Иммуногенная композиция, включающая ее вакцина, набор для приготовления вышеуказанной композиции и способ лечения заболеваний, связанных с патологией секреции гастрина

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуногенным композициям гастрина-17, и может быть использовано в медицине для лечения заболеваний, связанных с патологией секреции гастрина. Иммуногенная композиция включает а) первый компонент, который содержит адъювант, содержащий группу анти-CD32, связанную с лигандом TLR9, и первую пептидную альфа-спираль, и б) второй компонент, который содержит по меньшей мере один пептидный иммуноген гастрин-17, который связан со второй пептидной альфа-спиралью. Причем указанная первая пептидная альфа-спираль первой части скручена со второй пептидной альфа-спиралью второй части, образуя тем самым скрученную спиральную структуру. Изобретение позволяет повысить эффективность иммунизации против гастрина-17, преодолев естественную иммунологическую толерантность против аутологичного антигена G17M. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 7 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим пептидный иммуноген гастрин и анти-CD32 группу, связанную с лигандом TLR9, и к вакцине, содержащей такую иммуногенную композицию, и к ее применению при лечении болезненных состояний, связанных с патологией секреции гастрина.

Уровень техники

Рак или с медицинской точки зрения злокачественное новообразование - это широкая группа различных заболеваний, для которых характерен нерегулируемый клеточный рост. При раке клетки делятся и растут бесконтрольно, образуя злокачественные опухоли, и внедряются в другие части тела. Рак также распространяется на более отдаленные части тела через лимфатическую систему или кровоток. Не все опухоли являются злокачественными. Доброкачественные опухоли не растут бесконтрольно, не внедряются в соседние ткани и не распространяются по всему телу. Существует более 200 различных известных видов рака, поражающих человека.

Определение причины развития рака представляется сложным. Многие факторы, как известно, увеличивают риск развития рака, в том числе, употребление табака, некоторые инфекции, радиация, отсутствие физической активности, ожирение и загрязнители окружающей среды. Эти факторы могут непосредственно влиять на повреждение генов или усугублять существующие генетические дефекты в клетках, что вызывает возникновение заболевания. Примерно 5-10% всех случаев рака являются наследственными.

Рак может быть обнаружен несколькими путями, в том числе по наличию некоторых признаков и симптомов, при помощи скрининговых тестов или методами медицинской визуализации. После того, как обнаружен возможный рак, для его диагностики проводят микроскопическое изучение образца ткани. Рак обычно лечат при помощи химиотерапии, радиотерапии или хирургически. Шансы на выживание при данном заболевании в значительной степени варьируются в зависимости от типа и локализации рака и стадии заболевания на момент начала лечения. Несмотря на то, что рак поражает людей всех возрастов, и что некоторые типы рака являются более распространенными у детей, риск развития рака, как правило, с возрастом повышается. В 2007 г. рак стал причиной смерти примерно в 13% случаев от общего количества по всему миру (7,9 миллионов). Показатели увеличиваются из-за того, что все больше людей доживает до старости, а также из-за массового улучшения образа жизни в развивающихся странах.

После того, как иммунная система сталкивается с факторами окружающей среды, она встречает их на основе различия свой-чужой, и многие виды опухолевых клеток, возникающих в результате появления рака, более или менее допускаются собственной иммунной системой больного, поскольку опухолевые клетки по существу являются его собственными клетками, которые растут, делятся и распространяются без соответствующего регулирующего контроля.

Иммунная толерантность или иммунологическая толерантность - это процесс, при котором иммунная система не атакует антиген. При врожденной или аутотолерантности организм не дает иммунный ответ на аутоантигены. Встречаются три формы: центральная толерантность, периферическая толерантность и приобретенная толерантность.

Далее в описании следуют ссылки на следующие работы уровня техники:

1. Mathis, D. and C. Benoist. 2004. Back to central tolerance. Immunity 20: 509-516.

2. Miller, J.F.A.P. and G. Morahan. 1992. Peripheral T cell tolerance. Annu. Rev. Immunol. 10: 51-69.

3. Tafuri, A., J. Alferink, P.M Iler, G.J.H mmerling, and B. Arnold. 1995. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science 270: 630-633.

4. Cheever, M.A. and C.S. Higano. 2011. PROVENGE (Sipuleucel-T) in prostate cancer: the first FDA-approved therapeutic cancer vaccine. Clin. Cancer Res. 17: 3520-3526.

5. Linley, A.J., M. Ahmad, and R.C. Rees. 2011. Tumour-associated antigens: considerations for their use in tumour immunotherapy. Int. J. Hematol. 93: 263-273.

6. Brett, B.T., S.C. Smith, C.V. Bouvier, D. Michaeli, D. Hochhauser, B.R. Davidson, T.R. Kurzawinski, A.F. Watkinson, S.N. Van, R.E. Pounder, and M.E. Caplin. 2002. Phase II study of anti-gastrin-17 antibodies, raised to G17DT, in advanced pancreatic cancer. J Clin Oncol 20: 4225-4231.

7. Rengifo-Cam, W. and P. Singh. 2004. Role of progastrins and gastrins and their receptors in GI and pancreatic cancers: targets for treatment. Curr. Pharm. Des 10: 2345-2358.

8. Watson, S.A., D. Michaeli, T.M. Morris, P. Clarke, A. Varro, N. Griffin, A. Smith, T. Justin, and J.D. Hardcastle. 1999. Antibodies raised by gastrimmune inhibit the spontaneous metastasis of a human colorectal tumour, AP5LV. Eur J Cancer 35: 1286-1291.

9. Watson, S.A., T.M. Morris, D.F. McWilliams, J. Harris, S. Evans, A. Smith, and P.A. Clarke. 2002. Potential role of endocrine gastrin in the colonic adenoma carcinoma sequence. Br. J Cancer 87: 567-573.

10. Morton, M., G.C. Prendergast, and T.D. Barrett. 2011. Targeting gastrin for the treatment of gastric acid related disorders and pancreatic cancer. Trends in pharmacological sciences 32: 201-205.

11. Ciccotosto, G.D., J.K. Dawborn, K.J. Hardy, and A. Shulkes. 1996. Gastrin processing and secretion in patients with end-stage renal failure. J Clin Endocrinol. Metab 81: 3231-3238.

12. Eaton-Bassiri, A., S.B. Dillon, M. Cunningham, M.A. Rycyzyn, J. Mills, R.T. Sarisky, and M.L. Mbow. 2004. Toll-like receptor 9 can be expressed at the cell surface of distinct populations of tonsils and human peripheral blood mononuclear cells. Infect. Immun. 72: 7202-7211.

13. Saikh, K.U., T.L. Kissner, A. Sultana, G. Ruthel, and R.G. Ulrich. 2004. Human monocytes infected with Yersinia pestis express cell surface TLR9 and differentiate into dendritic cells. J. Immunol. 173: 7426-7434.

14. Tanaka, J., K. Sugimoto, K. Shiraki, M. Tameda, S. Kusagawa, K. Nojiri, T. Beppu, K. Yoneda, N. Yamamoto, K. Uchida, T. Kojima, and Y. Takei. 2010. Functional cell surface expression of toll-like receptor 9 promotes cell proliferation and survival in human hepatocellular carcinomas. Int. J Oncol. 37: 805-814.

15. Hartmann, G., J. Battiany, H. Poeck, M. Wagner, M. Kerkmann, N. Lubenow, S. Rothenfusser, and S. Endres. 2003. Rational design of new CpG oligonucleotides that combine В cell activation with high IFN-a induction in plasmacytoid dendritic cells. Eur. J. Immunol. 33: 1633-1641.

16. Tversky, J.R., A.P. Bieneman, K.L. Chichester, R.G. Hamilton, and J.T. Schroeder. 2010. Subcutaneous allergen immunotherapy restores human dendritic cell innate immune function. Clin. Exp. Allergy. 40: 94-102.

17. Abel, K., Y. Wang, L. Fritts, E. Sanchez, E. Chung, P. Fitzgerald-Bocarsly, A.M. Krieg, and C.J. Miller. 2005. Deoxycytidyl-deoxyguanosine oligonucleotide classes A, B, and С induce distinct cytokine gene expression patterns in rhesus monkey peripheral blood mononuclear cells and distinct alpha interferon responses in TLR9-expressing rhesus monkey plasmacytoid dendritic cells. Clin Diagn. Lab Immunol 12: 606-621.

18. Puig, M., K.W. Tosh, L.M. Schramm, L.T. Grajkowska, K.D. Kirschman, C. Tami, J. Beren, R.L. Rabin, and D. Verthelyi. 2012. TLR9 and TLR7 agonists mediate distinct type I IFN responses in humans and nonhuman primates in vitro and in vivo. J Leukoc. Biol. 91: 147-158.

19. Arndt, K.M., K.M. Muller, and A. Pluckthun. 2001. Helix-stabilized Fv (hsFv) antibody fragments: substituting the constant domains of a Fab fragment for a heterodimeric coiled-coil domain. J Mol. Biol. 312: 221-228.

20. Van Reijsen, F.C, C.A.F.M. Bruijnzeel-Koomen, F.S. Kalthoff, E. Maggi, S. Romagnani, J.K.T. Westland, and G.C. Mudde. 1992. Skin-derived aeroallergen-specific T-cell clones of Th2 phenotype in patients with atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 90: 184-193.

21. Krieg, A.M., A.K. Yi, S. Matson, T.J. Waldschmidt, G.A. Bishop, R. Teasdale, G.A. Koretzky, and D.M. Klinman. 1995. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature. 374: 546-549.

22. Chao, H., D.L. Bautista, J. Litowski, R.T. Irvin, and R.S. Hodges. 1998. Use of a heterodimeric coiled-coil system for biosensor application and affinity purification. J. Chromatogr. В Biomed. Sci. Appl. 715: 307-329.

23. Litowski, J.R. and R.S. Hodges. 2001. Designing heterodimeric two-stranded alpha-helical coiled-coils: the effect of chain length on protein folding, stability and specificity. J. Pept. Res. 58: 477-492.

24. Litowski, J.R. and R.S. Hodges. 2002. Designing heterodimeric two-stranded alpha-helical coiled-coils. Effects of hydrophobicity and alpha-helical propensity on protein folding, stability, and specificity. J. Biol. Chem. 277: 37272-37279.

25. Greenman, J., A.L. Tutt, A.J. George, K.A. Pulford, G.T. Stevenson, and M.J. Glennie. 1991. Characterization of a new monoclonal anti-Fc gamma RII antibody, AT10, and its incorporation into a bispecific F(ab')2 derivative for recruitment of cytotoxic effectors. Mol. Immunol 28: 1243-1254.

26. Stuart, S.G., M.L. Trounstine, D.J. Vaux, T. Koch, C.L. Martens, I. Mellman, and K.W. Moore. 1987. Isolation and expression of cDNA clones encoding a human receptor for IgG (Fc gamma RII). J. Exp. Med. 166: 1668-1684.

27. Macintyre, E.A., P.J. Roberts, R.bdul-Gaffar, K. O'Flynn, G.R. Pilkington, F. Farace, J. Morgan, and D.C. Linch. 1988. Mechanism of human monocyte activation via the 40-kDa Fc receptor for IgG. J Immunol. 141: 4333-4343.

28. Krug. A., S. Rothenfusser, V. Hornung, B. Jahrsdorfer, S. Blackwell, Z.K. Ballas, S. Endres, A.M. Krieg, and G. Hartmann. 2001. Identification of CpG oligonucleotide sequences with high induction of IFN-alpha/beta in plasmacytoid dendritic cells. Eur J Immunol. 31: 2154-2163.

29. Tel, J., N. Beenhakker, G. Koopman, B. Hart, G.C. Mudde, and V. de, I. 2012. Targeted delivery of CpG ODN to CD32 on human and monkey plasmacytoid dendritic cells augments IFNalpha secretion. Immunobiology. 217: 1017-1024.

30. Berntzen, G., J.T. Andersen, K. Ustgard, T.E. Michaelsen, S.A. Mousavi, J.D. Qian, P.E. Kristiansen, V. Lauvrak, and I. Sandlie. 2009. Identification of a high affinity Fcgamma RIIA binding peptide that distinguishes Fcgamma RIIA from Fcgamma RIIB and exploits Fcgamma RIIA mediated phagocytosis and degradation. J. Biol. Chem. 284: 1126-1135.

31. Stuart, S.G., N.E. Simister, S.B. Clarkson, B.M. Kacinski, M. Shapiro, and I. Mellman. 1989. Human IgG Fc receptor (hFcRII; CD32) exists as multiple isoforms in macrophages, lymphocytes and IgG-transporting placental epithelium. EMBO J. 8: 3657-3666.

Центральная толерантность¹:

Центральная толерантность возникает в процессе развития лимфоцита в тимусе и костном мозге. Именно здесь уничтожаются Т-и В-лимфоциты, которые распознают собственные аутоантигены прежде, чем они превратятся в полностью иммунокомпетентные клетки, что предотвращает развитие аутоиммунных реакций. Этот процесс наиболее активен в эмбриональном периоде, но продолжается и в течение всей жизни пока образуются незрелые лимфоциты.

