирования трансфицированных клеток в течение соответствующего периода времени, необходимого для обеспечения экспрессии белка (как, например, в течение приблизительно 72 часов), VLP можно выделять из надосадочной жидкости культуры клеток. В примере 4 приводится иллюстративный протокол очистки VLP, сходных с частицами вируса гриппа, от надосадочной жидкости культуры клеток. В этом примере VLP выделяют путем низкоскоростного центрифугирования (для удаления клеточного детрита), вакуум-фильтрации и ультрацентрифугирования в 20% глицерине. Другие способы получения VLP, сходных с частицами вируса гриппа, известны в данной области техники (см., например, публикации заявки на патент США №№ 2006/0263804; 2008/0031895; 2010/0166769 и 2010/0239610).

Если не указано иное, все технические и научные выражения, применяемые в данном документе, имеют то же значение, что и обычно понимаемое специалистом в той области техники, к которой принадлежит настоящее раскрытие. Выражения в единственном числе включают определяемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. “Содержащий A или B” означает включающий А или В или А и B. Также следует понимать, что все размеры оснований или размеры аминокислот и все значения молекулярного веса или молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и предназначены для описания. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные описываемым в данном документе, можно применять в практическом осуществлении или тестировании настоящего раскрытия, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упоминаемые в данном документе, включены посредством ссылки в полном объеме. В случае конфликта в качестве контрольного документа будет выступать настоящее описание, включая пояснения выражений. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены быть ограничивающими.

III. Обзор некоторых вариантов осуществления

В данном документе раскрывается получение оптимизированных с помощью вычислительных средств полипептидов HA вирусов гриппа H5N1 и H1N1, вызывающих иммунный ответ с широким спектром реактивности против вируса гриппа. Оптимизированные полипептиды HA разрабатывали путем проведения серии выравниваний последовательностей белков HA и последующего получения консенсусных последовательностей на основании строения определенных изолятов вирусов гриппа H5N1 и H1N1. Способы, применяемые для получения оптимизированных консенсусных последовательностей HA, описаны в примерах 1 и 2 и показаны на фиг. 1 и 2. Аминокислотные последовательности 2 определенных полипептидов HA приведены в данном документе как SEQ ID NO: 1 (H5N1) и SEQ ID NO: 2 (H1N1). Последовательность H5N1 получали, используя 426 изолятов H5N1 человека из клад 0, 1, 2.1, 2.2, 2.3 и 7, и она называется в данном документе как HA “PATH H5N1 COBRA”. Последовательность H1N1 получали, используя 205 изолятов вируса гриппа H1N1 человека и свиньи, и она называется в данном документе как “PATH H1N1 COBRA” HA.

В данном документе представлены рекомбинантные полипептиды HA вируса гриппа, которые имеют оптимизированную аминокислотную последовательность, вызывающие иммунный ответ с широким спектром активности в отношении вируса гриппа H5N1 или H1N1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность полипептида HA включает или содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

В других вариантах осуществления аминокислотная последовательность полипептида HA вируса гриппа включает или содержит аминокислотную последовательность из остатков 2-568 из SEQ ID NO: 1 или остатков 2-566 SEQ ID NO: 2.

Дополнительно обеспечиваются молекулы выделенных нуклеиновых кислот, кодирующие рекомбинантный полипептид HA, раскрытый в данном документе. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты подвергнута оптимизации кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих. Молекула нуклеиновой кислоты необязательно дополнительно оптимизирована для обеспечения стабильности РНК.

Векторы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие рекомбинантные полипептиды HA, также обеспечиваются в настоящем раскрытии. Вектором может быть любой вектор, подходящий для экспрессии полипептида HA, такой как вектор экспрессии у млекопитающих. В конкретных примерах вектор представляет собой вектор экспрессии pTR600 (публикация заявки на патент США №2002/0106798, которая включена в данный документ посредством ссылки; Ross et al., Nat Immunol. 1(2):102-103, 2000; Green et al., Vaccine 20:242-248, 2001).

В некоторых примерах вектор содержит промотор, функционально связанный c нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид HA. В конкретных примерах промотор представляет собой промотор CMV.

Также обеспечиваются выделенные клетки, содержащие раскрываемые векторы. В некоторых случаях клетка представляет собой клетку любого типа, подходящего для выработки и экспрессии VLP, такую как клетка млекопитающего.

Дополнительно обеспечиваются VLP, сходные с частицами вируса гриппа, содержащие оптимизированный полипептид HA, раскрытый в данном документе. VLP, сходные с частицами вируса гриппа, могут дополнительно включать любые дополнительные белки вируса гриппа, необходимые для формирования вирусной частицы. В некоторых вариантах осуществления VLP, сходные с частицами вируса гриппа, дополнительно включают белок нейраминидазу (NA) вируса гриппа, матриксный белок (M1) вируса гриппа или оба эти белка.

Также представлены VLP, сходные с частицами вируса гриппа, содержащие полипептид НА вируса гриппа, раскрытый в данном документе, полученные путем трансфекции клетки-хозяина с помощью вектора, кодирующего полипептид НА, вектора, кодирующего белок NA вируса гриппа, и вектора, кодирующего белок M1 вируса гриппа, в условиях, достаточных для обеспечения экспрессии белков НА, M1 и NA.

Слитые белки, содержащие оптимизированный полипептид НА вируса гриппа, дополнительно обеспечиваются настоящим раскрытием.

Также в данном документе обеспечиваются композиции, содержащие оптимизированный белок НА вируса гриппа, описанный в данном документе, или слитый белок или VLP, содержащие оптимизированный белок НА вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления композиции дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель и/или адъювант. Например, адъювант может представлять собой квасцы, полный адъювант Фрейнда, биологический адъювант или иммуностимулирующие олигонуклеотиды (такие как CpG-олигонуклеотиды).

