Связывающий антитело полипептид, связывающий антитело гибридный полипептид и адсорбционный материал

Изобретение относится к связывающему антитело полипептиду, представленному в любой из SEQ ID NO: с 1 по 18, и адсорбционному материалу для антитела или производного антитела, где связывающий антитело полипептид иммобилизован на водонерастворимом носителе. Эти связывающий антитело полипептид и адсорбционный материал имеют прекрасные связывающие антитело свойства и селективность в отношении антител, а также прекрасную устойчивость к щелочи и временную стабильность. 5 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 25 пр.

 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

1. Область техники, к которой относится изобретение

[0001] Настоящее изобретение относится к связывающему антитело полипептиду, связывающему антитело гибридному полипептиду и адсорбционному материалу.

2. Описание предшествующего уровня техники

[0002] В последние годы разработка лекарств на основе антител стремительно развивается. Это происходит потому, что лекарства на основе антител, находящие применение для иммунной функции человека, могут, как ожидается, обладать высокой эффективностью и также проявлять относительно слабые побочные эффекты, в результате чего такие лекарства на основе антител, как считается, в будущем будут в центре терапевтического применения. Методом, существенным для разработки и практического применения лекарств на основе антител, является поточный, широкомасштабный и высокоскоростной метод очистки антител. В настоящее время наиболее общепринятым используемым методом очистки антител является аффинная хроматография с использованием протеина А.

[0003] Протеин А представляет собой мембранный белок, присутствующий в клеточной стенке Staphylococcus aureus, и как известно, обладающий высоким связывающим сродством к константной области (области Fc, Fc=фрагмент, кристаллизуемый) молекулы антитела. Так как общие структуры являются консервативными в константной области между классами и подклассами различных молекул антител, аффинная хроматография с использованием протеина А в качестве лиганда, связывающего антитело, может быть использована для очистки различных типов молекул антител против различных антигенов.

[0004] Однако, так как протеин А получают с использованием метода генетической инженерии, проблема состоит в том, что методы получения являются сложными, что, следовательно, ведет в результате к высокой стоимости получения. Кроме того, протеин А не может быть использован с повторяющимися несколько раз промывками из-за недостаточной устойчивости к щелочи и временной стабильности, а также короткого времени жизни, возникающего из-за сильной деградации, обусловленной щелочной промывкой колонки. По этим причинам стоимость очистки антител с большой вероятностью является высокой.

[0005] Чтобы справиться с такими проблемами, например, Li, R., Dowd, V., Steward, D. J., Burton, S. J., и Lowe, C. R., 1998, Nature Biotechnology, Vol. 16, pp. с 190 по 195 раскрывают низкомолекулярное соединение ApA (аббревиатура, принятая для «искусственного протеина А»), которое может быть получено в соответствии со следующей схемой реакций из дипептида, состоящего из фенилаланина 132 и тирозина 133 протеина А в качестве лиганда - миметика протеина А.

[0006]

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Как будет описано в представленных ниже примерах, однако, в соответствии с исследованиями, проведенными изобретателями настоящего изобретения, низкомолекулярное соединение ApA, описанное у Li, R., Dowd, V., Steward, D. J., Burton, S. J., и Lowe, C. R., 1998, Nature Biotechnology, Vol. 16, pp. с 190 до 195, проявляло недостаточные связывающие свойства и селективность в отношении антител, таким образом не удовлетворяя требуемому уровню, хотя имело достаточную устойчивость к щелочи и временную стабильность.

[0009] Соответственно, целью настоящего изобретения является предоставление связывающего антитело полипептида и адсорбционного материала, которые имеют прекрасные связывающие антитело свойства и селективность в отношении антител, а также прекрасную устойчивость к щелочи и временную стабильность.

[0010] В результате интенсивных исследований, направленных на решение вышестоящих проблем, изобретатели настоящего изобретения обнаружили, что связывающий антитело полипептид, как представлено в любой из SEQ ID NOs: с 1 по 18, имеет связывающие свойства и селективность в отношении антител, сопоставимые с протеином А, а также проявляет высокую устойчивость к щелочи и временную стабильность. Настоящее изобретение выполнено на основе этих данных.

[0011] Таким образом, в изобретении предлагается следующее с (1) по (13).

(1) Связывающий антитело полипептид, представленный в любой из SEQ ID NOs: с 1 по 18.

(2) Связывающий антитело полипептид, обладающий последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду, представленному в любой из SEQ ID NOs: с 1 по 18.

(3) Связывающий антитело полипептид, в котором от 1 до 10 аминокислотных остатков ковалентно связаны, по меньшей мере, с одним участком, выбранным из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи полипептида, обладающего последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду, представленному в любой из SEQ ID NOs: с 1 по 18.

(4) Связывающий антитело полипептид, в котором от 1 до 24 этиленгликольных единиц ковалентно связаны, по меньшей мере, с одним участком, выбранным из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи полипептида, обладающего последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду, представленному в любой из SEQ ID NOs: с 1 по 18.

(5) Связывающий антитело полипептид, в котором, по меньшей мере, один участок, выбранный из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи полипептида, обладающего последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду, представленному в любой из SEQ ID NOs: с 1 по 18, модифицирован.

(6) Связывающий антитело гибридный полипептид, в котором от 2 до 10 доменных единиц соединены ковалентной связью, при использовании в качестве одной доменной единицы связывающего антитело полипептида по любому из пунктов от (1) до (3).

(7) Связывающий антитело гибридный полипептид, в котором, по меньшей мере, один участок, выбранный из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи связывающего антитело гибридного полипептида, в котором от 2 до 10 доменных единиц соединены ковалентной связью, при использовании в качестве одной доменной единицы связывающего антитело полипептида по любому из пунктов от (1) до (3), модифицирован.

(8) Связывающий антитело гибридный полипептид по п. (6) или (7), где связывающий антитело гибридный полипептид включает от 2 до 5 указанных выше доменных единиц и линкер, соединяющий указанные выше доменные единицы.

(9) Связывающий антитело гибридный полипептид по п. (8), в котором линкер представляет собой, по меньшей мере, один линкер, выбранный из группы, состоящей из пептидного линкера, состоящего из от 1 до 10 аминокислотных остатков на один линкер, полиэтиленгликольного (ПЭГ) линкера, состоящего из от 1 до 24 этиленгликольных единиц на один линкер, и комплексного линкера, состоящего из от 1 до 10 аминокислотных остатков и от 1 до 24 этиленгликольных единиц на один линкер.

(10) Связывающий антитело гибридный полипептид по п. (9), в котором линкер представляет собой, по меньшей мере, один линкер, выбранный из группы, состоящей из пептидного линкера, состоящего из от 1 до 10 аминокислотных остатков на один линкер, и комплексного линкера, состоящего из от 1 до 10 аминокислотных остатков и от 1 до 24 этиленгликольных единиц на один линкер, и от 1 до 10 аминокислотных остатков включают, по меньшей мере, один остаток, по меньшей мере, аминокислоты одного типа, выбранной из группы, состоящей из глицина (Gly), аланина (Ala) и серина (Ser).

(11) Связывающий антитело гибридный полипептид по п. (9), в котором линкер представляет собой, по меньшей мере, один линкер, выбранный из группы, состоящей из пептидного линкера, состоящего из от 1 до 10 аминокислотных остатков на один линкер, и комплексного линкера, состоящего из от 1 до 10 аминокислотных остатков и от 1 до 24 этиленгликольных единиц на один линкер, и от 1 до 10 аминокислотных остатков включают, по меньшей мере, один остаток, по меньшей мере, аминокислоты одного типа, выбранной из группы, состоящей из лизина (Lys), орнитина (Orn) и цистеина (Cys).

(12) Связывающий антитело гибридный полипептид по любому из пунктов с (9) по (11), где суммарная молекулярная масса аминокислотных остатков, содержащихся в доменной единице, и линкере, составляет 5000 или менее.

(13) Адсорбционный материал для антитела или производного антитела, где связывающий антитело полипептид по любому из пунктов с (1) по (5) или связывающий антитело гибридный полипептид по любому из пукнтов с (6) по (12) иммобилизован на водонерастворимом носителе.

[0012] В соответствии с настоящим изобретением можно предложить связывающий антитело полипептид, который имеет прекрасные связывающие свойства и селективность в отношении антител, а также прекрасную устойчивость к щелочи и временную стабильность, адсорбционный материал для антитела или производного антитела, который имеет прекрасные связывающие свойства и селективность в отношении антител, а также прекрасную устойчивость к щелочи и временную стабильность.

[0013] Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением можно создать лучше отлаженный способ, так как промывка щелочью или тому подобным может быть усилена по сравнению с протеином А.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0014] В настоящем изобретении аминокислоты указаны по общим правилам с использованием названий, аббревиатур или тому подобного, утвержденных объединенной комиссией по биохимической номенклатуре (JCBN) международного союза теоретической и прикладной химии и международного союза биохимии и молекулярной биологии IUPAC-IUB. Аминокислотные остатки указаны с использованием аббревиатур аминокислот, от которых произошли соответствующие аминокислотные остатки. Следует отметить, что аминокислотный остаток включает N-концевую аминокислоту (N-концевой остаток) и C-концевую аминокислоту (C-концевой остаток).

Кроме того, если не указано иначе, аминокислотная последовательность (также обозначаемая как «первичная структура») полипептида или белка представлена таким образом, что аминокислотные остатки организованы в одном измерении в направлении от N-конца к C-концу в порядке слева направо.

[0015] Названия и аббревиатуры (однобуквенные аббревиатуры и трехбуквенные аббревиатуры) аминокислот, для которых однобуквенные аббревиатуры и трехбуквенные аббревиатуры официально приняты, представлены в таблице 1.