Периферическая толерантность²:

Периферическая толерантность - это иммунологическая толерантность, развивающаяся после того, как Т- и В-лимфоциты достигают зрелости и выходят на периферию. Т-клетки, которые покидают тимус, не являются полностью безопасными. Некоторые будут обладать рецепторами (TCRs), которые могут реагировать на аутоантигены, присутствующие в такой высокой концентрации, что они могут связываться со слабыми рецепторами Т-клеток и с которыми они не встречаются в тимусе (такие как тканеспецифические молекулы, подобные молекулам в островках Лангерганса, головного или спинного мозга). Эти аутореактивные Т-клетки, которые избегают внутритимусового негативного отбора в тимусе, могут вызывать повреждение клеток, если они не будут удалены или эффективно нейтрализованы в периферической ткани. Известно несколько механизмов обратной связи, которые отключают такие потенциально аутореактивные Т-клетки. Различают следующие механизмы: анергия, гибель клеток, индуцированная активацией, периферическая супрессия

Приобретенная или индуцированная толерантность³:

Приобретенная или индуцированная толерантность относится к адаптации иммунной системы к внешним антигенам, характеризующаяся специфической нечувствительностью лимфоидных тканей к данному антигену, что, при других обстоятельствах, могло бы индуцировать клеточно-опосредованный или гуморальный иммунитет. Одним из наиболее важных видов приобретенной толерантности является иммунная толерантность при беременности, когда плод и плацента должны быть толерогенны по отношению к материнской иммунной системе.

Иммунотерапия, нацеленная на опухоль-ассоциированные антигены:

Иммунотерапия рака заключается в использовании иммунной системы для отторжения рака. Основной предпосылкой является стимулирование иммунной системы пациента, чтобы она атаковала злокачественные опухолевые клетки, являющиеся причиной заболевания. Это может происходить или путем активной иммунизации пациента (например, путем введения клеточной противораковой вакцины, такой как Provenge от компании "Дендреон", Сиэтл, штат Вашингтон, США)⁴, в этом случае иммунная система пациента обучается распознавать опухолевые клетки в качестве мишеней для уничтожения, или путем введения терапевтических антител в качестве лекарств, в этом случае иммунная система пациента мобилизуется на уничтожение опухолевых клеток при помощи терапевтических антител. Другой подход к активации иммунной системы против опухолей заключается в использовании так называемых опухоль-ассоциированных антигенов (ОАА), являющихся собственными протеинами, которые в некоторой степени экспрессируются на здоровых нормальных клетках, но избыточно экспрессируются на опухолевых клетках⁵. Эти ОАА создаются и презентируются организмом в иммуногенном образе, чтобы иммунная система создавала ответ, несмотря на то, что эти протеины являются своими. Очевидно, что такой подход будет полезен для ОАА, против которых у пациента развилась периферийная или приобретенная толерантность. В том случае, когда Т- и В-лимфоциты, распознающие ОАА, удалены из иммунологического репертуара, активная иммунотерапия рака становится невозможной.

Гастрин:

Примером аутоантигена, который может быть использован в качестве мишени для лечения раковых заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), таких как рак поджелудочной железы, является "малый гастрин" (G17)^6-9. Дополнительно, нейтрализация G17 также может быть полезна в случае любого гастрин-ассоциированного патологического состояния, включая язву желудка, гастроэзофагеальную рефлюксную болезнь (ГЭРБ)¹⁰, поскольку pH желудка регулируется гастрином, и терминальную стадию почечной недостаточности (ТСПН)¹¹, поскольку у пациентов с ТСПН гастрин циркулирует в более высоких концентрациях, чем обычно.

Патент US 5023077 описывает иммуногенные композиции и способы лечения и профилактики язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, в соответствии с которым иммуногенные композиции основаны на пептидах ряда гастрина, которые соединены с иммуногенным носителем, таким как дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, гемоцианин лимфы улитки или бычий сывороточный альбумин.

Гастрин обладает несколькими важными функциями в желудочно-кишечном тракте, из которых две наиболее важные - это стимуляция кислотной секреции и стимуляция роста клеток в ЖКТ. Гормон существует как минимум в двух молекулярных формах, в форме гептадека-гастрина, также называемого "малым" гастрином ("G17"), и тетратриаконто-гастрина ("G34"), названных в соответствии с числом аминокислотных остатков ("AK") в каждой молекуле, где G17 представляет собой 17-членный аминокислотный терминальный ("N-терминальный") остаток от G34.

Патент US 5609870 описывает получение анти-G17 иммуногена, инициирующего выработку антител у млекопитающих против их собственного G17 и не реагирующих на G34, содержащего конъюгированный пептид, состоящий из последовательности, соответствующей фрагменту N-терминальной аминокислотной последовательности G17 вплоть до аминокислотного остатка №12 на его С-конце, и спейсерный пептид, который конъюгирован с иммуногенным носителем, таким как дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, гемоцианин лимфы улитки и бычий сывороточный альбумин.

Иммунный баланс:

Иммунный баланс регулируется при помощи Th1/Th2/Th17/Treg клеток, играющих важную роль в разработке методов иммунотерапии.

Th1 клетки (Т-хелперы 1 типа) характеризуются продукцией провоспалительных цитокинов, таких как IFN-γ, IL-2 и TNF-β. Th1 клетки вовлечены в клеточно-опосредованный иммунитет. Цитокины, продуцируемые Th1 клетками, стимулируют фагоцитоз и разрушают микробиальные патогены. Несколько хронических воспалительных заболеваний было описано как Th1 доминантные заболевания, например, рассеянный склероз, диабет и ревматоидный артрит.

Th2 клетки (Т-хелперы 2 типа) характеризуются продукцией IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 и IL-13. Th2 клетки, как полагают, играют роль в аллергических ответах. Цитокины, такие как IL-4, в основном стимулируют продукцию антител. IL-5 стимулирует ответы эозинофилов, что также является частью иммунного ответа. Атопия и аллергия, как полагают, являются Th2 доминантными заболеваниями.

Дисбаланс Th1/Th2 или Th17/Treg иммунитета становится причиной различных иммунных заболеваний.

Аллергия рассматривается как гиперчувствительная реакция на белки в окружающей среде. Аллергены - это антигены, в ответ на которые пациенты отвечают продукцией антител IgE, что затем приводит к аллергическим реакциям. Антигены в комплексах или в виде слитых белков могут быть экзогенными аллергенами (например, клещи домашней пыли, пыльца березы, пыльца трав, кошачие антигены, антигены тараканов) или пищевыми аллергенами (например, коровье молоко, арахис, креветки, соя) или комбинацией обоих. Молекулы IgE важны из-за их роли в активации эффекторных клеток (тучные клетки, базофилы и эозинофилы). Общепринято, что IgE также играют важную роль в индукционной фазе аллергических заболеваний, через положительную регуляцию антиген-захватывающего потенциала В-клеток и дендритных клеток (DC), в обоих случаях как через низко-аффинные (CD23), так и высоко-аффинные рецепторы (Fc∈RI). Отрицательные функции антител IgE могут быть нейтрализованы при помощи аллерген-специфичных антител класса IgG, поскольку они перенаправляют иммунный ответ от В-клеток к моноцитам и DC. Дополнительно, они конкурируют с молекулами IgE за места связывания аллергена. Поэтому, аллергии могут подвергаться лечению, вылечены или предупреждены путем индукции аллерген-специфичных молекул IgG.

Период полувыведения молекул IgG из сыворотки равен примерно трем неделям по сравнению с тремя днями для молекул IgE. Молекулы IgE индуцируются при взаимодействии между (наивными) В-клетками и Th2 клетками, которые обеспечивают экспрессию IL-4 и IL-13 вместе с экспрессией CD40L, что необходимо для индукции переключения класса в сторону IgE в В-клетках памяти и плазматических клетках. В противоположность этому, Th1 клетки, которые продуцируют IFN-γ и IL-2, индуцируют переключение класса в сторону IgG. Таким образом, индукция Th1 вместо ответа Т-хелперов Th2-типа против аллергенов, имеет практическую значимость для предупреждения, лечения и излечения аллергических заболеваний.

В публикации WO 97/07218 описаны аллерген-анти-CD32 слитые белки. В данной публикации обойдены проблемы с изоляцией специфичных молекул IgG и с низким сродством этих IgG-антител к CD32, и ликвидированы факторы риска классической иммунотерапии, которая использует полное "IgE связывание" аллергенов.

Публикация WO 2007098934 A1 описывает молекулы, способные связываться с TLR9 и CD32, содержащие по крайней мере один эпитоп или по крайней мере один антиген, их получение и их использование в качестве лекарственного средства, в первую очередь, для лечения аллергий.

Роль TLR9:

Толл-подобные рецепторы (TLRs) - это класс белков, которые играют ключевую роль воврожденной иммунной системе. Они являются одиночными, трансмембранными, некаталитическимирецепторами, обычно экспрессированными на клеточной поверхности и в эндоцитозном компартменте сигнальных клеток, таких как макрофаги и дендритные клетки. TLRs распознают патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs), структурно консервативные молекулы, происходящие от микроорганизмов, и инициируют передачу сигналов для индукции продукции цитокинов, необходимых для врожденной иммунной системы и последующей адаптивной иммунной системы.

Разные TLRs обнаруживают различные паттерны экспрессии. Этот ген экспрессируется преимущественно в богатых иммунными клетками тканях, например, селезенкой, в лимфатическом узле, костном мозге и лейкоцитах периферической крови.

Всего было идентифицировано 13 общих TLRs (названных просто от TLR1 до TLR13) у людей и мышей, аналогичные формы многих TLRs были найдены и у других видов млекопитающих. В то же время не каждый TLR-рецептор у мышей может быть найден у людей и наоборот. Кроме того, не для каждого TLR-рецептора известны лиганд и функция, например, TLR10 - это редкий рецептор с неизвестной функцией.

Активация TLR-рецепторов используется для лечения различных заболеваний, например, активация TLR9 при помощи лекарственных средств показала преимущества в лечении аллергии и онкологических заболеваний. Исследования на мышах и людях показывают, что природными лигандами для TLR9 являются неметилированные CpG-последовательности в молекулах ДНК. Сайты CpG относительно редки (~1%) в геномах позвоночных по сравнению с бактериальными геномами или вирусной ДНК. TLR9 экспрессируются многими клетками иммунной системы, такими какдендритные клетки, В-лимфоциты, моноциты и естественные киллеры (NK). Однако, у здоровых людей экспрессия TLR9 ограничена плазматическим дендритными клетками (pDCs) и В-клетками. Экспрессия происходит внутриклеточно, в пределах эндосомальных компартментов и функциональных отделов, для предупреждения иммунной системы о вирусных или бактериальных инфекциях путем связывания с ДНК, богатой CpG-мотивами. Однако в условиях патологии сообщалось об экспрессии TLR9 также и на поверхности клеток^12-14.

Сообщалось о многих различных синтетических молекулах - агонистах TLR9. Агонистические лиганды (активация TLR9) были классифицированы по трем группам:

Группа, состоящая из CpG класса А, в частности, олигодеоксинуклеотидов (ОДН) класса CpG-A(D)¹⁵, также известных как ОДН типа "D". Указанные агонисты TLR9 вызывают мощную индукцию IFNa, минимальную матурацию дендритных клеток и именуются в данном случае лигандами TLR9 "группа 1". Примером может служить ODN2216¹⁶: (SEQ ID NO: 46)

Группа, состоящая из CpG класса В, в частности олигодеоксинуклеотидов (ОДН) класса CpG-B (K)¹⁵, также известных как ОДН типа «K». Указанные агонисты TLR9 вызывают мощную индукцию IFNa, минимальную матурацию дендритных клеток, и именуются в данном случае лигандами TLR9, "группа 2". Примером может служить ODN2006^17;18: (SEQ ID NO: 47)

Группа, состоящая из CpG класс С, также известная как олигодеоксинуклеотиды (ОДН) класса CpG-C¹⁵. Указанные агонисты TLR9 вызывают индукцию IFNa, матурацию дендритных клеток и именуются в данном случае лигандами TLR9, "группа 3". Примером может служить ODNM362¹⁵:

(SEQ ID NO: 48)

Все лиганды для TLR9, описанные до настоящего времени, базируются на нуклеотидах. Несмотря на то, что описаны антитела, специфичные для TLR9 и используемые для того, чтобы продемонстрировать присутствие и расположение рецептора, данные молекулы не описаны в качестве лигандов TLR9, и не существует описаний о какой-либо активирующей или ингибирующей активности в отношении TLR9.

Роль CD32:

CD32 сильно экспрессируются на моноцитах/дендритных клетках и В-клетках и такие молекулы предназначены для того, чтобы перенаправить иммунный ответ на эти важные иммунологические клетки, с целью предотвращения презентации антигена В-клетками, наряду с усилением презентации антигена исключительно дендритными клетками (DCs), что, при достаточной стимуляции, далее приводит к индукции Th1 - ответов против антигена. Существует как минимум два типа DCs: миелоидные (mDC) и плазматические дендритные клетки (pDC), что привело к возникновению новой концепции клеток DC1 и DC2. В соответствии с данной концепцией, DC1-клетки способствуют индукции развития Th1-клеток после стимуляции специфическим антигеном, а DC2-клетки поддерживают развитие Th2-клеток. DC, произошедшие от моноцитов (или mDC), обычно рассматриваются как тип DC1, в то время как pDC рассматриваются как тип DC2. Оба типа DC экспрессируют CD32a и будут индуцировать антиген-специфичный Т-клеточный ответ; однако это не гарантирует, что результатом будет ответ типа Th1. Более того, у доноров с аллергией выше вероятность Th2-ответов. Важно отметить, что pDC экспрессируют TLR9-рецептор, который связывает CpG-ODNs (олигодеоксинуклеотиды (ОДН), содержащие неметилированные CpG-мотивы). Активация этого рецептора на pDC ведет к очень сильной продукции IFN-альфа и IL-12, что способствует индукции Th1 и, таким образом, превращает потенциальные DC2-клетки в DC1-клетки.

