Композиции и способы

Изобретение относится к соединениям для лечения метаболических заболеваний и может быть использовано в медицине. Предложено соединение, содержащее одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид и конъюгирующую группу, или его фармацевтически приемлемая соль, при этом конъюгирующая группа содержит

,

где расщепляемый фрагмент (СМ) представляет собой связь или группу, которая может быть расщеплена при физиологических условиях; модифицированный олигонуклеотид имеет формулу: Ges Ges Tes Tds mCds mCds mCds Gds Ads Gds Gds Tds Gds mCes mCes mCes Ae, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин, G = гуанин, T = тимин, e = 2'-O-метоксиэтиловый модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и s = тиофосфатная межнуклеозидная связь; и конъюгирующая группа связана с модифицированным олигонуклеотидом на 5'-конце модифицированного олигонуклеотида. Предложены новые соединения и композиции на их основе для лечения метаболических заболеваний. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 113 пр., 108 табл., перечень последовательностей.

 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Принцип, лежащий в основе антисмысловой технологии, заключается в том, что антисмысловое соединение гибридизуется с целевой нуклеиновой кислотой и модулирует количество, активность и/или функцию целевой нуклеиновой кислоты. Например, в некоторых случаях антисмысловые соединения приводят к изменению транскрипции или трансляции мишени. Такое модулирование экспрессии может быть достигнуто, например, разрушением целевой мРНК или замещающим ингибированием. Пример модулирования целевой функции РНК путем разрушения представляет собой разрушение за счет РНКазы Н целевой РНК при гибридизации с ДНК-подобным антисмысловым соединением. Другой пример модулирования генной экспрессии путем направленного разрушения представляет собой РНК-интерференция (РНКи). РНКи относится к антисмысловому - сайленсингу гена по механизму, в котором применяется РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга (RISC). Дополнительный пример модулирования целевой функции РНК представляет собой замещающий механизм, такой как использует в естественных условиях микроРНК. МикроРНК представляют собой небольшие некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию РНК, кодирующих белки. Связывание антисмыслового соединение с микроРНК препятствует связыванию микроРНК с ее матричными РНК мишенями, и, следовательно, затрудняет функцию микроРНК. МикроРНК-миметики могут усиливать естественную функцию микроРНК. Некоторые антисмысловые соединения изменяют сплайсинг пре-мРНК. Независимо от конкретного механизма, специфичность в отношении последовательностей делает антисмысловые соединения перспективными в качестве средств для подтверждения наличия цели и функционализации генов, а также в качестве терапевтических средств для селективного модулирования экспрессии генов, участвующих в патогенезе заболеваний.

Антисмысловая технология представляет собой эффективный способ модулирования экспрессии одного или более специфических генных продуктов и, следовательно, может быть признана исключительно подходящей в ряде терапевтических, диагностических и исследовательских применений. Химически модифицированные нуклеозиды могут быть, внедрены в антисмысловые соединения для усиления одного или более свойств, таких как устойчивость к нуклеазе, фармакокинетика или аффинность к целевой нуклеиновой кислоте В 1998 году антисмысловое соединение Vitravene® (фомивирсен; разработанный компанией

Isis Pharmaceuticals Inc., Карлсбад, штат Калифорния) стал первым антисмысловым лекарством, получившим разрешение на продажу от Администрации США по пищевым продуктам и лекарственным веществам (FDA), и в настоящее время представляет собой средство для лечения вызванного цитомегаловирусом (CMV) ретинита у пациентов со СПИДом.

Новые химические модификации обладают улучшенной активностью и эффективностью антисмысловых соединений, раскрывая потенциал для пероральной доставки, а также для усовершенствования подкожного введения, снижения возможных побочных эффектов, и приводят к улучшению удобства для пациента. Химические модификации, усиливающие активность антисмысловых соединений, позволяют осуществлять введение более низких доз, что снижает возможность токсичности, а также уменьшает общую стоимость лечения. Модификации, увеличивающие устойчивость к разрушению, приводят к более медленному выведению из организма, обеспечивая возможность менее частого введения доз. Различные типы химических модификаций могут быть комбинированы в одном соединении для дальнейшей оптимизации эффективности соединения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены конъюгированные антисмысловые соединения. В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены конъюгированные антисмысловые соединения, содержащие антисмысловый олигонуклеотид, комплементарный транскрипту нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены способы, включающие контакт клетки с конъюгированным антисмысловым соединением, содержащим антисмысловый олигонуклеотид, комплементарный транскрипту нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены способы, включающие контакт клетки с конъюгированным антисмысловым соединением, содержащим антисмысловый олигонуклеотид, и уменьшение количества или активности транскрипта нуклеиновой кислоты в клетке.

Ранее был описан асиалогликопротеиновый рецептор (ASGP-R). См., например, Park et al., PNAS, том 102, №47, сс. 17125-17129 (2005). Такие рецепторы экспрессируются на клетках печени, в частности, гепатоцитах. Кроме того, было показано, что соединения,

содержащие кластеры трех N-ацетилгалактозаминовых (GalNAc) лигандов, способны связываться с ASGP-R, приводя к захвату указанного соединения клетой. См., например, Khorev et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 16, 9, сс. 5216-5231 (май, 2008). Соответственно, конъюгаты, содержащие такие кластеры GalNAc, применяли для облегчения захвата некоторых соединений клетками печени, в частности, гепатоцитами. Например, было показано, что некоторые GalNAc-содержащие конъюгаты увеличивают активность дуплексных миРНК соединений в клетках печени in vivo. В таких случаях GalNAc-содержащий конъюгат, как правило, прикрепляется к смысловой цепи дуплекса миРНК. Поскольку смысловая цепь отбрасывается перед окончательной гибридизацией антисмысловой цепи с целевой нуклеиновой кислотой, то маловероятно, что такой конъюгат будет влиять на активность. Как правило, конъюгат присоединяется к 3'-концу смысловой цепи миРНК. См., например, патент США 8106022. Некоторые конъгирующие группы, описанные в настоящем документе, более активны и/или синтезируются легче, чем конъгирующие группы, описанные ранее.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения конъюгаты присоединяются к одноцепочечным антисмысловым соединениям, включая, но не ограничиваясь ими, антисмысловые соединения на основе РНКазы Н или антисмысловые соединения, которые изменяют сплайсинг целевой нуклеиновой кислоты пре-мРНК. В таких вариантах реализации конъюгат должен оставаться присоединенным к антисмысловому соединению достаточно долго для обеспечения преимущества (улучшенного захвата в клетки), но затем он должен либо расщепляться, либо иным образом не препятствовать последующим стадиям, необходимым для активности, таким как гибридизация с целевой нуклеиновой кислотой и взаимодействие с РНКазой Н или ферментами, связанными со сплайсингом или модулированием сплайсинга. Такой баланс свойств более важен при подготовке одноцепочечных антисмысловых соединений, чем соединений миРНК, где конъюгат может быть просто присоединен к смысловой спирали. В настоящем документе описаны одноцепочечные антисмысловые соединения, обладающие улучшенной активностью в клетках печени in vivo, по сравнению с таким же антисмысловым соединением, не имеющим конъюгата. Учитывая необходимый баланс свойств для этих соединений, такая улучшенная активность является неожиданной.

В некоторых вариантах реализации конъгирующие группы по настоящему документу содержат расщепляемый фрагмент. Как было отмечено, не ограничиваясь каким-либо механизмом, логично, что конъюгат должен сохраняться у соединения достаточно долго для

обеспечения усиления захвата, но после этого желательно, чтобы некоторая его часть или, в идеале, весь конъюгат расщеплялся, выделяя исходное соединение (например, антисмысловое соединение) в его наиболее активной форме. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент представляет собой расщепляемый нуклеозид. Такие варианты реализации используют эндогенные нуклеаыз в клетке путем присоединения остальной части конъюгата (кластера) к антисмысловому олигонуклеотиду через нуклеозид при помощи одной или более расщепляемых связей, таких как фосфодиэфирные связи. В некоторых вариантах реализации кластер связан с расщепляемым нуклеозидом через фосфодиэфирную связь. В некоторых вариантах реализации расщепляемый нуклеозид присоединен к антисмысловому олигонуклеотиду (антисмысловому соединению) фосфодиэфирной связью. В некоторых вариантах реализации конъгирующая группа может содержать два или три расщепляемых нуклеозида. В таких вариантах реализации указанные расщепляемые нуклеозиды связаны друг с другом, с антисмысловым соединением и/или с кластером посредством расщепляемых связей (таких как фосфодиэфирная связь). Некоторые конъюгаты по настоящему документу не содержат расщепляемый нуклеозид, а вместо этого содержат расщепляемую связь. Показано, что достаточное расщепление конъюгата из олигонуклеотида обеспечивается по меньшей мере за счет одной связи, которая легко поддается расщеплению в клетке (расщепляемая связь).

В некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения представляют собой пролекарства. Такие пролекарства вводят животному, и они в конечном итоге метаболизируются до более активной формы. Например, конъюгированные антисмысловые соединения расщепляются с удалением всего или части конъюгата, приводя к активной (или более активной) форме антисмыслового соединения, не содержащего всего или части конъюгата.

В некоторых вариантах реализации конъюгаты присоединены на 5'-конце олигонуклеотида. Некоторые такие 5'-конъюгаты расщепляются более эффективно, чем аналоги, имеющие такую же конъгирующую группу, присоединенную на 3'-конце. В некоторых вариантах реализации улучшенная активность может коррелировать с улучшенным расщеплением. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды, содержащие конъюгат на 5'-конце, обладают более высокой эффективностью, чем олигонуклеотиды, содержащие конъюгат на 3'-концеа (см., например, Примеры 56, 81, 83 и 84). Кроме того, 5'-присоединение обеспечивает более простой синтез олигонуклеотида. Как правило, олигонуклеотиды синтезируют на твердой подложке в направлении от 3' к 5'. Для

получения 3'-конъюгированного олигонуклеотида, как правило присоединяют предварительно конъюгированный 3'-нуклеозид к твердой подложке, а затем обычным путем создают олигонуклеотид. Однако присоединение такого конъюгированного нуклеозида к твердой подложке усложняет синтез. Кроме того, применяя такой подход, конъюгат затем присутствует в ходе всего синтеза олигонуклеотида и может разрушаться во время последующих стадий или может ограничивать типы реакций и реагентов, которые можно применять. Применяя структуры и методики, описанные в настоящем документе для 5'-конъюгированных олигонуклеотидов, можно синтезировать олигонуклеотид при помощи стандартных автоматизированных методик и внедрять в конъюгат окончательный (5'-ближайший) нуклеозид или после отделения олигонуклеотида от твердой подложки.

С учетом известного уровня техники и настоящего описания, специалисты в данной области техники могут легко получить любые из конъюгатов и конъюгирозанных олигонуклеотидов, описанных в настоящем документе. Кроме того, синтез некоторых таких конъюгатов и конъюгированных олигонуклеотидов, описанных в настоящем документе, проще и/или требует меньше стадий и, следовательно, менее дорогой, чем синтез ранее описанных конъюгатов, что дает преимущество при производстве. Например, синтез некоторых конъюгирующих групп состоит из меньшего количество синтетических стадий, что приводит к увеличению выхода, по сравнению с ранее описанными конъюгирующими группами. Группы конъюгатов, такие как GalNAc3-10 в Примере 46 и GalNAc3-7 в Примере 48, гораздо проще, чем ранее описанные конъюгаты, такие как описаны в публикациях U.S. 8106022 или U.S. 7262177, для которых необходима сборка большего количества химических промежуточных соединений. Соответственно, эти и другие конъюгаты, описанные в настоящем документе, обладают преимуществом по сравнению с ранее описанными соединениями для применения с любым олигонуклеотидом, включая одноцепочечные олигонуклеотиды и любую цепьдвухспиральных олигонуклеотидов (например, миРНК).

Точно так же в настоящем документе описаны группы конъюгатов, имеющие только один или два лиганда GalNAc. Как показано, такие конъюгированные группы усиливают активность антисмысловых соединений. Такие соединения гораздо проще получить, чем конъюгаты, содержащие три лиганда GalNAc. Группы конъюгатов, содержащие один или два лиганда GalNAc, могут быть присоединены к любым антисмысловым соединениям, включая односпиральные олигонуклеотиды и любую спираль двухспиральных олигонуклеотидов (например, миРНК).

В некоторых вариантах реализации конъюгаты, описанные в настоящем документе,

существенно не изменяют некоторые показатели переносимости. Например, в настоящем документе показано, что конъюгированные антисмысловые соединения являются не более иммуногенными, чем не конъюгированные исходные соединения. Поскольку активность улучшается, то варианты реализации, в которых переносимость остается такой же (или, в действительности, если даже переносимость ухудшается лишь незначительно, по сравнению с приростом активности), обладают улучшенными характеристиками для терапии.

В некоторых вариантах реализации конъюгирование позволяет изменять антисмысловые соединения так, чтобы они обладали менее выраженными последствиями в отсутствие конъюгирования. Например, в некоторых вариантах реализации замена одной или более тиофосфатных связей полностью тиофосфатного антисмыслового соединения на фосфодиэфирные связи приводит к улучшению некоторых показателей переносимости. Например, в некоторых случаях такие антисмысловые соединения, имеющие один или более фосфодиэфиров, являются менее иммуногенными, чем такие же соединения, в которых каждая связь представляет собой тиофосфат. Однако в некоторых случаях, как показано в Примере 26, такое же замещение одной или более тиофосфатных связей на фосфодиэфирные связи приводит также к снижению клеточного захвата и/или к снижению активности. В некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения, описанные в настоящем документе, допускают такое изменение связей с небольшим снижением или без снижения захвата и активности, по сравнению с конъюгированным полностью тиофосфатным аналогом. В действительности, в некоторых вариантах реализации, например, в Примерах 44, 57, 59 и 86, олигонуклеотиды, содержащие конъюгат и по меньшей мере одну фосфодиэфирную межнуклеозидную связь, фактически демонстрируют повышенную активность in vivo даже по сравнению с полностью тиофосфатным аналогом, также содержащим такой же конъюгат. Более того, поскольку конъюгирование приводит к значительному увеличению захвата/активности, то небольшое снижение такого существенного прироста может быть приемлемым для достижения улучшенной переносимости. Соответственно, в некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения содержат по меньшей мере одну фосфодиэфирную связь.

В некоторых вариантах реализации конъюгирование антисмысловых соединений по настоящему документу приводит к улучшенной доставке, захвату и активности в гепатоцитах. Следовательно, в ткань печени доставляется большее количество соединения. Однако в некоторых вариантах реализации изобретения такая улучшенная доставка сама по себе не объясняет общего увеличения активности. В некоторых таких вариантах реализации

изобретения большее количество соединения поступает в гепатоциты. В некоторых вариантах реализации изобретения даже такой улучшенный захват гепатоцитов сам по себе не объясняет общего увеличения активности. В таких вариантах реализации изобретения увеличивается продуктивный захват конъюгированного соединения. Например, как показано в Примере 102, некоторые варианты реализации GalNAc-содержащих конъюгатов увеличивают обогащение антисмысловых олигонуклеотидов в гепатоцитах, по сравнению с не паренхимальными клетками. Такое обогащение преимущественно для олигонуклеотидов, которые нацелены на гены, экспрессируемые в гепатоцитах.

В некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения по настоящему документу приводят к уменьшению воздействия на почки. Например, как показано в Примере 20, концентрации антисмысловых олигонуклеотидов, содержащих некоторые варианты реализации GalNAc-содержащих конъюгатов, в почках ниже, чем концентрации антисмысловых олигонуклеотидов, не имеющих GalNAc-содержащего конъюгата. Это имеет несколько преимущественных терапевтических применений. Для терапевтических показаний, в которых не требуется проявление активности в почках, воздействие на почки подвергает их риску токсичности без соответствующей пользы. Более того, высокая концентрация в почках обычно приводит к выводу соединения с мочой, обеспечивая более быстрое выведение. Соответственно, для внепочечных мишеней накопление в почках является нежелательным.

В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены конъюгированные антисмысловые соединения, представленные формулой:

где

А представляет собой антисмысловый олигонуклеотид;

В представляет собой расщепляемый фрагмент;

С представляет собой конъюгирующий линкер;

D представляет собой группу ветвления;

каждый Е представляет собой связку;

каждый F представляет собой лиганд; и

q представляет собой целое число от 1 до 5.

На представленной выше схеме и в аналогичных схемах в настоящем документе группа ветвления «D» разветвляется такое количество раз, которое необходимо для соответствия количеству групп (E-F), указанному количеством «q». Так, если q=1, то формула представляет собой:

если q=2, то формула представляет собой:

если q=3, то формула представляет собой:

если q=4, то формула представляет собой:

если q=5, то формула представляет собой:

В некоторых вариантах реализации изобретения представлены конъюгированные антисмысловые соединения, имеющие структуру:

В некоторых вариантах реализации изобретения представлены конъюгированные антисмысловые соединения, имеющие структуру:

В некоторых вариантах реализации изобретения представлены конъюгированные антисмысловые соединения, имеющие структуру:

В некоторых вариантах реализации изобретения представлены конъюгированные антисмысловые соединения, имеющие структуру:

В настоящем описании представлены следующие не ограниченные нумерованные варианты реализации изобретения:

Вариант реализации 1. Конъюгированное антисмысловое соединение по любому из вариантов реализации 1179-1182, отличающееся тем, что связка имеет структуру, выбранную из:

и ; где каждый n независимо равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7.

Вариант реализации 2. Конъюгированное антисмысловое соединение по любому из вариантов реализации 1179-1182, отличающееся тем, что связка имеет структуру:

.

Вариант реализации 3. Конъюгированное антисмысловое соединение по любому из вариантов реализации 1179-1182 или 1688-1689, отличающееся тем, что линкер имеет структуру, выбранную из:

и

Вариант реализации 4. Конъюгированное антисмысловое соединение по любому из вариантов реализации 1179-1182 или 1688-1689, отличающееся тем, что линкер имеет структуру, выбранную из:

и ;

где каждый n независимо равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7.

Вариант реализации 5. Конъюгированное антисмысловое соединение по любому из вариантов реализации 1179-1182 или 1688-1689, отличающееся тем, что линкер имеет структуру:

.

В вариантах реализации, имеющих более одной конкретной переменной (например, более одного «m» или «n»), если не указано иное, каждая такая конкретная переменная выбрана независимо. Следовательно, для структуры, имеющей более одного n, каждый n выбран независимо, так что они могут быть или не быть одинаковыми между собой.

Подробное описание

Следует понимать, что и представленное выше общее описание, и следующее подробное описание являются лишь иллюстративными и пояснительными, и они не

ограничивают настоящее описание. В настоящем документе использование единственного числа включает множественное число, если специально не указано иное. При использовании в настоящем документе, термин «или» означает «и/или», если не указано иное. Кроме того, использование термина «включая», а также других форм, таких как «включает» и «включенный», не является ограничивающим. Также, такие термины как «элемент» или «компонент» охватывают как элементы и компоненты, содержащие одну единицу, так и элементы и компоненты, которые содержат более одной субъединицы, если специально не указано иное.