Аминокислоты	Однобуквенные аббревиатуры	Трехбуквенные аббревиатуры		Аминокислоты	Однобуквенные аббревиатуры	Трехбуквенные аббревиатуры
Аланин	A	Ala		Пролин	P	Pro
Цистеин	C	Cys		Глутамин	Q	Gln
Аспарагиновая кислота	D	Asp		Аргинин	R	Arg
Глутаминовая кислота	E	Glu		Серин	S	Ser
Фенилаланин	F	Phe		Треонин	T	Thr
Глицин	G	Gly		Селеноцистеин	U	Sec
Гистидин	H	His		Валин	V	Val
Изолейцин	I	Ile		Триптофан	W	Trp
Лизин	K	Lys		Тирозин	Y	Tyr
Лейцин	L	Leu		Asp или Asn	B	Asx
Метионин	M	Met		Glu или Gln	Z	Glx
Аспарагин	N	Asn		Произвольная аминокислота	X	Xaa
Пирролизин	O	Pyl

[0017] Так называемые неприродные аминокислоты, которые будут описаны в настоящем документе ниже, перечисленные в таблице 1 в дополнение к обычным аминокислотам, могут быть использованы в качестве аминокислоты.

В настоящем изобретении термин «неприродная аминокислота» относится к аминокислоте, которая в природе не кодируется мРНК. Неприродные аминокислоты особенно не ограничиваются, и их примеры включают 2,3-диаминопропионовую кислоту (Dpr), 2,4-диаминомасляную кислоту (Dbu), орнитин (Orn), 3-гидроксипролин (3Hyp), 4-гидроксипролин (4Hyp), 2-аминоадипиновую кислоту (Aad), 2-аминомасляную кислоту (Abu), 2-аминоизомасляную кислоту (Aib), 2-аминовалериановую кислоту (норвалин; Nva), 2-аминокапроновую кислоту (норлейцин; Nle), 2-аминогептановую кислоту (Ahe), 2-аминопимелиновую кислоту (Apm), 2,2'-диаминопимелиновую кислоту (Dpm), аллогидроксилизин (aHyl), аллоизолейцин (aIle), 6-N-метиллизин (MeLys), теанин (2-амино-4-(этилкарбамоил)масляную кислоту), цитруллин (2-амино-5-(карбамоиламино)валериановую кислоту), десмозин (Des) и изодесмозин (Ide).

В том случае, когда используется неприродная аминокислота, ее предпочтительно использовать в линкерной части для связывания полипептида с носителем или в линкерной части, связывающей домены гибридного пептида.

[0018] В настоящем изобретении термин «единица домена» представляет собой единицу в структуре белка или полипептида более высокого порядка и обозначает единицу аминокислотного полимера, которая состоит из последовательности приблизительно от пяти до нескольких сотен аминокислотных остатков и, следовательно, достаточна для проявления некоторых типов физико-химических или биохимических функций.

[0019] В настоящем изобретении термин «гибридный полипептид» относится к полимерному соединению, которое образовано путем соединения двух или более полипептидов (доменных единиц), имеющих некоторые типы физико-химических или биохимических функций, прямо или через линкер.

В настоящем изобретении линкер, соединяющий доменные единицы, особенно не ограничивается, и его примеры включают пептидный линкер, состоящий из пептидных единиц (аминокислотных остатков), ПЭГ (полиэтиленгликольный) линкер, состоящий из этиленгликольных единиц, дисульфидной связи (SS-связи) и их сочетаний.

[0020] В настоящем изобретении термин «антитело» относится к иммуноглобулину или его аналогу, фрагменту или гибридному белку. При применении в настоящем описании термин «аналог» относится к природному или искусственно созданному белку или конъюгату белка, в котором структура или функция иммуноглобулина, по меньшей мере, частично сохранена. Кроме того, термин «фрагмент» относится к белку, обладающему частичной структурой иммуноглобулина, который создан в результате обработки ферментами или с помощью генетической инженерии. Далее, термин «гибрид» относится к белку, созданному с помощью генно-инженерного соединения функциональной части белка, обладающего биологической активностью, такого как различные цитокины или рецепторы цитокинов, с полноразмерным иммуноглобулином или его частью. Дополнительно антитело предпочтительно представляет собой моноклональное антитело или гибрид, имеющий Fc область иммуноглобулина, и более предпочтительно представляет собой моноклональное антитело. В настоящем изобретении иммуноглобулин может представлять собой любой иммуноглобулин из пяти классов (изотипов) иммуноглобулинов G (IgG), иммуноглобулинов M (IgM), иммуноглобулинов A (IgA), иммуноглобулинов D (IgD) и иммуноглобулинов E (IgE), но предпочтительно представляет собой IgG или IgM и более предпочтительно IgG.

[0021] В настоящем изобретении термин «производное антитела» относится к гибридному антителу, в котором область Fc иммуноглобулина человека соединена с областью Fab иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, к гибридному антителу, в котором несколько областей Fc иммуноглобулина человека соединены с несколькими областями Fv иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, к гуманизированному антителу, в котором оставшаяся часть за исключением части области, определяющей комплементарность (CDR) иммуноглобулина человека, соединена с областью CDR, иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, к гибридному антителу, в котором область Fc иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, соединена с областью Fab иммуноглобулина человека, к гибридному антителу, в котором несколько областей Fc иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, соединены с несколькими областями Fv иммуноглобулина человека, к антителу млекопитающих, не относящихся к человеку, в котором оставшаяся часть за исключением части CDR иммуноглобулина человека соединена с областью CDR антитела млекопитающих, не относящихся к человеку, к гибридному антителу, в котором область Fc иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, соединена с областью Fab иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, к гибридному антителу, в котором несколько областей Fc глобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, соединены с несколькими областями Fv иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, к антителу млекопитающих, не относящихся к человеку, в котором оставшаяся часть за исключением части области CDR (области определяющей комплементарность) иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, соединена с областью CDR, иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, и белок оставшейся Fc области представляет собой белок, к которому добавляют химические модификации указанных выше антител.

[0022] В настоящем изобретении термин «свойства связывания антитела» относится к связыванию антитела или производного антитела с определенной аффинностью. Связывание антитела или производного антитела предпочтительно представляет собой связывание путем взаимодействия антигена с антителом, и сайт связывания предпочтительно представляет собой константную область (область Fc, область C_L или область C_H) антитела или производного антитела.

[0023] В настоящем изобретении термин «лиганд» относится к молекуле, которая связывается с определенным веществом с определенной аффинностью. Примеры таких молекул включают белок, полипептид и низкомолекулярное соединение. В настоящем изобретении термин «лиганд, связывающий антитело» относится к лиганду, обладающему связывающими свойствами в отношении антитела, т.е. к лиганду, который связывается с антителом или производным антитела с определенной аффинностью. В настоящем изобретении лиганд, связывающий антитело, предпочтительно связывается с антителом или производным антитела в результате взаимодействия антигена с антителом, в результате которого возникает аффинность между специфическими молекулами, и сайт связывания предпочтительно представляет собой константную область (область Fc, область C_L (константную область легкой цепи) или область C_H (константную область тяжелой цепи) антитела или производного антитела с точки зрения разнообразия.

[0024] [Связывающий антитело полипептид]

В настоящем изобретении предлагается связывающий антитело полипептид, как представлено в любой их SEQ ID NOs: с 1 по 18. Этот связывающий антитело полипептид представляет собой полипептид, который связывается с антителом или производным антитела с определенной степенью сродства и связывается с константной областью (областью Fc) антитела или производного антитела.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается связывающий антитело полипептид, имеющий последовательность, гомологичную на 85% или более, еще более предпочтительно на 90% или более и даже более предпочтительно на 95% или более, полипептиду, как представлено в любой их SEQ ID NOs: с 1 по 18.

[0026] В настоящем изобретении гомологию двух аминокислотных последовательностей определяют следующим образом.

(1) Осуществляют выравнивание двух аминокислотных последовательностей.

Выравнивание осуществляют до достижения максимальных очков выравнивания таким образом, что подобранной паре дается очко +1, неподобранной паре дается очко -1, и пропуску дается очко -1.

(2) Рассчитывают гомологию последовательностей.

На основе полученного выравнивания гомологию последовательностей рассчитывают в соответствии со следующим равенством.

Гомология последовательностей [%]=(количество совпадающих положений/суммарное количество положений)×100[%]

Суммарное количество положений представляет собой длину выравнивания, а количество совпадающих положений представляет собой количество положений, в которых типы аминокислот совпадают.

В настоящем изобретении будут ли совпадать типы аминокислотных остатков или нет, будет основываться на том, будут ли структуры боковых цепей аминокислот (аминокислотные боковые цепи), на которых основаны соответствующие аминокислотные остатки, идентичны друг другу или нет. Структуры боковых цепей энантиомерных аминокислот не идентичны друг другу.

(3) Пример расчета гомологии последовательностей

В качестве примера дано рассмотрение следующих аминокислотных последовательностей.

Последовательность A EQQNAFY

Последовательность B KEQQSAFY

Когда эти аминокислотные последовательности выравниваются в условиях, описанных выше, они становятся следующими. В настоящем описании для ясности описания черта гомологии «|» присоединяется к тому месту, где типы аминокислот (остатков) совпадают между последовательностями A и B. Кроме того, «-» представляет собой пробел.

Очки для этого выравнивания составляют совпадения (+1)×6+несовпадения (-1) ×1+пробел (-1)×1=4.

В этом примере, так как суммарное количество положений равно 8, а количество совпадающих положений равно 6, гомология последовательностей, рассчитанная в соответствии с представленным выше равенством, составляет 6/8×100=75,0%.