Таким образом, указанные молекулы могут сочетать активацию TLR9-рецептора на pDC со специфической стимуляцией и индукцией антиген-специфичных Th1-клеток.

При иммунотерапии опухолей одной из особых целей является использование специфичных Т-хелперов типа 1 (Th1) в дополнение к цитотоксическим Т-лимфоцитам (CTL).

Суперспирали:

Суперспирали состоят из структурных белковых мотивов, в которых 2-7 альфа-спиралей закручены вместе наподобие прядей каната; наиболее распространенными видами являются димеры и тримеры. Суперспирали использовались для стабилизации Fv-фрагментов антител, что приводит к образованию гетеродимерных суперспирализованных доменов¹⁹.

Раскрытие изобретения

Существует необходимость в обеспечении улучшенных методов иммунотерапии, нацеленной на гастрин и гастрин-зависимые болезненные состояния. Таким образом, задачей изобретения является создание вакцины с улучшенной иммуногенностью, стабильностью и структурой для регуляции иммунного ответа в отношении специфичных эпитопов гастрина.

Эта задача решается сущностью признаков, представленных в формуле изобретения.

В соответствии с настоящим изобретением предложена иммуногенная композиция, содержащая

а) направляющий адъювант, содержащий по крайней мере группу анти-CD32, связанную с лигандом TLR9, и первую пептидную альфа-спираль, и

б) пептидный иммуноген гастрин-17, связанный со второй пептидной альфа-спиралью, скрученной вокруг первой альфа-спирали, где пептидный иммуноген представляет собой любого из нижеперечисленных элементов:

(i) человеческий гастрин-17, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или ее фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или по крайней мере 4 N-терминальные аминокислоты из SEQ ID NO: 2;

(ii) аналог (i), предпочтительно происходящий от макаки-резуса или мышиного происхождения, и/или

(iii) функционально активный вариант любого из (i) или (ii), с одной, двумя, тремя или четырьмя точечными мутациями в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

В конкретном плане, упомянутый иммуноген является линейным пептидом, содержащим или включающим в себя:

(i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, предпочтительно SEQ ID NO: 4;

(ii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, предпочтительно SEQ ID NO: 6;

(iii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, предпочтительно SEQ ID NO: 8, или

(iii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или NO: 9.

Предпочтительно, чтобы иммуногенная композиция по изобретению содержала по крайней мере два пептидных иммуногена, связанных со второй пептидной альфа-спиралью, предпочтительно 2, 3 или 4 пептидных иммуногена.

Когда со второй альфа-спиралью связано более одного пептидного иммуногена, то пептидные иммуногены могут быть конъюгированы с альфа- последовательно, то есть иммуногенные пептиды пришиты один за другим, например, путем сшивания С-конца первого пептидного иммуногена с N-концом второго иммуногенного пептида, где первый и второй иммуногенные пептиды являются идентичными или отличающимися друг от друга.

В другом варианте, или дополнительно, последующие пептидные иммуногены могут быть включены в иммуногенную композицию по изобретению при помощи перекрестного сшивания, например, двух или более иммуногенных пептидов, которые являются или идентичными или отличающимися один от другого и связаны с той же самой альфа-спиралью при помощи химической реакции, такой как химическая поперечная сшивка, позволяющая создать межмолекулярные поперечные связи, например, с гомо-бифункциональными агентами, такими как диметиладипимидат (ДМА), диметилсуберимидат (ДМС) или глутаральдегид. Например, такие поперечные сшивки могут быть выполнены при помощи глутаральдегида, перекрестно сшиваемого со свободными лизиновыми группами в альфа-спирали и спейсере/линкере, соответственно. Таким образом, два или более пептидных иммуногена, используемые по настоящему изобретению, соединены с альфа-спиралью параллельно или бок о бок.

Согласно конкретному аспекту изобретения, каждая из упомянутых первая и вторая альфа-спирали содержат по 3-5 аминокислотных повторов аминокислотного мотива, специфически связывающихся друг с другом с константой диссоциации Kd менее чем 10^-6 М, предпочтительно с Kd менее чем 10^-7 М, более предпочтительно менее чем 10^-8 М или 10^-9 М.

Согласно дополнительному конкретному варианту изобретения, упомянутая анти-CD32 группа выбрана из группы, включающей анти-CD32 антитело, фрагмент антитела и пептид, предпочтительно целевой по отношению к CD32a. Фрагмент антитела в конкретном плане может, например, быть Fab, Fv, scFv, dAb, F(ab)2 или Fcab фрагментом или любой другой связывающей единицей, при условии, что она специфически связывается с рецептором и интернализуется после связывания.

В конкретном плане упомянутая анти-CD32 группа является специфической по отношению к CD32a, предпочтительно с высоким сродством с Kd≤10^-6 М, более предпочтительно менее чем 10^-7 М или менее чем 10^-8 М.

Более конкретно, упомянутая анти-CD32 группа является специфическим или селективным CD32a-связывающим агентом, то есть не является специфической по отношению к CD32b или CD32b с низким сродством с Kd>10^-6 М, предпочтительно высшим чем 10^-5 М, более предпочтительно высшим чем 10^-4 М. Дифференциальное сродство связывания с CD32a и CD32b составляет предпочтительно по крайней мере 1 логарифм, более предпочтительно по крайней мере 2 логарифма или по крайней мере 3 логарифма от большей разницы в значении Kd.

Конкретно, предпочтительно высокое сродство или высокое дифференциальное сродство анти-CD32 группы к связыванию с CD32a, а не с CD32b, что обычно используется в иммуностимулирующей вакцине с дополнительным использованием агонистического лиганда TLR9.

Сродство связывания анти-CD32 группы, специфичной по отношению к любому из CD32a или CD32b или к ним обоим, может быть определено подходящим анализом, таким как типичный ИФА с использованием коммерчески доступных рекомбинантных форм CD32a и CD32b c HIS-метками, нанесенных на планшеты для ИФА типа Ni-NTA, например, планшеты типа Ni-NTA HisSorb (Qiagen, Австрия). Анти-CD32 группы могут быть биотинилированы и в таком виде могут быть обнаружены при помощи стрептавидина-HRP или стрептавидина АР и надлежащего субстрата. В другом варианте, группы могут быть протестированы FACS-анализом при помощи U937-клеток (например, АТСС: CRL 1593), экспрессирующих CD32a, но не CD32b и EBV трансформированных В-клеток, например, CFB4:2, как описано у van Reijsen и др.²⁰, экспрессирующих CD32b и не экспрессирующих CD32a

Согласно дополнительному конкретному варианту изобретения, упомянутый лиганд TLR9 является агонистом TLR9, выбранным из группы, состоящей из олигодеоксинуклеотидов CpG классов А, В и С, или иммуностимулирующим пептидом, имитирующим любой из олигодеоксинуклеотидов CpG.

Согласно конкретному варианту изобретения, лиганд TLR9 является агонистом TLR9, выбранным из группы, состоящей из CpG класса А, в частности, олигодеоксинуклеотидов (ОДН) CpG-A (D)¹⁷, также известных как ОДН типа "D". Указанные агонисты TLR9 вызывают мощную индукцию IFNa, минимальную матурацию дендритных клеток и именуются в данном случае лигандами TLR9 "группа 1".

В соответствии с другим специфическим вариантом изобретения, лиганд TLR9 является агонистом TLR9, выбранным из группы, состоящей из CpG класса В, в частности, олигодеоксинуклеотидов (ОДН) CpG-B (K)²¹, также известных как ОДН типа "K". Указанные агонисты TLR9 вызывают мощную индукцию IFNa, минимальную матурацию дендритных клеток, и именуются в данном случае лигандами TLR9 "группа 2".

В соответствии с другим специфическим вариантом изобретения, лиганд TLR9 является агонистом TLR9, выбранным из группы, состоящей из CpG класса С, также известных как олигодеоксинуклеотиды (ОДН) CpG-C^{15; 21}. Такие агонисты TLR9 вызывают индукцию IFNa и матурацию дендритных клеток, и именуются в данном случае лигандами TLR9 "группа 3".

Индукция IFNa может быть определена по уровню экспрессии IFNa и соответствующему приросту по сравнению с контрольным уровнем. Прирост по отношению к непростимулированным клеткам может быть сравнен с уровнями индукции, вызванными эталонами, установленными для каждого типа CpG, определенными в зависимости от группы лиганда TLR9 - 1, 2 или 3, и, как правило, он находится в диапазоне от 30% до 300% от соответствующего эталона, предпочтительно по крайней мере 100%, более предпочтительно по крайней мере 120%, по крайней мере 150%, по крайней мере 200% или по крайней мере 250%.

Матурация незрелых дендритных клеток может быть определена по уровню экспрессии любого из маркеров CD80, CD83 и CD86. Прирост по отношению к непростимулированным клеткам может быть сравнен с уровнями индукции, вызванными эталонами, установленными для каждого типа CpG, определенными в зависимости от группы лиганда TLR9 - 1, 2 или 3, и, как правило, он находится в диапазоне от 30% до 300% от соответствующего эталона, предпочтительно по крайней мере 100%, более предпочтительно по крайней мере 120%, по крайней мере 150%, по крайней мере 200% или по крайней мере 250%.

Конкретно, агонист TLR9 из группы 1 и 3 приведет к усилению экспрессии IFNa и агонист TRL9 из группы 2 и 3 приведет к усиленной экспрессии любого из факторов созревания DC - CD80, CD83 и CD86. Антагонист TLR9 приведет к уменьшению экспрессии IFNa и уменьшению экспрессии любого из факторов созревания DC - CD80, CD83 и CD86, даже в присутствии с агонистом TLR9 из любой группы 1-3.

В качестве альтернативы полинуклеотидным лигандам TLR9, описанным выше, может быть использован любой другой Т1Л9-связывающий агент с агонистическими свойствами, например, пептидный связывающий агент, включая антитела или фрагменты антител.

Согласно дополнительному конкретному аспекту изобретения, иммуногенная композиция содержит одну или более линкерных последовательностей, предпочтительно состоящих из остатков глицина и/или серина и/или лизина, предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или NO: 13. Линкерные последовательности могут быть линейными или разветвленными, например, для того, чтобы обеспечить перекрестную сшивку между двумя или более пептидными или полипептидными единицами.

Согласно дополнительному конкретному варианту изобретения, иммунологическая композиция содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11.

Согласно настоящему изобретению предложена вакцина, содержащая иммуногенную композицию по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Такая вакцина является обычно иммуностимулирующей вакциной, например, стимулирующей гуморальный или Т-клеточный (Th1) иммунный ответы.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, гуморальный и Т-клеточный (Th1) иммунный ответы являются транзиторными, например, с достижением определенного максимума титра IgG, вызванного вакцинацией, что, как правило, достигается в течение от 2 до 8 недель после вакцинации, с последующим снижением титра на как минимум 30%, предпочтительно как минимум 40%, или как минимум 50%, или как минимум 60%, или как минимум 70%, или как минимум 80%, или как минимум 90%, или как минимум 100%, в течение 6 месяцев после вакцинации, предпочтительно в течение 5 месяцев, или в течение 4 месяцев, или в течение 3 месяцев, или в течение 2 месяцев. Такой сниженный титр может быть снова повышен после бустерной инъекции. В серии вакцинации транзиторный иммунный ответ может быть определен после последней инъекции иммуногенной композиции или вакцины. Транзиторный иммунный ответ имеет преимущество контролируемой терапии, например, возможность прервать или прекратить лечение при необходимости.

Согласно настоящему изобретению предложен набор для получения иммуногенной композиции по изобретению, содержащей следующие компоненты:

а) направляющий адъювант, содержащий по крайней мере группу анти-CD32, связанную с лигандом TLR9, и первую пептидную альфа-спираль, и

б) пептидный иммуноген гастрин-17, связанный со второй пептидной альфа-спиралью, скрученной вокруг первой альфа-спирали, где пептидный иммуноген представляет собой любой из нижеперечисленных элементов:

(i) человеческий гастрин-17, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или ее фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или по крайней мере 4 N-терминальные аминокислоты из SEQ ID NO: 2;

(ii) аналог (i), предпочтительно происходящий от макаки-резуса или мышиного происхождения, и/или

(iii) функционально активный вариант любого из (i) или (ii), с одной, двумя, тремя или четырьмя точечными мутациями в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

Набор конкретно может быть использован для облегчения производства вакцины при помощи предварительно полученного направляющего адъювантного компонента для комбинации с иммуногеном, что может быть обеспечено в соответствии с потребностями группы объектов или индивидуального объекта.