Названия разделов, используемые в настоящем документе, предназначены лишь для организационных целей, и их не следует толковать как ограничение описанного объекта изобретения. Все документы или части документов, цитируемые в настоящей заявке, включая, но не ограничиваясь ими, патенты, патентные заявки, статьи, книги и монографии, в явной форме включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

А. Определения

При отсутствии конкретных определений, номенклатура, используемая в связи с ними, а также в связи с приемами и методиками аналитической химии, синтетической органической химии, а также медицинской и фармацевтической химии, описанная в настоящем документе, является общеизвестной и общепринятой в данной области техники. Для химического синтеза и химического анализа могут быть использованы стандартные методики. Некоторые такие методики и приемы представлены, например, в публикациях "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" под редакцией Sangvi и Cook, American Chemical Society, федеральный округ Вашингтон, 1994; "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Истон, штат Пенсильвания, 21^е издание, 2005; и "Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications" под редакцией Stanley Т. Crooke, CRC Press, Бока-Ратон, штат Флорида; а также в книге Sambrook et al., "Molecular Cloning, A laboratory Manual," 2^е издание. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, которые включены в настоящий документ посредством ссылки для всех целей. Если это допустимо, все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации, а также другие данные, упоминаемые в тексте настоящего описания, включены в настоящий документ посредством ссылки в

полном объеме.

Если не указано иное, следующие термины имеют следующие значения:

При использовании в настоящем документе, «2'-F-нуклеозид» относится к нуклеозиду, содержащему сахар, который содержит фтор в 2'-положении. Если не указано иное, то фтор в 2'-F-нуклеозиде находится в рибо-положении (заменяя ОН природного рибозида).

«2'-O-метоксиэтил» (также 2'-МОЕ и 2'-O(СН₂)₂-ОСН₃) относится к O-метокси-этиловой модификации 2'-положения радикала фуранозного кольца. Сахар с 2'-O-метоксиэтиловой модификацией представляет собой модифицированный сахар.

«2'-O-метоксиэтил-нуклеотид» означает нуклеотид, включающий модифицированный 2'-O-метоксиэтиловый сахарный фрагмент.

При использовании в настоящем документе «2'-замещенный сахарный фрагмент» означает фуранозил, содержащий заместитель в 2'-положении, отличный от Н или ОН. Если не указано иное, то 2'-замещенный сахарный фрагмент не представляет собой бициклический сахарный фрагмент (т.е. 2'-заместитель 2'-замещенного сахарного фрагмента не образует мостик с другим атомом радикала фуранозного кольца).

«3'-сайт-мишень» относится к нуклеотиду целевой нуклеиновой кислоты, который комплементарен 3'-основному нуклеотиду конкретного антисмыслового соединения.

«5'-сайт-мишень» относится к нуклеотиду целевой нуклеиновой кислоты, который комплементарен 5'-основному нуклеотиду конкретного антисмыслового соединения.

«5-метилцитозин» означает цитозин, модифицированный метильной группой, присоединенной в 5'-положении. 5-метилцитозин представляет собой модифицированное азотистое основание.

«Около» означает в пределах ±10% от значения. Например, если указано, что «маркер может быть увеличен на около 50%», то подразумевается, что маркер может быть увеличен на значение в диапазоне 45%-55%.

«Активный фармацевтический агент» означает вещество или вещества в фармацевтической композиции, которые обеспечивают благоприятный терапевтический эффект при введении пациенту. Например, в некоторых вариантах реализации антисмысловый олигонуклеотид, нацеленный на РТР1В, представляет собой активный фармацевтический агент.

«Активная область мишени» или «область-мишень» означает область, на которую нацелено одно или более активных антисмысловых соединений. «Активные антисмысловые соединения» означают антисмысловые соединения, которые снижают уровни целевой нуклеиновой кислоты или уровни белка.

«Адипогенез» означает развитие жировых клеток из преадипоцитов. «Липогенез» означает выработку или образование жира, жировую дегенерацию или жировую инфильтрацию.

«Тучность» или «ожирение» относится к состоянию ожирения или избыточно высокого содержания телесного жира или жировой ткани по сравнению с тощей массой тела. Количество телесного жира подразумевает как распределение жира по телу, так и размер и массу отложений жировой ткани. Распределение телесного жира может быть оценено измерением кожных складок, отношением окружности талии к окружности бедра или такими способами как ультразвуковая, компьютерная томографическая или магнитная резонансная визуализация. В соответствии с рекомендациями Центра по контролю и профилактике заболеваний, индивидуумы с индексом массы тела (ИМТ), равным 30 и более, считаются страдающими ожирением. Термин «ожирение» при использовании в настоящем документе включает патологические состояния, при которых существует повышение содержания телесного жира за рамками физических ограничений в результате избыточного накопления жировой ткани в организме. Термин «ожирение» включает, не ограничивается ими, следующие патологические состояния: гипертрофическое ожирение; алиментарное ожирение; эндогенное или воспалительное ожирение; эндокринное ожирение; семейное ожирение; гиперпластическое-гипертрофическое ожирение; гипогонадное ожирение; гипотиреоидное ожирение; пожизненное ожирение; морбидное ожирение и экзогенное ожирение.

«Введенные параллельно» относится к совместному введению двух средств любым способом, при котором фармакологическое действие обоих средств проявляется у пациента одновременно. При параллельном введении не требуется, чтобы оба агенты были введены в одной фармацевтической композиции, в одной лекарственной форме или одним способом введения. Действие обоих средств не обязательно должно проявляться одновременно. Их действие должно лишь перекрываться в течение определенного периода времени, и оно не обязательно должно иметь одинаковую протяженность по времени.

«Введение» означает введение агента животному, и включает, но не ограничивается ими, введение медицинским специалистом или самостоятельное введение.

«Агент» означает активное вещество, которое может обеспечивать благоприятный терапевтический эффект при введении животному. «Первый агент» означает терапевтическое соединение, представленное в настоящем документе. Например, первый агент может быть антисмысловым олигонуклеотидом, нацеленным на РТР1В. «Второй агент» означает второе терапевтическое соединение согласно настоящему изобретению (например, второй антисмысловый олигонуклеотид, нацеленный на РТР1В) и/или не-PTP1B терапевтическое соединение.

«Облегчение» относится к снижению по меньшей мере одного показателя, признака или симптома ассоциированного заболевания, расстройства или патологического состояния. Тяжесть показателей может быть определена субъективными или объективными оценками, известными специалистам в данной области.

«Животное» относится к человеку или животному, не являющемуся человеком, включая, но не ограничиваясь этим, мышей, крыс, кроликов, собак, котов, свиней и приматов, не являющихся человеком, включая, но не ограничиваясь этим, обезьян и шимпанзе.

«Антисмысловая активность» означает любую обнаруживаемую или измеримую активность, которая относится к гибридизации антисмыслового соединения с его целевой нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах реализации, антисмысловая активность представляет собой снижение количества или экспрессии целевой нуклеиновой кислоты или белка, кодируемого такой целевой нуклеиновой кислотой.

«Антисмысловое соединение» означает олигомерное соединение, способное подвергаться гибридизации с целевой нуклеинвой кислотой при помощи водородной связи.

«Антисмысловое ингибирование» означает снижение уровней целевой нуклеиновой кислоты или уровней белка-мишени в присутствии антисмыслового соединения, комплементарного целевой нуклеиновой кислоте, по сравнению с уровнями целевой нуклеиновой кислоты или уровнями белка-мишени в отсутствие антисмыслового соединения.

«Антисмысловый олигонуклеотид» означает одноцепочечный олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований, которая допускает гибридизацию с соответствующей областью или сегментом целевой нуклеиновой кислоты.

«Бициклический сахар» означает радикал фуранозного кольца, модифицированный мостиковым присоединением двух не геминальных кольцевых атомов. Бициклический сахар представляет собой модифицированный сахар.

«Бициклическая нуклеиновая кислота» или «БНА» относится к нуклеозиду или нуклеотиду, в котором фуранозная часть нуклеозида или нуклеотида содержит мостик, связывающий два атома углерода в фуранозном кольце, образуя, таким образом, бициклическую кольцевую систему.

При использовании в настоящем документе «бициклический сахарный фрагмент» означает модифицированный сахарный фрагмент, содержащий 4-7-членное кольцо (включая. но не ограничиваясь им, фуранозил), которое содержит мостик, связывающий два атома 4-7-членного кольца с образованием второго кольца, что приводит к образованию бициклической структуры. В некоторых вариантах реализации изобретения 4-7-членное кольцо представляет собой сахарное кольцо. В некоторых вариантах реализации изобретения 4-7-членное кольцо представляет собой фуранозил. В некоторых таких вариантах реализации мостик соединяет 2'-углерод и 4'-углерод фуранозила.

«Кэп-структура» или «концевой кэп-фрагмент» означает химические модификации, которые были внедрены в любой конец антисмыслового соединения.

«Химически отличная область» относится к области антисмыслового соединения, которая каким-либо образом химически отличается от другой области того же антисмыслового соединения. Например, область, имеющая 2'-O-метоксиэтил-нуклеотиды является химически отличной от области, имеющей нуклеотиды с 2'-O-метоксиэтильными модификациями.

При использовании в настоящем документе «химическая модифицкация означает химическое отличие соединения по сравнению с природным аналогом. Химические модификации олигонуклеотидов включают нуклеозидные модификации (включая модификации сахарного фрагмента и модификации азотистого основания) и модификации межнуклеозидных связей. В отношении олигонуклеотида химическая модификация включает не только отличие последовательности азотистых оснований.

«Химерное антисмысловое соединение» означает антисмысловое соединение, которое имеет по меньшей мере две химически различных области.

«Совместное введение» означает введение индивидууму двух или более агентов. Два или более агентов могут быть в одной фармацевтической композиции или могут быть в отдельных фармацевтических композициях. Каждый из двух или более агентов может быть введен таким же или другим способом введения. Совместное введение включает параллельное или последовательное введение.

«Холестерин» представляет собой молекулу стерина, содержащуюся в клеточных мембранах всех животных тканей. В плазме крови животных холестерин транспортируется липопротеинами, включающими липопротеин очень низкой плотности (VLDL), липопротеин средней плотности (IDL), липопротеин низкой плотности (LDL) и липопротеин высокой плотности (HDL). «Холестерин в плазме» относится к сумме эстерифицированного и/или неэстерифицированного холестерина всех липопротеинов (VDL, IDL, LDL, HDL) в плазме или сыворотке.

«Ингибитор абсорбции холестерина» означает агент, который подавляет абсорбцию экзогенного холестерина, получаемого с пищей.

«Комплементарность» означает способность спаривания между азотистыми основаниями первой нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты.

При использовании в настоящем документе «стерически затрудненный этилнуклеозид» или «cEt» означает нуклеозид, содержащий бициклический сахарный фрагмент, содержащий мостик 4'-СН(СН₃)-O-2'.

«Смежные азотистые основания» означает азотистые основания, расположенные непосредственно рядом друг с другом.

«Дезоксирибонуклеотид» означает нуклеотид, имеющий водород в Т положении сахарной части нуклеотида. Дезоксирибонуклеотиды могут быть модифицированы любым из множества заместителей.

«Сахарный диабет» или «диабет» представляет собой синдром, характеризующийся нарушенным метаболизмом и патологически высоким содержанием сахара в крови (гипергликемией) из-за недостаточного содержания инсулина или сниженной чувствительности к инсулину. Характерные симптомы представляют собой избыточное выделение мочи (полиурия) из-за высокого содержания глюкозы в крови, избыточную жажду и повышенное потребление жидкости (полидипсия) в попытке компенсировать усиленное мочевыделение, расплывчатое зрение из-за того, что высокое содержание глюкозы в крови влияет на оптические свойства глаз, необъяснимую потерю веса и летаргию.

«Диабетическая дислипидемия» или «диабет 2 типа с дислипидемией» означает патологическое состояние, характеризующееся диабетом 2 типа, сниженным содержанием HDL-C, повышенным уровнем триглицеридов и повышенным уровнем мелких, плотных частиц LDL.

«Разбавитель» означает ингредиент в композиции, которые не обладает фармакологической активностью, но является фармацевтически необходимым или желательным. Например, разбавитель в композиции для инъекций может быть жидкостью, например, солевым раствором.

«Дислипидемия» относится к нарушению метаболизма липидов и/или липопротеинов, включая избыточную выработку или дефицит липидов и/или липопротеинов. Дислипидемия может проявляться в повышении содержания липидов, таких как холестерин и триглицериды, а также липопротеинов, таких как холестерин липопротеинов низкой плотности (LDL).

«Лекарственная форма» означает форму, в которой представлен фармацезтический агент, например, пилюлю, таблетку или другую лекарственную форму, известную в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения лекарственная форма представляет собой ампулу, содержащую лиофилизированный антисмысловый олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации лекарственная форма представляет собой ампулу, содержащую восстановленный антисмысловый олигонуклеотид.

«Доза» означает определенное количество фармацевтического средства, которое обеспечивается при разовом введении или в течение определенного периода времени. В некоторых вариантах реализации доза может быть введена одним, двумя или более болюсами, таблетками или инъекциями. Например, в некоторых вариантах реализации, в которых желательно подкожное введение, для требуемой дозы необходим объем, который трудно ввести за одну инъекцию, поэтому можно использовать две или более инъекций для достижения требуемой дозы. В некоторых вариантах реализации фармацевтический агент вводят инфузией в течение продолжительного периода времени или непрерывно. Дозы могут быть определены как количество фармацевтического средства в час, день, неделю или месяц.

«Эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» означает количество активного фармацевтического агента, достаточное для достижения желаемого физиологического результата у индивидуума, нуждающегося в таком агенте. Эффективное количество может варьироваться у различных индивидуумов в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, подлежащего лечению, таксономической группы индвидуумов, подлежащих лечению, состава композиции, оценки медико-санитарной обстановки и других релевантных факторов.

«Полная комплементарность» или «100% комплементарность» означает, что каждое азотистое основание последовательности азотистых оснований первой нуклеиновой кислоты

имеет комплементарное азотистое основание во второй последовательности азотистых оснований второй нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации, первая нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение, а целевая нуклеиновая кислота представляет собой вторую нуклеиновую кислоту.

При использовании в настоящем документе «фуранозил» означает структуру, содержащую 5-членное кольцо, которое содержит четыре атома углерода и один атом кислорода.

«Гэп-мер» означает химерное антисмысловое соединение, в котором внутренняя область, имеющая множество нуклеозидов, которые поддерживают Н расщепление РНКазы, расположена между внешними областями, имеющими один или несколько нуклеозидов, причем нуклеозиды, включающие внутреннюю область, являются химически отличными от нуклеозида или нуклеозидов, составляющих внешние области. Внутренняя область может быть упомянута как «сегмент гэп», а внешние области могут быть упомянуты как «сегменты крыльев».

«С расширенным гэп» означает химерное антисмысловое соединение, имеющее сегмент гэп из 12 или более смежных 2'-дезоксирибонуклеотидов, расположенных между и непосредственно рядом с 5' и 3' сегментами крыльев, имеющими от одного до шести нуклеозидов.

«Глюкоза» представляет собой моносахарид, используемый клетками в качестве источника энергии и воспалительного посредника. «Глюкоза в плазме» относится к содержанию глюкозы в плазме.

«Ингибитор редуктазы HMG-CoA» означает агент, который действует путем ингибирования фермента редуктазы HMG-CoA, такой как аторвастатин, розувастатин, флувастатин, ловастатин, правастатин и симвастатин.

«Гибридизация» означает гибридизацию молекул комплементарных нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах реализации изобретения молекулы комплементарной нуклеиновой кислоты содержат антисмысловое соединение и целевую нуклеиновую кислоту.

«Гиперлипидемия» или «гиперлипемия» представляет собой патологическое состояние, характеризующееся повышенным содержанием липидов в сыворотке или циркулирующих липидов (в плазме). Это состояние проявляется в патологически высоких концентрациях жиров. Липидная фракция в циркулирующей крови представляет собой

холестерин, липопротеины низкой плотности, липопротеины очень низкой плотности и триглицериды.

«Гипертриглицеридемия» означает патологическое состояние, характеризующееся повышенными уровнями триглицеридов.

«Идентификация» или «выбор животного с метаболическим заболеванием» означает определение или выбор субъекта, диагностированного с метаболическим заболеванием или метаболическим расстройством; или определение или выбор субъекта, имеющего любой симптом метаболического заболевания, включая, но не ограничиваясь ими, метаболический синдром, гипергликемию, гипертриглицеридемию, гипертонию, повышенную инсулинорезистентность, пониженную чувствительность к инсулину, увеличенную массу тела и/или увеличенное содержание жира в организме, или любую их комбинацию. Такая идентификация может быть выполнена любым способом, включая, но не ограничивась ими, стандартные клинические испытания или оценки, такие как измерение глюкозы в сыворотке или циркулирующей глюкозы (в плазме), измерение триглицеридов в сыворотке или циркулирующих триглицеридов (в плазме), измерение кровяного давления, измерение содержания жира в организме, измерение массы тела и т.п.

«Непосредственно смежные» означает отсутствие промежуточных элементов между непосредственно смежными элементами.

«Индивидуум» или «субъект» или «животное» означает человека или животное, не являющееся человеком, выбранное для лечения или терапии.

«Ингибирование экспрессии или активности» относится к снижению или блокированию экспрессии или активности РНК или белка и не обязательно означает полное исключение экспрессии или активности.

«Инсулинорезистентность» определяется как патологическое состояние, при котором нормальные количества инсулина недостаточны для получения нормального ответа на инсулин от жировых, мышечных и печеночных клеток. Инсулинорезистентность в жировых клетках приводит к гидролизу запасенных триглицеридов, что повышает содержание свободных жирных кислот в плазме крови. Инсулинорезистентность в мышцах снижает поглощение глюкозы, а инсулинорезистентность в печени снижает запас глюкозы, и оба эффекта приводят к повышению глюкозы в крови. Высокие уровни инсулина и глюкозы в

плазме из-за инсулинорезистентности зачастую приводят к метаболическому синдрому и диабету 2 типа.

«Чувствительность к инсулину» представляет собой меру эффективности переработки глюкозы в организме индивидуума. Индивидуум с высокой чувствительностью к инсулину эффективно перерабатывает глюкозу, тогда как индивидумм с низкой чувствительностью к инсулину перерабатывает глюкозу неэффективно.

«Межнуклеозидная связь» относится к химической связи между нуклеозидами.

«Внутривенное введение» означает введение в вену.

«Связанные нуклеозиды» означает смежные нуклеозиды, связанные друг с другом.

При использовании в настоящем документе «нуклеозид запертой нуклеиновой кислоты» или «ЗНК» означает нуклеозид, содержащий бициклический сахарный фрагмент содержащий мостик 4'-СН₂-O-2'.

«Терапия для понижения содержания липидов» или «агент для понижения содержания липидов» означает терапевтический режим, предоставленный субъекту для снижения содержания одного или более липидов в организме субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения терапия для понижения содержания липидов предоставлена для снижения одного или более из АроВ, общего холестерина, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, не-HDL-С, триглицеридов, мелких плотных частиц LDL и Lp(a) в организме субъекта. Примеры терапии для понижения содержания липидов включают статины, фибраты и ингибиторы МТР.

«Основные факторы риска» относится к факторам, которые способствуют высокому риску конкретного заболевания или патологического состояния. В некоторых вариантах реализации изобретения основные факторы риска для коронарной болезни сердца включают, без ограничения, курение, гипертонию, низкое содержание HDL-C, семейный анамнез коронарной болезни сердца, возраст и другие факторы, описанные в настоящем документе.