[0027] Примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (EQQNAFY), как представлено в SEQ ID NO: 1, включают полипептид (KEQQNAFY, 87,5%), как представлено в SEQ ID NO: 2, полипептид (EGQNAFY, 85,7%) как представлено в SEQ ID NO: 5, полипептид (EQNAFY, 85,7%) как представлено в SEQ ID NO: 9, полипептид (EQQSAFY, 85,7%) как представлено в SEQ ID NO: 10, полипептид (EAQQNAFY, 87,5%) как представлено в SEQ ID NO: 16, полипептид (EQQNAFY-NH₂, 100%) (в котором «-NH₂» представляет собой амидирование N-концевой карбоксильной группы. То же самое будет применяться в настоящем описании далее, как представлено в SEQ ID NO: 19, полипептид (Ac-EQQNAFYK, 87,5%) (в котором «Ac-» представляет собой ацетилирование C-концевой аминогруппы. То же самое будет применяться в настоящем описании далее, как представлено в SEQ ID NO: 20, и полипептид (H₂N-(peg)₈-EQQNAFYE, 87,5%) (где «peg» представляет собой единицу этиленгликоля, и «H₂N-(peg)₈-» демонстрирует, что полиэтиленгликольная цепь, состоящая из восьми этиленгликольных единиц, имеющая аминогруппу на конце, противоположном концу, связанному с полипептидной основной цепью, связана с N-концевой аминогруппой. То же самое будет применяться в настоящем описании далее, как представлено в SEQ ID NO: 24. Иногда процент, представленный после аминокислотной последовательности в скобках, представляет собой гомологию последовательности с полипептидом, представленным в SEQ ID NO: 1.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 87% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 1, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 2, полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 16, полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 19, полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 20, и полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 24.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 90% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 1, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 19.

[0028] Примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (KEQQNAFY), как представлено в SEQ ID NO: 2, включают полипептид (EQQNAFY, 87,5%), как представлено в SEQ ID NO: 1, и полипептид (EQQNAFY-NH₂, 87,5%), как представлено в SEQ ID NO: 19. Иногда процент, представленный после аминокислотной последовательности в скобках, представляет собой гомологию последовательности с полипептидом, как представлено в SEQ ID NO: 2.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 87% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 2, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 1, и полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 19.

[0029] Примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (EQQNAFYEILH), как представлено в SEQ ID NO: 3, включают полипептид (EQQNAFYEILHL, 91,7%) как представлено в SEQ ID NO: 4, полипептид (EQQSAFYEILH, 90,9%), как представлено в SEQ ID NO: 11, и полипептид (Ac-EQQNAFYEILHK, 91,7%) как представлено в SEQ ID NO: 21. Иногда процент, представленный после аминокислотной последовательности в скобках, представляет собой гомологию последовательности с полипептидом, как представлено в SEQ ID NO: 3.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 87% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 3, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 4, полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 11, и полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 21.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 90% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 3, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 4, полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 11, и полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 21.

[0030] Примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (EQQNAFYEILHL), как представлено в SEQ ID NO: 4, включают полипептид (EQQNAFYEILH, 91,7%), как представлено в SEQ ID NO: 3 и полипептид, (Ac-EQQNAFYEILHK, 91,7%) как представлено в SEQ ID NO: 21. Иногда процент, представленный после аминокислотной последовательности в скобках, представляет собой гомологию последовательности с полипептидом, как представлено в SEQ ID NO: 4.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 87% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 4, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 3, и полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 21.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 90% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 4, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 3, и полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 21.

[0031] Примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (EGQNAFY), как представлено в SEQ ID NO: 5, включают полипептид, (EQQNAFY, 85,7%) как представлено в SEQ ID NO: 1, полипептид, (EQNAFY, 85,7%), как представлено в SEQ ID NO: 9, и полипептид, (EQQNAFY-NH₂, 85,7%), как представлено в SEQ ID NO: 19. Иногда процент, представленный после аминокислотной последовательности в скобках, представляет собой гомологию последовательности с полипептидом, как представлено в SEQ ID NO: 5.

[0032] Примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (KKKEQQNAFYKKK), как представлено в SEQ ID NO: 6, включают полипептид (Ac-KKKEQQNAFYKKK, 100%), как представлено в SEQ ID NO: 22. Иногда процент, представленный после аминокислотной последовательности в скобках, представляет собой гомологию последовательности с полипептидом, как представлено в SEQ ID NO: 6.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 87% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 6, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 22.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 90% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 6, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 22.

[0033] Примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (KKKEQQNAFYEILHKKK), как представлено в SEQ ID NO: 7, включают полипептид (Ac-KKKEQQNAFYEILHKKK, 100%), как представлено в SEQ ID NO: 23. Иногда процент, представленный после аминокислотной последовательности в скобках, представляет собой гомологию последовательности с полипептидом, как представлено в SEQ ID NO: 7.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 87% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 7, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 23.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 90% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 7, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 23.

[0034] Примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (EQNAFY), как представлено в SEQ ID NO: 9, включают полипептид, (EQQNAFY, 85,7%), как представлено в SEQ ID NO: 1, полипептид, (EGQNAFY, 85,7%), как представлено в SEQ ID NO: 5, и полипептид, (EQQNAFY-NH₂, 85,7%), как представлено в 19. Иногда процент, представленный после аминокислотной последовательности в скобках, представляет собой гомологию последовательности с полипептидом, как представлено в SEQ ID NO: 9.

[0035] Примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (EQQSAFY), как представлено в SEQ ID NO: 10, включают полипептид (EQQNAFY, 85,7%), как представлено в SEQ ID NO: 1, полипептид (DQQSAFY, 85,7%), как представлено в SEQ ID NO: 12, полипептид (EAQQSAFY, 87,5%), как представлено в SEQ ID NO: 14, полипептид (EQSAFY, 85,7%), как представлено в SEQ ID NO: 15, и полипептид (EQQNAFY-NH₂, 85,7%), как представлено в SEQ ID NO: 19. Иногда процент, представленный после аминокислотной последовательности в скобках, представляет собой гомологию последовательности с полипептидом, как представлено в SEQ ID NO: 10.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 87% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 10, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 14.

[0036] Примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (EQQSAFYEILH), как представлено в SEQ ID NO: 11, включают полипептид (EQQNAFYEILH, 90,9%), как представлено в SEQ ID NO: 3, и полипептид (DQQSAFYEILH, 90,9%), как представлено в SEQ ID NO: 13. Иногда процент, представленный после аминокислотной последовательности в скобках, представляет собой гомологию последовательности с полипептидом, как представлено в SEQ ID NO: 11.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 87% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 11, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 3, и полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 13.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 90% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 11, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 3, и полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 13.

[0037] Примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (DQQSAFY), как представлено в SEQ ID NO: 12, включают полипептид (EQQSAFY, 85,7%) как представлено в SEQ ID NO: 10, полипептид (DAQQSAFY, 87,5%), как представлено в SEQ ID NO: 17, и полипептид (DQSAFY, 85,7%), как представлено в SEQ ID NO: 18. Иногда процент, представленный после аминокислотной последовательности в скобках, представляет собой гомологию последовательности с полипептидом, как представлено в SEQ ID NO: 12.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 87% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 12, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 17.

[0038] Примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (DQQSAFYEILH), как представлено в SEQ ID NO: 13, включают полипептид (EQQSAFYEILH, 90,9%) как представлено в SEQ ID NO: 11. Иногда процент, представленный после аминокислотной последовательности в скобках, представляет собой гомологию последовательности с полипептидом, как представлено в SEQ ID NO: 13.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 87% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 13, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 11.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 90% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 13, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 11.

[0039] Примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (EAQQSAFY), как представлено в SEQ ID NO: 14, включают полипептид (EQQSAFY, 87,5%), как представлено в SEQ ID NO: 10, полипептид (EAQQNAFY, 87,5%), как представлено в SEQ ID NO: 16, и полипептид (DAQQSAFY, 87,5%), как представлено в SEQ ID NO: 17. Иногда процент, представленный после аминокислотной последовательности в скобках, представляет собой гомологию последовательности с полипептидом, как представлено в SEQ ID NO: 14.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 87% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 14, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 10, полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 16, и полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 17.

[0040] Примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (EQSAFY), как представлено в SEQ ID NO: 15, включают полипептид (EQQSAFY, 87,5%) как представлено в SEQ ID NO: 10. Иногда процент, представленный после аминокислотной последовательности в скобках, представляет собой гомологию последовательности с полипептидом, как представлено в SEQ ID NO: 15.

[0041] Примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (EAQQNAFY), как представлено в SEQ ID NO: 16, включают полипептид (EQQNAFY, 87,5%), как представлено в SEQ ID NO: 1, полипептид (EAQQSAFY, 87,5%), как представлено в SEQ ID NO: 14, и полипептид (EQQNAFY-NH₂, 87,5%), как представлено в SEQ ID NO: 19. Иногда процент, представленный после аминокислотной последовательности в скобках, представляет собой гомологию последовательности с полипептидом, как представлено в SEQ ID NO: 16.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 87% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 16, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 1, полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 14, и полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 19.

[0042] Примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (DAQQSAFY), как представлено в SEQ ID NO: 17, включают полипептид (DQQSAFY, 87,5%), как представлено в SEQ ID NO: 12, и полипептид (EAQQSAFY, 87,5%), как представлено в SEQ ID NO: 14. Иногда процент, представленный после аминокислотной последовательности в скобках, представляет собой гомологию последовательности с полипептидом, как представлено в SEQ ID NO: 17.

Кроме того, примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 87% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 17, включают полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 12, и полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 14.

[0043] Примеры связывающих антитело полипептидов с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (DQSAFY), как представлено в SEQ ID NO: 18, включают полипептид (DQQSAFY, 85,7%), как представлено в SEQ ID NO: 12. Иногда процент, представленный после аминокислотной последовательности в скобках, представляет собой гомологию последовательности с полипептидом, как представлено в SEQ ID NO: 18.

[0044] Связывающий антитело полипептид с последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду, как представлено в любой из SEQ ID NOs: с 2 по 4, предпочтительно представляет собой связывающий антитело полипептид без изменений аминокислотной последовательности в части, указанной как EQQNAFY в аминокислотной последовательности, или связывающий антитело полипептид с заменой в аминокислотной последовательности такой части как EGQNAFY или EQQSAFY, и предпочтительно связывающий антитело полипептид без изменений аминокислотной последовательности в такой части.