Согласно изобретению далее предложена иммуногенная композиция для использования при лечении объекта, страдающего гастрин-зависимыми заболеваниями или болезненными состояниями. Такие заболевания или болезненные состояния прежде всего вызваны или связаны с продукцией эндогенного гастрина или его гиперпродукцией у объекта. Гастрин-зависимые заболевания или болезненные состояния конкретно включают гастрин-зависимые опухоли или гастрин-зависимый рак, такой как рак поджелудочной железы, или рак ЖКТ, язва желудка, гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ), терминальная стадия почечной недостаточности(ТСПН), или ожирение.

Таким образом, изобретение конкретно предлагает способ лечения объекта, страдающего гастрин-зависимыми заболеваниями, такими как гастрин-зависимый рак, такой как рак поджелудочной железы, или рак ЖКТ, язва желудка, гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ), терминальная стадия почечной недостаточности (ТСПН), или ожирение, при помощи введения объекту эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины по изобретению, либо профилактически, например, чтобы предотвратить вспышку заболевания или болезненного состояния или прогрессирование заболевания, либо терапевтически, например, для улучшения заболевания или болезненного состояния.

Конкретно, композиция вводится объекту в эффективном количестве с использованием режима "прайм-буст". Режим, при котором определяется конкретный иммунный ответ больного, подразумевает проведение проведение нескольких иммунизаций.

Конкретно, эффективное количество находится в диапазоне от 0,0001 до 2 мг на одно введение, предпочтительно в диапазоне от 0,001 до 2 мг на дозу.

В конкретном варианте осуществления, больной дополнительно подвергается лечению химиотерапией, например, в курсе лечения гастрин-зависимого рака.

Конкретно, иммуногенная композиция по изобретению запускает защитные иммунные ответы у больного, предпочтительно с титром сывороточного IgG против человеческого гастрин-17, равным по крайней мере 1/1000, предпочтительно по крайней мере 1/10⁴, предпочтительно по крайней мере 1/10⁵, предпочтительно по крайней мере 1/10⁶, или ниже, до обнаруживаемого уровня при большем разведении.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 продемонстрировано антитело (индукция IgG) у макак-крабоедов. Кривая зависимости от времени индукции анти- G17 класса IgG, после трех инъекций вакцины (TYG100_2RM) в день 0 (d0), через 14 дней (d14) и 28 дней (d28). Значительная индукция IgG была отмечена против ScFV-спираль1 и G17RM и G17H. Отмечено отсутствие ответа против контрольного пептида со сходной молекулярной массой или в том случае, когда животные были иммунизированы G17RM_2 без присутствия "боеголовки". Все специфические титры IgG снижаются через 4 недели после последней иммунизации, указывая на необходимость бустерных инъекций для поддержания уровней IgG. Кроме того, присутствие натуральных G17RM не усиливает ответ и, поскольку, уменьшение IgG против G17RM значительно выше, чем в случае одного ScFV-coil1, можно сделать вывод о том, что индуцированный иммунный ответ является обратимым.

На фигуре 2 продемонстрировано уменьшение массы после антигастриновой иммунизации. У четырех из шести животных показано значительное уменьшение массы тела в зависимости от времени после иммунизации TYG100_2RM. Обслуживающий животных персонал отметил у этих животных потерю аппетита в отношении послеобеденных закусок без потери интереса к нормальной повседневной пищи. Такие наблюдения отсутствовали при использовании других вакцин, поэтому антигастриновая вакцина по изобретению может быть использована для контроля над ожирением.

На фигуре 3 приводится информация о последовательности для SEQ ID NO: 1: малый человеческий гастрин, G17;

SEQ ID NO: 2: человеческий пептид гастрин, первых (N-терминальных) 12 АА (аминокислот) малого гастрина, G12;

SEQ ID NO: 3: N-терминальный эпитоп малого гастрина, первые (N-терминальные) 4 АА, включая специфичные функционально активные варианты с точечными мутациями;

SEQ ID NO: 4: N-терминальный эпитоп малого гастрина, первые (N-терминальные) 4 АА, включая более специфичные функционально активные варианты с точечными мутациями;

SEQ ID NO:5: N-терминальный эпитоп малого гастрина, первые (N-терминальные) 12 АА, включая специфические функционально активные варианты с точечными мутациями;

SEQ ID NO: 6: N-терминальный эпитоп малого гастрина, первые (N-терминальные) 12 АА, включая более специфичные функционально активные варианты с точечными мутациями;

SEQ ID NO: 7: N-терминальный эпитоп малого гастрина, первые (N-терминальные) 13 АА, включая специфические функционально активные варианты с точечными мутациями;

SEQ ID NO: 8: N-терминальный эпитоп малого гастрина, первые (N-терминальные) 13 АА, включая более специфичные функционально активные варианты с точечными мутациями;

SEQ ID NO: 9: человеческий пептид гастрин, первые (N-терминальные) 13 АА (аминокислоты) малого гастрина, G13;

SEQ ID NO: 10: Иммуногенный компонент TYG100_1H: Часть иммуногенной композиции по изобретению, содержащая человеческий пептид гастрин SEQ ID 9, линкерную последовательность и пептидную альфа-цепь (TYG100_1H).

Эта часть может быть связана с соответствующим целевым адъювантом при помощи суперспиральной сшивки.

В последовательности жирным шрифтом обознчен пептидный иммуноген, курсивом - линкер, подчеркнутым - спираль

SEQ ID NO: 11: Иммуногенный компонент TYG100_2H: Часть иммуногенной композиции по изобретению, включающей два человеческих пептида гастрина SEQ ID NO: 9, разветвленную линкерную последовательность и пептидную альфа-цепь (TYG100_2H). Эта часть может быть связана с соответствующим целевым адъювантом при помощи суперспиральной сшивки.

В последовательности жирным шрифтом обозначен пептидный иммуноген, курсивом - линкер, подчеркнутым - спираль

SEQ ID NO: 12: линейная линкерная последовательность;

SEQ ID NO: 13: разветвленная линкерная последовательность. Осуществление изобретения

Конкретные термины, использованные в описании, имеют следующее значение.

Под термином "адъювант", используемым здесь, понимают интегрированный или совместно вводимый компонент вакцины, который:

- усиливает иммунный ответ к специфическому иммуногену, например, антигену или гаптену. Иммунный ответ в таком случае обычно выше, нежели иммунный ответ, вызванный эквивалентным количеством иммуногенной композиции, вводимой без адъюванта,

и/или

- направляет конкретный тип или класс иммунного ответа против иммуногена, например, Th1 или Treg иммунного ответа, такой адъювант здесь понимается как "направляющий адъювант".

"Эффективное количество" адъюванта по настоящему изобретению конкретно представляет количество, которое усиливает иммунологический ответ на иммуноген таким образом, что, например, требуются более низкие или меньшие дозы иммуногенной композиции для генерации эффективного иммунного ответа намеченного класса.

Направляющий адъювант согласно изобретению не только опосредует эффективный иммунный ответ, но и регулируют иммунный ответ в желаемом направлении. Благодаря направлению иммуногена в соответствующие иммунные клетки для его интернализации и последующего процессинга, Th1 иммунный ответ индуцируется быстрее чем Th2 иммунный ответ, в частности, при использовании лиганда TLR9, которым является агонист TLR9 из группы 3. В случае, если агонист TLR9 из группы 1 комбинируется с анти-CD32 группой, которая связывает CD32b, то, как правило, это предполагает индукцию Treg клеток.

Термин "эффективное количество" иммуногенной композиции, например, используемой в вакцине по изобретению, относится к количеству, достаточному для того, чтобы продемонстрировать значимую пользу у объекта, подвергающегося лечению, когда иммуногенная композиция вводится в режиме вакцинации. Специалистам в данной области будет очевидно, что в некоторых вариантах осуществления, для конкретной композиции может быть желательно, чтобы она содержала профилактически или терапевтически эффективное количество в единице дозирования, вводимой в определенном режиме дозирования, даже если такое количество может быть недостаточным для достижения значительной пользы при введении композиции только в однократной дозе. Специалистам в данной области также будет очевидно, что эффективное количество иммуногенной композиции может отличаться для различных объектов, получающих композицию, например, в зависимости от таких факторов, как желаемая биологическая конечная точка, природа композиции, путь введения, состояние здоровья, размер и/или возраст объекта, подвергающегося лечению и т.д. В некоторых вариантах осуществления, эффективное количество является таким, которое коррелирует с полезным эффектом при введении в составе конкретного режима дозирования, например, при однократном введении или при серии введений в режиме "буст".

Под термином "пептидная альфа-спираль", используемым здесь, следует понимать спиральный структурный элемент, основанный на пептидной последовательности, содержащей число повторов, также называемых спиральные повторы. Такая альфа-спираль способная связываться с другим аналогом, также называемым сопряженной альфа-спиралью того же самого типа, с образованием димера, тримера или большего олигомера, также называемого суперспиралью.

Суперспираль является структурным мотивом полипептидов или пептидов, в которых от двух до семи альфа-спиралей скручены вместе как пряди каната. В некоторых вариантах осуществления, суперспираль вакцины представляет собой одну или две альфа-спирали, скрученные вместе. Такие альфа-спиральные участки способны образовывать суперспиральные структуры и могут быть вовлечены в олигомеризацию спиральных повторов, что может быть измерено подходящим анализом взаимодействия внутри суперспирали.

Конкретно, димер из альфа-цепей может быть образован путем соединения двух мономеров, благодаря которым димер образуется за счет взаимодействия с двумя альфа-спиралями суперспирализованных доменов. В некоторых вариантах осуществления спирали содержат пептид с аминокислотной последовательностью, какуказано в SEQ ID NO: 14 или NO: 16 (спираль и суперспираль), которая включает x повторов.

EVSAL (SEQ ID NO: 14)

Е5: (SEQ ID NO: 15)

KVSAL (SEQ ID NO: 16)

K5: (SEQ ID NO: 17)

В другом варианте могут быть использованы любые из последовательностей, описанных Chao и др.²² или Litowsky и др.^23;24 или функциональные эквиваленты, которые образуют конкретный тип сшивки суперспирали, такие как указаны в таблице далее, включая их варианты, например, с различным числом повторов, или одной, двумя или тремя точечными мутациями в типе спирали:

Для целей изобретения, предпочтительным типом суперспирали является димер, либо гетеродимер (гетероспираль) из двух разных, но совпадающих спиралей, которые отличаются по крайней мере по одной аминокислоте в последовательности спирального повтора, или гомодимер из двух идентичных совпадающих спиралей, то есть содержащих совпадающие последовательности спирального повтора ("спирали").

Предпочтительное количество спиралей - 3-5, предпочтительно любая из комбинаций 3+3, 3+4, 3+5, 4+4, 4+5, 5+5, 4+3, 5+3 или 5+4.

В качестве вариантного решения могут быть использованы гептадные повторы (повторы аминокислотной последовательности, содержащей 7 аминокислот, 7-меры), 6-меры, 8-меры или 9-меры.

В случае гомодимерной суперспирали, обычное количество спиральных повторов, как правило, не более 5, чтобы избежать нежелательного дисбаланса структуры. В случае гетеродимерной суперспирали, желательно использовать длину пептидной последовательности с как минимум 3-мя спиралями. Таким образом, связывание компонентов вакцины, то естьсвязывание друг с другом направляющего адъюванта и иммуногена, как правило, достигается с предпочтительно высокой аффинностью, то есть Kd менее чем 10^-7 М, более предпочтительно менее чем 10^-8 М или 10^-9 М. Однако, хотя большее число повторов и повышает сродство, это может быть связано с возросшей гомодимеризацией.

Компоненты иммуногенной композиции по изобретению могут также содержать пептидный спейсер для связывания анти-CD32 группы и/или лиганд TLR9, и дополнительно также эпитоп (пептидного иммуногена) с повторами спирали, соответственно. Например, пептидный спейсер может быть на одном или обоих концах суперспирали. Каждый из пептидных спейсеров может быть присоединен к первой альфа-спирали суперспирального домена суперспирали.

Пептидный спейсер может быть, например, пептидом из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот или более, либо линейным, либо разветвленным, например, чтобы обеспечить две, три, четыре или более ветвей. Количество аминокислот в пептидном спейсере может быть, в некоторых вариантах осуществления, равно 20, или на 10 выше или меньше, в зависимости от конкретных последовательностей и длины спирали.

Под термином "анти-CD32 группа", используемым здесь, понимается лиганд, специфически связывающийся с клеточной мишенью CD32, либо CD32a, CD32b или с ними обоими. Группа может быть любой связывающей структурой, как например, полученной из белков, полипептидов или пептидов, включая антитела или фрагменты антител или сложные молекулы со связывающей частью. Связывающая часть молекул или молекулярного комплекса по изобретению может содержать белки, как например антитела или фрагменты антител, такие как Fab, Fv, scFv, dAb, F(ab)2, мини-антитело, небольшие мутированные домены иммуноглобулинов, или другие биологические связывающие агенты, такие как растворимый Т-клеточный рецептор, дарпины и т.д. Антитела и фрагменты антител и их дериваты могут быть получены и отобраны для связывания с CD32 в соответствии с известными методами, такими как гибридомная технология, В-клеточное клонирование, фаговый дисплей, рибосомный дисплей или дисплей на поверхности клеток для библиотек антител, скрининговый анализ вариантов антител. Примерами анти-CD32 групп являются scFv, полученные из анти-CD32 моноклонального антитела АТ-10²⁵, IV.3²⁶, 2Е1²⁷ или любого другого aCD32 моноклонального антитела.