Дополнительно обеспечивается способ вызова иммунного ответа против вируса гриппа у субъекта путем введения оптимизированного белка НА вируса гриппа, слитого белка, содержащего оптимизированный полипептид НА вируса гриппа, VLP, содержащих оптимизированный НА вируса гриппа, или композиций с ними, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вирус гриппа представляет собой вирус гриппа H5N1 или H1N1. В некоторых вариантах осуществления белок НА, слитый белок, содержащий НА, или VLP можно вводить с помощью любого подходящего пути введения, такого как, например, внутримышечный, интраназальный или пероральный. В некоторых вариантах осуществления белок НА, слитый белок или VLP вводят в виде композиции, дополнительно содержащей фармацевтически приемлемый носитель и/или адъювант. Например, адъювант может представлять собой квасцы, полный адъювант Фрейнда, биологический адъювант или иммуностимулирующие олигонуклеотиды (такие как CpG-олигонуклеотиды).

Также обеспечивается способ иммунизации субъекта против вируса гриппа путем введения субъекту VLP, содержащих оптимизированный белок HA вируса гриппа, раскрытый в данном документе, или путем введения композиции с ними. В некоторых вариантах осуществления способа композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель и/или адъювант. Например, адъювант может представлять собой квасцы, полный адъювант Фрейнда, биологический адъювант или иммуностимулирующие олигонуклеотиды (такие как CpG-олигонуклеотиды). В некоторых вариантах осуществления VLP (или композиции с ними) вводят внутримышечно.

В некоторых вариантах осуществления способов вызова иммунного ответа или иммунизации субъекта субъекту вводят от около 1 до около 25 мкг VLP, содержащих оптимизированный белок HA. В конкретных примерах субъекту вводят от около 5 до около 20 мкг VLP или от около 10 до около 15 мкг VLP. В одном конкретном неограничивающем примере субъекту вводят около 15 мкг VLP. Однако, специалист в данной области способен определить терапевтически эффективное количество (например, количество, обеспечивающее защиту от инфекции, вызываемой вирусом гриппа H5N1 или H1N1) VLP, которое необходимо ввести субъекту.

IV. Вирусы гриппа

Вирусы гриппа представляют собой вирусы с сегментированной отрицательно-полярной нитью РНК, которые принадлежат к семейству Orthomyxoviridae. Существует три типа вирусов гриппа: А, В и С. Вирусы гриппа А инфицируют большое число видов птиц и млекопитающих, в том числе людей, лошадей, морских млекопитающих, свиней, хорьков и кур. У животных большинство вирусов гриппа A вызывают локализованные инфекции дыхательных путей и кишечника в легкой форме. Тем не менее, высокопатогенные штаммы вируса гриппа A, такие как H5N1, вызывают системные инфекции домашней птицы, при которых смертность может достигать 100%. Животные, инфицированные вирусом гриппа А, часто выступают в роли резервуара вирусов гриппа, и было показано, что определенные подтипы могут преодолевать межвидовой барьер, инфицируя людей.

Вирусы гриппа A могут быть классифицированы на подтипы на основании аллельных вариаций антигенных участков двух генов, которые кодируют поверхностные гликопротеины, а именно, гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA), которые необходимы для прикрепления вируса и высвобождения из клетки. В настоящее время известно шестнадцать подтипов HA (H1-H16) и девять антигенных вариантов NA (N1-N9) вируса гриппа A. Ранее были известны только три подтипа, циркулирующие в крови человека (H1N1, H1N2 и H3N2). Однако в последние годы сообщалось о том, что патогенный подтип H5N1 птичьего гриппа A преодолевает межвидовой барьер и инфицирует людей, что было документально зафиксировано в Гонконге в 1997 и 2003 гг. и привело к смерти нескольких пациентов.

В 2009 г. вирус гриппа H1N1 был наиболее частой причиной заболевания людей гриппом. Новый штамм H1N1, источником которого являлись свиньи, появился в 2009 г. и был объявлен Всемирной организацией здравоохранения пандемическим. Этот штамм был назван “вирусом свиного гриппа”. Вирусы гриппа A H1N1 также были причиной пандемии испанского гриппа в 1918 г., вспышки заболевания в Форт-Дикс в 1976 г. и эпидемии гриппа в России в 1977-1978 гг.

Сегментированный геном вируса гриппа содержит восемь генных сегментов отрицательно-полярной нити РНК (nsRNA) (PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA и NA), которые кодируют по меньшей мере десять полипептидов, в том числе белки РНК-полимеразы, управляемые РНК (PB2, PB1 и PA), нуклеопротеин (NP), нейраминидазу (NA), гемагглютинин (субъединицы HA1 и HA2), матриксные белки (M1 и M2) и неструктурные белки (NS1 и NS2) (Krug et al., в “The Influenza Viruses”, R. M. Krug, ed., Plenum Press, N.Y., 1989, pp. 89 152).

Способность вируса гриппа вызывать широко распространенное заболевание связана с его способностью избегать действия иммунной системы путем подвергания антигенному изменению, которое, как полагают, происходит в том случае, когда хозяин одновременно инфицирован как вирусом гриппа животных, так и вирусом гриппа человека. Во время мутации и реассортации, происходящих в организме хозяина, вирус может внедрять в свой геном ген поверхностного белка HA и/или NA из другого вируса, что, тем самым, приводит к образованию нового подтипа вируса гриппа и избеганию действия иммунной системы.

HA является поверхностным гликопротеином вируса, который обычно содержит приблизительно 560 аминокислот и представляет 25% от общего количества вирусного белка. Он отвечает за прикрепление вирусной частицы к клетке-хозяину и ее проникновение в нее на ранних стадиях инфекции. Расщепление вирусного предшественника HA0 на субфрагменты HA1 и HA2 является необходимым этапом для того, чтобы вирус инфицировал клетку. Таким образом, расщепление требуется для того, чтобы превратить новые вирусные частицы в клетке-хозяине в вирионы, способные инфицировать новые клетки. Известно, что расщепление происходит во время транспортировки интегрального мембранного белка HA0 из эндоплазматического ретикулума инфицированной клетки к плазматической мембране. В ходе транспортировки гемагглютинин подвергается ряду ко- и посттрансляционных модификаций, включая протеолитическое расщепление предшественника HA на амино-концевой фрагмент HA1 и карбокси-концевой HA2. Одна из основных трудностей при выращивании штаммов гриппа в первичной культуре ткани или в устойчивых клеточных линиях проистекает из потребности в активации протеолитического расщепления гемагглютинина вируса гриппа в клетке-хозяине.