[0045] Кроме того, в настоящем изобретении предлагается связывающий антитело полипептид, в котором от 1 до 10 аминокислотных остатков и предпочтительно от 1 до 5 аминокислотных остатков, каждый независимо ковалентно связан, по меньшей мере, с одним участком, выбранным из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи полипептида, обладающего последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду, представленному в любой из SEQ ID NOs: с 1 по 18.

[0046] Указанные выше аминокислота или полипептид, состоящий из от 1 до 10 аминокислотных остатков, могут быть использованы, например, в качестве линкера, соединяющего с материалом подложки (носителем). Примеры линкера, соединяющего с носителем, включают Cys, имеющий тиоловую группу, Lys, Orn, Dbu и Dpr, имеющие аминогруппу, Glu и Asp, имеющие карбоксильную группу, Ser, Thr и Tyr, имеющие гидроксильную группу, и оставшиеся His и Arg. Кроме того, может быть использовано множество этих аминокислотных остатков. Кроме того, предпочтительные примеры аминокислотной боковой цепи для отбора включают Cys, имеющий тиоловую группу, Lys, Orn, Dbu и Dpr, имеющие аминогруппу, Glu и Asp, имеющие карбоксильную группу, Ser, Thr и Tyr, имеющие гидроксильную группу, и оставшиеся His и Arg.

[0047] У концевого участка или боковой цепи на стороне, противоположной той стороне, на которой указанный выше линкер, состоящий из от 1 до 10 аминокислотных остатков, связан с основной цепью или боковой цепью полипептида, может быть введена иммобилизирующая функциональная группа. Примеры иммобилизирующих функциональных групп включают аминогруппу, карбоксильную группу, гидроксильную группу и тиоловую группу.

[0048] Примеры связывающих антитело полипептидов, в которых от 1 до 10 аминокислотных остатков и предпочтительно от 1 до 5 аминокислотных остатков, каждый независимо ковалентно связан, по меньшей мере, с одним участком, выбранным из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи полипептида, обладающего последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (EQQNAFY), как представлено в SEQ ID NO: 1, включают полипептид (KKKEQQNAFYKKK), как представлено в SEQ ID NO: 6. Следует отметить, что этот полипептид представляет собой полипептид, в котором «KKK», состоящий из 3 аминокислотных остатков, является связанным с пептидом на каждом N-концевом и C-концевом участке полипептида (EQQNAFY), обладающего 100% гомологией последовательности с полипептидом, представленным в SEQ ID NO: 1.

[0049] Примеры связывающих антитело полипептидов, в которых от 1 до 10 аминокислотных остатков и предпочтительно от 1 до 5 аминокислотных остатков, каждый независимо ковалентно связан, по меньшей мере, с одним участком, выбранным из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи полипептида, обладающего последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (EQQNAFYEILH), как представлено в SEQ ID NO: 3, включают полипептид (KKKEQQNAFYEILHKKK), как представлено в SEQ ID NO: 7. Следует отметить, что этот полипептид представляет собой полипептид, в котором «KKK», состоящий из 3 аминокислотных остатков, является связанным с пептидом на каждом N-концевом и C-концевом участке полипептида (EQQNAFYEILH), обладающего 100% гомологией последовательности с полипептидом, представленным в SEQ ID NO: 3.

[0050] Кроме того, аминокислотная последовательность связывающего антитело полипептида, в котором от 1 до 10 аминокислотных остатков и предпочтительно от 1 до 5 аминокислотных остатков, каждый независимо ковалентно связан, по меньшей мере, с одним участком, выбранным из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи полипептида, обладающего последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 1, предпочтительно не содержит, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, как представлено в SEQ ID NOs: с 2 по 8, и более предпочтительно не содержит никакой аминокислотной последовательности.

[0051] Кроме того, аминокислотная последовательность полипептида, в котором от 1 до 10 аминокислотных остатков и предпочтительно от 1 до 5 аминокислотных остатков, каждый независимо ковалентно связан, по меньшей мере, с одним участком, выбранным из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи полипептида, обладающего последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 2, предпочтительно не содержит, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, как представлено в SEQ ID NOs: 6 и 7.

[0052] Кроме того, аминокислотная последовательность полипептида, в котором от 1 до 10 аминокислотных остатков и предпочтительно от 1 до 5 аминокислотных остатков, каждый независимо ковалентно связан, по меньшей мере, с одним участком, выбранным из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи полипептида, обладающего последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 3, предпочтительно не содержит, по меньшей мере, одной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, как представлено в SEQ ID NOs: 4 и 7.

[0053] Кроме того, в настоящем изобретении предлагается связывающий антитело полипептид, в котором от 1 до 24 этиленгликольных единиц и предпочтительно от 4 до 8 этиленгликольных единиц, каждая независимо ковалентно связана, по меньшей мере, с одним участком, выбранным из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи полипептида, обладающего последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду, как представлено в любой из SEQ ID NOs: с 1 по 18.

[0054] Указанная выше полиэтиленгликольная цепь, состоящая из от 1 до 24 этиленгликольных единиц, может быть также использована в качестве линкера для материала подложки (носителя). В том случае, когда ее используют в качестве линкера, связывающего с носителем, иммобилизирующая функциональная группа для иммобилизации на носителе может быть введена на концевом участке, на стороне, противоположной той стороне, на которой происходит связывание с основной цепью или боковой цепью полипептида. Примеры иммобилизирующей функциональной группы включают аминогруппу, карбоксильную группу, гидроксильную группу и тиоловую группу.

[0055] Примеры связывающего антитело полипептида, в котором от 1 до 24 этиленгликольных единиц и предпочтительно от 4 до 8 этиленгликольных единиц, каждая независимо ковалентно связана, по меньшей мере, с одним участком, выбранным из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи полипептида, обладающего последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду (EQQNAFY), как представлено в SEQ ID NO: 1, включают полипептид (H₂N-(peg)₈-EQQNAFYE), как представлено в SEQ ID NO: 24. Этот полипептид представляет собой полипептид, в котором полиэтиленгликоль, состоящий из 8 этиленгликольных единиц, имеющий аминогруппу на конце стороны, противоположной стороне, на которой происходит связывание полипептида, ковалентно связан с N-концом полипептида (EQQNAFYE), обладающего последовательностью на 87,5% гомологичной полипептиду, как представлено в SEQ ID NO: 1.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается связывающий антитело полипептид, в котором модифицирован, по меньшей мере, один участок, выбранный из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи полипептида, обладающего последовательностью на 85% или более гомологичной полипептиду, как представлено в любой из SEQ ID NOs: с 1 по 18.

[0057] Модификация представляет собой предпочтительно введение защитной группы или введение иммобилизирующей функциональной группы для иммобилизации полипептида на носителе. Примеры модификаций включают ацетилирование N-конца, добавление Boc (трет-бутилкарбонилирование), амидирование C-конца и этерификацию. Кроме того, может быть добавлен линкер для иммобилизации на носителе. Например, иллюстрацией может быть присоединение полиэтиленгликольной цепи, состоящей из от 1 до 24 этиленгликольных единиц. На конце стороны, противоположной стороне связывания с полипептидом этой полиэтиленгликольной цепи, может быть гидроксильная группа, но может быть введена иммобилизирующая функциональная группа, такая как аминогруппа, карбоксильная группа или тиоловая группа.

[0058] Кроме того, аминокислотная боковая цепь может быть модифицирована. Примеры модификаций аминокислотной боковой цепи включают, но особенно не ограничиваются этим, фосфорилирование гидроксильной группы боковой цепи (остатков Tyr, Ser или Thr), метилирование аминогруппы боковой цепи (остатка Lys) и ацетилирование аминогруппы боковой цепи (остатка Lys).

[0059] Связывающий антитело полипептид по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой полипептид, как представлено в любой из SEQ ID NOs: с 1 по 4, полипептид, обладающий последовательностью на 85% или более гомологичной такому полипептиду, полипептид, в котором от 1 до 10 аминокислотных остатков, каждый ковалентно связан, по меньшей мере, с одним участком, выбранным из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи такого полипептида, или полипептид, в котором, по меньшей мере, один участок, выбранный из N-концевого, C-концевого участка и аминокислотной боковой цепи полипептида, обладающего последовательностью на 85% или более гомологичной такому полипептиду, модифицирован, более предпочтительно полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 1 или 3, полипептид, обладающий последовательностью на 85% или более гомологичной такому полипептиду, или полипептид, в котором от 1 до 10 аминокислотных остатков, каждый ковалентно связан, по меньшей мере, с одним участком, выбранным из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи такого полипептида, и еще более предпочтительно полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 1, полипептид, обладающий последовательностью на 85% или более гомологичной такому полипептиду, или полипептид, в котором от 1 до 10 аминокислотных остатков, каждый ковалентно связан, по меньшей мере, с одним участком, выбранным из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи такого полипептида.

[0060] Кроме того, связывающий антитело полипептид по настоящему изобретению предпочтительно содержит линкерную часть для иммобилизации на носителе и предпочтительно представляет собой полипептид, в котором от 1 до 10 аминокислотных остатков, каждый ковалентно связан, по меньшей мере, с одним участком, выбранным из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи полипептида, как представлено в любой из SEQ ID NOs: с 1 по 4, более предпочтительно полипептид, в котором от 1 до 10 аминокислотных остатков, каждый ковалентно связан, по меньшей мере, с одним участком, выбранным из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи полипептида, как представлено в SEQ ID NO: 1 или 3, и еще более предпочтительно полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 6 или 7.

Особенно предпочтительным является полипептид, как представлено в SEQ ID NO: 7.

[0061] [Связывающий антитело гибридный полипептид]

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается связывающий антитело гибридный полипептид, в котором от 2 до 10 доменных единиц соединены ковалентными связями при рассмотрении в качестве одной доменной единицы указанного выше связывающего антитело полипептида.