«Метаболическое заболевание» или «метаболическое расстройство» относится к патологическому состоянию, характеризующемуся изменением или нарушением метаболической функции. «Метаболический» и «метаболизм» представляют собой термины, общеизвестные в данной области техники, и обычно включают весь диапазон биохимических процессов, происходящих в живом организме. Метаболические заболевания и/ли расстройства включают, но не ограничиваются ими, ожирение, диабет, гипергликемию, преддиабет, неалкогольную жировую инфильтрацию печени (NAFLD), метаболический

синдром, инсулинорезистентность, диабетическую дислипидемию или гипертриглицеридемию, или их комбинации.

«Метаболический синдром» означает патологическое состояние, характеризующееся группой липидных и нелипидных сердечно-сосудистых факторов риска метаболического происхождения. В некоторых вариантах реализации изобретения метаболический синдром определяют по наличию любых 3 из следующих факторов: окружность талии более 102 см у мужчин или более 88 см у женщин; содержание триглицеридов в сыворотке по меньшей мере 150 мг/дл; содержание HDL-C менее 40 мг/дл у мужчин или менее 50 мг/дл у женщин; кровяное давление по меньшей мере 130/85 мм рт.ст.; и содержание глюкозы натощак по меньшей мере 110 мг/дл. Эти детерминанты могут быть легко измерены в клинической практике (JAMA, 2001, 285: 2486-2497).

«Не совпадает» или не комплементарный нуклеозид» относится к случаю, когда азотистое основание первой нуклеиновой кислоты не может спариваться с соответствующим азотистым основанием второй или целевой нуклеиновой кислоты.

«Смешанная дислипидемия» означает патологическое состояние, характеризующееся повышенным уровнем холестерина и повышенным уровнем триглицеридов.

«Модифицированная межнуклеозидная связь» относится к замещению или любому изменению природной межнуклеозидной связи (то есть фосфодиэфирной межнуклеозидной связи).

«Модифицированное азотистое основание» относится к любому азотистому основанию, отличному от аденина, цитозина, гуанина, тимидина или урацила. «Не модифицированное азотистое основание» означает пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G), а также пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).

«Модифицированный нуклеозид» означает нуклеозид, имеющий, независимо, модифицированный сахарный фрагмент или модифицированное азотистое основание.

«Модифицированный нуклеотид» означает нуклеотид, имеющий, независимо, модифицированный сахарный фрагмент, модифицированную межнуклеозидную связь иль модифицированное азотистое основание. «Модифицированный нуклеозид» означает нуклеозид, имеющий, независимо, модифицированный сахарный фрагмент или модифицированное азотистое основание.

«Модифицированный олигонуклеотид» означает олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один модифицированный нуклеотид.

«Модифицированный сахар» относится к замещению или изменению относительно природного сахара.

При использовании в настоящем документе «модифицированный сахарный фрагмент» означает замещенный сахарный фрагмент или заменитель сахара.

При использовании в настоящем документе «МОЕ» означает -OCH₂CH₂OCH₃.

«Мотив» означает схематическое изображение химически отличных областей в антисмысловом соединении.

«Ингибитор МТР» означает агент, который ингибирует фермент, микросомальный белок-переносчик триглицеридов.

«Природная межнуклеозидная связь» означает 3'-5' фосфодиэфирную связь.

При использовании в настоящем документе «природный сахарный фрагмент» означает рибофуранозил, встречающийся в природной РНК, или дезоксирибофуранозил, встречающийся в природной ДНК.

«Природный сахарный фрагмент» означает сахар, который находится в ДНК (2'-Н) или РНК (2'-ОН).

«Неалкогольная жировая инфильтрация печени» или «NAFLD» означает патологическое состояние, характеризующееся жировым воспалением печени, которое не обусловлено избыточным употреблением алкоголя (например, потреблением алкоголя более 20 г/сутки). В некоторых вариантах реализации изобретения NAFLD связана с инсулинорезистентностью и метаболическим синдромом. NAFLD охватывает спектр заболеваний от простого накопления триглицеридов в гепатоцитах (стеатоз печени) до стеатоза печение воспалением (стеатогепатит), фиброза и цирроза.

«Неалкогольный стеатогепатит» (NASH) возникает в результате прогрессирования NAFLD за пределы отложения триглицеридов. Для развития NASH необходима «вторичная травма», способная вызывать некроз, воспаление и фиброз. Потенциальные факторы для вторичной травмы могут быть сгруппированы в широкие категории: факторы, вызывающие повышение окислительного стресса, и факторы, ускоряющие экспрессию провоспалительных цитокинов.

«Нуклеиновая кислота» относится к молекулам, состоящим из мономерных нуклеотидов. Нуклеиновая кислота включает рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), одноцепочечные нуклеиновые кислоты двухцепочечные нуклеиновые кислоты, малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты

(миРНК) и микроРНК (микроРНК). Нуклеиновая кислота может также содержать комбинацию этих элементов в одной молекуле.

«Азотистое основание» означает гетероциклический фрагмент, способный спариваться с основанием другой нуклеиновой кислоты. При использовании в настоящем документе «азотистое основание» означает группу атомов, которые могут быть связаны с сахарным фрагментом с образованием нуклеозида, который может внедряться в олигонуклеотид, и при этом такая группа атомов может связываться с комплементарным природным азотистым основанием другого олигонуклеотида или нуклеиновой кислоты. Азотистые основания могут быть природными или модифицированными.

«Последовательность азотистых оснований» означает порядок смежных азотистых оснований, независимый от какого-либо сахара, связи или модификации азотистого основания.

При использовании в настоящем документе «нуклеозид» означает соединение, содержащее фрагмент азотистого основания и сахарный фрагмент. Нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, природные нуклеозиды (встречающиеся в ДНК и РНК) и модифицированные нуклеозиды. Нуклеозиды могут быть связаны с фосфатным фрагмеюом.

«Нуклеозид-миметик» включает такие структуры, используемые для замещения сахара или сахара и основания, и не обязательно связи в одном или нескольких положениях олигомерного соединения, как, например, нуклеозид-миметики, имеющие морфолино, циклогексенил, циклогексил, тетрагидропиранил, бицикло или трицикло-сахарные миметики, например, не фуранозные сахарные звенья.

«Нуклеотид» означает нуклеозид, имеющий фосфатную группу, ковалентно присоединенную к сахарной части нуклеозида. При использовании в настоящем документе «нуклеотид» означает нуклеозид, дополнительно содержащий фосфатную линкерную группу. При использовании в настоящем документе, «связанные нуклеозиды» могут быть или не быть связанными фосфатными линкерами, и, следовательно, этот термин включает, но не ограничивается этим, «связанные нуклеотиды». При использовании в настоящем документе, «связанные нуклеозиды» представляют собой нуклеозиды, которые связаны в непрерывную последовательность (т.е. между связанными нуклеозидами нет дополнительных нуклеозидов).

«Нуклеотид-миметик» включает такие структуры, используемые для замены нуклеозида и связи в одном или нескольких положениях олигомерного соединения, как,

например, пептидные нуклеиновые кислоты или морфолиновые соединения (морфолиновые соединения, связанные при помощи -N(H)-C(=О)-О- или другой не фосфодиэфирной связи).

«Олигомерное соединение» или «олигомер» относится к полимерной структуре, содержащей две или более субструктур и способной гибридизоваться с областью молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерные соединения представляют собой олигонуклеозиды. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерные соединения представляют собой олигонуклеотиды. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерные соединения представляют собой антисмысловые соединения. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерные соединения представляют собой антисмысловые олигонуклеотиды. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерные соединения представляют собой химерные олигонуклеотиды.

«Олигонуклеотид» означает полимер связанных нуклеозидов, каждый из которых может быть модифицированным или не модифицированным, независимо друг от друга.

«Парентеральное введение» означает введение инъекцией или инфузией. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, внутрибрюшинное введение или внутричерепное введение, например, интратекальное или интрацеребровентрикулярное введение. Введение может быть непрерывным или хроническим, или кратковременным, или периодическим.

«Пептид» означает молекулу, образованную связыванием по меньшей мере двух аминокислот амидными связями, Пептид относится к полипептидам и белкам.

«Фармацевтическое средство» означает вещество, которое обеспечивает благоприятный терапевтический эффект при введении пациенту. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловый олигонуклеотид, нацеленный на РТР1В, представляет собой фармацевтический агент.

«Фармацевтическая композиция» означает смесь веществ, пригодную для введения индивидууму. Например, фармацевтическая композиция может содержать один или более активных агентов и стерильный водный раствор.

«Фармацевтически приемлемый носитель» означает среду или разбавитель, который не взаимодействует со структурой олигонуклеотида. Некоторые из таких носителей обеспечивают возможность составления фармацевтических композиций, таких как,

например, таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, гели, сиропы, взвеси, суспензии и пастилки для перорального приема пациентом. Например, фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой стерильный водный раствор.

«Фармацевтически приемлемое производное» охватывает фармацевтически приемлемые соли, конъюгаты, пролекарства или изомеры соединений, описанных в настоящем документе.

«Фармацевтически приемлемые соли» означает физиологически и фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, то есть соли, которые сохраняют желаемую биологическую активность исходного олигонуклеотида и не наделяют его нежелательным токсикологическим действием.

«Тиофосфатная связь» означает связь между нуклеозидами, где фосфодиэфирная связь модифицирована заменой одного из немостиковых атомов кислорода атомом серы. Тиофосфатная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь.

«Часть» означает определенное количество смежных (то есть связанных) азотистых оснований нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения часть представляет собой определенное количество смежных азотистых оснований целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации часть представляет собой определенное количество смежных азотистых оснований антисмыслового соединения.

«Предупреждение» относится к отсрочке или предотвращению возникновения или развития заболевания, расстройства или патологические состояния в течение периода времени от нескольких минут до бесконечности. Предупреждение означает также снижение риска развития заболевания, расстройства или патологического состояния.

«Пролекарство» означает терапевтическое средство, которое готовят в неактивной форме, которая превращается в активную форму внутри организма или его клеток под действием эндогенных ферментов или других химических веществ или условий.

«Протеин-тирозинфосфатаза 1В» или «РТР1В» (известная также как PTPN1; протеин-тирозинфосфатаза, нерецепторный тип 1; РТР-1В; RKPTP) означает любую нуклеиновую кислоту или белок РТР1В.

«Экспрессия РТР1В» означает уровень мРНК, транскрибированной из гена, кодирующего РТР1В, или уровень белка, транслированного из мРНК. Экспрессия РТР1В может быть определена известными в данной области техники способами, такими как нозерн или вестерн-блоттинг.

«Нуклеиновая кислота РТР1В» означает любую нуклеиновую кислоту, кодирующую РТР1В. Например, в некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота РТР1В содержит последовательность ДНК, кодирующую РТР1В, последовательность РНК, транскрибированную из ДНК, кодирующей РТР1В (включая геномную ДНК, содержащую интроны и экзоны), и последовательность мРНК, кодирующую РТР1В. «мРНК РТР1В» означает мРНК, кодирующую белок РТР1В.

«Побочные эффекты» означает физиологические реакции, приписываемые лечению, которые отличны от желаемого действия. В некоторых вариантах реализации изобретения побочные эффекты включают реакции в точке инъекции, патологии при испытании функции печени, патологии функции почек, печеночную токсичность, почечную токсичность, патологии центральной нервной системы, миопатию и дискомфорт. Например, повышенные уровни аминотрансферазы в сыворотке могут указывать на печеночную токсичность или патологию функции печени. Например, повышенный билирубин может указывать на печеночную токсичность или патологию функции печени.

«Одноцепочечный олигонуклеотид» означает олигонуклеотид, который не гибридизован с комплементарной цепью.

«Специфически гибридизуемый» относится к антисмысловому соединению, имеющему достаточную степень комплементарности между антисмысловым олигонуклеотидом и целевой нуклеиновой кислотой для инициации желаемого эффекта, одновременно демонстрирующему минимальное влияние или отсутствие влияния на нецелевые нуклеиновые кислоты в условиях, в которых необходимо специфическое связывание, то есть при физиологических условиях в случае анализов in vivo и при терапевтическом лечении.

«Статин» означает агент, который подавляет активность редуктазы HMG-CoA.

«Подкожное введение» означает введение непосредственно под кожу. При использовании в настоящем документе «сахарный фрагмент» означает природный сахарный фрагмент или модифицированный сахарный фрагмент нуклеозида.

При использовании в настоящем документе «замещенный сахарный фрагмент» означает фуранозил, который не является природным сахарным фрагментом. Замещенные сахарные фрагменты включают, но не ограничиваются ими, фуранозилы, содержащие заместители в 2'-положении, в 3'-положении, в 5'-положении и/или в 4'-положении.

Некоторые замещенные сахарные фрагменты представляют собой бициклические сахарные фрагменты.

При использовании в настоящем документе термин «заменитель сахара» означает структуру, которая не содержит фуранозил и которая может заменять природный сахарный фрагмент нуклеозида, так что полученные нуклеозидные субъединицы могут связываться друг с другом и/или связываться с другими нуклеозидами с образованием олигомерного соединения, которое может гибридизоваться с комплементарным олигомерным соединением. Такие структуруы включают кольца, содержащие другое количество атомов, чем фуранозил (например, 4, 6 или 7-членные кольца); замещения кислорода фуранозила на некислородный атом (например, углерод, серу или азот); или оба изменения, касающиеся количества атомов и замены кислорода. Такие структуры также могут содержать замещения, соответствующие тем, которые описаны в замещенных сахарных фрагментах (например, 6-членные карбоциклические бициклические заменители сахара, необязательно содержащие дополнительные заместители). Заменители сахара содержат также более сложные сахарные замещения (например, некольцевые системы пептидной нуклеиновой кислоты). Заменители сахара включают, без ограничения, морфолиновые соединения, циклогексеничы и циклогекситолы.

«Таргетинг» или «нацеленный» означает процесс разработки и выбора антисмыслового соединения, которое будет специфически гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой и вызывать желаемый эффект.

«Целевая нуклеиновая кислота», «целевая РНК» и «целевой РНК транскрипт», все эти термины относятся к нуклеиновой кислоте, на которую могут быть нацелены антисмысловые соединения.

«Целевой сегмент» означает последовательность нуклеотидов целевой нуклеиновой кислоты, на которую нацелено антисмысловое соединение. «Сайт-мишень 5'» относится к 5'-основному нуклеотиду целевого сегмента. «Сайт-мишень 3'» относится к 3'-основному нуклеотиду целевого сегмента.

«Терапевтически эффективное количество» означает количество агента, которое обеспечивает пациенту благоприятный терапевтический эффект.

«Терапевтическое изменение образа жизни» означает изменение питания и образа жизни, направленное на снижение массы жировой/адипозной ткани и/или холестерина. Такое изменение может снижать риск развития сердечного заболевания и может включать рекомендации по диетическому употреблению общих суточных калорий, общих жиров,

насыщенных жиров, полиненасыщенных жиров, мононенасыщенных жиров, углеводов, белков, холестерина, нерастворимых волокон, а также рекомендации по физической активности.

«Триглицерид» или «TG» означает липид или нейтральный жир, состоящий из глицерина, связанного с тремя молекулами жирной кислоты.

«Диабет 2 типа» (известный также как «сахарный диабет 2 типа» или «сахарный диабет, 2 тип», и называемый ранее «сахарный диабет 2 типа», «инсулинонезависимый диабет (NIDDM)», «диабет на фоне ожирения» или «диабет взрослого возраста») представляет собой метаболическое расстройство, которое характеризуется, главным образом, инсулинорезистентностью, относительным дефицитом инсулина и гиперглицемией.

«Лечение» относится к введению фармацевтической композиции животному для обеспечения изменения или облегчения заболевания, расстройства или патологического состояния.

При использовании в настоящем документе термины «немодифицированное азотистое основание» или «природное азотистое основание» означают природные гетероциклические азотистые основания РНК или ДНК: пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G), a также пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) (включая 5-метил С) и урацил (U).

«Немодифицированный нуклеотид» означает нуклеотид, состоящий из природных азотистых оснований, сахарных фрагментов и межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения немодифицированный нуклеотид представляет собой нуклеотид РНК (то есть β-D-рибонуклеозиды) или нуклеотид ДНК (то есть β-D-дезоксирибонуклеозид).

При использовании в настоящем документе, «2'-замещенный нуклеозид» означает нуклеозид, содержащий заместитель в 2'-положении, отличный от Н или ОН. Если не указано иное, то 2'-замещенный нуклеозид не является бициклическим нуклеозидом.

При использовании в настоящем документе, «дезоксинуклеозид» означает нуклеозид, содержащий 2'-Н фуранозный сахарный фрагмент, находящийся в природных дезоксирибонуклеозидах (ДНК). В некоторых вариантах реализации 2'-дезоксинуклеозид

может содержать модифицированное азотистое основание или может содержать азотистое основание РНК (например, урацил).

При использовании в настоящем документе, «олигонуклеотид» означает соединение, содержащее множество связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит один или более немодифицированных рибонуклеозидов (РНК) и/или немодифицированных дезоксирибонуклеозидов (ДНК), и/или один или более модифицированных нуклеозидов.

При использовании в настоящем документе, «олигонуклеозид» означает олигонуклеотид, в котором ни один из межнуклеозидных связей не содержит атом фосфора. При использовании в настоящем документе, олигонуклеотиды включают олигонуклеозиды.

При использовании в настоящем документе, «модифицированный олигонуклеотид» означает олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один модифицированный нуклеозид и/или по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь.

При использовании в настоящем документе, «связь» или «связывающая группа» означает группу атомов, которая связывает вместе две или более других групп атомов.

При использовании в настоящем документе, «межнуклеозидная связь» означает ковалентную связь между соседними нуклеозидами в олигонуклеотиде.

При использовании в настоящем документе, «природная межнуклеозидная связь» означает фосфодиэфирную связь 3' с 5'.

При использовании в настоящем документе, «модифицированная межнуклеозидная связь» означает любую межнуклеозидную связь, отличную от природной межнуклеозидной связи.

При использовании в настоящем документе, «концеваяй межнуклеозидная связь» означает связь между последними двумя нуклеозидами олигонуклеотида или его определенной области.

При использовании в настоящем документе, «фосфорная связывающая группа» означает связывающую группу, содержащую атом фосфора. Фосфорные связывающие группы включают, без ограничения, группы, имеющие формулу:

где:

R_a и R_d, каждый независимо, представляют собой О, S, CH₂, NH или NJ₁, где J₁ представляет собой C₁-С₆ алкил или замещенный C₁-С₆ алкил;

R_b представляет собой О или S;

R_e представляет собой ОН, SH, C₁-С₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил, C₁-С₆ алкокси, замещенный C₁-С₆ алкокси, амино или замещенный амино; и

J₁ представляет собой R_b представляет собой О или S.

Фосфорные связывающие группы включают, без ограничения, фосфодиэфир, тиофосфат, дитиофосфат, фосфонат, фосфорамидат, фосфортиоамидат, тионоалкилфосфонат, фосфотриэфиры, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфат.

При использовании в настоящем документе, «межнуклеозидная фосфорная связывающая группа» означает фосфорную связывающую группу, которая напрямую связывает два нуклеозида.