Хотя известно, что нерасщепленный HA может опосредовать прикрепление вируса к его рецепторам на поверхности клетки, содержащим нейраминовую кислоту, он не способен к участию в следующем этапе инфекционного цикла, которым является слияние. Сообщалось, что необходимо, чтобы гидрофобный амино-конец HA2, образуемый при расщеплении, был выставлен на поверхности, так чтобы он мог встраиваться в целевые клетки, тем самым образуя мостик между мембранами вируса и целевой клетки. Следом за этим процессом происходит слияние двух мембран и проникновение вируса в целевую клетку.

Протеолитическая активация HA включает расщепление по аргининовому остатку трипсиноподобной эндопротеазой, которая часто является внутриклеточным кальций-зависимым ферментом, оптимальное значение рН для которого является нейтральным. Так как активирующие протеазы являются клеточными ферментами, то, будет ли расщепляться HA, определяется типом инфицированных клеток. HA вирусов гриппа млекопитающих и непатогенных вирусов птичьего гриппа являются восприимчивыми к протеолитическому расщеплению только в ограниченном количестве типов клеток. С другой стороны, HA патогенных вирусов птиц из подтипов Н5 и Н7 расщепляются протеазами, присутствующими в широком круге различных клеток-хозяев. Таким образом, существуют различия среди ряда хозяев, обусловленные различиями в способности гемагглютинина к расщеплению, которые коррелируют с патогенными свойствами вируса.

Нейраминидаза (NA) является вторым мембранным гликопротеином вирусов гриппа. Было показано, что присутствие NA вируса является важным для формирования многостороннего защитного иммунного ответа против инфицирующего вируса. У большинства вирусов гриппа A NA имеет 413 аминокислот в длину и кодируется геном, содержащим 1413 нуклеотидов. Девять различных подтипов NA были идентифицированы в вирусах гриппа (N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 и N9), все из которых были обнаружены у диких птиц. NA участвует в разрушении клеточного рецептора к HA вируса за счет отщепления концевых остатков нейраминовой кислоты (также называемой сиаловой кислотой) от углеводных фрагментов, расположенных на поверхности инфицированных клеток. NA также отщепляет остатки сиаловой кислоты от вирусных белков, предупреждая агрегацию вирусов. Гипотетически предполагается, что при помощи этого механизма NA облегчает высвобождение вирусного потомства, предупреждая накопление вновь образованных вирусных частиц вдоль клеточной мембраны, а также содействуя транспортировке вируса через слизь, присутствующую на поверхности слизистой оболочки. NA является важной антигенной детерминантой, которая подвергается антигенной вариации.

Вирус гриппа, в дополнение к поверхностным белкам HA и NA, содержит шесть дополнительных внутренних генов, которые отвечают за синтез восьми различных белков, в том числе гены белков полимеразного комплекса PB1, PB2 и PA, матриксных белков M1 и M2, нуклеопротеина (NP) и неструктурных белков NS1 и NS2 (Horimoto et al., Clin Microbiol Rev. 14(1):129-149, 2001).

Для упаковки в вирионы потомства вирусная РНК транспортируется из ядра в виде рибонуклеопротеинового (RNP) комплекса, образованного тремя белками, представляющими собой полимеразы вируса гриппа, нуклеопротеином (NP) и вирусной РНК, в ассоциации с матриксным белком 1 (M1) вируса гриппа и белком ядерного экспорта (Marsh et al., J Virol, 82:2295-2304, 2008). Считается, что белок М1, который располагается в оболочке, задействован в сборке и отпочковании. Ограниченное число белков M2 интегрировано в вирионы (Zebedee, J. Virol. 62:2762-2772, 1988). Они образуют тетрамеры, обладающие активностью ионных каналов для H+, и при активации под действием низкого pH в эндосомах подкисляют внутреннее пространство вириона, облегчая сбрасывание его оболочки (Pinto et al., Cell 69:517-528, 1992). Амантадин является противогриппозным лекарственным средством, которое предупреждает вирусную инфекцию путем нарушения активности ионных каналов, образуемых белками М2, тем самым ингибируя сбрасывание оболочки вируса.

NS1, неструктурный белок, имеет несколько функций, включая регуляцию сплайсинга и ядерного экспорта клеточных мРНК, а также стимуляцию трансляции. По-видимому, основной функцией NS1 является противодействие активности интерферона хозяина, поскольку вирус с нокаутом гена NS1 был жизнеспособным, хотя характеризовался менее эффективным ростом, чем родительский вирус, в клетках без недостаточности интерферона (Garcia-Sastre, Virology 252:324-330, 1998).

NS2 выявляли в вирусных частицах (Richardson et al., Arch. Virol. 116:69-80, 1991; Yasuda et al., Virology 196:249-255, 1993). По оценкам среднее количество белков NS2 в вирусной частице составляет 130-200 молекул. Анализ связывания in vitro показывает наличие прямого белок-белкового контакта между M1 и NS2. Комплексы NS2-M1 также выявляли с помощью иммунопреципитации в лизатах клеток, инфицированных вирусом. Считается, что белок NS2 играет роль в экспорте RNP из ядра посредством взаимодействия с белком М1 (Ward et al., Arch. Virol. 140:2067-2073, 1995).