В результате создания связывающего антитело гибридного полипептида можно увеличить способность связывания с антителом и производным антитела.

[0062] По меньшей мере, один участок, выбранный из N-концевого, C-концевого участков и аминокислотной боковой цепи этого связывающего антитело гибридного полипептида, может быть модифицирован.

Модификация представляет собой предпочтительно введение защитной группы или введение иммобилизирующей функциональной группы для иммобилизации полипептида на носителе. Примеры модификаций включают ацетилирование N-конца, добавление Boc (трет-бутилкарбонилирование), амидирование C-конца и этерификацию. Кроме того, может быть добавлен линкер для иммобилизации на носителе. Например, иллюстрацией может быть присоединение полиэтиленгликольной цепи, состоящей из от 1 до 24 этиленгликольных единиц. На конце стороны, противоположной стороне связывания с полипептидом этой полиэтиленгликольной цепи, может быть гидроксильная группа, но может быть введена иммобилизирующая функциональная группа, такая как аминогруппа, карбоксильная группа или тиоловая группа.

Кроме того, аминокислотная боковая цепь может быть модифицирована. Примеры модификаций аминокислотной боковой цепи включают, но особенно не ограничиваются этим, фосфорилирование гидроксильной группы боковой цепи (остатков Tyr, Ser или Thr), метилирование аминогруппы боковой цепи (остатка Lys) и ацетилирование аминогруппы боковой цепи (остатка Lys).

[0063] Такой связывающий антитело гибридный полипептид может представлять собой связывающий антитело гибридный полипептид, содержащий от 2 до 5 доменных единиц, описанных выше, и линкер, соединяющий доменные единицы.

[0064] Линкер практически не ограничивается до тех пор, пока он способен ковалентно связываться с полипептидом, тем самым создавая связь между доменными единицами. Линкер предпочтительно представляет собой линкер, состоящий из аминокислотных остатков и/или этиленгликольных единиц.

В том случае, когда линкер состоит из аминокислотных остатков (пептидных единиц) (в настоящем описании далее линкер, состоящий из аминокислотных остатков, иногда обозначается как пептидный линкер), количество аминокислотных остатков на один линкер особенно не ограничивается, но предпочтительно составляет от 1 до 10 и более предпочтительно от 1 до 5.

Кроме того, в том случае, когда линкер состоит из этиленгликольных единиц (в настоящем описании далее линкер, состоящий из этиленгликольных единиц, иногда обозначается как ПЭГ линкер), количество этиленгликольных единиц на один линкер особенно не ограничивается, но предпочтительно составляет от 1 до 24, более предпочтительно от 1 до 12, и еще более предпочтительно от 4 до 8.

Кроме того, в том случае, когда линкер состоит из аминокислотных остатков и этиленгликольных единиц (в настоящем описании далее линкер, состоящий из аминокислотных остатков и этиленгликольных единиц, иногда обозначается как комплексный линкер), аминокислотные остатки и этиленгликольные единицы могут быть связаны случайным образом или альтернативно, и один или множество блоков, состоящих из аминокислотных остатков, и один или множество блоков, состоящих из этиленгликольных единиц, могут быть соединены. Суммарное количество аминокислотных остатков в том случае, когда линкер состоит из аминокислотных остатков и этиленгликольных единиц, особенно не ограничивается, но предпочтительно составляет от 1 до 10 и более предпочтительно от 1 до 5. Суммарное количество этиленгликольных единиц также особенно не ограничивается, но предпочтительно составляет от 1 до 24, более предпочтительно от 1 до 12 и еще более предпочтительно от 4 до 8.

[0065] Более конкретно, предпочтительным является, по меньшей мере, один линкер, выбранный из группы, состоящей из пептидного линкера, состоящего из от 1 до 10 аминокислотных остатков на один линкер, ПЭГ линкера, состоящего из от 1 до 24 этиленгликольных единиц на один линкер, и комплексного линкера, состоящего из от 1 до 10 аминокислотных остатков и от 1 до 24 этиленгликольных единиц на один линкер, более предпочтительным является пептидный линкер, в котором количество аминокислотных остатков на один линкер составляет от 1 до 10, ПЭГ линкер, в котором количество этиленгликольных единиц на один линкер составляет от 1 до 24, или пептидный линкер, в котором количество аминокислотных остатков на один линкер составляет от 1 до 10, и еще более предпочтительным является пептидный линкер, в котором количество аминокислотных остатков на один линкер составляет от 1 до 5.

[0066] Кроме того, в случае содержания двух или более линкеров, тип и количество аминокислотных остатков и количество этиленгликольных единиц в каждом линкере может быть одинаковым или различаться. Например, необязательно могут быть выбраны и использованы два или более линкеров из группы, состоящей из пептидного линкера, ПЭГ линкера и комплексного линкера.

[0067] Кроме того, тип аминокислотных остатков, которые могут содержаться в линкере, особенно не ограничивается, и их примеры включают Gly, Ala и Ser, имеющие слабое взаимодействие с антителом IgG. Предпочтительно содержание, по меньшей мере, одного, по меньшей мере, из одного типа аминокислотных остатков, выбранного из группы, состоящей из Gly, Ala и Ser, на один линкер. Это значит, что предпочтительно, чтобы линкер представлял собой, по меньшей мере, один линкер, выбранный из группы, состоящей из пептидного линкера, состоящего из от 1 до 10 аминокислотных остатков на один линкер, и комплексного линкера из от 1 до 10 аминокислотных остатков и от 1 до 24 этиленгликольных единиц на один линкер, и более предпочтительно, чтобы эти от 1 до 10 аминокислотных остатков включали, по меньшей мере, один, по меньшей мере, из одного типа аминокислот, выбранных из группы, состоящей из Gly, Ala и Ser.

[0068] Кроме того, линкер может содержать один или более аминокислотных остатков, имеющих способность связываться с носителем. Например, линкер может содержать один, или два, или более аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из Cys, имеющего тиоловую группу, Lys, Orn, Dbu и Dpr, имеющих аминогруппу, Glu и Asp, имеющие карбоксильную группу, Ser, Thr и Tyr, имеющих гидроксильную группу, и оставшиеся His и Arg.

[0069] Молекулярная масса связывающего антитело полипептида по настоящему изобретению особенно не ограничивается. С точки зрения антигенности суммарная молекулярная масса аминокислотных остатков предпочтительно составляет 5000 или менее, более предпочтительно 3500 или менее и еще более предпочтительно 3000 или менее.

[0070] [Способ синтеза полипептида]

Способ синтеза полипептида по настоящему изобретению особенно не ограничивается. Например, полипептид может быть синтезирован с помощью метода органической химии синтеза пептида или с помощью генно-инженерного метода синтеза пептида.

Любой из методов синтеза в жидкой фазе и твердофазных методов синтеза может быть использован в качестве метода органической химии для синтеза пептида. В качестве способа синтеза полипептида по настоящему изобретению метод твердофазного синтеза с использованием автоматического пептидного синтезатора является пригодным и предпочтительным.

Генно-инженерный метод пептидного синтеза представляет собой метод синтеза пептида путем перенесения гена в клетки. Клетки, которые могут быть использованы, включают бактерии, клетки нематод, клетки насекомых, клетки млекопитающих, клетки животных и тому подобное.

[0071] [Адсорбционный материал для антитела или производного антитела]

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается адсорбционный материал для антитела или производного антитела, где указанный выше связывающий антитело полипептид или указанный выше связывающий антитело гибридный полипептид иммобилизован на водонерастворимом носителе. Кроме того, в настоящем изобретении может также предлагаться носитель для аффинной хроматографии, использующий этот адсорбционный материал.

[0072] Примеры указанного выше водонерастворимого носителя включают полисахариды, такие как кристаллическая целлюлоза, поперечно сшитая целлюлоза, поперечно сшитая агароза, поперечно сшитый декстран и поперечно сшитый пуллулан; органические носители, такие как полимеры на основе акрилата и полимеры на основе стирола; неорганические носители, такие как стеклянные шарики и силикагели; и композитные носители, полученные путем сочетания этих носителей, такие как органо-органические носители и органо-неорганические носители. С точки зрения устойчивости к щелочам из водонерастворимых носителей более предпочтительными являются полисахарид или полимер на основе акрилата и еще более предпочтительными полисахарид, такой как агароза или целлюлоза. Примеры имеющихся в продаже продуктов, которые могут быть использованы в качестве водонерастворимого носителя, включают Cellufine GCL2000 (производимый JNC Corporation) и Cellufine MAX CM (производимый JNC Corporation), каждый из которых представляет собой пористый целлюлозный гель, Sephacryl S-1000 SF (производимый GE Healthcare), который представляет собой ковалентно поперечно сшитый продукт аллилдекстрана с метиленбисакриламидом, TOYOPEARL (производимый Tosoh Corporation), TOYOPEARL AF-Carboxy-650 (производимый Tosoh Corporation) и TOYOPEARL GigaCap CM-650 (производимый Tosoh Corporation), каждый из которых представляет собой носитель на основе акрилата, Sepharose CL4B (производимую GE Healthcare), которая представляет собой поперечно сшитый носитель на основе агарозы, и Eupergit C250L (производимый Sigma-Aldrich), который представляет собой полиметакриламид, активированный эпоксигруппой. Однако водонерастворимый носитель по настоящему изобретению не ограничивается этими носителями или активированными носителями. Кроме того, в свете предназначаемого применения представленного адсорбционного материала, водонерастворимый носитель, используемый в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой водонерастворимый носитель, имеющий большую область поверхности, и предпочтительно является пористым водонерастворимым носителем, имеющим большое количество пор, характеризующихся подходящим размером. Форма носителя особенно не ограничивается и может быть любой из подобной шарикам, подобной волокнам, подобной пленке, подобной пористым волокнам и тому подобного, из чего может быть выбрана любая форма.