При использовании в настоящем документе, «не межнуклеозидная фосфорная связывающая группа» означает фосфорную связывающую группу, которая не связывает напрямую два нуклеозида. В некоторых вариантах реализации не межнуклеозидная фосфорная связывающая группа связывает нуклеозид с группой, отличной от нуклеозида. В некоторых вариантах реализации не межнуклеозидная фосфорная связывающая группа связывает две группы, ни одна из которых не является нуклеозидом.

При использовании в настоящем документе, «нейтральная связывающая группа» означает связывающую группу, которая не имеет заряда. Нейтральные связывающие группы включают, без ограничения, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, MMI (-СН₂-N(СН₃)-O-), амид-3 (-CH₂-C(=O)-N(H)-), амид-4 (-CH₂-N(H)-C(=O)-), формацеталь (-O-CH₂-O-) и тиоформацеталь (-S-CH₂-O-). Дополнительные нейтральные связывающие группк включают неионные связи, содержащие силоксан (диалкилсилоксан), карбоксильный сложный эфир,

карбоксамид, сульфид, сульфоновый сложный эфир и амиды (см., например: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; под ред. Y.S. Sanghvi и P.D. Cook, ACS Symposium, серия 580; главы 3 и 4, (cc. 40-65)). Дополнительные нейтральные связывающие группы включают неионные связи, содержащие смешанные составные части N, О, S и СН₂.

При использовании в настоящем документе, «межнуклеозидная нейтральная связывающая группа» означает нейтральную связывающую группу, которая напрямую связывает два нуклеозида.

При использовании в настоящем документе, «не межнуклеозидная нейтральная связывающая группа» означает нейтральную связывающую группу, которая не связывает напрямую два нуклеозида. В некоторых вариантах реализации не межнуклеозидная нейтральная связывающая группа связывает нуклеозид с группой, отличной от нуклеозида. В некоторых вариантах реализации не межнуклеозидная нейтральная связывающая группа связывает две группы, ни одна из которых не является нуклеозидом.

При использовании в настоящем документе, «олигомерное соединение» означает полимерную структуру, содержащую две или более субструктур. В некоторых вариантах реализации олигомерное соединение содержит олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации олигомерное соединение содержит одну или более конъюгированных групп и/или концевых групп. В некоторых вариантах реализации олигомерное соединение состоит из олигонуклеотида. Олигомерные соединения включают также природные нуклеиновые кислоты. В некоторых вариантах реализации олигомерное соединение содержит скелет одной или более связанных мономерных субъединиц, при этом каждая связанная мономерная субъединица прямо или косвенно присоединена к гетероциклическому основному фрагменту. В некоторых вариантах реализации олигомерные соединения могут содержать также мономерные субъединицы, которые не связаны с гетероциклическим основным фрагментом, обеспечивая таким образом сайты с удаленными основаниями. В некоторых вариантах реализации связи, соединяющие мономерные субъединицы, сахарные фрагменты или заменители и гетероциклические основные фрагменты, могут быть независимо модифицированы. В некоторых вариантах реализации единица связь-сахар, которая может содержать или не содержать гетероциклическое основание, может быть замещена миметиком, таким как мономеры в пептидных нуклеиновых кислотах.

При использовании в настоящем документе, «концевая группа» означает один или более атомов, присоединенных к любому или к обоим 3'- или 5'-концам олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации концевая группа представляет собой конъгирующую группу. В некоторых вариантах реализации концевая группа содержит один или более нуклеозидов концевой группы.

При использовании в настоящем документе, «конъюгат» или «конъгирующая группа» означает атом или группу атомов, связанную с олигонуклеотидом или олигомерным соединением. Как правило, конъгирующей группы модифицируют одно или белее свойств соединения, к которому они присоединены, включая, но не ограничиваясь ими, свойства фармакодинамики, фармакокинетики, связывания, поглощения, клеточного распределения, клеточного захвата, заряда и/или выведения.

При использовании в настоящем документе, «конъюгирующий линкер» или «линкер» к контексте конъгирующей группы означает часть конъгирующей группы, содержащую любой атом или группу атомов и ковалентно связывающую (1) олигонуклеотид с другой частью конъгирующей группы или (2) две или более частей конъгирующей группы.

Конъгирующей группы показаны в настоящем документе как радикалы, обеспечивающие связь для образования ковалентного присоединения к олигомерному соединению, такому как антисмысловый олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации точка присоединения у олигомерного соединения представляет собой 3'-атом кислорода 3'-гидроксильной группы 3'-концевого нуклеозида олигомерного соединения. В некоторых вариантах реализации точка присоединения у олигомерного соединения представляет собой 5'-атом кислорода 5'-гидроксильной группы 5'-концевого нуклеозида олигомерного соединения. В некоторых вариантах реализации связь для образования присоединения к олигомерному соединению представляет собой расщепляемую связь. В некоторых таких вариантах реализации такая расщепляемая связь составляет весь или часть расщепляемого фрагмента.

В некоторых вариантах реализации конъгирующей группы содержат расщепляемый фрагмент (например, расщепляемую связь или расщепляемый нуклеозид) и часть углеводного кластера, такую как часть кластера GalNAc. Такая часть углеводного кластера содержит: нацеливающий фрагмент и, необязательно, конъюгирующий линкер. В некоторых вариантах реализации часть углеводного кластера определяют по количеству и сущности

лиганда. Например, в некоторых вариантах реализации часть углеводного кластера содержит три группы GalNAc и означена «GalNAc₃». В некоторых вариантах реализации часть углеводного кластера содержит 4 группы GalNAc и означена «GalNAc₄». Конкретные части углеводных кластеров (имеющие конкретную связку, группы ветвления и конъюгирующий линкер) описаны в настоящем документе и означены римской цифрой с последующим нижним индексом «а». Соответственно, «GalNac3-1_a» относится к конкретной части углеводного кластера конъгирующей группы, имеющей 3 группы GalNac и конкретно определенную связку, группы ветвления и линкера. Такой фрагмент углеводного кластера присоединен к олигомерному соединению через расщепляемый фрагмент, такой как расщепляемая связь или расщепляемый нуклеозид.

При использовании в настоящем документе, «расщепляемый фрагмент» означает связь или группу, которая может быть расщеплена при физиологических условиях. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент расщепляется внутри клетки или во внутриклеточных отделах, таких как лизосома. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент расщепляется эндогенными ферментами, такими как нуклеазы. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент содержит группу атомов, имеющую один, два, три, четыре или более четырех расщепляемых связей.

При использовании в настоящем документе, «расщепляемая связь» означает любую химическую связь, которая может быть расщеплена. В некоторых вариантах реализации расщепляемая связь выбрана из: амида, полиамида, сложного эфира, эфира, одного или обоих сложных эфиров фосфодиэфира, фосфатного сложного эфира, карбамата, дисульфида или пептида.

При использовании в настоящем документе, «углеводный кластер» означает соединение, имеющее один или более углеводных остатков, присоединенных к скелету или связывающей группе. (см., например, публикацию Maier et al., "Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting," Bioconjugate Chemistry, 2003, (14): 18-29, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки, или Rensen et al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor," J. Med. Chem. 2004, (47): 5798-5808, где представлены примеры углеводных конъюгированных кластеров).

При использовании в настоящем документе, «модифицированный углевод» означает любой углевод, имеющий одну или более модификаций, по сравнению с природными углеводами.

При использовании в настоящем документе, «производное углевода» означает любое соединение, которое может быть синтезировано с использованием углевода в качестве исходного материала или промежуточного соединения.

При использовании в настоящем документе, «углевод» означает природный углевод, модифицированный углевод или производное углевода.

При использовании в настоящем документе, «защитная группа» означает любое соединение или защитную группу, известную специалистам в данной области техники. Не ограничивающие примеры защитных групп представлены в публикации "Protective Groups in Organic Chemistry", Т.W. Greene, P.G.M. Wuts, ISBN 0-471-62301-6, John Wiley & Sons, Inc, Нью-Йорк, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

При использовании в настоящем документе, «односпиральное» означает олигомерное соединение, которое не гибридизовано с его комплементом и которое не имеет достаточной самокомплементарностью для образования усточивого собственного дуплекса.

При использовании в настоящем документе, «двухспиральное» означает пару олигомерных соединений, которые гибридизованы друг с другом, или одно самокомплементарное олигомерное соединение, которое образует шпилечную структуру. В некоторых вариантах реализации двухспиральное олигомерное соединение содержит первое и второе олигомерное соединение.

При использовании в настоящем документе, «антисмысловое соединение» означает соединение, содержащее или состоящее из олигонуклеотида, по меньшей мере часть которого комплементарна целевой нуклеиновой кислоте, с которой возможна его гибридизация, что приводит к получению по меньшей мере одной антисмысловой активности.

При использовании в настоящем документе, «антисмысловая активность» означает любое обнаруживаемое и/или измеримое изменение, обусловленное гибридизацией

антисмыслового соединения с его целевой нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах реализации антисмысловая активность включает модулирование количества или активности транскрипта целевой нуклеиновой кислоты (например, мРНК). В некоторых вариантах реализации антисмысловая активность включает модулирование сплайсинга пре-мРНК.

При использовании в настоящем документе, «антисмысловое соединение на основе РНКазы Н» означает антисмысловое соединение, в котором по меньшей мере часть антисмысловой активности антисмыслового соединения обусловлена гибридизацией антисмыслового соединения с целевой нуклеиновой кислотой и последующим расщеплением целевой нуклеиновой кислоты под действием РНКазы Н.

При использовании в настоящем документе, «антисмысловое соединение на основе RISC» означает антисмысловое соединение, в котором по меньшей мере часть антисмысловой активности антисмыслового соединения обусловлена РНК-индуцируемым комплексом сайленсинга (RISC).

При использовании в настоящем документе, «обнаружение» или «измерение» означает, что выполнено испытание или анализ для обнаружения или измерения. Такое обнаружение и/или измерение может приводить к результату с нулевым значением. Следовательно, даже если испытание для обнаружения или измерения приводит к обнаружению отсутствия активности (нулевой активности), то стадия обнаружения или измерения активности была выполнена.

При использовании в настоящем документе, «обнаруживаемая и/или измеримая активность» означает статистически значимую активность, которая не является нулевой.

При использовании в настоящем документе, «по существу не измененный» означает небольшое или отсутствие изменения конкретного параметра, в частности, по сравнению с другим параметром, который изменился гораздо больше. В некоторых вариантах реализации параметр является по существу не измененным, если его изменение составило менее 5% В некоторых вариантах реализации параметр является по существу не измененным, если его изменение составило менее двух раз, тогда как изменение другого параметра составило по меньшей мере десять раз. Например, в некоторых вариантах реализации антисмысловая активность представляет собой изменение количества целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых таких вариантах реализации количество нецелевой нуклеиновой кислоты является по существу не измененным, если оно изменяется гораздо меньше, чем изменяется

количество целевой нуклеиновой кислоты, но это изменение не обязательно должно быть нулевым.

При использовании в настоящем документе, «экспрессия» означает процесс, посредством которого ген в конечном итоге преобразуется в белок. Экспрессия включает, но не ограничивается этим, транскрипцию, пост-транскрипционную модификацию (например, сплайсинг, полиаденилирование, добавление 5'-кэпа) и трансляцию.

При использовании в настоящем документе, «целевая нуклеиновая кислота» означает молекулу нуклеиновой кислоты, с которой предполагается гибридизация антисмыслового соединения с получением желаемой антисмысловой активности. Антисмысловые олигонуклеотиды обладают достаточной комплементарностью с их целевыми нуклеиновыми кислотами для обеспечения гибридизации при физиологических условиях.

При использовании в настоящем документе, «комплементарность азотистого основания» или «комплементарность» в отношении азотистых оснований означает азотистое основание, которое способно к спариванию оснований с другим азотистым основанном. Например, в ДНК аденин (А) комплементарен тимину (Т). Например, в РНК аденин (A) комплементарен урацилу (U). В некоторых вариантах реализации комплементарное азотистое основание означает азотистое основание антисмыслового соединения, которое способно к спариванию оснований с азотистым основанием его целевой нуклеиновой кислоты. Например, если азотистое основание в определенном положении антисмыслового соединения способно к водородному связыванию с азотистым основанием в определенном положении целевой нуклеиновой кислоты, то это положение водородного связывания между олигонуклеотидом и целевой нуклеиновой кислотой считается комплементарным по этой паре азотистых оснований. Азотистые основания, содержащие определенные модификации, могут сохранять способность к спариванию с противоположным азотистым основанием и, следовательно, все еще могут обладать комплементарностью азотистых оснований.

При использовании в настоящем документе, «не комплементарные» в отношении азотистых оснований означает пару азотистых оснований, которые не образуют водородные связи друг с другом.

При использовании в настоящем документе, «комплементарные» в отношении олигомерных соединений (например, связанных нуклеозидов, олигонуклеотидов или

нуклеиновых кислот) означает способность таких олигомерных соединений или их областей к гибридизации с другим олигомерным соединением или его областью за счет комплементарности азотистых оснований. Комплементарные олигомерные соединения не обязательно должны обладать комплементарностью азотистых оснований в каждом нуклеозиде. До не которой степени допустимы некоторые несоответствия. В некоторых вариантах реализации комплементарные олигомерные соединения или области комплементарны по 70% азотистых оснований (комплементарность 70%). В некоторых вариантах реализации комплементарные олигомерные соединения или области комплементарны на 80%. В некоторых вариантах реализации комплементарные олигомерные соединения или области комплементарны на 90%. В некоторых вариантах реализации комплементарные олигомерные соединения или области комплементарны на 95%. В некоторых вариантах реализации комплементарные олигомерные соединения или области комплементарны на 100%.

При использовании в настоящем документе, «несоответствие» означает азотистое основание первого олигомерного соединения, которое не способно спариваться с азотистым основанием в соответствующем положении второго олигомерного соединения при выравнивании первого и второго олигомерного соединения. Любое или оба первое и второе олигомерные соединения могут быть олигонуклеотидами.

При использовании в настоящем документе, «гибридизация» означает спаривание комплементарных олигомерных соединений (например, антисмыслового соединения и его целевой нуклеиновой кислоты). Не ограничиваясь конкретным механизмом, наиболее распространенный механизм спаривания включает водородное связывание, которое может представлять собой уотсон-криковское, хугстиновское или обратное хугстиновское водородное связывание между комплементарными азотистыми основаниями.

При использовании в настоящем документе, «специфически гибридизуется» означает способность олигомерного соединения гибридизоваться с одним сайтом нуклеиновой кислоты с большей аффинностью, чем оно гибридизуется с другим сайтом нуклеиновой кислоты.

При использовании в настоящем документе, «полностью комплементарный» в отношении олигонуклеотида или его части означает, что каждое азотистое основание олигонуклеотида или его части способно к спариванию с азотистым основанием

комплементарной нуклеиновой кислоты или ее непрерывной частью. Следовательно, полностью комплементарная область не содержит несоответствий или не гибридизованных азотистых оснований в обеих спиралях.

При использовании в настоящем документе, «процент комплементарности» означает процент азотистых оснований олигомерного соединения, которые комплементарны равной по длине части целевой нуклеиновой кислоты. Процент комплементарности рассчитывают делением количества азотистых оснований олигомерного соединения, которые комплементарны азотистым основаниям в соответствующих положениях целевой нуклеиновой кислоты, на общую длину олигомерного соединения.

При использовании в настоящем документе, «процент идентичности» означает количество азотистых оснований в первой нуклеиновой кислоте, которые относятся к тому же типу (независимо от химической модификации), что и азотистые основания в соответствующих положениях второй нуклеиновой кислоты, деленное на общее количество азотистых оснований в первой нуклеиновой кислоте.

При использовании в настоящем документе, «модулирование» означает изменение количества или качества молекулы, функции или активности, по сравнению с количеством или качеством молекулы, функции или активности до модулирования. Например, модулирование включает изменение, как увеличение (стимуляцию или индукцию), так и снижение (ингибирование или уменьшение) генной экспрессии. В качестве дополнительного примера, модулирование экспрессии может включать изменение выбора сайта сплайсинга при процессинге пре-мРНК, что приводит к изменению абсолютного или относительного количества определенного сплайс-варианта, по сравнению с его количеством в отсутствие модулирования.

При использовании в настоящем документе, «химический мотив» означает характерный участок химических модификаций в олигонуклеотиде или его области. Мотивы могут быть определены по модификациям в определенных нуклеозидах и/или в определенных связывающих группах олигонуклеотида.

При использовании в настоящем документе, «нуклеозидный мотив» означает характерный участок нуклеозидных модификаций в олигонуклеотиде или его области. Связи такого олигонуклеотида могут быть модифицированными или немодифицированными. Если

не указано иное, мотивы, описывающие в настоящем документе только нуклеозиды, представляют собой нуклеозидные мотивы. Следовательно, в таких случаях связи не ограничены.

При использовании в настоящем документе, «сахарный мотив» означает характерный участок сахарных модификаций в олигонуклеотиде или его области.

При использовании в настоящем документе, «связывающий мотив», означает характерный участок связывающих модификаций в олигонуклеотиде или его области. Нуклеозиды такого олигонуклеотида могут быть модифицированными или немодифицированными. Если не указано иное, мотивы, описывающие в настоящем документе только связи, представляют собой связывающие мотивы. Следовательно, в таких случаях нуклеозиды не ограничены.

При использовании в настоящем документе, «мотив модификации азотистого основания» означает характерный участок модификаций азотистых оснований вдоль олигонуклеотида. Если не указано иное, то мотив модификации азотистого основания не зависит от последовательности азотистых оснований.

При использовании в настоящем документе, «мотив последовательности» означает характерный участок азотистых оснований, расположенных вдоль олигонуклеотида или его части. Если не указано иное, то мотив последовательности не зависит от химических модификаций и, следовательно, может иметь любую комбинацию химических модификация, включая отсутствие химических модификаций.

При использовании в настоящем документе, «тип модификации» в отношении нуклеозида или нуклеозида определенного «типа» означает химическую модификацию нуклеозида и включает модифицированные и немодифицированные нуклеозиды. Соответственно, если не указано иное, «нуклеозид, имеющий модификацию первого типа» может быть немодифицированным нуклеозидом.

При использовании в настоящем документе, «по-разному модифицированные» означает химические модификации или химические заместители, которые отличны друг от друга, включая их отсутствие или модификации. Так, например, МОЕ нуклеозид и немодифицированный нуклеозид ДНК являются «по-разному модифицированными», даже несмотря на то, что нуклеозид ДНК является немодифицированным. Точно так же, ДНК и РНК

являются «по-разному модифицированными», даже несмотря на то, что оба представляют собой природные немодифицированные нуклеозиды. Нуклеозиды, которые являются одинаковыми, но содержат различные азотистые основания, не являются по-разному модифицированными. Например, нуклеозид, содержащий 2'-ОМе модифицированный сахар и немодифицированное адениновое нуклооснование, и нуклеозид, содержащий 2'-ОМе модифицированный сахар и немодифицированное тиминовое азотистое основание, не являются по-разному модифицированными.

При использовании в настоящем документе, «модификации одного типа» относится к модификациям, которые являются одинаковыми друг относительно друга, включая отсутствие модификаций. Так, например, два немодифицированных нуклеозида ДНК имеют «модификацию одного типа», даже несмотря на то, что нуклеозид ДНК является немодифицированным. Такие нуклеозиды, имеющие модификацию одного типа, могут содержать различные азотистые основания.