Специфическое связывание может быть определено при помощи подходящего метода оценки связывания, как например, традиционные иммунотесты. Существуют многочисленные способы, известные в данной области, для определения связывания при помощи иммунотестов. Могут быть использованы различные иммунотесты, известные в данной области, включая конкурентные и неконкурентные системы анализа, использующие такие техники, как радиоиммунотесты, ИФА (иммуноферментный анализ), иммунорадиометрические анализы, реакция диффузной преципитации в геле, иммунодиффузионные анализы, вестерн-блот, анализ BIAcore и т.д.

Термин "перекрестно реагирующий" по отношению к антигенам или антителам, используемым здесь, относится к эпитопам, распределенным между антигенами различного происхождения, например, от человека, макаки-резуса или мышиного происхождения. N-терминальный эпитоп содержит или включает первые 4 АА из G17, который является перекрестно реагирующим в пептидах различного происхождения, при этом эпитоп запускает иммунный ответ и IgG-антитела, которые являются перекрестно-реагирующими с эпитопами.

Иммунологическая композиция по изобретению является конкретно полезной для лечения гастрин-зависимых заболеваний или болезненных состояний, которые связаны с избытком гастрина, например, гастрин-зависимые опухоли или гастрин-зависимый рак, такой как рак поджелудочной железы, язва желудка, гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ), терминальная стадия почечной недостаточности (ТСПН) или ожирение.

Термин "гастрин-зависимая опухоль" или "гастрин-зависимый рак", используемый здесь, относится к опухолям или заболеваниям или болезненным состояниям, которые с ними ассоциированными, например, гастрин-зависимая колоректальная аденокарцинома и другие гастрин-зависимые раковые заболевания, например, рак желудка, печени, поджелудочной железа и мелкоклеточная карцинома легких. Термин конкретно используется здесь в части лечения опухоли для предупреждения прогрессии опухолевого заболевания для положительного ответа опухоли или уменьшения массы опухоли. Термин также применяется по отношению к минимальному остаточному заболеванию, которое может быть успешно вылечено, например, в случае целевых циркулирующих опухолевых клеток -для снижения их количества ниже определенного порога, например, ниже предела обнаружения.

Язвенная болезнь желудка может быть вызвана повышенной продукцией кислоты в желудке и разрушением комплекса защиты желудка, который в нормальном состоянии защищает слизистую желудка от кислотного повреждения. Хотя эти два состояния являются различными по этиологии, в обоих случаях будет польза от уменьшения кислотной секреции в желудке. Желудочная кислота производится специализированными желудочными клетками - париетальными клетками. Секреция кислоты париентальными клетками может быть простимулирована ацетилхолином, гистамином или гастрином, после связывания каждого из этих соединений со специфическими рецепторами на поверхности клетки. Среди указанных наиболее сильным стимулятором секреции кислоты является пептидный гормон гастрин. Антигастриновая иммунотерапия, описанная здесь, будет улучшать болезненное состояние при язве желудка.

Термины "пептидный гастрин-17" или "пептид G17" или "G17", используемые здесь, относятся к малому гастрину G17, который состоит из N-терминальных 17 АА гастрина. Пептид G17 может быть человеческого происхождения или от других млекопитающих, включая макак-резусов, или мышей, следовательно, имеет последовательность человека или другого млекопитающего, или может быть искусственной конструкцией, например, включать искусственные последовательности, например, полученные путем изменения типа и/или последовательности аминокислотных остатков в нативной (естественного происхождения) последовательности G17. Термин в частности включает варианты человеческого G17, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, или ее фрагментов, но отличающихся от этой пептидной последовательности, поскольку она получена из гомологичной последовательности различных видов. Это относится к встречающимся в природе вариантам или аналогам. Под термином "аналоги" следует понимать химические конструкты, происходящие от двух или более источников, где по крайней мере одна часть является естественного происхождения, например, которая содержит главную часть (по крайней мере 50%) пептидного иммуногена, а другая часть от нее отличается, и является либо естественной или синтетической (искусственной).

Термин в частности включает фрагменты или функционально активные варианты G17, например, которые включают одну или более точечных мутаций, или также пептиды или полипептиды, содержащие дополнительные аминокислотные последовательности помимо G17, например, путем расширения N-конца и/или С-конца при помощи одной или более аминокислотных остатков или последовательностей. Расширение С-конца является предпочтительным, например, при помощи G17 последовательностей, как идентичных, так и нет, или при помощи дополнительных аминокислотных последовательностей гастрина.

Термин в частности включает пептиды с одним или более модифицированными аминокислотными остатками. Стандартные модификации включают фосфорилирование, метилирование, ацетилирование, амидирование, образование пирролидин карбоновой кислоты, изомеризацию, гидроксилирование, сульфатирование, связывание флавина, окисление цистеина и нитрозилирование. Примером модификации, описанной здесь, является модификация N-терминальной глутаминовой кислоты G17, то есть pyroGlu в позиции 1, также известной как "Пирролидин карбоновой кислоты (Glu)" или pGlu или рЕ.

Термин "функционально активные варианты", используемый здесь в отношении пептидного иммуногена по изобретению, означает последовательность, полученную в результате модификации родительской последовательности, например, в результате вставки, делеции или замены одной или более аминокислот, например, рекомбинантными методами или путем химической дериватизацией одного или более аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, или нуклеотидов в кодирующей нуклеотидной последовательности, или на одном или обоих дистальных концах последовательности, при условии, что такие модификации не влияют (в частности, не уменьшают) на активность такой последовательности. В случае пептидного иммуногена, вызывающего некоторый иммунный ответ на целевой гастрин, функционально активный вариант пептидного иммуногена по-прежнему будет включать антигенную детерминанту или эпитоп, хотя это может быть изменено, например, для повышениям иммуногенности. В частности, функционально активные варианты пептидного иммуногена G17, или его фрагмента, как, например, фрагменты G12 или G13, обладают активностью индуцировать антигастриновые антитела класса IgG у объекта, получающего лечение, при этом антитела обладают перекрестной реактивностью к эндогенному гастрину объекта.

Функционально активные варианты могут быть получены, например, путем изменения последовательности в родительском пептиде, например, в пептиде G17 - от человека, макаки-резуса или мыши, или его фрагменте, например, в пептидах G12 или G13, путем введения одной или нескольких мутаций, которые существенным образом не изменят перекрестно реагирующие эпитопы, и позволяют получить молекулу по существу с такой же иммуногенностью. Под термином "по существу та же иммуногенность", используемым здесь, понимается величина иммунного ответа или антигастриновых антител класса IgG, индуцированные у объекта, подвергающегося лечению иммуногенной композицией, где величина является предпочтительно по крайней мере по крайней мере 20%, по крайней мере 30%, по крайней мере 40%, по крайней мере 50%, по крайней мере 60%, по крайней мере 70%, по крайней мере 80%, по крайней мере 90%, по крайней мере 95%, по крайней мере 98% или даже по крайней мере 100%, или по крайней мере 110%, или по крайней мере 120%, или по крайней мере 130%, или по крайней мере 140%, или по крайней мере 150%, или по крайней мере 160%, или по крайней мере 170%, или по крайней мере 180%, или по крайней мере 190%, например, вплоть до 200% от величины, определенной для родительского пептида.

В предпочтительном варианте осуществления, функциональноактивный вариант родительского пептида

a) получен из пептида путем замены, инсерции (аддикции) и/или делеции по крайней мере одной аминокислоты, например, содержит одну или более точечных мутаций, где функционально активный вариант имеет идентичность специфической последовательности в отношении родительской молекулы, например, по крайней мере 50% идентичность последовательности, предпочтительно по крайней мере 60%, более предпочтительно по крайней мере 70%, более предпочтительно по крайней мере 80%, еще более предпочтительно по крайней мере 90%; и/или

b) содержит пептид и дополнительно по крайней мере одну аминокислоту, гетерологичную пептиду.

Функционально активные варианты могут быть получены путем изменений последовательности в пептидной последовательности, например, путем одной или более точечных мутаций, где измененные последовательности по существу сохраняют функцию неизмененной пептидной последовательности, которая используется согласно изобретению. Такие изменения последовательности или точечные мутации могут включать, но не ограничиваются, (консервативными) заменами, аддикциями, делециями и инсерциями, например, альтерация 1, 2, 3 или 4 аминокислот, или путем аддикции или инсерции одной или нескольких аминокислот, например, 1, 2, 3 или 4 аминокислот, или путем химической дериватизации одной или нескольких аминокислот, например, 1, 2, 3 или 4 аминокислот, или их комбинацией методов, предпочтительно, чтобы точечные мутации не были смежными. Замены аминокислотных остатков могут быть консервативными заменами, например, замена одной гидрофобной аминокислоты на альтернативную гидрофобную кислоту.

Консервативными заменами также являются такие, которые происходят в пределах семейства аминокислот, что связано с их боковыми цепями и химическими свойствами. Примерами таких семейств являются аминокислоты с основными боковыми цепями, с неполярными алифатическими боковыми цепями, с неполярными ароматическими боковыми цепями, с незаряженными полярными боковыми цепями, с небольшими боковыми цепями, с большими боковыми цепями и т.д.

Предпочтительные точечные мутации относятся к обмену аминокислотами с одинаковой полярностью и/или зарядом. В этой связи, под аминокислотами понимаются двадцать природных аминокислот, кодируемых 64 триплетными кодонами. Эти 20 аминокислот модно разделить на те, которые обладают нейтральным зарядом, позитивным зарядом и отрицательным зарядом:

Далее приводятся "нейтральные" аминокислоты вместе с соответствующим трехбуквенным кодом и полярностью:

Алании: (Ala, А) неполярная, нейтральная;

Аспарагин: (Asn, N) полярная, нейтральная;

Цистеин: (Cys, С) неполярная, нейтральная;

Глутамин: (Gln, Q) полярная, нейтральная;

Глицин: (Gly, G) неполярная, нейтральная;

Изолейцин: (Ile, I) неполярная, нейтральная;

Лейцин: (Leu, L) неполярная, нейтральная;

Метионин: (Met, М) неполярная, нейтральная;

Фенилаланин: (Phe, F) неполярная, нейтральная;

Пролин: (Pro, Р) неполярная, нейтральная;

Серии: (Ser, S) полярная, нейтральная;

Треонин: (Thr, Т) полярная, нейтральная;

Триптофан: (Trp, W) неполярная, нейтральная;

Тирозин: (Tyr, Y) полярная, нейтральная;

Валин: (Val, V) неполярная, нейтральная; и

Гистидин: (His, Н) полярная, положительно заряженная (10%) нейтральная (90%).

"Положительно" заряженные аминокислоты - это:

Аргинин: (Arg, R) полярная, положительно заряженная; и

Лизин: (Lys, K) полярная, положительно заряженная.

"Отрицательно" заряженные аминокислоты - это:

Аспарагиновая кислота: (Asp, D) полярная, отрицательно заряженная;

и

Глутаминовая кислота: (Glu, Е) полярная, отрицательно заряженная.

"Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" в отношении пептидной последовательности, описанной здесь, определяется как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, являющихся идентичными аминокислотным остаткам в специфической пептидной последовательности, после выравнивания последовательности и в нее введения, при необходимости, пробелов, для достижения максимального процента идентичности последовательности, и без учета любых консервативных замен как части идентичности последовательности. Специалисты в данной области техники могут определять соответствующие параметры выравнивания, включая любые алгоритмы необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.

Функционально активные варианты могут быть получены при помощи любого известного способа мутагенеза, включая точечные мутации в нужных точках, например, получены при помощи методов рандомизации. В некоторых случаях точки выбираются случайным образом, например, либо по любым возможным аминокислотам или выбором предпочтительным аминокислот для рандомизации пептидных последовательностей. В этой связи термин "мутагенез" относится к любым известным в данной области методикам для изменения полинуклеотидной или полипептидной последовательности.

Под терминами "иммуноген" или "пептидный иммуноген", используемыми здесь, понимают антиген или иммуноген пептидной структуры, в частности, иммуноген, который содержит или состоит из пептида из специфической аминокислотной последовательности, который представлен либо в виде линейного, либо разветвленного пептида, содержащий природные аминокислотные остатки или их модификации, например, путем фосфорилирования, метилирования, ацетилирования, амидирования, образования пирролидона карбоновой кислоты, изомеризации, гидроксилирования, сульфатирования, связывания флавина, окисления цистеина и нитрозилирования.

Пептидный иммуноген конкретно разработан для того, чтобы запустить иммунный ответ у объекта и, в частности, включает одну или более антигенных детерминант, которые могут быть распознаны сайтом связывания антитела или способен связываться с пептидной бороздкой молекул HLA I или II класса или другими антиген-презентирующими молекулами, такими как CD1 и которые могут служить в качестве стимуляторов специфических Т-клеток. Целевой антиген - это тот, который или распознается целой молекулой-мишенью или фрагментом такой молекулы, главным образом, субструктурами, например, полипептидной или углеводной структурами мишеней, как правило, называемых эпитопы, например, В-клеточные эпитопы, Т-клеточные эпитопы, которые являются иммуногенными, то есть такими, которые также распознаются природными или моноклональными антителами. В данном документе предпочтительным является использование В-клеточных эпитопов.