V. VLP, сходные с частицами вируса гриппа, и их введение

В данном документе обеспечиваются VLP, сходные с частицами вируса гриппа, содержащие оптимизированный HA (такой как HA, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную ниже как SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2). VLP, сходные с частицами вируса гриппа, как правило, образованы белками HA, NA и М1. Получение VLP, сходных с частицами вируса гриппа, описано в данной области техники и находится в пределах квалификации специалиста в данной области. Например, VLP, сходные с частицами вируса гриппа, можно получить путем трансфекции клеток-хозяев с помощью плазмид, которые кодируют белки HA, NA и М1. После инкубирования трансфицированных клеток в течение соответствующего периода времени, необходимого для обеспечения экспрессии белка (как, например, в течение приблизительно 72 часов), VLP можно выделять из надосадочной жидкости культуры клеток. В примере 4 ниже приводится иллюстративный протокол очистки VLP, сходных с частицами вируса гриппа, от надосадочной жидкости культуры клеток. В этом примере VLP выделяют путем низкоскоростного центрифугирования (для удаления клеточного детрита), вакуум-фильтрации и ультрацентрифугирования в 20% глицерине.

VLP, сходные с частицами вируса гриппа, раскрываемые в данном документе, можно применять в качестве вакцин против гриппа для вызова защитного иммунного ответа на вирусы гриппа H5N1 и H1N1.

VLP, сходные с частицами вируса гриппа, или композиции с ними можно вводить субъекту любым путем, обычно применяемым для введения рекомбинантных вирусов субъекту. Способы введения включают, но без ограничений, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, парентеральный, внутривенный, подкожный, вагинальный, ректальный, интраназальный, ингаляционный или пероральный. Парентеральное введение, такое как, подкожное, внутривенное или внутримышечное введение, как правило, совершают путем инъекции. Инъекционные лекарственные средства можно получать в традиционных формах либо в виде жидких растворов, либо суспензий, в твердых формах, пригодных для получения раствора или суспензии в жидкости перед инъекцией, или в виде эмульсий. Инъекционные растворы и суспензии можно получать из стерильных порошков, гранул и таблеток ранее описанного типа. Введение может быть системным или локальным.

VLP, сходные с частицами вируса гриппа, или композиции с ними вводят любым подходящим способом, как, например, с помощью фармацевтически приемлемых носителей. Фармацевтически приемлемые носители частично определяются конкретной вводимой композицией, а также конкретным способом, применяемым для введения композиции. Соответственно, в настоящем раскрытии представлено большое разнообразие подходящих составов фармацевтических композиций.

Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, в том числе солевые и буферные среды. Среды для парентерального применения включают раствор хлорида натрия, декстрозу в растворе Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактатный раствор Рингера или нелетучие масла. Среды для внутривенного применения включают жидкие и питательные наполнители, электролитные наполнители (как, например, на основе декстрозы в растворе Рингера) и т.п. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, хелатообразующие средства и инертные газы и т.п.

Некоторые из композиций теоретически можно вводить в виде фармацевтически приемлемой соли присоединения кислоты или основания, образованной в результате реакции с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, перхлорная кислота, азотная кислота, тиоциановая кислота, серная кислота и фосфорная кислота, и органическими кислотами, такими как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота и фумаровая кислота, или в результате реакции с неорганическим основанием, таким как гидроксид натрия, гидроксид аммония, гидроксид калия, и органическими основаниями, такими как моно-, ди-, триалкиламины, и ариламины, и замещенные этаноламины.

Введение можно осуществлять с применением однократных или многократных доз. Доза, вводимая субъекту применительно к настоящему раскрытию, должна быть достаточной для индуцирования благоприятного терапевтического эффекта у субъекта, продолжающегося в течение длительного времени, или для подавления или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гриппа H5N1 или H1N1. Требуемая доза будет варьировать для различных субъектов в зависимости от вида, возраста, веса и общего состояния субъекта, тяжести инфекции, лечение которой осуществляется, конкретной применяемой композиции и способа ее введения. Соответствующая доза может быть определена специалистом в данной области при помощи только стандартных экспериментов.

В данном документе обеспечиваются фармацевтические композиции, которые включают терапевтически эффективное количество VLP, сходных с частицами вируса гриппа, отдельно или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтически приемлемые носители включают, но без ограничений, солевой раствор, забуференный солевой раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол и их комбинации. Носитель и композиция могут быть стерильными, а состав соответствует режиму введения. Композиция может также содержать небольшие количества смачивающих или эмульгирующих средств или буферных средств, поддерживающих pH. Композиция может представлять собой жидкий раствор, суспензию, эмульсию, таблетку, драже, капсулу, состав с замедленным высвобождением или порошок. Композицию можно составить в виде суппозитория с традиционными связующими и носителями, такими как триглицериды. Составы для перорального применения могут включать стандартные носители, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза и карбонат магния фармацевтической степени чистоты. Можно применять любые обычные фармацевтические носители, такие как стерильный солевой раствор или кунжутное масло. Среда может также содержать традиционные фармацевтические вспомогательные средства, такие как, например, фармацевтически приемлемые соли для корректировки осмотического давления, буферы, консерванты и т.п. Другие среды, которые можно применять с композициями и способами, обеспеченными в данном документе, представляют собой физиологический раствор и кунжутное масло.

VLP, сходные с частицами вируса гриппа, описанные в данном документе, можно вводить отдельно или в комбинации с другими терапевтическими средствами для усиления антигенных свойств. Например, VLP, сходные с частицами вируса гриппа, можно вводить с адъювантом, таким как неполный адъювант Фрейнда или полный адъювант Фрейнда.

Необязательно, один или несколько цитокинов, таких как IL-2, IL-6, IL-12, RANTES, GM-CSF, TNF-α или IFN-γ, один или несколько факторов роста, таких как GM-CSF или G-CSF; одну или несколько молекул, таких как OX-40L или 41 BBL, или комбинации этих молекул, можно использовать в качестве биологических адъювантов (см., например, Salgaller et al., 1998, J. Surg. Oncol. 68(2):122-38; Lotze et al., 2000, Cancer J. Sci. Am. 6(Suppl 1):S61-6; Cao et al., 1998, Stem Cells 16(Suppl 1):251-60; Kuiper et al., 2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465:381-90). Эти молекулы можно вводить хозяину системно (или локально).