При использовании в настоящем документе, «отдельные области» означает части олигонуклеотида, в которых химические модификации или мотив химических модификаций любой из соседних частей содержит по меньшей мере одно отличие для обеспечения возможности различать области друг от друга.

При использовании в настоящем документе, «фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель» означает любое вещество, подходящее для использования при введении животному. В некоторых вариантах реализации фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель представляет собой стерильный солевой раствор. В некоторых вариантах реализации такой стерильный солевой раствор представляет собой солевой раствор фармацевтической марки.

При использовании в настоящем документе, термин «метаболическое расстройство» означает заболевание или патологическое состояние, которое характеризуется, прежде всего, дисрегуляцией метаболизма - сложного набора химических реакций, связанных с расщеплением пищи с выработкой энергии.

При использовании в настоящем документе, термин «сердечно-сосудистое расстройство» означает заболевание или патологическое состояние, которое характеризуется, прежде всего, ухудшенной функцией сердца или кровеносных сосудов.

При использовании в настоящем документе, термин «моно- или полициклическая кольцевая система» включает все кольцевые системы, выбранные из одиночных или полициклических радикальных кольцевых систем, в которых указанные кольца конденсированы или связаны, и включает одиночные или смешанные кольцевые системы, индивидуально выбранные из алифатических, алициклических, арильных, гетероарильных, аралкильных, арилалкильных, гетероциклических, гетероарильных, гетероароматических и гетероарилалкильных. Такие моно- и полициклические структуры могут содержать кольца, каждое из которых имеет одинаковую степень насыщенности, или каждое независимо имеет переменные степени насыщенности, включая полностью насыщенные, частично насыщенные или полностью ненасыщенные. Каждое кольцо может содержать кольцевые атомы, выбранные из С, N, О и S с образованием гетероциклических колец, а также колец содержащих только кольцевые атомы С, которые могут быть представлены в смешанном мотиве, как, например, в бензимидазоле, в котором одно кольцо имеет только кольцевые атомы углерода, а конденсированное кольцо имеет два атома азота. Моно- или полициклическая кольцевая система может быть дополнительно замещена группами заместителей, как, например, фталимид, который имеет две группы =O, присоединенные к одному из колец. Моно- или полициклические кольцевые системы могут быть присоединены к исходным молекулам при помощи различных способов, таких как непосредственно через кольцевой атом, путем конденсации через несколько кольцевых атомов, через группу заместителя или через бифункциональный связывающий фрагмент.

При использовании в настоящем документе, «пролекарство» означает неактивную или менее активную форму соединения, которая при введении субъекту метаболизируется с образованием активного или более активного соединения (например, лекарства).

При использовании в настоящем документе, «заместитель» и «группа заместителя» означает атом или группу, которая вытесняет атом или группу указанного исходного соединения. Например, заместитель модифицированного нуклеозида представляет собой любой атом или группу, которая отлична от атома или группы, находящейся в природном нуклеозиде (например, модифицированный 2'-заместитель представляет собой любой атом или группу в 2'-положении нуклеозида, отличную от Н или ОН). Группы заместителей могут быть защищенными или не защищенными. В некоторых вариантах реализации соединения настоящего описания имеют заместители в одном или более чем в одном положении исходного соединения. Заместители также могут быть дополнительно замещены другими

группами заместителей и могут быть присоединены напрямую или через связывающую группу, такую как алкильная или углеводородная группа, к исходному соединению.

Точно так же, при использовании в настоящем документе, «заместитель» в отношении химической функциональной группы означает атом или группу атомов, которая отлична от атома или группы атомов, обычно содержащихся в указанной функциональной группе. В некоторых вариантах реализации заместитель вытесняет атом водорода функциональной группы (например, в некоторых вариантах реализации заместитель замещенной метильной группы представляет собой атом или группу, отличную от водорода, которая вытесняет один или более атомов водорода незамещенной метильной группы). Если не указано иное, группы, которые могут быть использованы в качестве заместителей, включают, без ограничения, галоген, гидроксил, алкил, алкенил, алкинил, ацил (-C(O)R_aa), карбоксил (-C(O)O-R_aa), алифатические группы, алициклические группы, алкокси, замещенный окси (-O-R_aa), арил, аралкил, гетероциклический радикал, гетероарил, гетероарилалкил, амино (-N(R_bb)(R_cc)), имино (=NR_bb), амидо (-C(O)N(R_bb)(R_cc) или -N(R_bb)C(O)R_aa), азидо (-N₃), нитро (-NO₂), циано (-CN), карбамидо (-OC(O)N(R_bb)(R_cc) или -N(R_bb)C(O)OR_aa), уреидо (-N(R_bb)C(O)N(R_bb)(R_cc)), тиоуреидо (-N(R_bb)C(S)N(R_bb)(R_cc)), гуанидинил (-N(R_bb)C(=NR_bb)N(R_bb)(R_cc)), амидинил (-C(=NR_bb)N(R_bb)(R_cc) или -N(R_bb)C(=NR_bb)(R_aa)), тиол (-SR_bb), сульфинил (-S(O)R_bb), сульфонил (-S(O)₂R_bb) и сульфонамидил (-S(O)₂N(R_bb)(R_cc) или -N(R_bb)S(O)₂R_bb). Где каждый R_aa, R_bb и R_cc независимо представляет собой H, необязательно связанную химическую функциональную группу или дополнительную группу заместителя, при этом предпочтительный перечень включает, без ограничения, алкил, алкенил, алкинил, алифатические, алококси, ацил, арил, аралкил, гетероарил, алициклические, гетероциклические и гетероарилалкил. Выбранные заместители с соединениями, описанными в настоящем документе, находятся в рекурсивной степени.

При использовании в настоящем документе, «алкил», используемый в настоящем документе, означает насыщенный прямой или разветвленный углеводородный радикал, содержащий до двадцати четырех атомов углерода. Примеры алкильных групп включают, без ограничения, метил, этил, пропил, бутил, изопропил, н-гексил, октил, децил, додецил и т.п. Алкильные группы обычно содержат от 1 до около 24 атомов углерода, более часто от 1 до около 12 атомов углерода (C₁-C₁₂ алкил), при этом более предпочтительно от 1 до около 6 атомов углерода.

При использовании в настоящем документе, «алкенил» означает прямой или разветвленный углеводородный радикал, содержащий до двадцати четырех атомов углерода и имеющий по меньшей мере одну двойную углерод-углеродную связь. Примеры алкенильных групп включают, без ограничения, этенил, пропенил, бутенил, 1-метил-2-бутен-1-ил, диены, такие как 1,3-бутадиен и т.п. Алкенильные группы обычно содержат от 2 до около 24 атомов углерода, более часто от 2 до около 12 атомов углерода, при этом более предпочтительно от 2 до около 6 атомов углерода. Алкенильные группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать одну или более дополнительных групп заместителей.

При использовании в настоящем документе, «алкинил» означает прямой или разветвленный углеводородный радикал, содержащий до двадцати четырех атомов углерода и имеющий по меньшей мере одну тройную углерод-углеродную связь. Примеры алкинильных групп включают, без ограничения, этинил, 1-пропинил, 1-бутанил и т.п. Алкинильные группы обычно содержат от 2 до около 24 атомов углерода, более часто от 2 до около 12 атомов углерода, при этом более предпочтительно от 2 до около 6 атомов углерода. Алкинильные группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать одну или более дополнительных групп заместителей.

При использовании в настоящем документе, «ацил» означает радикал, образованный путем удаления гидроксильной группы от органической кислоты, и имеет общую формулу -С(O)-Х, где Х обычно является алифатическим, алициклическим или ароматическим. Примеры включают алифатические карбонилы, ароматические карбонилы, алифатические сульфонилы, ароматические сульфинилы, алифатические сульфиннлы, ароматические фосфаты, алифатические фосфаты и т.п. Ацильные группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.

При использовании в настоящем документе, «алициклическая» означает циклическую кольцевую систему, в которой кольцо является алифатическим. Кольцевая система может содержать одно или более колец, при этом по меньшей мере одно кольцо является алифатическим. Предпочтительные алициклические системы включают кольца, имеющие от около 5 до около 9 атомов углерода в кольце. Алициклические группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.

При использовании в настоящем документе, «алифатический» означает прямой или разветвленный углеводородный радикал, содержащий до двадцати четырех атомов углерода, в котором насыщенность между любыми двумя атомами углерода представляет собой одинарную, двойную или тройную связь. Алифатическая группа предпочтительно содержит от 1 до около 24 атомов углерода, более часто от 1 до около 12 атомов углерода, при этом более предпочтительно от 1 до около 6 атомов углерода. Прямая или разветвленная цепь алифатической группы может быть прервана одним или более гетероатомами, которые включают азот, кислород, серу и фосфор. Такие алифатические группы, прерванные гетероатомами, включают, без ограничения, полиалкокси, такие как полиалкиленгликоли, полиамины и полиимины. Алифатические группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.

При использовании в настоящем документе, «алкокси» означает радикал, образованный между алкильной группой и атомом кислорода, при этом атом кислорода используется для присоединения алкокси-группы к исходной молекуле. Примерь; алкокси-групп включают, без ограничения, метокси, этокси, пропокси, изопропокси, н-бутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, н-пентокси, неопентокси, н-гексокси и т.п. Алкокси-группы используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.

При использовании в настоящем документе, «аминоалкил» означает аминозамещенный С₁-С₁₂ алкильный радикал. Алкильная часть указанного радикала образует ковалентную связь с исходной молекулой. Аминогруппа может быть расположена в любом положении, и аминоалкильная группа может быть замещена дополнительной группой заместителя в алкильной и/или амино-части.

При использовании в настоящем документе, «аралкил» и «арилалкил» означает ароматическую группу, которая ковалентно связана с C₁-C₁₂ алкильным радикалом. Часть алкильного радикала образовавшейся аралкильной (или арилалкильной) группы образует ковалентную связь с исходной молекулой. Примеры включают, без ограничения, бензил, фенетил и т.п. Аралкильные группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей, присоединенные к алкильной, арильной или к обеим группам, которые образуют указанную радикальную группу.

При использовании в настоящем документе, «арил» и «ароматический» означает радикалы моно- или полициклической карбоциклической кольцевой системы, имеющие одно или более ароматических колец. Примеры арильных групп включают, без ограничения, фенил, нафтил, тетрагидронафтил, инданил, инденил и т.п. Предпочтительные арильные кольцевые системы имеют от около 5 до около 20 атомов углерода в одном или более кольцах. Арильные группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.

При использовании в настоящем документе, «галоген» означает атом, выбранный из фтора, хлора, брома и йода.

При использовании в настоящем документе, «гетероарил» и «гетероароматический» означает радикал, содержащий моно- или полициклическое ароматическое кольцо, кольцевую систему или конденсированную кольцевую систему, в котором по меньшей мере одно из колец является ароматическим и содержит один или более гетероатомов. Гетероарил включает также конденсированные кольцевые системы, включая системы, в которых одно или более из конденсированных колец не содержат гетероатомов. Гетероарильные группы, как правило, содержат один кольцевой атом, выбранный из серы, азота или кислорода. Примеры гетероарильных групп включают, без ограничения, пиридинил, пиразинил, пиримидинил, пирролил, пиразолил, имидазолил, тиазолил, оксазолил, изооксазолил, тиадиазолил, оксадиазолил, тиофенил, фуранил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, бензоксазолил, хиноксалинил и т.п. Гетероарильные радикалы могут быть присоединены к исходной молекуле напрямую или через связывающий фрагмент, такой как алифатическая группа или гетероатом. Гетероарильные группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.

При использовзании в настоящем документе, «конъюгированное соединение» означает любые атомы, группы атомов или группу связанных атомов, подходящую для применения в качестве конъгирующей группы. В некоторых вариантах реализации конъюгированные соединения могут обладать или влиять на одно или более свойств. включая, но не ограничиваясь этим, свойства фармакодинамики, фармакокинетики, связывания, адсорбции, клеточного распределения, клеточного захвата, заряда и/или выведения.

При использовании в настоящем документе, если не указано или немодифицировано

иным образом, «двухспиральные» относится к двум отдельным олигомерным соединениям, которые гибридизованы друг с другом. Такие двухспиральные соединения могут иметь один или более не гибридизованных нуклеозидов у одного или обоих концов одной или обеих спиралей (выступы) и/или один или более внутреннийх не гибридизованных нуклеозидов (несоответствий), при условии, что существует достаточная комплементарность для сохранения гибридизации при физиологически релевантных условиях.

В. Некоторые соединения

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приведены конъюгированные антисмысловые соединения, содержащие антисмысловые олигонуклеотиды и конъюгат.

а. Некоторые антисмыловые олигонуклеотиды

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приведены антисмысловые олигонуклеотиды. Такие антисмысловые олигонуклеотиды содержат связанные нуклеозиды, и каждый нуклеозид содержит сахарный фрагмент и азотистой основание Структура таких антисмысловых олигонуклеотидов может быть рассмотрела с точки зрения химических особенностей (например, модификаций и характерных участков модификаций) и последовательности азотистых оснований (например, последовательность антисмыслового олигонуклеотида, сущность и последовательность целевой нуклеиновой кислоты).

i. Некоторые химические особенности

В некоторых вариантах реализации антисмысловый олигонуклеотид содержит одну или более модификаций. В некоторых таких вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды содержат один или более модифицированных нуклеозидов и/или модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации модифицированные нуклеозиды содержат модифицированный сахарный фрагмент и/или модифицированное азотистое основание.

1. Некоторые сахарные фрагменты

В некоторых вариантах реализации соединения настоящего описания содержат один или более модифицированных нуклеозидов, содержащих модифицированный сахарный фрагмент. Такие соединения, содержащие один или более модифицированных по сахару нуклеозидов, могут обладать желаемыми свойствами, такими как улучшенная стабильность к нуклеазе или увеличенная связывающая аффинность к целевой нуклеиновой кислоте, по сравнению с олигонуклеотидом, содержащим только нуклеозиды, которые содержат природные сахарные фрагменты. В некоторых вариантах реализации модифицированные сахарные фрагменты представляют собой замещенные сахарные фрагменты. В некоторых вариантах реализации модифицированные сахарные фрагменты представляют собой заменители сахара. Такие заменители сахара могут содержать одно или более замещений, соответствующих замещениям замещенных сахарных фрагментов.

В некоторых вариантах реализации модифицированные сахарные фрагменты представляют собой замещенные сахарные фрагменты, содержащие один или более немостиковых сахарных заместителей, включая, но не ограничиваясь этим, заместители в 2' и/или 5'-положениях. Примеры заместителей сахара, подходящих для 2'-положения, включают, но не ограничиваются ими: 2'-F, 2'-ОСН₃ («ОМе» или «O-метил») и 2'-O(СН₂)₂OCH₃ («МОЕ»). В некоторых вариантах реализации заместитель сахара в 2'-положении выбран из аллила, амино, азидо, тио, O-аллила, O-C₁-С₁₀ алкила, O-C₁-C₁₀ замещенного алкила; OCF₃, O(CH₂)₂SCH₃, O(CH₂)₂-O-N(Rm)(Rn) и O-CH₂-C(=O)-N(Rm)(Rn), где каждый Rm и Rn независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный C₁-С₁₀ алкил. Примеры заместителей сахара в 5'-положении включают, но не ограничиваются ими: 5'-метил (R или S), 5'-винил и 5'-метокси. В некоторых вариантах реализации замещенные сахара содержат более одного немостикового сахарного заместителя, например, 2'-F-5'-метил-сахарные фрагменты (см., например. Международную заявку РСТ WO 2008/101157, где представлены дополнительные 5', 2'-бис-замещенные сахарные фрагменты и нуклеозиды).

Нуклеозиды, содержащие 2'-замещенные сахарные фрагменты, упоминаются как 2'-замещенные нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации 2'-замещенный нуклеозид содержит 2'-группу заместителя, выбранную из галогена, аллила, амино, азидо, SH, CN, OCN, CF₃, OCF₃, О, S или N(R_m)-алкила; О, S или N(R_m)-алкенила; О, S или N(R_m)-алкинила; О-алкиленил-O-алкила, алкинила, алкарила, аралкила, O-алкарила, O-аралкила, O(CH₂)₂SCH₃, O-(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n) или O-CH₂-C(=O)-N(R_m)(R_n), где каждый R_m и R_n

независимо представляет собой Н, аминозащитную группу или замещенный или незамещенный С₁-С₁₀ алкил. Эти 2'-группы заместителей могут быть дополнительно замещены одной или более группами заместителей, независимо выбранными из гидроксила, амино, алкокси, карбокси, бензила, фенила, нитро (NO₂), тиола, тиоалкокси (S-алкила), галогена, алкила, арила, алкенила и алкинила.

В некоторых вариантах реализации 2'-замещенный нуклеозид содержит 2'-группу заместителя, выбранную из F, NH₂, N₃, OCF₃, O-СН₃, О(CH₂)₃NH₂, CH₂-CH=CH₂, O-CH₂-СН=СН₂, OCH₂CH₂OCH₃, O(СН₂)₂SCH₃, O-(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n), O(CH₂)₂O(CH₂)₂N(CH₃)₂ и N-замещенного ацетамида (O-CH₂-C(=O)-N(R_m)(R_n), где каждый R_m и R_n независимо представляет собой Н, аминозащитную группу или замещенный или незамещенный C₁-С₁₀ алкил.

В некоторых вариантах реализации 2'-замещенный нуклеозид содержит сахарный фрагмент, содержащий 2'-группу заместителя, выбранную из F, OCF₃, O-СН₃, OCH₂CH₂OCH₃, O(СН₂)₂SCH₃, O-(СН₂)₂-O-N(СН₃)₂, -O(СН₂)₂O(СН₂)₂N(СН₃)₂ и O-СН₂-С(=O)-N(H)CH₃.

В некоторых вариантах реализации 2'-замещенный нуклеозид содержит сахарный фрагмент, содержащий 2'-группу заместителя, выбранную из F, O-СН₃ и OCH₂CH₂OCH₃.

Некоторые модифицированные сахарные фрагменты содержат мостиковый сахарный заместитель, который образует второе кольцо, что приводит к получению бициклического сахарного фрагмента. В некоторых таких вариантах реализации бициклический сахарный фрагмент содержит мостик между 4' и 2' атомами фуранозного кольца. Примеры таких 4'-2' сахарных заместителей включают, но не ограничиваются ими: -[C(R_a)(R_b)]_n-, -[C(R_a)(R_b)]_n-O-, -C(R_aR_b)-N(R)-O- или -C(R_aR_b)-O-N(R)-; 4'-CH₂-2', 4'-(CH₂)₂-2', 4'-(СН₂)₃-2', 4'-(СН₂)-O-2' (LNA); 4'-(CH₂)-S-2'; 4'-(СН₂)₂-O-2' (ЭНК); 4'-СН(СН₃)-O-2' (cEt) и 4'-CH(CH₂OCH₃)-O-2', и его аналоги (см., например, патент США 7399845, выданный 15 июля 2008 года); 4'-С(СН₃)(СН₃)-O-2' и его аналоги (см., например, WO 2009/006478, опубликованный 8 января 2009 года); 4'-CH₂-N(OCH₃)-2' и его аналоги (см., например, WO 2008/150729, опубликованный 11 декабря 2008 года); 4'-СН₂-O-N(СН₃)-2' (см., например, US 2004/0171570, опубликованный 2 сентября 2004 года); 4'-CH₂-O-N(R)-2' и 4'-CH₂-N(R)-O-2'-, где каждый R независимо представляет собой Н, защитную группу или C₁-C₁₂ алкил; 4'-CH₂-N(R)-O-2', где R представляет собой Н, C₁-C₁₂ алкил или защитную группу (см., например, патент США

7427672, выданный 23 сентября 2008 года); 4'-CH₂-С(Н)(СН₃)-2' (см.. например, Chattopadhyaya, et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); и 4'-CH₂-С(=CH₂)-2' и его аналоги (см. опубликованную Международную заявку РСТ WO 2008/154401, опубликованную 8 декабря 2008 года).