Термин "эпитоп", используемый здесь по настоящему изобретению, в частности относится к молекулярной структуре, которая может полностью компенсировать специфического связывающего партнера или часть специфического связывающего партнера для сайта связывания антитела. С химической точки зрения, эпитоп пептидного иммуногена по настоящему изобретению может быть пептидным эпитопом, который, как правило, включает в себя по крайней мере 3 аминокислотных остатка, предпочтительно 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 аминокислот. Не существует верхнего критического предела для длины пептида, который мог бы содержать даже полную длину аминокислотной последовательности пептида.

По настоящему изобретению могут быть использованы один или более эпитопов одного и того же антигена иди различных антигенов.

Под пептидным иммуногеном по изобретению конкретно понимается аутоантиген. Под термином "аутоантиген", используемым здесь, понимается любой антиген, конкретно полипептид или пептид, вырабатываемый у нормального, здорового объекта, который не вызывает иммунный ответ как таковой. Такие аутоантигены могут вырабатываться в аберрантных или высоких уровнях при некоторых болезненных состояниях, включая раковое заболевание, в таком случае они называются опухоль-ассоциированные антигены (ОАА). В данном случае, под человеческим гастрином или человеческим G17 понимается аутоантиген, вырабатываемый у человеческих объектов, и конкретно как ОАА у объектов, страдающих гастрин-зависимой опухолью.

Подразумевается, что аутоантигены, которые используются по изобретению, могут быть природного происхождения или получены синтетическим путем. Также подразумевается, что аутоантигены не должны быть обязательно идентичными производимому в природе антигену, и скорее могут включать его варианты, имеющие некоторую идентичность, сходство или гомологичность в последовательности.

Пептидный иммуноген или иммуногенная композиция, используемые в вакцине согласно изобретению, как правило, содержатся в вакцине в эффективном количестве, которое здесь конкретно означает "иммунологически эффективное количество". Под "иммунологически эффективным количеством" подразумевается такое количество, которое при введении объекту, либо в однократной дозе, либо как часть серий доз, является эффективным для терапевтических или профилактических целей. Это количество будет варьироваться в зависимости от состояния здоровья и физического состояния объекта, подлежащего лечению, возраста, способности иммунной системы объекта синтезировать антитела, выраженности желаемого иммунного ответа, состава вакцины и других условий.

Согласно изобретению также предложен способ лечения объекта или повышения иммунного ответа у объекта, включающий стадию введения иммунологически эффективного количества пептидного иммуногена, иммуногенной композиции или вакцины по изобретению.

Эффективное количество или доза иммуногенной композиции, вводимой объекту, который в ней нуждается, например, взрослому человеческому объекту, может варьироваться от 0,0001 до 2 мг, например, между 0,001 и 2 мг. Эффективная доза иммуногенной композиции способна вызывать иммунный ответ у пациента в виде эффективных уровней титра антител для связывания и нейтрализации эндогенного зрелого G17 и его прекурсора, в течение, например, 1-3 месяцев после иммунизации. Эффективность терапии может быть оценена по титру антигастриновых антител в образцах крови, взятых у объекта.

Термин "лиганд TLR9", используемый здесь, понимается следующим образом.

Толл-подобный рецептор 9 (TLR9) распознает неметилированные бактериальные CpG ДНК и запускает сигнальный каскад, ведущий к производству провоспалительных цитокинов. Существуют многочисленные структуры или последовательности, которые способны выступать в качестве лиганда TLR9, то есть связываться с этим рецептором и тем самым либо активировать (стимулировать, позитивно регулировать, TLR9-агонист) или деактивировать (подавлять, TLR9-антагонист) TLR9. Например, стимулировать TLR9 могут микробиальная ДНК или синтетическая ДНК, например, ОНД CpG с изменениями в количестве и расположении CpG-димеров, также как и точные последовательности оснований, фланкирующих CpG-димеры. Синтетические ОДГ CpG отличаются от микробиальной ДНК тем, что они имеют частично или полностью тиофосфатный скелет вместо типичного фосфодиэфирного скелета и могут иметь или не иметь поли-G хвост на 3'-конце, 5-конце или на обоих.

Термин "агонист" в сочетании с лигандом TLR9, используемым здесь, конкретно относится к связыванию и активации TLR9 в тесте на основе клеток.

Лиганд TLR9, который состоит из нуклеотидной последовательности, как правило, соединен с компонентом представленной иммуногенной композиции - направляющим адъювантом - путем химического связывания, например, при помощи коммерчески доступного набора от Solulink. Пептидный лиганд TLR9 может быть присоединен с использованием стандартного химического синтеза или может быть интегрирован при помощи рекомбинантной ДНК-технологии.

Примерами лиганд TLR9 являются ОДН 2216²⁸ (группа 1), ОДН 2006/ОДН 2007²¹ (группа 2) и CpG-M362¹⁹ (группа 3).

Дополнительными примерами лиганд TLR9 могут быть пептиды, которые имитируют действие CpG-агонистов TLR9, например, идентифицированные или полученные из пептидной библиотеки, которые отобраны по их сродству связывания с TLR9 и обладают доказанной агонистической активностью, или белковые лиганды, включая специфические антитела.

Функция лиганда TLR9 или агониста может быть определена подходящим тестом, например, следующим путем: pDCs изолируют из крови здорового донора как описано у Tel и др.²⁹ и затем инкубирую в лигандом TLR9. Через 24 часа в супернатанте измеряют уровень IFNa при помощи стандартных ИФА-протоколов. Для определения стадии созревания клеток, pDCs окрашивают для оценки экспрессии CD80, CD83 или CD86 при помощи стандартных FACS-процедур с использованием коммерчески доступных специфических антител до и после инкубации с лигандом TLR9.

Количество реактивных Т-клеток, активирующихся после воздействия вакцины, может быть определено при помощи ряда методов, включая метод иммуноферментных пятен (ELISPOT), FACS-анализ, высвобождение цитокинов или способ Т-клеточной пролиферации.

Используемый в настоящем документе термин "специфичность" или "специфическое связывание" относится к реакции связывания, которая является определяющей для родственного лиганда, представляющего интерес среди гетерогенной популяции молекул. Таким образом, в определенных условиях (например, в условиях иммуноанализа), один или более антигенов специфически связываются с соответствующим сайтом (сайтами) связывания связывающего агента, который не связывается в значительном количестве с другими молекулами, присутствующими в образце. Специфическое связывание означает связывание, являющееся селективным по отношению к целевой идентичности, с выбранным высоким, средним или низким сродством или авидностью. Селективное связывание обычно достигается в том случае, если константа связывания или динамика связывания отличается по крайней мере в 10 раз, предпочтительно, если разница составляет по крайней мере 100 раз, и более предпочтительно по крайней мере 1000 раз. Вполне понятно, что термин также относится к перекрестно-реактивным или мультиспецифическим связывающим агентам, которые конкретно распознают один или более различных антигенов.

Термин "лечение", используемый здесь, всегда относится к объектам, подвергающимся воздействию с профилактическими (то есть, для предупреждения инфекции и/или патологического состояния) или терапевтическими (то есть, для лечения заболеваний независимо от их патогенеза) целями. Лечение объекта будет, как правило, терапевтическим в случаях раковых болезненных состояний, включая гастрин-зависимые опухоли или гастрин-зависимый рак. Однако, в случае пациентов, страдающих от примарного заболевания, где существует риск прогрессирования или риск развития вторичного патологического состояния или побочной реакции, например, если это зависит от эффектов эндогенно вырабатываемого гастрина, лечение может быть профилактическим.

Лечение может проводиться при помощи иммуногенной композиции или вакцины по изобретению, вводимых в качестве единственного профилактического или терапевтического агента или также в комбинации с любыми подходящими средствами, например, включая химиотерапию или использование антацидов.

При терапии рака, дополнительные терапевтические методы включают, например, хирургическую резекцию, радиотерапию, химиотерапию, гормональную терапию, противораковые вакцины, терапию на основе антител, облучение всего тела, пересадку костного мозга, пересадку периферических стволовых клеток и назначение химиотерапевтических агентов.

Термин "комбинация", используемый в этой связи, например, по отношению к комбинации компонентов или методов лечения, в частности, относится к сопутствующему, одновременному, параллельному или последовательному лечению объекта.

В случае лечения иммуногенной композицией или вакциной по изобретению, они могут быть введены единовременно или разделены на отдельные компоненты и/или на ряд меньших доз, вводимых через временные интервалы. Вакцина обычно вводится в концентрации от 0,1 до 500 мкг/мл, например, подкожно, внутрикожно, внутримышечно, внутривенно, перорально, ингаляционно или интраназально, с или без дополнительного адъюванта, например, квасцов. Очевидно, что точная дозировка и длительность лечения зависят от типа заболевания и могут быть определены эмпирически при помощи известных протоколов исследования или путем экстраполяции по данным, полученным in vivo или in vitro.

Иммуногенная композиция или вакцина по настоящему изобретению могут быть введены при помощи любых подходящих средств и в соответствующих лекарственных формах, включая, но не ограничиваясь, например, любым парентеральным (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное или внутрикожное) введением, или местным введением в пораженное место, например, в суставы или в/или около опухоли. В предпочтительном варианте осуществления, вакцина предложена в лекарственной форме для внутримышечного, подкожного или внутрикожного введения.

В изобретении также предложено устройство доставки, например, шприц, заранее заполненный вакциной по изобретению.

Обычно, после введения объекту первой "затравочной" инъекции вакцины, далее на протяжении какого-то периода времени могут быть выполнены одна или более усиливающих инъекций, тем же самым или отличным путем введения. В случае использования множественных инъекций, последующие инъекции могут выполняться, например, на в течение последующих 1-52 недель от первой инъекции, или дольше.

Обычно вакцина может содержать растворители, например, воду, изотонический раствор, глицерин, этанол и т.д. Дополнительно, среди наполнителей могут присутствовать такие вспомогательные вещества, как смачивающие иди эмульгирующие агенты, поддерживающие pH буферные вещества и т.п. Обычно, вакцину по изобретению получают в инъекционной форме, либо в виде растворов или суспензий, или в твердой форме, подходящей для растворения или суспендирования в жидком носителе перед введением. Препараты могут быть также быть представлены в виде эмульсий или инкапсулированы в липосомы.

Введение вакцины по изобретению может быть соответствующим образом или дополнительно скомбинировано с введением любых других агонистов TLR9 и/или других адъювантных средств, например, в виде отдельных компонентов в той же самой композиции или в виде отдельных композиций с целью усиления иммунного ответа

Усиленный Th1-иммунный ответ может включать повышение уровня одного или более цитокинов, ассоциированных с Th1-иммунным ответом (например, IFNγ), и повышение уровня активных макрофагов.

Усиленный Th1-иммунный ответ может включать повышение уровня одного или более антиген-специфичных антител класса IgG, в частности, антител IgG1.

Например, иммуногенная композиция или вакцина по изобретению могут быть ассоциированы (например, при помощи химической или рекомбинантной сшивки, связаны сродством связывания или представлять собой смесь отдельных компонентов) с одним или более адъювантами и/или фармацевтически приемлемыми наполнителями. Вакцина по изобретению может включать один или более фармацевтически приемлемых наполнителей или переносчиков, например, воду, изотонический раствор, глицерин, этанол и т.д. Дополнительно, в качестве таких переносчиков могут быть представлены такие вспомогательные вещества, как смачивающие иди эмульгирующие агенты, поддерживающие pH буферные вещества и т.п. Адъюванты могут, в частности, использоваться для усиления эффективности вакцины. Адъюванты могут быть непосредственно добавлены в композиции вакцин или введены отдельно, либо одновременно с введением вакцины или вскоре после этого.

Подходящие адъюванты включают цитокины и сходные компоненты которые помогают управлять иммунным ответом на иммуноген. Используемый в настоящем документы термин "цитокин" используется в качестве родового имени для различной группы растворимых белков и пептидов, которые действует как гуморальные регуляторы в нано- и пико-концентрациях и которые, как при нормальных, так и патологических состояниях регулируют функциональную активность отдельных клеток или тканей. Эти белки могут также опосредовать взаимодействия между клетками и регулировать процессы, происходящие во внеклеточной среде.

Примеры цитокинов включают IL-1, IL-4, TNFα, IFNα, INFγ, GM-CSF, G-CSF

Олигонуклеотиды CpG также могут быть использованы в качестве адъюванта в сочетании с представлением соответствующих эпитопов. Другие адъюванты включают квасцы, (не) полный адъювант Фрейнда, В. pertussis или его токсин, IC31 и т.д.