Известен ряд средств, индуцирующих клеточный ответ как in vitro, так и in vivo. Липиды были идентифицированы в качестве средств, способных содействовать in vivo праймингу CTL против различных антигенов. Например, как описано в патенте США №5662907, остатки пальмитиновой кислоты могут прикрепляться к альфа- и эпсилон-аминогруппам лизинового остатка, а затем связываться (например, посредством одного или нескольких связывающих остатков, таких как глицин, глицин-глицин, серин, серин-серин или т.п.) с иммуногенным пептидом. Липидизированный пептид можно затем инъецировать напрямую в мицеллярной форме, включенным в липосому или эмульгированным в адъюванте. В качестве другого примера, для праймирования опухолеспецифического CTL можно применять липопротеины E.coli, такие как трипальмитоил-S-глицерилцистеинилсерилсерин, в случаях, когда они ковалентно присоединены к соответствующему пептиду (см. Deres et al., Nature 342:561, 1989). Дополнительно, поскольку индуцирование выработки нейтрализующих антител также может быть достигнуто с помощью праймирования той же молекулой, конъюгированной с пептидом, у которого обнаруживается соответствующий эпитоп, две композиции можно объединить, чтобы вызвать как гуморальный, так и клеточный ответы в тех случаях, когда это считается необходимым.

Хотя в данном документе в качестве примера приводится введение VLP, содержащих оптимизированный белок НА, специалист в данной области поймет, что для того, чтобы вызвать иммунный ответ у субъекта, также можно вводить оптимизированный белок НА вируса гриппа сам по себе (в отсутствие вирусной частицы) или в форме слитого белка.

Следующие примеры приведены для иллюстрации конкретных отдельных признаков и/или вариантов осуществления. Эти примеры не должны рассматриваться как ограничивающие раскрытие конкретными описываемыми признаками или вариантами осуществления.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: получение последовательности COBRA вируса гриппа H5N1

В данном примере описано получение консенсусной последовательности COBRA НА вируса гриппа H5N1 с использованием 426 последовательностей НА вируса гриппа H5N1 человека из клад 0, 1, 2.1, 2.2, 2.3 и 7. Полученную в результате последовательность COBRA называют "PATH H5N1 COBRA".

Для получения конечной последовательности COBRA НА вируса гриппа H5N1 получали три уровня консенсусных последовательностей (фиг. 1). На первом уровне получали шесть отдельных консенсусных последовательностей с использованием (1) 5 изолятов клады 0; (2) 86 изолятов клады 1; (3) 106 изолятов клады 2.1; (4) 97 изолятов клады 2.2; (5) 34 изолятов клады 2.3 и (6) 1 изолята клады 7. На втором уровне получали консенсусную последовательность клады 2 с использованием трех консенсусных последовательностей клады 2, полученных на первом уровне (консенсусные последовательности клады 2.1, клады 2.2 и клады 2.3). Конечную консенсусную последовательность получали с использованием отдельных консенсусных последовательностей клады 0, клады 1 и клады 7, полученных на первом уровне, и консенсусной последовательности клады 2, полученной на втором уровне. Последовательность PATH H5N1 COBRA показана ниже и приведена в данном документе как SEQ ID NO: 1.

PATH H5N1 COBRA HA (SEQ ID NO: 1).

MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKASPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSNHEASSGVSSACPYQGRSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVKNGTYDYPQYSEEARLNREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI

Пример 2: получение последовательности COBRA вируса гриппа H1N1

В данном примере описано получение консенсусной последовательности COBRA HA вируса гриппа H1N1 с использованием 205 последовательностей HA вируса гриппа человека и свиньи. Полученную в результате последовательность COBRA называют “PATH H1N1 COBRA”.

Для получения конечной последовательности COBRA HA вируса гриппа H1N1 получали два уровня консенсусных последовательностей (фиг. 2). На первом уровне получали пять отдельных консенсусных последовательностей с использованием (1) 8 "человеческих" штаммов, выделенных в период с 1933 по1934 гг.; (2) 13 "человеческих" штаммов, выделенных в период с 1935 по 1947 гг.; (3) 12 "человеческих" штаммов, выделенных в период с 1948 по 1957 гг.; и (4) 123 "человеческих" штаммов, выделенных в период с 2009 по 2011 гг.; и (5) 49 "свиных" штаммов. Конечную консенсусную последовательность получали с использованием пяти отдельных консенсусных последовательностей, полученных на первом уровне. Последовательность PATH H1N1 COBRA показана ниже и приведена в данном документе как SEQ ID NO: 2.

PATH H1N1 COBRA HA (SEQ ID NO: 2)

MKARLLVLLCALAATDADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCKLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECESLLSARSWSYIVETPNSENGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTTKGVTAACSHAGKSSFYRNLLWLTKKGGSYPKLSKSYVNNKGKEVLVLWGVHHPSTSTDQQSLYQNENAYVSVVSSNYNRRFTPEIAERPKVRGQAGRMNYYWTLLEPGDTIIFEATGNLIAPWYAFALSRGSGSGIITSNASMHECNTKCQTPQGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVRSTKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNNLEKRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLRNNAKEIGNGCFEFYHKCDNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

Пример 3: последовательности гена COBRA, подвергнутые оптимизации кодонов

Аминокислотные последовательности COBRA, раскрытые в данном документе, могут подвергаться обратной трансляции и оптимизации для экспрессии в клетках млекопитающих, включая оптимизацию частоты использования кодонов и РНК (GeneArt; Регенсбург, Германия). Оптимизированные последовательности нуклеиновых кислот могут быть вставлены в соответствующий вектор экспрессии, такой как вектор экспрессии pTR600 (публикация заявки на патент США №2002/0106798; Ross et al., Nat Immunol. 1(2):102-103, 2000; Green et al., Vaccine 20:242-248, 2001). Векторы экспрессии, кодирующие последовательности генов COBRA, подвергнутые оптимизации кодонов, можно применять, например, для получения VLP, содержащих COBRA HA.