[0073] [Способ иммобилизации на носителе]

Хотя метод иммобилизации связывающего антитело полипептида или связывающего антитело гибридного полипептида по настоящему изобретению на водонерастворимом носителе особенно не ограничивается, будет проиллюстрирован метод, обычно применяемый в том случае, когда белок или полипептид иммобилизуется на носителе.

Примеры такого метода иммобилизации включают метод иммобилизации, при котором носитель вступает в реакцию с цианогенбромидом, эпихлоргидрином, диглицидиловым эфиром, тозилхлоридом, трезилхлоридом, гидразином или тому подобным, для активации носителя или введения реакционной функциональной группы на поверхность носителя, и затем носитель вступает в реакцию с соединением для иммобилизации в качестве лиганда для иммобилизации его на носителе, и метод иммобилизации, при котором конденсирующий агент, такой как карбодиимид, или реагент, имеющий множество функциональных групп в молекуле, такой как глицеральдегид, добавляют к системе, где присутствуют носитель и соединение для иммобилизации в качестве лиганда, с последующей конденсацией и поперечной сшивкой.

[0074] Когда лиганд иммобилизуют на носителе, предпочтительно растворять (диспергировать) лиганд в водном растворителе (водной дисперсионной среде) или в органическом растворителе (органической дисперсионной среде). Водный растворитель (водная дисперсионная среда) особенно не ограничивается, и их примеры включают HEPES буфер, ацетатный буфер, фосфатный буфер, цитратный буфер и трис-HCl буфер. Органический растворитель (органическая дисперсионная среда) особенно не ограничивается, но особенно предпочтителен полярный органический растворитель, особенно предпочтителен диметилсульфоксид (ДМСО), или диметилформамид (ДМФ), или спирт, примеры которого включают метанол, этанол, 2-пропанол (IPA, изопропиловый спирт), 2,2,2-трифторэтанол (TFE, трифторэтанол), и 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол (HFIP, гексафторизопропиловый спирт).

Величина рН во время иммобилизации особенно не ограничивается, и рН может быть кислым, нейтральным или щелочным. Например, величина рН может быть приблизительно установлена в соответствии с планируемым для использования растворителем (дисперсионной средой).

Например, в том случае, когда уровень рН является щелочным, к ДМСО или спирту может быть добавлено основание, такое как диазабициклоундецен (DBU).

[0075] Плотность связывающего антитело лиганда в том случае, когда указанный выше адсорбционный материал служит в качестве упаковочного материала для аффинной хроматографии, особенно не ограничивается, но предпочтительно составляет от 0,1 до 1000 ммоль/л упаковочного материала, более предпочтительно от 0,1 до 500 ммоль/л упаковочного материала, и еще более предпочтительно от 1 до 100 ммоль/л упаковочного материала. Когда плотность связывающего антитело лиганда находится в пределах этого диапазона, антитела можно эффективно очищать при более низкой стоимости с хорошим балансом между используемым количеством связывающего антитело лиганда и осуществлением очистки антитела.

[0076] [Молекулярная масса лиганда]

Кроме того, хотя известно, что молекула, обладающая высокой молекулярной массой, такая как протеин А или фрагмент Z протеина А, характеризуется антигенностью, известно также, что молекула, имеющая небольшую молекулярную массу с суммарной молекулярной массой аминокислотных остатков, составляющей обычно 5000 или менее, предпочтительно 3500 или менее, почти не проявляет антигенности. Связывающий антитело полипептид по настоящему изобретению почти не проявляет антигенности и, следовательно, иммобилизирующий лиганд носитель, где такой связывающий антитело полипептид иммобилизован на носителе, предпочтительно используется в качестве носителя для аффинной хроматографии.

[0077] [Применение связывающего антитело полипептида]

В отношении применения связывающего антитело полипептида по настоящему изобретению существует его использование в качестве связывающего антитело лиганда в области техники указанной выше аффинной хроматографии, использование в качестве линкера для мечения антитела в области техники иммуноанализа и использование в качестве линкера для конъюгата лекарства с антителом в области техники конъюгата лекарства с антителом.

[0078] <Линкер для меченого антитела>

Иммуноанализ представляет собой аналитический метод для осуществления определения и количественной оценки следовых количеств веществ с использованием иммунной реакции (реакции антиген-антитело) и характеризуется высокой специфичностью и высокой чувствительностью.

В случае иммуноанализа при определении антитела (первичного антитела), связанного со следовым количеством вещества (антигеном), существует метод прямого мечения первичного антитела, метод мечения антитела (вторичного антитела), которое связывается с первичным антителом или тому подобное. Связывающий антитело полипептид по настоящему изобретению может быть использован в качестве линкера для связывания меченого вещества с первичным антителом и может быть также использован в качестве линкера для связывания меченого вещества с вторичным антителом. Так как связывающий антитело полипептид по настоящему изобретению обладает свойствами связывания антитела (IgG-связывающими свойствами), можно использовать меченый связывающий антитело полипептид по настоящему изобретению вместо меченого вторичного антитела.

Кроме того, существует большое разнообразие меток. Система с использованием радиоизотопа в качестве системы мечения обозначается как радиоиммуноанализ (RIA), система с использованием фермента, такого как пероксидаза, в качестве метки обозначается как ферментный иммуноанализ (EIA), система с использованием хемилюминесцентного вещества, такого как люминал, в качестве метки обозначается как хемилюминесцентный иммуноанализ (CLIA) и система с использованием излучающего флуоресценцию вещества (флуоресцентного красителя), такого как изотиоцианат флуоресцина (ФИТЦ) в качестве вещества метки обозначается как флуоресцентный иммуноанализ (FIA). Связывающий антитело полипептид по настоящему изобретению может быть использован в любой из систем в качестве линкера для мечения антитела.

Для того чтобы повысить чувствительность определения в иммуноанализе, необходимо метить одну молекулу антитела большим количеством меток, но в обычных линкерах для мечения антитела есть вероятность того, что связывание большого количества меток приведет к снижению связывающей активности антитела, таким образом ухудшая специфичность и чувствительность, которые являются преимуществами иммуноанализа. Однако в отношении связывающего антитело полипептида по настоящему изобретению даже в том случае, когда большое количество таких связывающих антитело полипептидов связывается с антителом, ожидается увеличение чувствительности определения без ухудшения специфичности и чувствительности, что является преимуществами иммуноанализа, даже когда связывается большое количество таких связывающих антитело полипептидов, так как может сохраняться структурная целостность антитела и, следовательно, связывающая активность антитела не снижается.

[0079] <Линкер для конъюгата лекарства с антителом>

Конъюгат лекарства с антителом (ADC) обозначается также как армированное антитело, что является другим названием, и представляет собой лекарство, в котором клетки, узнающие антитело, и активную основную часть, соединяют через подходящий линкер с лекарством (низкомолекулярным лекарством). Этот механизм действия конъюгата лекарства с антителом схематически является следующим.

(1) Часть антитела конъюгата лекарства с антителом связывается с молекулой-мишенью на поверхности клетки-мишени.

(2) Конъюгат лекарства с антителом захватывается в клетки.

(3) Линкер конъюгата лекарства с антителом отщепляется внутри клетки.

(4) В клетках проявляется терапевтическая эффективность действия лекарства (низкомолекулярного лекарства).

В случае конъюгата лекарства с антителом, так как эффективность действия лекарства проявляется только в клетках, экспрессирующих молекулу-мишень для антитела, системные побочные эффекты ингибируются, и эффективность действия лекарства может быть сфокусирована на клетках-мишенях и проявляться в них, так что конъюгат лекарства с антителом более эффективно действует и проявляет меньше побочных эффектов по сравнению только с лекарством. Например, так как противораковые агенты, разработанные с целью поражения раковых клеток, характеризующихся активным клеточным делением, будут также поражать клетки, сохраняющие функции активного клеточного деления в той же степени, конкретно клетки, ответственные за иммунитет, клетки желудочно-кишечного тракта, клетки волосяных корней или тому подобные, могут появляться такие случаи, при которых в качестве побочных эффектов возникают такие симптомы, как восприимчивость к инфекциям, диарея и потеря волос головы. Однако в случае конъюгата лекарства с антителом возможна доставка противоракового препарата селективно к раковым клеткам-мишеням, так что можно подавить побочные эффекты, вызываемые действием противоракового агента на клетки, отличные от клеток-мишеней.

Линкер для конъюгата лекарства с антителом требуется не только для уверенности в том, что часть антитела и часть лекарства в конъюгате лекарства с антителом соединены и стабильны в крови, и антитело и лекарство расщепляются и высвобождаются внутри клетки, но также для уверенности в том, что связывающая активность антитела не уменьшена. Для того, чтобы увеличить эффективность доставки лекарства, необходимо пометить одну молекулу антитела большим количеством молекул лекарства, но в традиционных линкерах для конъюгата лекарства с антителом есть вероятность того, что связывание большого количества молекул лекарства приведет к снижению связывающей активности антитела, таким образом ухудшая селективность, которая является преимуществом конъюгата лекарства с антителом, в результате чего эффективность доставки лекарства к клеткам-мишеням будет снижаться. Однако в отношении связывающего антитело полипептида по настоящему изобретению даже в том случае, когда большое количество таких связывающих антитело полипептидов связывается с антителом, ожидается увеличение эффективности доставки лекарства к клеткам-мишеням без ухудшения селективности, что является преимуществом конъюгата лекарства с антителом, даже когда связывается большое количество таких связывающих антитело полипептидов, так как может сохраняться структурная целостность антитела и, следовательно, связывающая активность антитела не снижается.

ПРИМЕРЫ

[0080] Настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на последующие примеры, но настоящее изобретение ими не ограничивается.

[0081] [Синтез полипептида]

Полипептиды или гибридные полипептиды с SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 20, представленные в таблице 2, синтезировали с помощью полностью автоматизированного синтезатора пептидов (PSSM-8, производимого Shimadzu Corporation).