В некоторых вариантах реализации такие мостики 4'-2' независимо содержат от 1 до 4 связанных групп, независимо выбранных из -[C(R_a)(R_b)]_n-, -C(R_a)=C(R_b)-, -C(R_a)=N-, -C(=NR_a)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R_a)₂-, -S(=O)_x- и -N(R_a)-;

где:

x равен 0, 1 или 2;

n равен 1, 2, 3 или 4;

каждый R_a и R_b независимо представляет собой Н, защитную группу, гндооксил, C₁-C₁₂ алкил, замещенный C₁-C₁₂ алкил, C₂-C₁₂ алкенил, замещенный C₂-C₁₂ алкенил, С₂-С₁₂ алкинил, замещенный C₂-C₁₂ алкинил, С₅-С₂₀ арил, замещенный C₅-C₂₀ арил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, C₅-C₇ алициклический радикал, замещенный C₅-C₇ алициклический радикал, галоген, OJ₁, NJ₁J₂, SJ₁, N₃, COOJ₁, ацил (С(=O)-Н), замещенный ацил, CN, сульфонил (S(=O)₂-J₁) или сульфоксил (S(=O)-J₁); и

каждый J₁ и J₂ независимо представляет собой Н, C₁-C₁₂ алкил, замещенный C₁-C₁₂ алкил, C₂-C₁₂ алкенил, замещенный C₂-C₁₂ алкенил, C₂-C₁₂ алкинил, замещенный C₂-C₁₂ алкинил, С₅-С₂₀ арил, замещенный C₅-C₂₀ арил, ацил (С(=O)-Н), замещенный ацил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, C₁-C₁₂ аминоалкип, замещенный C₁-C₁₂ аминоалкил или защитную группу.

Нуклеозиды, содержащие бициклические сахарные фрагменты, упоминаются как бициклические нуклеозиды или BNA. Бициклические нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, (А) α-L-метиленокси (4'-CH₂-O-2') BNA, (В) β-D-метиленокси (4'-CH₂-O-2') BNA (также упоминаемый как закрытая нуклеиновая кислота или LNA), (С) этиленокси (4'-(CH₂)₂-O-2') BNA, (D) аминоокси (4'-CH₂-O-N(R)-2') BNA, (Е) оксиамино (4'-CH₂-N(R)-O-2') BNA, (F) метил(метиленокси) (4'-СН(СН₃)-O-2') BNA (также упоминаемый как стерически затрудненный этил или cEt), (G) метилентио (4'-CH₂-S-2') BNA, (Н) метиленамино (4'-CH₂-N(R)-2') BNA, (I) метилкарбоциклический (4'-CH₂-СН(СН₃)-2') BNA и (J) пропиленкарбоциклический (4'-(CH₂)₃-2') BNA, как показано ниже.

где Вх представляет собой фрагмент азотистого основания, a R независимо представляет собой Н, защитную группу или C₁-C₁₂ алкил.

В данной области техники известны дополнительные бициклические сахарные фрагменты, например: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 129(26) 8362-8379 (4 июля 2007 года); Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; патенты США №7053207 6268490 6770748 6794499 7034133 6525191 6670461 и 7399845; WO 2004/106356, WO 1994/14226, WO 2005/021570 и WO 2007/134181; публикации патентов США № US 2004/0171570, US 2007/0287831 и US 2008/0039618; патенты США с серийными номерами 12/129154 60/989574 61/026995 61/026998 61/056564 61/086231 61/097787 и 61/099844; и Международные заявки РСТ № PCT/US2008/064591, PCT/US2008/066154 и PCT/US2008/068922.

В некоторых вариантах реализации бициклические сахарные фрагменты и

нуклеозиды, содержащие такие бициклические сахарные фрагменты, дополнительно определяют по изомерной конфигурации. Например, нуклеозид, содержащий мостик 4'-2'-метилен-окси, может быть в α-L конфигурации или в β-D конфигурации. Ранее α-L-метиленокси (4'-СН₂-O-2') бициклические нуклеозиды были внедрены в антисмыеловые олигонуклеотиды, которые обладают антисмысловой активностью (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).

В некоторых вариантах реализации замещенные сахарные фрагменты содержат один или более немостиковых сахарных заместителей и один или более мостиковых сахарных заместителей (например, 5'-замещенные и 4'-2'-мостиковые сахара), (см., например, Международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 11/22/07, в которой LNA замещена, например, 5'-метильной или 5'-виниловой группой).

В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные сахарные фрагменты представляют собой заменители сахара. В некоторых таких вариантах реализации атом кислорода природного сахара является замещенным, например, атомом серы, углерода или азота. В некоторых таких вариантах реализации такой модифицированый сахарный фрагмент содержит также мостиковые и/или немостиковые заместители, как описано выше. Например, некоторые заменители сахара содержат 4'-атом серы и замещение в 2'-положении (см., например, опубликованную патентную заявку США US 2005/0130923, опубликованную 16 июня 2005 года) и/или 5'-положении. В качестве дополнительного примера, были описаны карбоциклические бициклические нуклеозиды, имеющие мостик 4'-2' (см., например, Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 и Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 77, 7731-7740).

В некоторых вариантах реализации заменители сахара содержат кольца, имеющие не 5 атомов. Например, в некоторых вариантах реализации заменитель сахара содержит морфолино. Морфолино-соединения и их применение в олигомерных соединениях было описано в многочисленных патентах и опубликованных статьях (см., например: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; и патенты США 5698685; 5166315; 5185444; и 5034506). При использовании в настоящем документе, термин «морфолино» означает заменитель сахара, имеющий следующую структуру:

.

В некоторых вариантах реализации морфолино могут быть модифицированными, например, добавлением или изменением различных групп заместителей в представленной выше структуре морфолино. Такие заменители сахара упомянуты в настоящем документе как «модифицированные морфолино».

В качестве другого примера, в некоторых вариантах реализации заменитель сахара содержит шестичленный тетрагидропиран. Такие тетрагидропираны могут быть дополнительно модифицированы или замещены. Нуклеозиды, содержащие такие модифицированные тетрагидропираны, включают, но не ограничиваются ими, гекситоловую нуклеиновую кислоту (HNA), анитоловую нуклеиновую кислоту (ANA), манитоловую нуклеиновую кислоту (MNA) (см. Leumann, CJ. Bioorg. & Med. Chem. (2002) 10: 841-854), фтор-HNA (F-HNA) и соединения, имеющие Формулу VI:

где независимо для каждого из указанного по меньшей мере одного тетрагидропиранового нуклеозидного аналога Формулы VI:

Вх представляет собой фрагмент азотистого основания;

Т₃ и Т₄, каждый независимо, представляют собой межнуклеозидную связывающую группу, связывающую тетрагидропирановый нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением, или один из Т₃ и Т₄ представляет собой межнуклеозидную связывающую группу, связывающую тетрагидропирановый нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением, а другой из Т₃ и Т₄ представляет собой Н, гидроксил-защитную группу, связанную конъгирующую группу или 5' или 3'-концевую группу;

q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇, каждый независимо, представляют собой Н, C₁-С₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил, С₂-С₆ алкенил, замещенный С₂-С₆ алкенил, C₂-С₆ алкинил или

замещенный С₂-С₆ алкинил; и

каждый из R₁ и R₂ независимо выбран из: водорода, галогена, замещенного или незамещенного алкокси, NJ₁J₂, SJ₁, N₃, OC(=X)J₁, OC(=X)NJ₁J₂, NJ₃C(=X)NJ₁J₂ и CN, где Х представляет собой О, S или NJ₁, и каждый J₁, J₂ и J₃ независимо представляет собой H или C₁-С₆ алкил.

В некоторых вариантах реализации представлены модифицированные ТНР нуклеозиды Формулы VI, в которых каждый q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇ представляет собой Н. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇ отличен от Н. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇ представляет собой метил. В некоторых вариантах реализации представлены ТНР нуклеозиды Формулы VI, в которых один из R₁ и R₂ представляет собой F. В некоторых вариантах реализации R₁ представляет собой фтор, a R₂ представляет собой Н, R₁ представляет собой метокси, a R₂ представляет собой Н, и R₁ представляет собой метоксиэтокси, а R₂ представляет собой Н.

В данной области техники известны также мноие другие бициклические и трициклические кольцевые системы заменителей сахара, которые могут быть использованы для модификации нуклеозидов для внедрения в антисмысловые соединеия (см.; например, обзорную статью: Leumann, J. С, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854).

Без ограничения, представлены также комбинации модификаций, такие как 2'-F-5'-метил-замещенные нуклеозиды (см. Международную заявку РСТ WO 2008/101157, опубликованную 8/21/08, где описаны другие 5', 2'-бис-замещенные нуклеозиды) и замена атома кислорода рибозильного кольца на S и дополнительное замещение в 2'-положении (см. опубликованную заявку на патент США US 2005-0130923, опубликованную 16 июня 2005 года) или, альтернативно, 5'-замещение бициклической нуклеиновой кислоты (см. Международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 11/22/07, в которой 4'-СН₂-O-2' бициклический нуклеозид дополнительно замещен в 5'-положении 5'-метильной или 5'-виниловой группой). Был описан также синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов вместе с их олигомеризацией и биохимическими исследованиями (см., например, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).

В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены олигонуклеотиды, содержащие модифицированные нуклеозиды. Такие модифицированные нуклеотиды могут

содержать модифицированные сахара, модифицированные азотистые основания и/или модифицированные связи. Конкретные модификации выбирают так, чтобы полученные олигонуклеотиды обладали желаемыми характеристиками. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды содержат один или более РНК-подобных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды содержат один или более ДНК-подобных нуклеотидов.

2. Некоторые модификации азотистых оснований

В некоторых вариантах реализации нуклеозиды настоящего описания содержат одно или более немодифицированных азотистых оснований. В некоторых вариантах реализации нуклеозиды настоящего описания содержат одно или более модифицированных азотистых оснований.

В некоторых вариантах реализации модифицированные азотистые основания выбраны из: универсальных оснований, гидрофобных оснований, смещанных оснований, увеличенных в размере оснований и фторированных оснований, описанных в настоящем документе. 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6-замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил; 5-пропинилцитозин; 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил,, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинил (-С≡С-СН₃) урацил и цитозин и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований; 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-F-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, 2-деазагуанин и 3-деазааденин, универсальные основания, гидрофобные основания, смешанные основания, увеличенные в размере основания и фторированные основания, описанные в настоящем документе. Допонительные модифицированные азотистые основания включают трициклические пиримидины, такие как феноксазина цитидин ([5,4-b][1,4]бензоксазин-2(3Н)-он), фенотиазина цитидин (1Н-пиримидо[5,4-b][1,4]бензотиазин-2(3Н)-он), так называемые G-clamp, такие как замещенный феноксазина цитидин (например, 9-(2-аминоэтокси)-Н-пиримидо[5,4-b][1,4]бензоксазин-2(3Н)-он), карбазола цитидин (2Н-пиримидо[4,5-b]индол-2-он), пиридоиндола цитидин (Н-

пиридо[3',2':4,5]пирроло[2,3-d]пиримидин-2-он). Модифицированные азотистые основания также могут включать азотистые основания, в которых пуриновое или пиримидиновое основание заменено другими гетероциклами, например, 7-деаза-аденин, 7-деазагуанозин, 2-аминопиридин и 2-пиридон. Дополнительные азотистые основания включают азотистые основания, описанные в патенте США №3687808, описанные в публикации The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J.I., ред., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; описанные авторами Englisch et al., Angewandte Chemie, Международное издание, 1991, 30, 613; и описанные в публикации Sanghvi, Y.S., глава 15, Anfisense Research and Applications, Crooke, S.T. и Lebleu, В., ред., CRC Press, 1993, 273-288.

Типичные патенты США, в которых описано получение некоторых из вышеупомянутых модифицированных азотистых оснований, а также других модифицированных азотистых оснований, включают, без ограничения, U.S. 3687808; 4845205; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121; 5596091; 5614617; 5645985; 5681941; 5750692; 5763588; 5830653 и 6005096, некоторые из которых находятся на рассмотрении одновременно с настоящей заявкой, и каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

3. Некоторые межнуклеозидные связи

В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведеныолигонуклеотиды, содержащие связанные нуклеозиды. В таких вариантах реализации нуклеозиды могут быть связаны вместе при помощи любой межнуклеозидной связи. Два основных класса межнуклеозидных связывающих групп определяются по наличию или отсутствию атома фосфора. Иллюстративные фосфорсодержащие межнуклеозидные связи включают, но не ограничиваются ими, фосфодиэфиры (РО), фосфотриэфиры, метилфосфонаты, фосфорамидаты и тиофосфаты (PS). Иллюстративные не содержащие фосфора межнуклеозидные связывающие группы включают, но не ограничиваются ими, метиленметилимино (-СН₂-N(СН₃)-O-СН₂-), тиодиэфир (-O-C(O)-S-), тионокарбамат (-O-C(O)(NH)-S-); силоксан (-O-Si(H)₂-O-); и N,N'-диметилгидразин (-СН₂-N(СН₃)-N(СН₃)-). Модифицированные связи, в сравнении с природными фосфодиэфирными связями, могут быть использованы для изменения, обычно увеличения устойчивости олигонуклеотида к нуклеазе. В некоторых вариантах реализации межнуклеозидные связи, имеющие хиральный атом, могут быть получены в виде рацемической смеси или в виде отдельных энантиомеров. Иллюстративные хиральные связи включают, но не

ограничиваются ими, алкилфосфонаты и тиофосфаты. Способы получения фосфорсодержащих и не содержащих фосфора межнуклеозидных связей хорошо известны специалистам в данной области техники.

Олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, содержат один или более асимметричных центров и, следовательно, могут образовывать энантиомеры, диастереомеры и другие стереоизомерные конфигурации, которые в соответствии с абсолютной стереохимией могут быть определены как (R) или (S), как для аномеров сахара, и ни как (D) или (L), как для аминокислот и т.д. В антисмысловые соединения, представленные в настоящем документе, включены все такие возможные изомеры, а также их рацемические и оптически чистые формы.

Нейтральные связывающие линкеры включают, без ограничения, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, MMI (3'-СН₂-N(СН₃)-O-5'), амид-3 (3'-CH₂-C(=O)-N(H)-5'), амид-4 (3'-СН₂-N(Н)-С(=O)-5'), формацеталь (3'-O-СН₂-O-5') и тиоформацеталь (3'-S-CH₂-O-5'). Дополнительные нейтральные межнуклеозидные связи включают неионные связи, содержащие силоксан (диалкилсилоксан), карбоксильный сложный эфир, карбоксамид, сульфид, сульфоновый сложный эфир и амиды (см., например: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi и P.D. Cook, ред., ACS Symposium Series 580; главы 3 и 4, 40-65). Дополнительные нейтральные межнуклеозидные связи включают неионные связи, содержащие смешанные составные части N, О, S и СН₂.

4. Некоторые мотивы

В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды содержат один или более модифицированных нуклеозидов (например, нуклеозид, содержащий модифицированный сахар и/или модифицированное азотистое основание) и/или один или более модифицированных межнуклеозидных связей. Характерный участок таких модификаций в олигонуклеотиде упоминается в настоящем документе как мотив. В некоторых вариантах реализации мотивы сахара, азотистые основания и линкера не зависят друг от друга.

а. Некоторые сахарные мотивы

В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды содержат один или более типов модифицированных сахарных фрагментов и/или природных сахарных фрагментов, расположенных вдоль олигонуклеотида или его области определенным образом или в виде

мотива сахарной модификации. Такие мотивы могут содержать любые сахарные модификации, рассмотренные в настоящем документе и/или другие известные модификации сахара.

В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды содержат или состоят из области, имеющей сахарный мотив гэпмера, который содержит две внешних области или «крыла» и центральную или внутреннюю область, или «гэп». Эти три области сахарного мотива гэпмера (5'-крыло, гэп и 3'-крыло) образуют непрерывную последовательность азотистых оснований, в которой по меньшей мере некоторые из сахарных фрагментов нуклеозидов в каждом крыле отличаются по меньшей мере от некоторых сахарных фрагментов нуклеозидов в гэпе. В частности, по меньшей мере те сахарные фрагменты нуклеозидов каждого крыла, которые расположены ближе всего к гэпу (3'-ближайший нуклеозид 5'-крыла и 5'-ближайший нуклеозид 3'-крыла), отличаются от сахарного фрагмента соседних нуклеозидов в гэпе, определяя таким образом границу между крыльями и гэпом. В некоторых вариантах реализации сахарные фрагменты в гэпе являются одинаковыми между собой. В некоторых вариантах реализации гэп содержит один или более нуклеозидов, имеющих сахарный фрагмент, который отличается от сахарного фрагмента одного или более других нуклеозидов в гэпе. В некоторых вариантах реализации сахарные мотивы двух крыльев являются одинаковыми между собой (симметричный сахарный гэпмер). В некоторых вариантах реализации сахарные мотивы 5'-крыла отличаются от сахарного мотива 3'-крыла (асимметричный сахарный гэпмер).

i. Некоторые 5'-крылья

В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 1-8 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 1-7 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 1-6 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 1-5 Связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 2-5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 3-5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 4 или 5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 1-4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 1-3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 1 или 2 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит

из 2-4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 2 или 3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 3 или 4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 1 нуклеозида. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 2 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера состоит из 6 связанных нуклеозидов.

В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере два бициклических нуклеозида. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере три бициклических нуклеозида. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере четыре бициклических нуклеозида. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой бициклический нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой стерически затрудненный этил-нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой LNA нуклеозид.

В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один 2'-МОЕ нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один 2'-ОМе нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой 2'-МОЕ нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой 2'-ОМе нуклеозид.

В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один рибонуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой рибонуклеозид. В некоторых вариантах реализации один, более одного или каждый из нуклеозидов 5'-крыла представляет собой РНК-подобный нуклеозид.

В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2'-МОЕ нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2'-ОМе нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.

В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один 2'-МОЕ нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один 2'-ОМе нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.

ii. Некоторые 3'-крылья

В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 1-8 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 1-7 связанных

нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 1-6 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 1-5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 2-5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 3-5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 4 или 5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 1-4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 1-3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 1 или 2 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 2-4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 2 или 3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 3 или 4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 1 нуклеозида. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 2 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера состоит из 6 связанных нуклеозидов.

В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой бициклический нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой стерически затрудненный этил-нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой LNA нуклеозид.