Пример 4: получение VLP, сходных с частицами вируса гриппа, и иммунизация ими

Следующие способы можно применять для получения и определения характеристик VLP, сходных с частицами вируса гриппа, содержащих COBRA HA. Иллюстративные способы иммунизации мышей, хорьков и макак также описаны ниже (см. также Giles and Ross, Vaccine 29(16):3043-3054, 2011).

Получение вакцины

Клетки 293T подвергали транзиентной трансфекции с помощью плазмид, экспрессирующих M1, NA и оптимизированный HA, и инкубировали в течение 72 часов при 37^oC. Последовательности, кодирующие M1, NA и HA, могут быть подвергнуты оптимизации кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих. Собирали надосадочную жидкость, а клеточный детрит удаляли путем низкоскоростного центрифугирования с последующей вакуум-фильтрацией через стерильный фильтр на 0,22 мкм. VLP очищали при помощи ультрацентрифугирования (100000 x g в 20% глицерине, частей по весу) в течение 4 часов при 4^oC. Осадки затем ресуспендировали в PBS, pH 7,2, и хранили в виде аликвот для однократного применения при -80^oC до применения. Общую концентрацию белка определяли с помощью набора реагентов для анализа белков Micro BCA^TM (Pierce Biotechnology, Рокфорд, Иллинойс, США).

Определение дозы

Удельное содержание HA можно определить при помощи вестерн-блоттинга и денситометрического анализа. Очищенный рекомбинантный COBRA HA и очищенные VLP получали при стандартном общем количестве белка, и подвергали электрофорезу в 10% SDS-PAGE геле, и переносили на PVDF-мембрану. Блот зондировали при помощи мышиной поликлональной антисыворотки, полученной от мышей, инфицированных вирусом гриппа, и комплексы HA-антитело выявляли при помощи антител козы к IgG мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP) (Southern Biotech; Бирмингем, Алабама, США). HRP выявляли с помощью хемилюминесцентного субстрата (Pierce Biotechnology; Рокфорд, Иллинойс, США), и делали рентгеновский снимок (ThermoFisher; Питтсбург, Пенсильвания, США). Оптическую плотность полос определяли при помощи программного обеспечения ImageJ (NIH). Значения оптической плотности полос рекомбинантного HA применяли для расчета стандартной кривой, а значения оптической плотности очищенных VLP интерполировали с применением результатов, полученных для рекомбинантного HA.

Исследования на мышах

Мышей BALB/c (Mus musculus, самки, возраст 6-8 недель) можно приобрести у Harlan Sprague Dawley (Индианаполис, Индиана, США). Мышей содержали в микроизоляторных блоках, и им обеспечивали свободный доступ к пище и воде, и уход за ними осуществляли в соответствии с директивами USDA в отношении лабораторных животных. Мышей вакцинировали с помощью одной из трех доз очищенных VLP с COBRA HA (1,5 мкг, 0,3 мкг или 0,06 мкг), исходя из содержания HA, определенного в результате денситометрического анализа, посредством внутримышечной инъекции на 0 неделе, а затем им вводили такую же дозу посредством бустер-инъекции на 3 неделе. Вакцины в каждой дозе составляли с квасцовым адъювантом (Imject^TM Alum, Pierce Biotechnology; Рокфорд, Иллинойс, США), CpG-олигонуклеотидами или только со средой. Через четырнадцать - двадцать один день после каждой вакцинации у мышей под анестезией из ретроорбитального сплетения забирали кровь и переносили ее в микроцентрифужную пробирку. Пробирки центрифугировали и сыворотку отбирали и замораживали при -80±5ºС. Сывороточный титр антител, ингибирующих гемагглютинацию (HAI), для каждой группы вакцинации определяли на 5 неделе при помощи типичных реассортантных вирусов или VLP с COBRA HA.

Через три недели после заключительной вакцинации производили интраназальное контрольное заражение мышей патогенным вирусом гриппа H5N1 или H1N1 в объеме 50 мкл. После инфицирования проводили ежедневное отслеживание мышей в отношении снижения массы тела, наличия признаков заболевания и наступления смерти в течение 14 дней после инфицирования. Индивидуальные значения массы тела, баллы по шкале оценки заболевания (Toapanta and Ross, Respiratory Research 10(1):112, 2009) и случаи смерти регистрировали для каждой группы ежедневно после прививки.

Исследования на хорьках

Черных хорьков (Mustela putorius furo, самки, возраст 6-12 месяцев), не подвергавшихся ранее заражению вирусом гриппа и с удаленными пахучими железами, можно приобрести у Marshall Farms (Сейр, Пенсильвания, США). Хорьков содержали парами в клетках из нержавеющей стали (Shor-line, Канзас-Сити, Канзас, США), в которых была подстилка Sani-chips для лабораторных животных (P.J. Murphy Forest Products, Монтвилл, Нью-Джерси, США). Хорьки получали корм для хорьков Teklad Global (Harlan Teklad, Мэдисон, Висконсин, США) и свежую воду ad libitum. VLP с COBRA HA разводили в PBS, pH 7,2, до достижения конечной концентрации. Хорьков вакцинировали с помощью одной из двух доз очищенных VLP с COBRA (15 мкг, 3 мкг), исходя из содержания HA, определенного денситометрическим анализом, посредством внутримышечной инъекции в четырехглавую мышцу в объеме 0,25 мл на 0 неделе, а затем им вводили такую же дозу посредством бустер-инъекции на 3 неделе. Вакцины хранили при -80ºС до применения и составляли с квасцовым адъювантом (Imject Alum; Pierce Biotechnology, Рокфорд, Иллинойс, США) непосредственно перед применением. Проводили еженедельное отслеживание животных в отношении нежелательных явлений, включая снижение массы тела, повышение температуры, снижение активности, выделения из носа, чихание и диарею, во время действия режима вакцинации. До вакцинации животных подвергали анализу на HAI для подтверждения того, что они являются серонегативными в отношении циркулирующих в крови вирусов гриппа A и гриппа B. Через четырнадцать - двадцать один день после каждой вакцинации у хорьков под анестезией из передней полой вены забирали кровь и переносили ее в микроцентрифужную пробирку. Пробирки центрифугировали и сыворотку отбирали и замораживали при -80±5ºС. Сывороточный титр HAI-антител для каждой группы вакцинации определяли на 5 неделе при помощи типичных реассортантных вирусов или VLP с COBRA HA.