Компоненты иммуногенной композиции, то есть направляющий адъювантный компонент, например, анти-CD32 группа, сшитая с лигандом TLR9 и первой пептидной альфа-спиралью, и иммуногенный компонент, например, содержащий пептидный иммуноген, сшитый со второй альфа-спиралью, которая совпадает с первой, так же как и сама иммуногенная композиция или вакцина, или любая из связывающих группировок или лигандов или иммуноген, как с остатками спирали так и без них, могут быть получены различными способами, известными в данной области, например, путем очистки или изоляции из клеточной культуры, рекомбинантной технологией или химическим синтезом.

В конкретном варианте осуществления иммуногенную композицию и/или направляющий адъювантный компонент и/или ее иммуногенный компонент, получают в виде рекомбинантного пептида например, при помощи технологии рекомбинантной ДНК. Используемый в настоящем документе, термин "рекомбинантный" относится к молекуле или конструкту, который не присутствует в естественном состоянии в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления, молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержат две или более встречающиеся в природе последовательности, которые соединены вместе способом, не встречающимся в природе. Под рекомбинантным белком понимают белок, кодируемый и/или экспрессируемый рекомбинантной нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления, "рекомбинантные клетки" экспрессируют гены, которые не обнаруживаются в нативной форме клетки (то есть, нерекомбинантной), и/или экспрессируют родные гены, которые в данном случае экспрессируются выше нормального уровня и/или не экспрессируются вообще благодаря умышленному вмешательству человека. Рекомбинантные клетки содержат по крайней мере один полинуклеотид или полипептид. "Рекомбинация", "рекомбинирование" и полученная "рекомбинантная" нуклеиновая кислота, как правило, охватывает сборку из по крайней мере двух фрагментов нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантные белки и рекомбинантные нуклеиновые кислоты остаются функциональными, то есть сохраняют свою активность или проявляют повышенную активность в клетке-хозяине.

Поэтому, согласно изобретению также предложено получение иммуногенной композиции или ее компонентов, и к рекомбинантным средствам такого получения, включая нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, экспрессионную кассету, вектор или плазмиду, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, которая должна бытьэкспрессирована, и клетку-хозяина, содержащую любые такие средства. Подходящие стандартные технологии получения рекомбинантной ДНК, известные в данной области и описанные в том числе у Sambrook и др. "Молекулярное клонирование: лабораторный справочник" (1989), 2 издание (Изд-во: Cold Spring Harbor Laboratory).

Используемый в данном документе термин "объект" означает человеческие или млекопитающие объекты, включая сельскохозяйственных животных, животных-компаньонов и лабораторных животных, в частности, человеческих субъектов, которые являются либо пациентами, страдающими конкретными патологическими состояниями, или здоровыми объектами.

Согласно изобретению далее предложен набор компонентов для приготовления иммуногенной композиции по изобретению, например, фармацевтический набор, включающий один или более контейнеров, заполненных компонентами. Набор может быть использован в описанных выше методах. В конкретном варианте осуществления, набор далее включает инструкции по использованию компонентов иммуногенной композиции или подготовленной иммуногенной композиции или вакцины по изобретению.

Согласно конкретному примеру, вакцина по изобретению содержит рекомбинантный полипептид

SEQ ID NO: 40:

Одинарным подчеркиванием выделен N-конец: последовательность ScFV, конкретно связывающаяся с CD32a;

Курсивом выделен линкер (может быть использован любой альтернативный линкер, обычно используемый в препаратах scFv); Жирный шрифтом выделена StrepTag И-метка для очистки (может быть использована любая другая метка, например, flag-метка или HIS-метка или без метки, в таком случае для очистки можно воспользоваться гептадным повтором альфа-спирали)

Двойным подчеркиванием С-конец: гептадный повтор альфа-спирали (рерЕ) для формирования суперспирали со встречным гептадным повтором альфа-спирали в иммуногене (pepK).

В этом примере (SEQ ID NO: 40) использовано 5 повторов; большее число повторов может быть причиной аутоагрегации, меньшее - вести к уменьшению сродства, в данном случае будет использовано 4 повтора. Предпочтительное минимальное функциональное количество повторов для спирали равно 3 и предпочтительное максимальное функциональное количество повторов равно 5^22-24, однако, в зависимости от типа альфа-спирали используется и большее число повторов. Ограничением будет количество повторов, которые начинают вызывать гомодимеризацию. Таким образом, гомодимеризация конкретно исключается.

Сходные полипептиды могут содержать лидерную последовательность, аминокислотную последовательность анти-CD32 группы, которая является, например, рекомбинантной scFv, линкер, метку для целей очистки последовательность пептидной альфа-цепи рерЕ. Такой конструкте лигандом TLR9 или без такового также называется "боеголовкой", которая может быть далее использована для создания вакцины путем комбинации с иммуногеном, связанным со встречной альфа-спиралью pepK.

Согласно другому конкретному примеру, анти-CD32 группа является анти-CD32a пептидом с последовательностью SEQ ID NO: 41: , используемая в качестве альтернативы ScFv.

Согласно дополнительному примеру, стабильная суперспираль образуется между "боеголовкой" scFv и иммуногеном.

Оказалось, что такие иммуноген или вакцина могут эффективно стимулировать мононуклеарные клетки периферической крови.

В другом примере можно увидеть, что "боеголовка" опосредовала усиленную антигенную презентацию. Т-клетки эффективно стимулировались при введении иммуногена со спиралью (спираль pepK), взаимодействующего с "боеголовкой", содержащей встречную спираль (спираль рерЕ).

В других примерах описано лечение рака поджелудочной железы в экспериментах на мышах и резус-макаках при помощи "боеголовки", использующей либо анти-CD32 scFv, либо анти-CD32a пептид, связанный со спиралью пептидного иммуногена G12. Уменьшение аппетита и контроль над аппетитом продемонстрированы в эксперименте на макаках-резусах.

Таким образом, в настоящем изобретении предложены уникальная иммуногенная композиция и вакцина, и соответствующие применения.

Приведенное выше описание будет более понятными из следующих примеров. Однако, указанные примеры являются всего лишь показательными способами воплощения на практике одного или более вариантов осуществления настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем данного изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Примеры связывающих агентов

CD32-связывающая область, также называемая здесь как анти-CD32 группа или CD32-связывающий агент:

CD32a связывающие агенты: Антитело, специфически связывающееся с CD32a: мАТ IV.3³¹

ScFV, полученное из мАТ АТ-3 (VH-linker-VL): (SEQ ID NO: 42)

Подчеркнуто: домен VH

Жирный шрифт: домен HL

Нормальным шрифтом: гибкий линкер (может быть любым линкером)

пептид анти-CD32a³⁰:

(SEQ ID NO: 43):

Группа CD32a+b связывающие агенты:

Антитело, конкретно связывающееся в CD32a и CD32b: мАТ АТ-10 (AbD Серотек)

ScFV, полученное из мАТ АТ-10 (VH-линкер-VL): (SEQ ID NO: 44)

Подчеркнуто: домен VH

Жирный шрифт: домен HL

Нормальным шрифтом: гибкий линкер (может быть любым линкером)

IgG1 Fc фрагмент (домен СН2-СН3): (SEQ ID NO: 45)

В скобках может быть опущена шарнирная область

Подчеркнуто: домен СН2

Жирный шрифт: домен СН3

TLR9-связывающая область или группа, здесь также называемый связывающий агент TLR9 или TLR9 лиганд

CpG класс А

Группа CpG-A:

ODN2216: (SEQ ID NO: 46):

CpG класс В

Группа CpG-B:

Природные лиганды:

ODN2006: (SEQ ID NO: 47):

CpG класс С

Группа CpG-C

ODNM362: (SEQ ID NO: 48):

примеры CD32 связывающих продуктов со спиралями

ScFV-спираль 1 (IV.3): (SEQ ID NO: 49)

Подчеркнуто: домен VH

Жирный шрифт: домен HL

Нормальный шрифт: Гибкий линкер (может быть любым линкером)

Курсив: спираль рерЕ плюс С StrepTag II последовательность и линкер "GP" может быть любым гибким линкером (метка StrepTag II может быть удалена или заменена HIS-меткой или любой другой меткой)

ScFV-спираль 2 (АТ10): (SEQ ID NO: 50)

Подчеркнуто: домен VH

Жирный шрифт: домен HL

Нормальным шрифтом: гибкий линкер (может быть любым линкером) Курсив: спираль рерЕ плюс С StrepTag II последовательность и линкер "GP" может быть любым гибким линкером (метка StrepTag II может быть удалена или заменена HIS - меткой или любой другой меткой).

Пептид-спираль: (SEQ ID NO: 51)

Курсивом обозначена спираль рерЕ плюс линкер "GP", который может быть любым гибким линкером.

IgG1 Fc фрагмент-спираль: (SEQ ID NO: 52)

В скобках - может быть опущена шарнирная область.

Подчеркнуто: домен СН2.

Жирным шрифтом показан домен СН3.

Курсивом показана спираль рерЕ плюс линкер "GP", который может быть любым гибким линкером.

Примеры TLR9 связывающих продуктов с SH-группой для перекрестного химического сшивания с CD32 связывающим агентом.

Группа CpG-A:

ODN2216_SH: (SEQ ID NO: 46):

Жирным шрифтом обозначен гибкий линкер с SH-группой для перекрестного химического сшивания со ScFV-спиралью (может быть любой линкер и химически активная группа, например, NH2, подходящая для химического перекрестного сшивания).

Группа CpG-B:

Природные лиганды:

ODN2006_SH: (SEQ ID NO: 47):

Жирным шрифтом обозначен гибкий линкер с SH-группой для перекрестного химического сшивания со ScFV-спиралью (может быть любой линкер и химически активная группа, например, NH2, подходящая для химического перекрестного сшивания).

Группа CpG-C

ODNM362_SH: (SEQ ID NO: 48):

Жирным шрифтом обозначен гибкий линкер с SH-группой для перекрестного химического сшивания со ScFV-спиралью (может быть любой линкер и химически активная группа, например, NH2, подходящая для химического перекрестного сшивания).

Примеры "боеголовки", то есть структуры, содержащей CD32-связываюший агент и TLR9-связывающий агент

"Боеголовками" может быть любой представитель из группы CD32-связывающих агентов, химически связанный любым способом с любым представителем из группы TLR9-связывающих агентов, при этом предпочтительно TLR9-связывающие агенты соединяются, например, с доступными лизинами (K) в CD32-связывающих агентах. Кроме того, смеси различных TLR9 -связывающих агентов могут быть соединены, например, с CpG-B природными или пептидными связывающими агентами. ScFV-coil1 (IV.3) (SEQ ID NO: 49)

Предпочтительными в структуре спирали являются лизины (обозначены курсивом).

Или

Пептид-спираль: (SEQ ID NO: 51)

Предпочтительными в структуре спирали являются лизины (обозначены курсивом).

Пример 2: Использование технологической платформы в онкологии.

"Боеголовка" основана на ScFV-coil1 (IV.3) + ODNM362, и иммуноген G17 - от макак-резусов и макак-крабоедов (G17RM). В дальнейшем рЕ следует понимать как pyroGlu.

Последовательность малого иммуногена гастрина человека (G17H, первые 13 АА, SEQ ID NO: 9):

Последовательность малого иммуногена гастрина, полученная от макак-резусов и макак-крабоедов

(G17RM, первые 13 АА, SEQ ID NO: 53:

Последовательность малого иммуногена гастрина человека (G17M, первые 13 АА, SEQ ID NO: 54):

различия с G17RM выделены жирным шрифтом.

Конечный продукт - иммуноген G17RM 1-спираль и G17H 1-спираль:

G17RM_1 - спираль, SEQ ID NO: 55:

G17H_1 - спираль, SEQ ID NO: 56

Жирным шрифтом: линкер (может быть любой линкер)

Курсивом: спираль pepK для взаимодействия с "боеголовкой"

Готовый к применению (конечный продукт) TYG100_1RM и TYG100 1Н

"Боеголовка" как описано выше (на основе ScFV-coil1 IV.3) смешана с G17RM_1-спиралью или G17H_1-спиралью в соотношении, которое указывает на 100% "боеголовку", связанную в единое целое с G17RM_1-спиралью или G17H_1-спиралью, без присутствия свободного иммуногена G17 (молярное соотношение ~1: 1) и в составе с квасцами. Таким образом, получаются TYG100JRM и TYG100JH.

Пример 3 TYG100 1RM для лечения гастрин-зависимого рака, например, рака поджелудочной железы:

Мыши 6 Balb/c были троекратно иммунизированы - в день 0, через 14 дней и 35 дней - TYG100_1RM или G17_1RM (без "боеголовки"), содержащей G17, полученный от резус-макак (58,4 мкг/инъекция в 0,5 мл). Через две недели после последней иммунизации, отбирали сыворотку и анализировали на присутствие антител класса IgG против G17RM, G17H и G17M (=G17 мышиного происхождения).

Таблица 1 демонстрирует, что все мыши ответили продукцией IgG против 2 компонентов вакцины ("боеголовка" и G17RM). Важно отметить, что у всех мышей полученный IgG является перекрестно-реагирующим с человеческим G17 и в меньшей степени с мышиным G17 (G17M). Последнее примечательно тем, что первые 13 аминокислотмышиного G17 ( SEQ ID NO: 9) отличаются по 3 АА от G17RM (различия продемонстрированы жирным шрифтом и подчеркиванием) и G17M является аутоантигеном для мышей. Антитела распознаются G17M и поэтому являются аутоантителами, указывая на то, что TYG100_1RM удалось сломать естественную толерантность против аутоантигена G17M. Отсутствовал ответ против G17 в том случае, когда G17-пептид использовали для иммунизации без "боеголовки".