В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере два не бициклических модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере три не бициклических модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах реализации

3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере четыре не бициклических модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один 2'-МОЕ нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один 2'-ОМе нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой 2'-МОЕ нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой 2'-ОМе нуклеозид.

В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один рибонуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой рибонуклеозид. В некоторых вариантах реализации один, более одного или каждый из нуклеозидов 5'-крыла представляет собой РНК-подобный нуклеозид.

В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2'-МОЕ нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2'-ОМе нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.

В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера

содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один 2'-МОЕ нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один 2'-ОМе нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.

В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид и по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид и по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид и по меньшей мере один 2'-МОЕ нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид и по меньшей мере один 2'-ОМе нуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.

В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид, по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид, по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид, по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.

В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид, по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид, по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых

вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид, по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.

В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид, по меньшей мере один 2'-МОЕ нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид, по меньшей мере один 2'-МОЕ нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид, по меньшей мере один 2'-МОЕ нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.

В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид, по меньшей мере один 2'-ОМе нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид, по меньшей мере один 2'-ОМе нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид, по меньшей мере один 2'-ОМе нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.

iii. Некоторые центральные области (гэпы)

В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 6-20 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 6-15 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 6-12 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 6-10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 6-9 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 6-8 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 6 или 7 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 7-10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 7-9 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 7 или 8 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 8-10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 8 или 9 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 6 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 7 связанных

нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 8 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 9 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 11 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп гэпмера состоит из 12 связанных нуклеозидов.

В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид гэпа гэпмера представляет собой 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации гэп содержит один или более модифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид гэпа гэпмера представляет собой 2'-дезоксинуклеозид или представляет собой модифицированный «ДНК-подобный» нуклеозид. В таких вариантах реализации «ДНК-подобный» означает, что нуклеозид имеет такие же характеристики, что и ДНК, то есть что дуплекс, содержащий гэпмер и молекулу РНК может активировать РНКазу Н. Например, было показано, что при некоторых условиях 2'-(ara)-F поддерживает активацию РНКазы Н и, следовательно, является ДНК-подобным. В некоторых вариантах реализации один или более нуклеозидов гэпа гэпмера не представляет собой 2'-дезоксинуклеозид и не является ДНК-подобным. В некоторых таких вариантах реализации гэпмер тем не менее поддерживает активацию РНКазы Н (например, за счет количества или положения не-ДНК нуклеозидов).

В некоторых вариантах реализации гэпы содержат участок немодифицированного 2'-дезоксинуклеозида, прерванный одним или более модифицированными нуклеозидами, что приводит к образованию трех субрайонов (двух участков одного или более 2'-дезоксинуклеозидов и участка одного или более прерывающих модифицированных нуклеозидов). В некоторых вариантах реализации ни один участок немодифицированных 2'-дезоксинуклеозидов не длиннее 5, 6 или 7 нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации такие короткие участки образуются путем использования коротких гэп-областей. В некоторых вариантах реализации короткие участки образуются путем прерывания более длинной области гэп.

В некоторых вариантах реализации гэп содержит один или более модифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп содержит один или более модифицированных нуклеозидов, выбранных из cEt, FHNA, LNA и 2-тиотимидина. В некоторых вариантах реализации гэп содержит один модифицированный нуклеозид. В

некоторых вариантах реализации гэп содержит 5'-замещенный сахарный фрагмент, выбранный из 5'-Ме и 5'-(R)-Me. В некоторых вариантах реализации гэп содержит два. модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах реализации гэп содержит три модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах реализации гэп содержит четыре модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах реализации гэп содержит два или более модифицированных нуклеозидов, и каждый модифицированный нуклеозид является таким же. В некоторых вариантах реализации гэп содержит два или более модифицированных нуклеозидов, и каждый модифицированный нуклеозид является другим.

В некоторых вариантах реализации гэп содержит одну или более модифицированных связей. В некоторых вариантах реализации гэп содержит одну или более метилфосфонатных связей. В некоторых вариантах реализации гэп содержит две или более модифицированных связей. В некоторых вариантах реализации гэп содержит одну или более модифицированных связей и один или более модифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации гэп содержит одну модифицированную связь и один модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации гэп содержит две модифицированных связи и два или более модифицированных нуклеозидов.

b. Некоторые мотивы межнуклеозидных связей

В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды содержат модифицированные межнуклеозидные связи, расположенные вдоль олигонуклеотида или его области определенным образом или в виде мотива модифицированной межнуклеозидной связи. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды содержат область, имеющую мотив чередующихся межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды по настоящему описанию содержат область одинаково модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых таких вариантах реализации олигонуклеотид содержит область, которая равномерно связана тиофосфатными межнуклеозидными связями. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид равномерно связан тиофосфатными межнулеозидными связями. В некоторых вариантах реализации каждая межнуклеозидная связь олигонуклеотида выбран из фосфодиэфира и тиофосфата. В некоторых вариантах реализации каждая межнуклеозидная связь олигонуклеотида выбран из фосфодиэфира и тиофосфата, и по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфат.

В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере 6 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере 7 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере 9 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере 10 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере 11 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере 12 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере 13 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере 14 тиофосфатных межнуклеозидных связей.

В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 6 последовательных тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 7 последовательных тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 8 последовательных тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 9 последовательных тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 10 последовательных тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 12 последовательных тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых таких вариантах реализации по меньшей мере один такой блок расположен на 3'-конце олигонуклеотида В некоторых таких вариантах реализации по меньшей мере один такой блок расположен в пределах 3 нуклеозидов 3'-конца олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит менее 15 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит менее 14 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит менее 13 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид

содержит менее 12 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит менее 11 тиофосфатных межнуклеозидных связен. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит менее 10 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит менее 9 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит менее 8 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит менее 7 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит менее 6 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит менее 5 тиофосфатных межнуклеозидных связей.

с. Некоторые мотивы модификаций азотистых оснований

В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды содержат химические модификации азотистых оснований, расположенные вдоль олигонуклеотида или его области определенным образом или в виде мотива модификации азотистых оснований. В некоторых таких вариантах реализации модификации азотистых оснований расположены в разорванном мотиве. В некоторых вариантах реализации модификации азотистых оснований расположены в чередующемся мотиве. В некоторых вариантах реализации каждое азотистое основание является модифицированным. В некоторых вариантах реализации ни одно из азотистых оснований не является химически модифицированным.

В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды содержат блок модифицированных азотистых оснований. В некоторых таких вариантах реализации блок находится на 3'-конце олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации блок находится в пределах 3 нуклеотидов 3'-конца олигонуклеотида. В некоторых таких вариантах реализации блок находится на 5'-конце олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации блок находится в пределах 3 нуклеотидов 5'-конца олигонуклеотида.

В некоторых вариантах реализации модификации азотистых оснований зависят от природного основания в конкретном положении олигонуклеотида. Например, в некоторых вариантах реализации каждый пурин или каждый пиримидин в олигонуклеотиде является модифицированным. В некоторых вариантах реализации модифицированным является каждый аденин. В некоторых вариантах реализации модифицированным является каждый гуанин. В некоторых вариантах реализации модифицированным является каждый тимин. В

некоторых вариантах реализации модифицированным является каждый цитозин. В некоторых вариантах реализации модифицированным является каждый урацил.

В некоторых вариантах реализации некоторые, все или никакие из цитозиновых фрагментов в олигонуклеотиде не представляют собой 5-метилцитозиновые фрагменты, В настоящем документе 5-метилцитозин не является «модифицированным азотистым основанием». Соответственно, если не указано иное, то немодифицированные азотистые основания включают как цитозиновые остатки, содержащие 5-метил, так и те, которые не содержат 5-метил. В некоторых вариантах реализации оговорено состояние метилирования всех или некоторых цитозиновых азотистых оснований.

В некоторых вариантах реализации химические модификации азотистых оснований включают присоединение некоторых конъюгирующих групп к азотистым основаниям. В некоторых вариантах реализации каждый пурин или каждый пиримидин в олигонуклеотиде может быть необязательно модифицирован так, чтобы он содержал конъгирующую группу.

d. Некоторые общие длины

В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведеныолигонуклеотиды любого из различных диапазонов длин. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды содержат от Х до Y связанных нуклеозидов, где Х представляет собой наименьшее количество нуклеозидов в диапазоне, а Y представляет собой наибольшее количество нуклеозидов в диапазоне. В некоторых таких вариантах реализации каждый Х и Y независимо выбран из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 и 50; при условии, что X≤Y. Например, в некоторых вариантах реализации олигонуклеотид может состоять из 8-9, 8-10, 8-11, 8-12, 8-13, 8-14, 8-15, 8-16, 8-17, 8-18, 8-19, 8-20, 8-21, 8-22, 8-23, 8-24, 8-25, 8-26, 8-27, 8-28, 8-29, 8-30. 9-10, 9-11, 9-12, 9-13, 9-14, 9-15, 9-16, 9-17, 9-18, 9-19, 9-20, 9-21, 9-22, 9-23, 9-24, 9-25, 9-26, 9-27, 9-28, 9-29, 9-30, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, 10-16, 10-17, 10-18, 10-19, 10-20, 10-21, 10-22, 10-23, 10-24, 10-25, 10-26, 10-27, 10-28, 10-29, 10-30, 11-12, 11-13, 11-14, 11-15, 11-16, 11-17, 11-18, 11-19, 11-20, 11-21, 11-22, 11-23, 11-24, 11-25, 11-26, 11-27, 11-28, 11-29, 11-30, 12-13, 12-14, 12-15, 12-16, 12-17, 12-18, 12-19, 12-20, 12-21, 12-22, 12-23, 12-24, 12-25, 12-26, 12-27, 12-28, 12-29, 12-30, 13-14, 13-15, 13-16, 13-17, 13-18, 13-19, 13-20, 13-21, 13-22, 13-23, 13-24, 13-25, 13-26, 13-27, 13-28, 13-29, 13-30, 14-15, 14-16, 14-17, 14-18,

14-19, 14-20, 14-21, 14-22, 14-23, 14-24, 14-25, 14-26, 14-27, 14-28, 14-29, 14-30, 15-16, 15-17, 15-18, 15-19, 15-20, 15-21, 15-22, 15-23, 15-24, 15-25, 15-26, 15-27, 15-28, 15-29, 15-30, 16-17, 16-18, 16-19, 16-20, 16-21, 16-22, 16-23, 16-24, 16-25, 16-26, 16-27, 16-28, 16-29, 16-30, 17-18, 17-19, 17-20, 17-21, 17-22, 17-23, 17-24, 17-25, 17-26, 17-27, 17-28, 17-29, 17-30, 18-19, 18-20, 18-21, 18-22, 18-23, 18-24, 18-25, 18-26, 18-27, 18-28, 18-29, 18-30, 19-20, 19-21, 19-22, 19-23, 19-24, 19-25, 19-26, 19-29, 19-28, 19-29, 19-30, 20-21, 20-22, 20-23, 20-24, 20-25, 20-26, 20-27, 20-28, 20-29, 20-30, 21-22, 21-23, 21-24, 21-25, 21-26, 21-27, 21-28, 21-29, 21-30, 22-23, 22-24, 22-25, 22-26, 22-27, 22-28, 22-29, 22-30, 23-24, 23-25, 23-26, 23-27, 23-28, 23-29, 23-30, 24-25, 24-26, 24-27, 24-28, 24-29, 24-30, 25-26, 25-27, 25-28, 25-29, 25-30, 26-27, 26-28, 26-29, 26-30, 27-28, 27-29, 27-30, 28-29, 28-30 или 29-30 связанных нуклеозидов. В тех вариантах реализации, в которых количество нуклеозидов в олигонуклеотиде соединения является ограниченным, либо до диапазона, либо до определенного числа, то соединение может, тем не менее, дополнительно содержать другие дополнительные заместители. Например, олигонуклеотид, содержащий 8-30 нуклеозидов, исключает олигонуклеотиды, имеющие 31 нуклеозид, но, если не указано иное, такой олигонуклеотид может дополнительно содержать, например, одну или более конъюгирующих групп, концевых групп или других заместителей.

Более того, если олигонуклеотид описан общим диапазоном длины и областями, имеющими определенную длину, и если сумма указанных длин областей меньше, чем верхняя граница диапазона общей длины, то олигонуклеотид может иметь дополнительные нуклеозиды, помимо тех, которые находятся в указанных областях, при условии, что общее количество нуклеозидов не превышает верхнюю границу диапазона общей длины.

5. Некоторые химические мотивы антисмысловых олигонуклеотидов

В некоторых вариантах реализации химические структурные особенности антисмысловых олигонуклеотидов описываются их сахарным мотивом, мотивом межнуклеозидной связи, мотивом модификации азотистого основания и общей длиной. В некоторых вариантах реализации такие параметры не зависят друг от друга. Так, каждая межнуклеозидная связь олигонуклеотида, имеющий сахарный мотив гэпмера, может быть модифицированным или немодифицированным и может повторять или не повторять характер модификации сахарных модификаций гэпмера. Следовательно, межнуклеозидные связи в областях крыльев сахара-гэпмера могут быть одинаковыми или отличными друг от

друга и могут быть одинаковыми или отличными от межнуклеозидных связей области гэп. Точно так же, такие сахар-гэпмерные олигонуклеотиды могут содержать одно или более модифицированных азотистых оснований, независимо от характера сахарных модификаций гэпмера. Специалистам в данной области техники понятно, что такие мотивы могут быть комбинированы с получением множества олигонуклеотидов.

В некоторых вариантах реализации выбор межнуклеозидной связи и модификации нуклеозида не зависят друг от друга.

i. Некоторые последовательности и мишени

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приведены антисмысловые олигонуклеотиды, имеющие последовательность, комплементарную целевой нуклеиновой кислоте. Такие антисмысловые соединения могут гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой с получением по меньшей мере одной антисмысловой активности. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения специфически гибридизуются с одной или более целевыми нуклеиновыми кислотами. В некоторых вариантах реализации специфически гибридизующееся антисмысловое соединение имеет последовательность азотистых оснований, содержащую область с достаточной комплементарностью с целевой нуклеиновой кислотой для обеспечения возможности гибридизации и получению антисмысловой активности, и недостаточной комплементарностью любой нецелевой нуклеиновой кислоте для предотвращения или снижения неспецифической гибридизации с последовательностями нецелевых нуклеиновых кислот в условиях, в которых необходима специфическая гибридизация (например, в физиологических условиях для in vivo или терапевтических применений и в условиях выполнения анализов - в случае in vitro анализов). В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды являются селективными между мишенью и не мишенью, даже если мишень и не мишень содержат целевую последовательность. В таких вариантах реализации селективность может быть результатом относительной доступности целевой области одной молекулы нуклеиновой кислоты, по сравнению с другой.

В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведеныантисмысловые соединения, содержащие олигонуклеотиды, которые полностью комплементарны целевой нуклеиновой кислоте по всей длине олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды на 99% комплементарны целевой нуклеиновой кислоте. В некоторых

вариантах реализации олигонуклеотиды на 95% комплементарны целевой нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации такие олигонуклеотиды на 90% комплементарны целевой нуклеиновой кислоте.

В некоторых вариантах реализации такие олигонуклеотиды на 85% комплементарны целевой нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации такие олигонуклеотиды на 80% комплементарны целевой нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение содержит область, которая полностью комплементарна целевой нуклеиновой кислоте, и по меньшей мере на 80% комплементарно целевой нуклеиновой кислоте по всей длине олигонуклеотида. В некоторых таких вариантах реализации область полной комплементарности имеет от 6 до 14 нуклеозидов в длину.

В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды содержат область гибридизации и концевую область. В некоторых таких вариантах реализации область гибридизации состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и полностью комплементарна целевой нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации область гибридизации содержит одно несоответствие в сравнении с целевой нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах реализации область гибридизации содержит два несоответствия в сравнении с целевой нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах реализации область гибридизации содержит три несоответствия в сравнении с целевой нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах реализации концевая область состоит из 1-4 концевых нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации концевые нуклеозиды находятся на 3'-конце. В некоторых вариантах реализации один или более концевых нуклеозидов не комплементарны целевой нуклеиновой кислоте.

Антисмысловые механизмы включают любой механизм, затрагивающий гибридизацию олигонуклеотида с целевой нуклеиновой кислотой, при этом гибридизация приводит к биологическому эффекту. В некоторых вариантах реализации такая гибридизация приводит либо к разрушению, либо к применению целевой нуклеиновой кислоты 'с сопутствующим подавлением или стимулированием клеточного механизма, затрагивающего, например, трансляцию, транскрипцию или сплайсинг целевой нуклеиновой кислоты.

Один из типов антисмыслового механизма, затрагивающий разрушение целевой РНК представляет собой антисмысл, опосредованный РНКазой Н. РНКаза Н представляет собой клеточную эндонуклеазу, которая расщепляет спираль РНК дуплекса РНК: ДНК. В данной области техники известно, что односпиральные антисмысловые соединения, которые

являются «ДНК-подобными», вызывают активность РНКазы Н в клетках млекопитающих. Следовательно, активация РНКазы Н приводит к расщеплению РНК-мишени, посредством этого в значительной степени усиливая эффективность подавления генной экспрессии, опосредованного ДНК-подобным олигонуклеотидом.

В некоторых вариантах реализации конъгирующая группа содержит расщепляемый фрагмент. В некоторых вариантах реализации конъгирующая группа содержит одну или более расщепляемых связей. В некоторых вариантах реализации конъгирующая группа содержит линкер. В некоторых вариантах реализации линкер содержит белковый связывающий фрагмент. В некоторых вариантах реализации конъгирующая группа содержит фрагмент, нацеливающий на клетку (упоминаемый также как группа, нацеливающая на клетку). В некоторых вариантах реализации фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит группу ветвления. В некоторых вариантах реализации фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит одну или более связок. В некоторых вариантах реализации фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит углевод или углеводный кластер.

ii. Некоторые расщепляемые фрагменты

В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент представляет собой расщепляемую связь. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент содержит расщепляемую связь. В некоторых вариантах реализации конъгирующая группа содержит расщепляемый фрагмент. В некоторых таких вариантах реализации расщепляемый фрагмент присоединяется к антисмысловому олигонуклеотиду. В некоторых таких вариантах реализации расщепляемый фрагмент присоединяется непосредственно к фрагменту, нацеливающему на клетку. В некоторых таких вариантах реализации расщепляемый ' фрагмент присоединяется к конъюгирующему линкеру. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент содержит фосфат или фосфодиэфир. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент представляет собой расщепляемый нуклеозйй или нуклеозидный аналог.В некоторых вариантах реализации нуклеозид или нуклеозидный аналог содержит необязательно защищенное гетероциклическое основание, выбранное из пурина, замещенного пурина, пиримидина или замещенного пиримидина. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент представляет собой нуклеозид, содержащий необязательно защищенное гетероциклическое основание, выбранное из урацила, тимина, цитозина, 4-N-бензоилцитозина, 5-метилцитозина, 4-N-бензоил-5-метилцитозина, аденина, 6-N-бензоиладенина, гуанина и 2-N-изобутирилгуанина. В некоторых вариантах реализации

расщепляемый фрагмент представляет собой 2'-дезоксинуклеозид, который присоединен к 3'-положению антисмыслового олигонуклеотида фосфодиэфирной связью и присоединен к линкеру фосфодиэфирной или тиофосфатной связью. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент представляет собой 2'-дезоксиаденозин, который присоединен к 3'-положению антисмыслового олигонуклеотида фосфодиэфирной связью и присоединен к линкеру фосфодиэфирной или тиофосфатной связью. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент представляет собой 2'-дезоксиаденозин, который присоединен к 3'-положению антисмыслового олигонуклеотида фосфодиэфирной связью и присоединен к линкеру фосфодиэфирной связью.