[0082] [Пример 1]

(1) Иммобилизация лиганда

Коммерчески доступный CM5 (карбоксиметилдекстрановый, типа для введения, производимый GE Healthcare) сенсорный чип устанавливали в прибор для поверхностного плазмонного резонанса (SPR) Biacore3000 (производимый GE Healthcare), HEPES буфер (20 мМ HEPES-HCl, 150 мМ NaCl, pH 7,4) для SPR стабилизировали при скорости тока 10 мкл/мин и добавляли 70 мкл смешанного водного раствора 0,2 М 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC, производимого Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и 0,04 М N-гидроксисукцинимида (NHS, производимого Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Затем 500 мкл раствора образца полипептида 1, разведенного до 100 мкМ указанным выше HEPES буфером и обработанного 0,20 мкМ PTFE фильтром (производимым ADVANTEC), подавали на носитель образца, блокированный раствором этаноламина, и промывали водным раствором гидроксида натрия с последующей иммобилизацией, для получения иммобилизованного носителя. Этот иммобилизованный носитель обозначали в настоящем описании далее как «иммобилизованный носитель A».

[0083] (2) Оценка связывающих свойств антитела

От 10 до 3000 нМ антитела IgG человека добавляли к иммобилизованному носителю A, полученному в указанном выше пункте (1), в течение 10 мин, и измеряли диссоциацию при 25°C в HEPES буфере. Скорость диссоциации Kon [нМ/сек] и скорость диссоциации Koff [1/сек] антитела рассчитывали из кривой реакции связывания и рассчитывали также константу диссоциации Kd [нМ] реакции связывания полипептида 1 с антителом IgG человека.

(Оценка стандартов связывающих свойств антитела)

Константа диссоциации (Kd) составляет 100 нМ или менее A

Константа диссоциации (Kd) выше 100 нМ и составляет 300 нМ или менее B

Константа диссоциации (Kd) выше 300 нМ и составляет 500 нМ или менее C

Константа диссоциации (Kd) выше 500 нМ и составляет 1000 нМ или менее D

Константа диссоциации (Kd) выше 1000 нМ E

Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Оценка A и B указывает на то, что лиганд имеет достаточные свойства связывания антитела как лиганд для носителя аффинной хроматографии, и оценка C, D и E указывает на то, что он не имеет достаточных свойств связывания антитела. С помощью использования лиганда, имеющего достаточные свойства связывания антитела, эффективность выхода повышается и становится возможным более эффективно очищать антитела, в результате чего стоимость очистки антител может быть дополнительно снижена.

Подбор осуществляли с использованием BIAevaluation4.1 (программного обеспечения для подбора, поставляемого GE Healthcare), и рассчитанная таким образом скорость диссоциации Koff составляла 1,7×10^-4[1/сек].

[0084] (3) Оценка селективности

1000 нМ бычьего сывороточного альбумина (BSA, поставляемого Sigma-Aldrich) добавляли к иммобилизованному носителю A, полученному выше в (1), при 25°C в течение 10 мин, и связанное количество измеряли с помощью SPR после 10 минут в HEPES буфере.

(Оценка стандартов селективности)

Не связывается с BSA A

Подтверждено связывание с BSA D

Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Оценка A указывает на то, что лиганд обладает достаточной селективностью как лиганд для носителя аффинной хроматографии, и оценка D указывает на то, что он не обладает достаточной селективностью. Путем использования лиганда, обладающего достаточной селективностью, возможность связывания с лигандом белка, отличного от желаемого антитела, снижается, в результате чего могут быть получены более высокоочищенные антитела.

[0085] (4) Оценка устойчивости к щелочам

Синтезированный полипептид 1 помещали в 1 Н NaOH при комнатной температуре на 1 час и затем лиганд иммобилизовали как указано выше в (1). Изменялось или нет количество связываемого антитела полученным таким образом иммобилизованным носителем A, оценивали с помощью SPR.

(Оценка стандартов устойчивости к щелочи)

Количество связываемого антитела не изменялось A

Количество связываемого антитела снижалось D

Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Оценка A указывает на то, что лиганд обладает достаточной устойчивостью к щелочи как лиганд для носителя аффинной хроматографии, и оценка D указывает на то, что лиганд не обладает достаточной устойчивостью к щелочи. Путем использования лиганда, обладающего достаточной устойчивостью к щелочи, можно использовать носитель для аффинной хроматографии с повторной отмывкой, в результате чего стоимость очистки антител может быть снижена.

[0086] (5) Оценка временной стабильности

Раствор синтезированного полипептида 1 хранили в диапазоне постоянной температуры (40°C) в течение одного месяца, и затем лиганд иммобилизовали как описано выше в (1). Изменялось или нет количество связываемого антитела полученным таким образом иммобилизованным носителем A, оценивали с помощью SPR.

(Оценка стандартов временной стабильности)

Количество связываемого антитела не изменялось A

Количество связываемого антитела снижалось D

Оценка A указывает на то, что лиганд обладает достаточной временной стабильностью как лиганд для носителя аффинной хроматографии, и оценка D указывает на то, что лиганд не обладает достаточной временной стабильностью. Путем использования лиганда, обладающего достаточной временной стабильностью, носитель для аффинной хроматографии может храниться в условиях комнатной температуры и может быть использован повторно, в результате чего стоимость очистки антител может быть снижена.

[0087] [Пример 2]

(1) «Иммобилизованный носитель B» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 2, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя B и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,3×10^-4[1/сек].

[0088] [Пример 3]

(1) «Иммобилизованный носитель C» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 3, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя C и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,7×10^-4[1/сек].

[0089] [Пример 4]

(1) «Иммобилизованный носитель D» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 4, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя D и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,3×10^-4[1/сек].

[0090] [Пример 5]

(1) «Иммобилизованный носитель E» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 5, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя E и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 2,0×10^-4[1/сек].

[0091] [Пример 6]

(1) «Иммобилизованный носитель F» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 6, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1, и 50 мкл раствора образца, разведенного до 25 мкМ ацетатным буфером рН 4,0, использовали вместо 500 мкл раствора образца, разведенного до 100 мкМ HEPES буфером.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя F и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,5×10^-4[1/сек].

[0092] [Пример 7]

(1) «Иммобилизованный носитель G» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 7, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1, и 50 мкл раствора образца, разведенного до 25 мкМ ацетатным буфером рН 4,0, использовали вместо 500 мкл раствора образца, разведенного до 100 мкМ HEPES буфером.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя G и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,6×10^-4[1/сек].

[0093] [Пример 8]

(1) «Иммобилизованный носитель H» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 8, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя H и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,5×10^-4[1/сек].

[0094] [Пример 9]

(1) «Иммобилизованный носитель I» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 9, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя I и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,7×10^-4[1/сек].

[0095] [Пример 10]

(1) «Иммобилизованный носитель J» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 10, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1, и 50 мкл раствора образца, разведенного до 25 мкМ ацетатным буфером рН 4,0, использовали вместо 500 мкл раствора образца, разведенного до 100 мкМ HEPES буфером.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя J и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,5×10^-4[1/сек].

[0096] [Пример 11]

(1) «Иммобилизованный носитель K» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 11, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1, и 50 мкл раствора образца, разведенного до 25 мкМ ацетатным буфером рН 4,0, использовали вместо 500 мкл раствора образца, разведенного до 100 мкМ HEPES буфером.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя K и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,8×10^-4[1/сек].

[0097] [Пример 12]

(1) «Иммобилизованный носитель L» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 12, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1, и 50 мкл раствора образца, разведенного до 25 мкМ ацетатным буфером рН 4,0, использовали вместо 500 мкл раствора образца, разведенного до 100 мкМ HEPES буфером.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя L и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,5×10^-4[1/сек].

[0098] [Пример 13]

(1) «Иммобилизованный носитель M» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 13, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1, и 50 мкл раствора образца, разведенного до 25 мкМ ацетатным буфером рН 4,0, использовали вместо 500 мкл раствора образца, разведенного до 100 мкМ HEPES буфером.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя M и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,5×10^-4[1/сек].

[0099] [Пример 14]

(1) «Иммобилизованный носитель N» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 14, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1, и 50 мкл раствора образца, разведенного до 25 мкМ ацетатным буфером рН 4,0, использовали вместо 500 мкл раствора образца, разведенного до 100 мкМ HEPES буфером.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя N и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,4×10^-4[1/сек].

[0100] [Пример 15]

(1) «Иммобилизованный носитель O» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 15, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1, и 50 мкл раствора образца, разведенного до 25 мкМ ацетатным буфером рН 4,0, использовали вместо 500 мкл раствора образца, разведенного до 100 мкМ HEPES буфером.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя O и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,4×10^-4[1/сек].

[0101] [Пример 16]

(1) «Иммобилизованный носитель P» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 16, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1, и 50 мкл раствора образца, разведенного до 25 мкМ ацетатным буфером рН 4,0, использовали вместо 500 мкл раствора образца, разведенного до 100 мкМ HEPES буфером.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя P и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,9×10^-4[1/сек].

[0102] [Пример 17]

(1) «Иммобилизованный носитель Q» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 17, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1, и 50 мкл раствора образца, разведенного до 25 мкМ ацетатным буфером рН 4,0, использовали вместо 500 мкл раствора образца, разведенного до 100 мкМ HEPES буфером.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя Q и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,3×10^-4[1/сек].

[0102] [Пример 18]

(1) «Иммобилизованный носитель R» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 18, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1, и 50 мкл раствора образца, разведенного до 25 мкМ ацетатным буфером рН 4,0, использовали вместо 500 мкл раствора образца, разведенного до 100 мкМ HEPES буфером.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя R и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,9×10^-4[1/сек].

[0104] [Пример 19]

(1) «Иммобилизованный носитель S» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, имеющий первичную структуру, представленную в графе «Лиганд» примера 19 в таблице 2 вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1.