Способность вакцины индуцировать аутоиммунный ответ является необходимым условием для противораковой вакцины, поскольку все опухоль-ассоциированные антигены (ОАА) являются ауто-антигенами, которые экспрессируются в избыточном количестве, например, экспрессируются в избыточном количестве в опухолевых клетках. Поэтому, вакцина, составленная из "боеголовки" TYG100_1RM в сочетании с человеческим G17 в качестве иммуногена, может быть использована в качестве вакцины для лечения гастрин-зависимых опухолей, например, рака поджелудочной железы.

Пример 4: Примеры продуктов, включающих димер пептидного иммуногена

Конечный продукт - иммуноген G17RM_2-спираль и G17H_2-спираль:

Димер G17RM (1st 13 АА малого гастрина) был синтезирован при помощи специального гибкого линкера, соединяющего 2 пептида в одну спираль pepK

G17RM 2-спираль: (SEQ ID 57: Часть иммуногенной композиции по изобретению, включающей два полученных от макак-резус пептида гастрина SEQ ID NO: 53, разветвленную линкерную последовательность и пептидную альфа-цепь (TYG100_2RM). Эта часть может быть связана с соответствующим направляющим адъювантом при помощи суперспиральной сшивки)

Жирным шрифтом обозначен специальный гибкий линкер (может быть любой линкер, который связывает три пептида).

Курсивом обозначена спираль pepK для взаимодействия с боеголовкой G17H 2-спираль: (SEQ ID NO: 11: Часть иммуногенной композиции по изобретению, содержащая два человеческих пептида гастрина SEQ ID NO: 9, разветвленную линкерную последовательность и пептидную альфа-цепь (TYG100_2H). Эта часть может быть связана с соответствующим направляющим адъювантом при помощи суперспиральной сшивки).

Жирным шрифтом обозначен специальный гибкий линкер (может быть любой линкер, который связывает три пептида).

Курсивом обозначена спираль pepK для взаимодействия с "боеголовкой".

Финальный продукт TYG100 2RM и TYG100 2Н

"Боеголовка" как описано выше (на основе ScFV-coil1 IV.3) смешана с 7RM_2-спиралью или G17H_2-спиралью в соотношении, которое указывает на 100% "боеголовку", связанную в единое целое с G17 ВМ_2-спиралью или G17H_2-спиралью, без присутствия свободного иммуногена G17 (молярное соотношение ~1: 1) и в составе с квасцами. Таким образом, получаются TYG100_2RM и TYG100_2H.

Пример 5: TYG100 2RM для лечения гастрин-зависимого рака, например, рака поджелудочной железы:

Мыши 6 Balb/c были троекратно иммунизированы - в день 0, через 14 дней и 35 дней - TYG100_2RM, содержащим первые 13 аминокислот G17 от макаки-резуса (66,8 мкг/укол в 0,5 мл). Через две недели после последней иммунизации, отбирали сыворотку и анализировали на присутствие антител класса IgG против G17RM, G17H и G17M (=G17 мышиного происхождения).

Таблица 2 демонстрирует, что все мыши ответили продукцией IgG против 2 компонентов вакцины ("боеголовка" и G17RM). Важно отметить, что у всех мышей полученный IgG является перекрестно-реагирующим с человеческим G17 и в меньшей степени с мышиным G17 (G17M). Последнее примечательно тем, что первые 13 аминокислот мышиного G17 (, SEQ ID NO: 9) отличаются по 3 АА от G17RM (различия продемонстрированы жирным шрифтом и подчеркиванием) и G17M является аутоантигеном для мышей. Антитела распознаются G17M и поэтому являются аутоантителами, указывая на то, что TYG100_2RM удалось сломать естественную толерантность против аутоантигена G17M. Отсутствовал ответ против G17 в том случае, когда G17-пептид использовали для иммунизации без "боеголовки".

Способность вакцины индуцировать аутоиммунный ответ является необходимым условием для противораковой вакцины, поскольку все опухоль-ассоциированные антигены (ОАА) являются аутоантигенами, которые экспрессируются в избыточном количестве в опухолевых клетках. Поэтому, вакцина, составленная из "боеголовки" TYG100_2RM в сочетании с человеческим G17 в качестве иммуногена, может быть использована в качестве вакцины для лечения гастрин-зависимых опухолей, например, рака поджелудочной железы. Ответы против всех 3 типов G17, индуцированные при помощи TYG100_2RM, были более выраженными в случае использования для индукции TYG100_1RM (таблица 1), указывая на то, что димер является более предпочтительным в составе вакцины.

Пример 6 TYG100 2RM для лечения гастрин-зависимого рака, например, рака поджелудочной железы:

6 макак-крабоедов были иммунизированы при помощи TYG100_2RM и 6 были иммунизированы при помощи C17RM_2-спираль на день 0 (d0), через 14 дней (d14) и через 28 дней (d28). Сыворотку на d0, d14, d28, 42 и d56 анализировали на присутствие антител IgG против аутогенного малого гастрина (G17RM), малого гастрина человеческого происхождения (G17H), нерелевантного контрольного пептида, сходного MW в качестве гастрина (контрольный пептид) или против боеголовки (ScFV-спираль1) при помощи многоканальной системы ИФА Meso Scale Discovery (MSD) в соответствии с руководством по MSD.

На фигуре 1 можно увидеть, что у всех 6 животных наблюдается выраженный время-зависимый IgG-ответ против "боеголовки" (ScFV-coil1), также как и против G17RM и G17H, и отсутствие отчета против контрольного пептида. Ответ против G17RM после трехкратной иммунизации составлял 75% от ответа против ScFV-coil1. Это примечательно, поскольку G17RM является 100% аутогенным протеином с молекулярной массой лишь ~ 1,2 кДа, в то время как ScFV-coil1 является 100% аутогенным протеином с молекулярной массой >30 кДа. Анти-G17RM антитела являются перекрестно реагирующими только с G17H. Отсутствовал ответ против G17RM в том случае, когда пептид G17RM_2-спираль использовали для иммунизации без "боеголовки". Снижение титра IgG между d42 и d56 было более сильно в случае G17RM, чем для ScFV, указывая на то, что часть IgG-антител была нейтрализована эндогенным G17. Важно отметить, что присутствие эндогенного G17 не усиливает ответ на G17RM.

Данные на фигуре 1 демонстрируют, что вакцина способна индуцировать достоверную продукцию аутоантител, причем данный ответ является обратимым. Это является необходимым условием для противораковой вакцины, поскольку все опухоль-ассоциированные антигены (ОАА) являются ауто-антигенами, которые экспрессируются в избыточном количестве, например, экспрессируются в избыточном количестве в опухолевых клетках, но также присутствуют в нормальных здоровых клетках. Поэтому, вакцины, такие как TYG100_2RM или TYG100_2H могут быть использованы для лечения гастрин-зависимых опухолей, например, рака поджелудочной железы. После того, как рак полностью вылечен, лечение может быть приостановлено и анти-G17 антитела будут удалены из циркуляции. Для поддержания устойчивого состояния (во время лечения) аутоиммунный ответ должен быть усилен при помощи повторных инъекций вакцины. Данный тип вакцины не вызывает необратимого аутоиммунного заболевания.

Пример 7: TYG100 2RM для лечения ожирения:

У животных по примеру 3 контролировали аппетит и массу тела, которые измеряли на *d0, d14, d28, d42 и d56. После двух инъекций TYG100_2RM, у 4 из 6 животных отмечено снижение интереса к их ежедневной закуске (печенье), в то время как основной прием пищи оставался нормальным. Это сопровождалось значительным уменьшением массы тела (фигура 2), но без нежелательных побочных эффектов. До настоящего времени отсутствовали такого рода наблюдения, касающиеся других вакцин, которые были бы основаны на взаимодействиях между боеголовкой и суперспиралью, как например, целевые иммуногены, за исключением иммуногенов гастрина (данные не представлены)

Эти данные свидетельствуют о том, что TYG100_2RM уменьшают тягу к перекусам (между приемами пищи), без влияния на основное потребление пищи, необходимого для здорового образа жизни. Животные были нормально активны и веселы. Таким образом, TYG100_2RM может быть использован для лечения ожирения.

1. Иммуногенная композиция для лечения заболеваний, связанных с патологией секреции гастрина, включающая

а) первый компонент, который содержит адъювант, содержащий группу анти-CD32, связанную с лигандом TLR9, и первую пептидную альфа-спираль, причем

(i) указанная группа анти-CD32 является белком, полипептидом или пептидом, специфически связывающимся с CD32; и

(ii) указанный лиганд TLR9 является агонистом TLR9, выбранным из группы, включающей CpG олигодеоксинуклеотиды класса А, В и С; и

б) второй компонент, который содержит по меньшей мере один пептидный иммуноген, который связан со второй пептидной альфа-спиралью, при этом пептидный иммуноген выбран из группы, включающей

(i) человеческий гастрин-17, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 1, фрагмент SEQ ID NO: 1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и по крайней мере 4 N-терминальные аминокислоты из SEQ ID NO: 2,

(ii) пептид гастрин-17, происходящий от макаки-резуса или мышиного происхождения, и/или

(iii) функционально активный вариант любого элемента из (i) или (ii) с одной, двумя, тремя или четырьмя точечными мутациями в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2,

причем указанная первая пептидная альфа-спираль первой части скручена со второй пептидной альфа-спиралью второй части, образуя тем самым скрученную спиральную структуру.

2. Композиция по п. 1, в которой упомянутый пептидный иммуноген является линейным пептидом, содержащим или состоящим из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, предпочтительно SEQ ID NO: 4, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, предпочтительно SEQ ID NO: 6, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, предпочтительно SEQ ID NO: 8, и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или NO: 9.

3. Композиция по п. 1 или 2, которая содержит по крайней мере два пептидных иммуногена, связанных со второй пептидной альфа-спиралью.

4. Композиция по п. 3, которая содержит 2, 3 или 4 пептидных иммуногена.

5. Композиция по п. 1, в которой каждая из упомянутых первой и второй альфа-спиралей содержит по 3-5 аминокислотных повторов аминокислотного мотива, специфически связывающихся друг с другом с константой диссоциации Kd менее чем 10^-6 М.

6. Композиция по п. 1, в которой упомянутая анти-CD32 группа выбрана из группы, включающей анти-CD32 антитело, фрагмент антитела и пептид анти-CD32a.

7. Композиция по п. 1, которая содержит по меньшей мере одну линкерную последовательность, предпочтительно состоящую из остатков глицина, и/или серина, и/или лизина, предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или NO: 13, которая связывает указанный пептидный иммуноген с указанной второй пептидной альфа-спиралью.

8. Композиция по п. 1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11.

9. Вакцина для лечения заболеваний, связанных с патологией секреции гастрина, включающая эффективное количество иммуногенной композиции по любому из пп. 1-8 и фармацевтически приемлемый носитель.

10. Набор для приготовления иммуногенной композиции для лечения заболеваний, связанных с патологией секреции гастрина, по любому из пп. 1-8, включающий

а) первый компонент, который содержит адъювант, содержащий группу анти-CD32, связанную с лигандом TLR9, и первую пептидную альфа-спираль, причем

(i) указанная группа анти-CD32 является белком, полипептидом или пептидом, специфически связывающимся с CD32; и

(ii) указанный лиганд TLR9 является агонистом TLR9, выбранным из группы, включающей CpG олигодеоксинуклеотиды класса А, В и С; и

б) второй компонент, который содержит по меньшей мере один пептидный иммуноген, который связан со второй пептидной альфа-спиралью, при этом пептидный иммуноген выбран из группы, включающей

(i) человеческий гастрин-17, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 1, фрагмент SEQ ID NO: 1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и по крайней мере 4 N-терминальные аминокислоты из SEQ ID NO: 2,

(ii) пептид гастрин-17, происходящий от макаки-резуса или мышиного происхождения, и/или

(iii) функционально активный вариант любого элемента из (i) или (ii) с одной, двумя, тремя или четырьмя точечными мутациями в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2,

причем указанная первая пептидная альфа-спираль первой части скручена со второй пептидной альфа-спиралью второй части, образуя тем самым скрученную спиральную структуру.

11. Применение иммуногенной композиции по любому из пп. 1-8 для медицинского лечения больных, страдающих заболеваниями, связанными с патологией секреции гастрина, такими как опухоли, в том числе злокачественные, включая рак поджелудочной железы, язва желудка, гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ), терминальная стадия почечной недостаточности (ТСПН) или ожирение.

12. Применение по п. 11, в котором композицию вводят больному в эффективном количестве в режиме "прайм-буст".

13. Применение по п. 11, в котором композицию вводят больному в эффективном количестве в диапазоне от 0,0001 до 2 мг на одно введение.

14. Применение по п. 11, в котором больного дополнительно лечат химиотерапией.

15. Применение по любому из пп. 11-14, в котором композиция вызывает защитный иммунный ответ у больного предпочтительно в форме сывороточного титра IgG против человеческого гастрина-17, равного по крайней мере 1/1000.