Через три недели после заключительной вакцинации производили интраназальное контрольное заражение хорьков патогенным вирусом гриппа H5N1 или H1N1 в объеме 1 мл. После инфицирования проводили ежедневное отслеживание хорьков в отношении снижения массы тела, наличия признаков заболевания и наступления смерти в течение 14 дней после инфицирования. Индивидуальные значения массы тела, баллы по шкале оценки заболевания и случаи смерти регистрировали для каждой группы ежедневно после прививки. Промывания полости носа выполняли путем закапывания 3 мл PBS в ноздри хорьков под анестезией ежедневно в течение 7 дней после прививки. Смывы собирали и хранили при -80°С до применения.

Иммунизации приматов

Макак-крабоедов (Macaca fascicularis, самцы, возраст 3-5 лет) можно приобрести у Harlan Sprague Dawley (Индианаполис, Индиана, США). Макак вакцинировали с помощью очищенных VLP с COBRA HA (15 мкг), исходя из содержания HA, определенного в результате денситометрического анализа, посредством внутримышечной инъекции на 0 неделе, а затем им вводили такую же дозу посредством бустер-инъекции на 3 и 6 неделях. Вакцины составляли с квасцовым адъювантом (Imject Alum; Pierce Biotechnology, Рокфорд, Иллинойс, США) непосредственно перед применением. Через двадцать один день после каждой вакцинации у макак под анестезией из бедренной вены забирали кровь и переносили в пробирку для отделения сыворотки. В пробирках обеспечивали возможность активации свертывания, после чего центрифугировали, а сыворотку отбирали и замораживали при -80±5ºС. Конечную точку титрования IgG и сывороточный титр HAI-антител для каждой группы вакцинации определяли на 5 неделе при помощи типичных реассортантных вирусов или VLP с COBRA HA.

Через три недели после заключительной вакцинации производили контрольное заражение макаков посредством интраназальной, интратрахеальной или глазничной прививки с помощью патогенного вируса гриппа H5N1 или H1N1 в объеме 1 мл. После инфицирования проводили ежедневное отслеживание макак в отношении снижения массы тела, наличия признаков заболевания и наступления смерти в течение 5 дней после инфицирования. Индивидуальные значения массы тела, баллы по шкале оценки заболевания и случаи смерти регистрировали для каждой группы ежедневно после прививки.

Пример 5: иммуногенность и протективная эффективность VLP, содержащих PATH H5N1 COBRA HA

В данном примере описано четыре исследования на мышах для тестирования иммуногенности и протективной эффективности VLP с PATH H5N1 COBRA.

COBRA, исследование 1

Данное исследование проводили для тестирования иммуногенности и протективной эффективности VLP с PATH H5N1 COBRA в отношении контрольных заражений кладой 1 и кладой 2. Для сравнения использовали VLP, содержащие человеческий COBRA HA клады 2 (VLP с COBRA-2 человека).

Мышей вакцинировали внутримышечно 3 мкг VLP, содержащими последовательность PATH H5N1 COBRA HA (SEQ ID NO: 1), VLP, содержащими последовательность COBRA-2 HA человека, или VLP, содержащими HA вируса гриппа Whooper Swan (A/Whooper Swan/Mongolia/244/2005). Вакцинации выполняли на 0 неделе и 3 неделе с адъювантом (Imject^TM). Мышей подвергали контрольному заражению 5000 БОЕ вируса Indonesia клады 2.1 (A/Indonesia/5/2005) или 5000 БОЕ вируса Vietnam клады 1 (A/Vietnam/1203/2004) на протяжении 5 недели. Образцы крови собирали на 0 неделе, 3 неделе и 5 неделе. Легкие брали на анализ на 3 день (D3) после контрольного заражения для определения концентрации вируса.

Титры HAI к VLP с PATH H5N1 COBRA (положительный контроль), вирусу Vietnam клады 1, вирусу Indonesia клады 2.1, вирусу Whooper Swam клады 2.2, вирусу Egypt/3300/08 клады 2.2.1, вирусу Egypt/321/07 клады 2.2.1, вирусу Anhui клады 2.3 и вирусу Chicken/Vietnam клады 7 у вакцинированных мышей показаны на фиг. 3. Данные результаты показывают, что вакцинация VLP, содержащими PATH H5N1 COBRA HA, вызывает ответ с формированием антител, которые могут распознавать вирусы гриппа как клады 1, так и клады 2.

Массы тел вакцинированных и интактных мышей до 14 дня (D14) после контрольного заражения вирусами Indonesia клады 2.1 и Vietnam клады 1 показаны на фиг. 4 и фиг. 5, соответственно. Как показано на фиг. 4, масса тела всех вакцинированных мышей с течением времени изменялась в незначительной степени, тогда как у интактных мышей наблюдалось резкое снижение массы тела через 5 дней (D5) после контрольного заражения вирусом клады 2.1. Как показано на фиг. 5, масса тела мышей, вакцинированных VLP с PATH H5N1, существенно не изменялась после контрольного заражения вирусом клады 1. В отличие от этого, у интактных мышей наблюдалась быстрая потеря массы, начавшаяся на D3 после контрольного заражения.

COBRA, исследование 2A

Данное исследование проводили для тестирования протективной эффективности в отношении контрольного заражения вирусом клады 1 после единичной вакцинации мышей VLP, содержащими PATH H5N1 COBRA HA.