В графе «Лиганд» примера 19 в таблице 2 «-NH₂» на C-конце первичной структуры указывает на то, что карбоксильная группа тирозилового остатка на C-конце амидирована.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя S и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,5×10^-4[1/сек].

[0105] [Пример 20]

(1) «Иммобилизованный носитель T» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, имеющий первичную структуру, представленную в графе «Лиганд» примера 20 в таблице 2, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1.

В графе «Лиганд» примера 20 в таблице 2 «Ac-» на N-конце первичной структуры указывает на то, что аминогруппа, связанная с углеродом в α-положении глутаминового остатка на N-конце ацетилирована.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя T и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,4×10^-4[1/сек].

[0106] [Пример 21]

(1) «Иммобилизованный носитель U» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, имеющий первичную структуру, представленную в графе «Лиганд» примера 21 в таблице 2, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1.

В графе «Лиганд» примера 21 в таблице 2 «Ac-» на N-конце первичной структуры указывает на то, что аминогруппа, связанная с углеродом в α-положении глутаминового остатка на N-конце ацетилирована.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя U и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,6×10^-4[1/сек].

[0107] [Пример 22]

(1) «Иммобилизованный носитель V» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, имеющий первичную структуру, представленную в графе «Лиганд» примера 22 в таблице 2, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1, и 50 мкл раствора образца, разведенного до 25 мкМ ацетатным буфером рН 4,0, использовали вместо 500 мкл раствора образца, разведенного до 100 мкМ HEPES буфером.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя V и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,5×10^-4[1/сек].

[0108] [Пример 23]

(1) «Иммобилизованный носитель W» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, имеющий первичную структуру, представленную в графе «Лиганд» примера 23 в таблице 2, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1, и 50 мкл раствора образца, разведенного до 25 мкМ ацетатным буфером рН 4,0, использовали вместо 500 мкл раствора образца, разведенного до 100 мкМ HEPES буфером.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя W и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,6×10^-4[1/сек].

[0109] [Пример 24]

(1) «Иммобилизованный носитель X» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, имеющий первичную структуру, представленную в графе «Лиганд» примера 24 в таблице 2, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя X и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,3×10^-4[1/сек].

[0110] [Пример 25]

(1) «Иммобилизованный носитель Y» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали гибридный полипептид, имеющий первичную структуру, представленную в графе «Лиганд» примера 25 в таблице 2, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя Y и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 1,9×10^-4[1/сек].

[0111] [Сравнительный пример 1]

(1) «Иммобилизованный носитель Z» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали протеин А дикого типа (выпускаемый Repligen Corporation) вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1, и 10 мкл раствора образца, разведенного до 50 нМ ацетатным буфером рН 5,0, использовали вместо 500 мкл раствора образца, разведенного до 100 мкМ HEPES буфером.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя Z и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 2,5×10^-4[1/сек].

[0112] [Сравнительный пример 2]

(1) «Иммобилизованный носитель AA» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали модифицированный протеин А дикого типа (выпускаемый Sino Biological Inc.) вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1, и 10 мкл раствора образца, разведенного до 100 нМ ацетатным буфером рН 5,0, использовали вместо 500 мкл раствора образца, разведенного до 100 мкМ HEPES буфером.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя AA и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 3,2×10^-4[1/сек].

[0113] [Сравнительный пример 3]

(1) «Иммобилизованный носитель AB» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали низкомолекулярное соединение ApA (следующей химической формулы), синтезированное в соответствии с методом синтеза, описанным в Li, R., Dowd, V., Steward, D. J., Burton, S. J., and Lowe, C. R., 1998, Nature Biotechnology, Vol. 16, pp. с 190 по 195, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1.

[0114]

[0115] (2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя AB и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 6,5×10^-4[1/сек].

[0116] [Сравнительный пример 4]

(1) «Иммобилизованный носитель AC» получали также как в примере 1, за исключением того, что в качестве лиганда использовали полипептид, представленный в SEQ ID NO: 26, вместо полипептида, представленного SEQ ID NO: 1.

(2) При использовании полученного таким образом иммобилизованного носителя AC и таким же способом, что и в примере 1, оценивали связывающие антитело свойства, селективность, устойчивость к щелочи и временную стабильность. Оценка результатов представлена в соответствующей графе таблицы 2.

Кроме того, Koff скорости диссоциации составляла 2,4×10^-4[1/сек].

[0117] [Таблица 2]

	Лиганд	Иммобилизованный носитель
Первичная структура (N-конец→C-конец) или название	Число аминокислотных остатков	SEQ ID NO.	Символ	Связывающие антитело свойства	Селективность	Устойчивость к щелочи	Временная стабильность
Примеры	1	EQQNAFY	7	1	A	A	A	A	A
	2	KEQQNAFY	8	2	B	A	A	A	A
	3	EQQNAFYEILH	11	3	C	A	A	A	A
	4	EQQNAFYEILHL	12	4	D	A	A	A	A
	5	EGQNAFY	7	5	E	A	A	A	A
	6	KKKEQQNAFYKKK	13	6	F	A	A	A	A
	7	KKKEQQNAFYEILHKKK	17	7	G	A	A	A	A
	8	EQQNAFYGGGKGGGEQQNAFY	21	8	H	A	A	A	A
	9	EQNAFY	6	9	I	A	A	A	A
	10	EQQSAFY	7	10	J	A	A	A	A
	11	EQQSAFYEILH	11	11	K	A	A	A	A
	12	DQQSAFY	7	12	L	A	A	A	A
	13	DQQSAFYEILH	11	13	M	A	A	A	A
	14	EAQQSAFY	8	14	N	A	A	A	A
	15	EQSAFY	6	15	O	A	A	A	A
	16	EAQQNAFY	7	16	P	A	A	A	A
	17	DAQQSAFY	8	17	Q	A	A	A	A
	18	DQSAFY	6	18	R	A	A	A	A
	19	EQQNAFY-NH2	7	19	S	A	A	A	A
	20	Ac-EQQNAFYK	8	20	T	A	A	A	A
	21	Ac-EQQNAFYEILHK	12	21	U	A	A	A	A
	22	Ac-KKKEQQNAFYKKK	13	22	V	A	A	A	A
	23	Ac-KKKEQQNAFYEILHKKK	17	23	W	A	A	A	A
	24	H2N-(peg)8-EQQNAFYE	8	24	X	A	A	A	A
25	Ac-EQQNAFY-(peg)8-K-(peg)8-EQQNAFY	15	25	Y	A	A	A	A
Сравнительные примеры	1	Протеин A дикого типа/SpA			Z	A	A	D	D
	2	Модифицированный протеин A			AA	A	A	D	D
	3	Низкомолекулярное соединение ApA			AB	E	D	A	A
4	QQNAFYEI	8	26	AC	C	D	A	A

[0118] С помощью полученных выше результатов продемонстрировано, что все связывающие антитело полипептиды примеров с 1 по 25 имеют связывающие антитело свойства и селективность, сравнимые с природным протеином А, и проявляют превосходную устойчивость к щелочам и временную стабильность по сравнению с природным протеином А и модифицированным протеином А.

Кроме того, так как природный протеин А и модифицированный протеин А обладают антигенностью, тогда как связывающий антитело полипептид по настоящему изобретению не обладает антигенностью, он является высоко безопасным для организма человека даже когда связывающий антитело полипептид по настоящему изобретению включают в очищенные антитела в случае его использования в качестве лиганда при очистке с помощью аффинной хроматографии.

Кроме того, при сравнении связывающих антитело полипептидов примеров с 1 по 25 с полипептидом (QQNAFYE) сравнительного примера 4, полипептид сравнительного примера 4 проявляет слабые связывающие антитело свойства и селективность, таким образом, проявляя отсутствие способности достижения требуемого уровня.

Промышленная применимость

[0119] Связывающий антитело полипептид и адсорбционный материал по настоящему изобретению пригодны в качестве компонентов очистки для лекарств на основе антител. Кроме того, связывающий антитело полипептид по настоящему изобретению также пригоден в качестве линкера для мечения антитела или в качестве линкера для конъюгата лекарства с антителом.

[Перечень последовательностей]

Международная заявка No. W-5420PCT СВЯЗЫВАЮЩИЙ АНТИТЕЛО ПОЛИПЕПТИД, СВЯЗЫВАЮЩИЙ АНТИТЕЛО, основана на международном уведомлении договора о патентной кооперации

JP15075157 20150904----00050044951501773276 обычный

20150904091646201508251433374700_P1AP101__W-_4.app

1. Связывающий антитело полипептид, состоящий из полипептида, представленного в любой из SEQ ID NOs: с 1 по 18.

2. Связывающий антитело полипептид, состоящий из полипептида, представленного в любой из SEQ ID NOs: с 1 по 18, и от 1 до 24 этиленгликольных единиц ковалентно связаны с N-концом и/или C-концом полипептида.

3. Связывающий антитело полипептид, состоящий из полипептида, представленного в любой из SEQ ID NOs: с 1 по 18, где полипептид модифицирован путем ацетилирования или трет-бутоксикарбонилирования на N-конце и/или амидирования или этерификации на C-конце.

4. Связывающий антитело гибридный полипептид, содержащий от 2 до 5 доменных единиц и по меньшей мере один линкер, соединяющий указанные доменные единицы, где доменные единицы состоят из полипептида, представленного в любой из SEQ ID NO: от 1 до 18 на одну доменную единицу, линкер состоит из от 1 до 24 этиленгликольных единиц на один линкер.

5. Связывающий антитело гибридный полипептид по п. 4, где суммарная молекулярная масса аминокислотных остатков, содержащихся в доменной единице, составляет 5000 или менее.

6. Адсорбционный материал для антитела или производного антитела для использования в качестве аффинного хроматографического носителя или для использования в качестве компонента очистки для лекарств на основе антител, где связывающий антитело полипептид по любому из пп. 1-3 или связывающий антитело гибридный полипептид по п. 5 или 6 иммобилизован на водонерастворимом носителе.