Мышей вакцинировали внутримышечно 3 мкг VLP, содержащими последовательность PATH H5N1 COBRA HA (SEQ ID NO: 1), VLP, содержащими последовательность COBRA-2 HA человека, или VLP, содержащими HA вируса гриппа Whooper Swan (A/Whooper Swan/Mongolia/244/2005). Вакцинацию выполняли на 0 неделе с адъювантом (Imject^TM). Мышей подвергали контрольному заражению 5000 БОЕ вируса Indonesia клады 2.1 (A/Indonesia/5/2005) или 5000 БОЕ вируса Vietnam клады 1 (A/Vietnam/1203/2004) на протяжении 4 недели. Образцы крови собирали на 0 неделе и 3 неделе. Легкие брали на анализ на D2 и D3 после контрольного заражения для определения концентрации вируса.

Как показано на фиг. 6, масса тела вакцинированных мышей существенно не изменялась после контрольного заражения вирусом Vietnam клады 1, тогда как у интактных мышей наблюдалась значительная потеря массы после D3.

COBRA, исследование 4A

Данное исследование проводили для тестирования протективной эффективности против вируса клады 1 после единичной вакцинации в отсутствии адъюванта. Мышей вакцинировали внутримышечно 3 мкг VLP с PATH H5N1 COBRA, VLP с COBRA-2 человека или VLP с Whooper Swan без адъюванта. Мышей подвергали контрольному заражению 5000 БОЕ вируса Vietnam клады 1 на протяжении 4 недели. Образцы крови собирали на 0 неделе и 3 неделе. Легкие брали на анализ на D2 и D3 после контрольного заражения для определения концентрации вируса.

Как показано на фиг. 7, интактные мыши умирали от инфекции к 7 дню, тогда как 40-60% вакцинированных мышей переживали контрольное заражение до 14 дня. А именно, после контрольного заражения выжило 60% мышей, вакцинированных VLP Human COBRA-2, в то время как 40% мышей, вакцинированных VLP с PATH H5N1 COBRA или VLP с Whooper Swan, выжило после контрольного заражения.

COBRA, исследование 5A

Данное исследование проводили для тестирования протективной эффективности против вируса клады 1 после единичной вакцинации адъювантом (Imject^TM) при более низкой дозе VLP (0,6 мкг). Мышей вакцинировали внутримышечно 0,6 мкг VLP с PATH H5N1 COBRA, VLP с COBRA-2 человека или VLP с Whooper Swan в присутствии адъюванта. Мышей подвергали контрольному заражению 5000 БОЕ вируса Vietnam клады 1 на протяжении 4 недели. Образцы крови собирали на 0 неделе и 3 неделе. Легкие брали на анализ на D2 и D3 после контрольного заражения для определения концентрации вируса.

Как показано на фиг. 8, масса тела вакцинированных мышей слегка понижалась после контрольного заражения вирусом, но возвращалась до нормальных уровней к D10. В отличие от этого, масса тела интактных мышей понижалась в значительной степени, и мыши не выздоравливали.

Ввиду многих возможных вариантов осуществления, к которым могут быть применены принципы раскрытого изобретения, следует признать, что проиллюстрированные варианты осуществления являются только предпочтительными примерами настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Напротив, объем настоящего изобретения определяется следующей формулой изобретения. Поэтому в качестве настоящего изобретения заявляется все, что находится в пределах объема и сущности данной формулы изобретения.

1. Рекомбинантный полипептид гемагглютинин (НА) вируса гриппа для вызова иммунного ответа на вирус гриппа H5N1, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 2-568 SEQ ID NO: 1.

2. Полипептид НА вируса гриппа по п. 1, состоящий из аминокислотной последовательности из остатков 2-568 SEQ ID NO: 1.

3. Полипептид НА вируса гриппа по п. 1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

4. Полипептид НА вируса гриппа по п. 1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

5. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид НА вируса гриппа по любому из пп. 1-4.

6. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 5, где молекула нуклеиновой кислоты подвергнута оптимизации кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих.

7. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 5 или 6.

8. Вектор по п. 7, дополнительно содержащий промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид НА вируса гриппа.

9. Выделенная клетка млекопитающего для выработки и экспрессии вирусоподобных частиц (VLP) вируса гриппа H5N1, содержащая вектор по п. 7 или 8.

10. Вирусоподобная частица (VLP) для вызова иммунного ответа на вирус гриппа H5N1, сходная с частицей вируса гриппа, содержащая полипептид НА вируса гриппа по любому из пп. 1-4, белок нейраминидазу (NA) вируса гриппа и матриксный белок (M1) вируса гриппа.

11. VLP для вызова иммунного ответа на вирус гриппа H5N1, сходная с частицей вируса гриппа, содержащая полипептид НА вируса гриппа по любому из пп. 1-4, получаемая путем трансфекции клетки-хозяина млекопитающего с помощью вектора, кодирующего полипептид НА, вектора, кодирующего белок NA вируса гриппа, и вектора, кодирующего белок Ml вируса гриппа, в условиях, достаточных для обеспечения экспрессии белков НА, M1 и NA.

12. Слитый белок для вызова иммунного ответа на вирус гриппа H5N1, содержащий полипептид НА вируса гриппа по любому из пп. 1-4, слитый с гетерологичным белком.

13. Композиция для вызова иммунного ответа на вирус гриппа H5N1, содержащая терапевтически эффективное количество полипептида НА вируса гриппа по любому из пп. 1-4, VLP по любому из пп. 10-11 или слитого белка по п. 12 и фармацевтически приемлемый носитель.

14. Способ вызова иммунного ответа в отношении вируса гриппа у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества полипептида НА вируса гриппа по любому из пп. 1-4, VLP по любому из пп. 10-11, слитого белка по п. 12 или композиции по п. 13.

15. Способ иммунизации субъекта против вируса гриппа, включающий введение субъекту композиции, содержащей терапевтически эффективное количество VLP по любому из пп. 10-11 и фармацевтически приемлемый носитель.

16. Способ по п. 15, где композиция дополнительно содержит адъювант.

17. Способ по п. 15 или 16, где композицию вводят внутримышечно.

18. Способ по п. 15, где композиция содержит от около 1 до около 25 мкг VLP.

19. Способ по п. 18, где композиция содержит около 15 мкг VLP.