В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент присоединен к 3'-положению антисмыслового олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент присоединен к 5'-положению антисмыслового олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент присоединен к 2'-положению антисмыслового олигонуклеотида, В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент присоединен к антисмысловому олигонуклеотиду фосфодиэфирной связью. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент присоединен к указанному линкеру либо фосфодиэфирной, либо тиофосфатной связью. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент присоединен к указанному линкеру фосфодиэфирной связью. В некоторых вариантах реализации конъгирующая группа не содержит расщепляемый фрагмент.

В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент расщепляется после введения указанного комплекса в организм животного только после его поглощения целевой клеткой. Внутри клетки расщепляемый фрагмент расщепляется, высвобождая таким образом активный антисмысловый олигонуклеотид. Не ограничиваясь теорией, предполагается, что расщепляемый фрагмент расщепляется под действием одной или более нуклеаз внутри клетки. В некоторых вариантах реализации одна или более нуклеаз расщепляют фосфодиэфирную связь между расщепляемым фрагментом и линкером. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент имеет структуру, выбранную из следующих:

; ; и

где каждый из Вх, Bx₁, Bx₂ и Вх₃ независимо представляет собой фрагмент гетероциклического основания. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент имеет структуру, выбранную из следующих:

iii. Некоторые линкеры

В некоторых вариантах реализации конъгирующей группы содержат линкер. В некоторых таких вариантах реализации линкер ковалентно связан с расщепляемым фрагментом. В некоторых таких вариантах реализации линкер ковалентно связан с антисмысловым олигонуклеотидом. В некоторых вариантах реализации линкер ковалентно связан с фрагментом, нацеливающим на клетку. В некоторых вариантах реализации линкер дополнительно содержит ковалентное присоединение к твердой подложке. В некоторых вариантах реализации линкер дополнительно содержит ковалентное присоединение к белковому связывающему фрагменту. В некоторых вариантах реализации линкер дополнительно содержит ковалентное присоединение к твердой подложке и дополнительно

содержит ковалентное присоединение к белковому связывающему фрагменту. В некоторых вариантах реализации линкер содержит несколько положений для присоединения связанных лигандов. В некоторых вариантах реализации линкер содержит несколько положений для присоединения связанных лигандов и не присоединен к группе ветвления. В некоторых вариантах реализации линкер дополнительно содержит одну или более расщепляемых связей. В некоторых вариантах реализации конъгирующая группа не содержит линкер.

В некоторых вариантах реализации линкер содержит по меньшей мере одну линейную группу, содержащую группы, выбранные из алкильных, амидных, дисульфидных, полиэтиленгликолевых, тиоэфирных (-S-) и гидроксиламино (-O-N(H)-) групп. В некоторых вариантах реализации линейная группа содержит группы, выбранные из алкильных, амидных и простых эфирных групп. В некоторых вариантах реализации линейная группа содержит группы, выбранные из алкильных и простых эфирных групп. В некоторых вариантах реализации линейная группа содержит по меньшей мере одну фосфорную связывающую группу. В некоторых вариантах реализации линейная группа содержит по меньшей мере одну фосфодиэфирную группу. В некоторых вариантах реализации линейная группа содержит по меньшей мере одну нейтральную связывающую группу. В некоторых вариантах реализации линейная группа ковалентно присоединена к фрагменту, нацеливающему на клетку и к расщепляемому фрагменту. В некоторых вариантах реализации линейная группа ковалентно присоединена к фрагменту, нацеливающему на клетку, и к антисмысловому олигонуклеотиду. В некоторых вариантах реализации линейная группа ковалентно присоединена к фрагменту, нацеливающему на клетку, к расщепляемому фрагменту и к твердой подложке. В некоторых вариантах реализации линейная группа ковалентно присоединена к фрагменту, нацеливающему на клетку, к расщепляемому фрагменту, к твердой подложке и к белковому связывающему фрагменту. В некоторых вариантах реализации линейная группа содержит одну или более расщепляемых связей.

В некоторых вариантах реализации линкер содержит линейную группу, ковалентно присоединенную к группе скелета. В некоторых вариантах реализации скелет содержит разветвленную алифатическую группу, которая содержит группы, выбранные из алкильных, амидных, дисульфидных, полиэтиленгликолевых, простых эфирных, тиоэфирных и гидроксиламино-групп. В некоторых вариантах реализации скелет содержит разветвленную алифатическую группу, которая содержит группы, выбранные из алкильных, амидных и простых эфирных групп. В некоторых вариантах реализации скелет содержит по меньшей

мере одну моно- или полициклическую кольцевую систему. В некоторых вариантах реализации скелет содержит по меньшей мере две моно- или полициклические кольцевые системы. В некоторых вариантах реализации линейная группа ковалентно присоединена к группе скелета, а группа скелета ковалентно присоединена к расщепляемому фрагменту и линкеру. В некоторых вариантах реализации линейная группа ковалентно присоединена к группе скелета, а группа скелета ковалентно присоединена к расщепляемому фрагменту, линкеру и твердой подложке. В некоторых вариантах реализации линейная группа ковалентно присоединена к группе скелета, а группа скелета ковалентно присоединена к расщепляемому фрагменту, линкеру и белковому связывающему фрагменту. В некоторых вариантах реализации линейная группа ковалентно присоединена к группе скелета, а группа скелета ковалентно присоединена к расщепляемому фрагменту, линкеру, белковому связывающему фрагменту и твердой подложке. В некоторых вариантах реализации группа скелета содержит одну или более расщепляемых связей.

В некоторых вариантах реализации линкер содержит белковый связывающий фрагмент. В некоторых вариантах реализации белковый связывающий фрагмент представляет собой липид, такой как, например, включая, но не ограничиваясь ими, холестерин, холевая кислота, адамантан-уксусная кислота, 1-пирен-масляная кислота, дигидротестостерон, 1,3-бис-O(гексадецил)глицерин, геранилоксигексиловая группа, гексадецилглицерин, борнеол, ментол, 1,3-пропандиол, гептадециловая группа, пальмитиновая кислота, миристиновая кислота, О3-(олеоил)литохолевая кислота, O3-(олеоил)холеновая кислота, диметокситритил или феноксазин, витамин (например, фолат, витамин А, витамин Е, биотин, пиридоксаль), пептид, углевод (например, моиосахарид, дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, олигосахарид, полисахарид), эндосомолитический компонент, стероид (например, уваол, гецигенин, диосгенин), терпен (например, тритерпен, например, сарсасапогенин, фриделин, литохолевая кислота, дериватизованная эпифриделанолом) или катионный липид. В некоторых вариантах реализации белковый связывающий фрагмент представляет собой насыщенную или ненасыщенную жирную кислоту с длиной цепи от С16 до С22, холестерин, холевую кислоту, витамин Е, адамантан или 1-пентафторпропил.

В некоторых вариантах реализации линкер имеет структуру, выбранную из:

; ;

; ; ;

; ; ;

; ;

; и

где каждый n независимо равен от 1 до 20; и р равен от 1 до 6.

В некоторых вариантах реализации линкер имеет структуру, выбранную из:

; ;

; ;

; ;

; ; и

где каждый n независимо равен от 1 до 20.

В некоторых вариантах реализации линкер имеет структуру, выбранную из:

; ; ;

; ; ; ;

; ; ;

; ;

; ; и

где n равен от 1 до 20.

В некоторых вариантах реализации линкер имеет структуру, выбранную из:

; ; ;

; ; ; ;

; ; ; ;

; ; ;

; ;

; ;

и .

где каждый L независимо представляет собой фосфорную связывающую группу или нейтральную связывающую группу; и

каждый n независимо равен от 1 до 20.

В некоторых вариантах реализации линкер имеет структуру, выбранную из:

; ;

; ;

;

; ;

; ; ;

; ; ;

; ; и

.

В некоторых вариантах реализации линкер имеет структуру, выбранную из:

; ; ;

; ; ;

; ; ;

; ;

; ; и

.

В некоторых вариантах реализации линкер имеет структуру, выбранную из:

; ; ;

; ; ;

; ; ;

; ;

;

; ; ;

; ;

; и

.

В некоторых вариантах реализации линкер имеет структуру, выбранную из:

и

где n равен от 1 до 20.

В некоторых вариантах реализации линкер имеет структуру, выбранную из:

; ; и .

В некоторых вариантах реализации линкер имеет структуру, выбранную из:

и .

В некоторых вариантах реализации линкер имеет структуру, выбранную из:

и .

В некоторых вариантах реализации конъюгирующий линкер имеет структуру:

.

В некоторых вариантах реализации конъюгирующий линкер имеет структуру:

.

В некоторых вариантах реализации линкер имеет структуру, выбранную из:

и .

В некоторых вариантах реализации линкер имеет структуру, выбранную из:

и .

где каждый n независимо равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7.

iv. Некоторые фрагменты, нацеливающие на клетку

В некоторых вариантах реализации конъгирующей группы содержат фрагменты, нацеливающие на клетку. Некоторые такие фрагменты, нацеливающие на клетку, увеличивают клеточный захват антисмысловых соединений. В некоторых вариантах реализации фрагменты, нацеливающие на клетку, содержат группу ветвления, одну или более связок и один или более лигандов. В некоторых вариантах реализации фрагменты, нацеливающие на клетку, содержат группу ветвления, одну или более связок, один или более лигандов и одну или более расщепляемых связей.

1. Некоторые группы ветвления

В некоторых вариантах реализации конъгирующей группы содержат нацеливающий фрагмент, содержащий группу ветвления и по меньшей мере два связанных лиганда. В некоторых вариантах реализации группа ветвления присоединяет конъюгирующий линкер В некоторых вариантах реализации группа ветвления присоединяет расщепляемый фрагмент. В некоторых вариантах реализации группа ветвления присоединяет антисмысловый олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации группа ветвления ковалентно присоединена к линкеру и каждому из связанных лигандов. В некоторых вариантах реализации группа ветвления содержит разветвленную алифатическую группу, которая содержит группы, выбранные из алкильных, амидных, дисульфидных, полиэтиленгликолевых, простых эфирных, тиоэфирных и гидроксиламино-групп. В некоторых вариантах реализации группа ветвления содержит группы, выбранные из алкильных, амидных и простых эфирных групп. В некоторых вариантах реализации группа ветвления содержит группы, выбранные из алкильных и простых эфирных групп. В

некоторых вариантах реализации группа ветвления содержит моно- или полициклическую кольцевую систему. В некоторых вариантах реализации группа ветвления содержит одну или более расщепляемых связей. В некоторых вариантах реализации конъгирующая группа не содержит группу ветвления.

В некоторых вариантах реализации группа ветвления имеет структуру, выбранную из:

; ; ;

; ; ;

;

; ; ;

; ; ;

; и .

где каждый n независимо равен от 1 до 20;

j равен от 1 до 3; и

m равен от 2 до 6.

В некоторых вариантах реализации группа ветвления имеет структуру, выбранную из:

; ; ;

; ; ;

; ; ; ; и

где каждый n независимо равен от 1 до 20; и

m равен от 2 до 6.

В некоторых вариантах реализации группа ветвления имеет структуру, выбранную из:

; ;

; ; ; ;

; ; ;

; и .

В некоторых вариантах реализации группа ветвления имеет структуру, выбранную из:

и .

где каждый A₁ независимо представляет собой О, S, С=O или NH; и

каждый n независимо равен от 1 до 20.

В некоторых вариантах реализации группа ветвления имеет структуру, выбранную из:

; и ,

где каждый A₁ независимо представляет собой О, S, С=O или NH; и

каждый n независимо равен от 1 до 20.

В некоторых вариантах реализации группа ветвления имеет структуру, выбранную из:

и ,

где A₁ представляет собой О, S, С=O или NH; и

каждый n независимо равен от 1 до 20.

В некоторых вариантах реализации группа ветвления имеет структуру, выбранную из:

.

В некоторых вариантах реализации группа ветвления имеет структуру, выбранную из:

.

В некоторых вариантах реализации группа ветвления имеет структуру, выбранную из:

.

2. Некоторые связки

В некоторых вариантах реализации конъгирующей группы содержат одну или более связок, ковалентно присоединенных к группе ветвления. В некоторых вариантах реализации конъгирующей группы содержат одну или более связок, ковалентно присоединенных к связывающей группе. В некоторых вариантах реализации каждая связка представляет собой линейную алифатическую группу, содержащую одну или более групп, выбранных из алкильных, простых эфирных, тиоэфирных, дисульфидных, амидных и полиэтиленгликолевых групп в любой комбинации. В некоторых вариантах реализации каждая связка представляет собой линейную алифатическую группу, содержащую одну или более групп, выбранных из алкильных, замещенных алкильных, простых эфирных, тиоэфирных, дисульфидных, амидных, фосфодиэфирных и полиэтиленгликолевых групп в любой комбинации. В некоторых вариантах реализации каждая связка представляет собой линейную алифатическую группу, содержащую одну или более групп, выбранных из алкильных, простых эфирных и амидных групп в любой комбинации. В некоторых вариантах реализации каждая связка представляет собой линейную алифатическую группу, содержащую одну или более групп, выбранных из алкильных, замещенных алкильных, фосфодиэфирных, простых эфирных и амидных групп в любой комбинации. В некоторых вариантах реализации каждая связка представляет собой линейную алифатическую группу, содержащую одну или более групп, выбранных из алкила и фосфодиэфира в любой комбинации. В некоторых вариантах реализации каждая связка содержит по меньшей мере одну фосфорную связывающую группу или нейтральную связывающую группу.

В некоторых вариантах реализации связка содержит одну или более расщепляемых связей. В некоторых вариантах реализации связка присоединена к группе ветвления через амидную или простую эфирную группу. В некоторых вариантах реализации связка присоединена к группе ветвления через фосфордиэфирную группу. В некоторых вариантах реализации связка присоединена к группе ветвления через фосфорную связывающую группу или через нейтральную связывающую группу. В некоторых вариантах реализации связка

присоединена к группе ветвления через простую эфирную группу. В некоторых вариантах реализации связка присоединена к лиганду либо через амидную, либо через простую эфирную группу. В некоторых вариантах реализации связка присоединена к лиганду через простую эфирную группу. В некоторых вариантах реализации связка присоединена к лиганду либо через амидную, либо через простую эфирную группу. В некоторых вариантах реализации связка присоединена к лиганду через простую эфирную группу.

В некоторых вариантах реализации каждая связка имеет длину от около 8 до около 20 атомов в цепи между лигандом и группой ветвления. В некоторых вариантах реализации каждая связка имеет длину от около 10 до около 18 атомов в цепи между лигандом и группой ветвления. В некоторых вариантах реализации каждая связка имеет длину около 13 атомов в цепи.

В некоторых вариантах реализации связка имеет структуру, выбранную из:

; ; ; ;

; ; ;

; ; ;

; ; и

где каждый n независимо равен от 1 до 20; и

каждый р равен от 1 до около 6.

В некоторых вариантах реализации связка имеет структуру, выбранную из:

; ; ;

; ; ; и .

В некоторых вариантах реализации связка имеет структуру, выбранную из:

где каждый n независимо равен от 1 до 20.

В некоторых вариантах реализации связка имеет структуру, выбранную из:

и

где L представляет собой либо фосфорную связывающую группу, либо нейтральную связывающую группу;

Z₁ представляет собой C(=O)O-R₂;

Z₂ представляет собой H, C₁-C₆ алкил или замещенный C₁-C₆ алкил;

R₂ представляет собой Н, C₁-C₆ алкил или замещенный C₁-C₆ алкил; и

каждый m₁ независимо равен от 0 до 20, при этом по меньшей мере один m₁ больше 0 для каждой связки.

В некоторых вариантах реализации связка имеет структуру, выбранную из:

.

В некоторых вариантах реализации связка имеет структуру, выбранную из:

и

где Z₂ представляет собой Н или СН₃; и

каждый m₁ независимо равен от 0 до 20, при этом по меньшей мере один m₁ больше 0 для каждой связки.

В некоторых вариантах реализации связка имеет структуру, выбранную из:

или ; где каждый n независимо равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7.

В некоторых вариантах реализации связка содержит фосфорную связывающую группу. В некоторых вариантах реализации связка не содержит ни одной амидной связи. В некоторых вариантах реализации связка содержит фосфорную связывающую группу и не содержит ни одной амидной связи.

3. Некоторые лиганды

В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведенылиганды, при этом каждый лиганд ковалентно присоединен к связке. В некоторых вариантах реализации каждый лиганд выбран так, чтобы он обладал аффинностью по меньшей мере к одному типу рецептора на клетке-мишени. В некоторых вариантах реализации лиганды выбраны так, чтобы они обладали аффинностью по меньшей мере к одному типу рецептора на поверхности клетки печени млекопитающего. В некоторых вариантах реализации лиганды выбраны так, чтобы они обладали аффинностью к печеночному асиалогликопротеиновому рецептору (ASGP-R). В некоторых вариантах реализации каждый лиганд представляет собой углевод. В некоторых вариантах реализации каждый лиганд независимо выбран из галактозы, N-ацетилгалактозамина, маннозы, глюкозы, глюкозамина и фукозы. В некоторых вариантах реализации каждый лиганд представляет собой N-ацетилгалактозамин (GalNAc). В некоторых вариантах реализации нацеливающий фрагмент содержит 2-6 лигандов. 3 некоторых вариантах реализации нацеливающий фрагмент содержит 3 лиганда. В некоторых вариантах реализации нацеливающий фрагмент содержит 3 N-ацетилгалактозаминовых лиганда.

В некоторых вариантах реализации лиганд представляет собой углевод, углеводное производное, модифицированный углевод, поливалентный углеводный кластер, полисахарид,

модифицированный полисахарид или полисахаридное производное. В некоторых вариантах реализации лиганд представляет собой аминосахар или тиосахар. Например, аминосахара могут быть выбраны из любого количества соединений, известных в данной области техники, например, глюкозамина, сиаловой кислоты, α-D-галактозамина, N-ацетилгалактозамина, 2-ацетамидо-2-дезокси-D-галактопиранозы (GalNAc), 2-амино-3-O-[(R)-1-карбоксиэтил]-2-дезокси-β-D-глюкопиранозы (β-мурамовой кислоты), 2-дезокси-2-метиламино-L-глюкопиранозы, 4,6-дидезокси-4-формамидо-2,3-ди-O-метил-D-маннопиранозы, 2-дезокси-2-сульфоамино-D-глюкопиранозы и N-сульфо-D-глюкозамина, и N-гликолоил-α-нейраминовой кислоты. Например, тиосахара могут быть выбраны из группы, состоящей из 5-тио-β-D-глюкопиранозы, метил 2,3,4-три-O-ацетил-1-тио-6-O-тритил-α-D-глюкопиранозида, 4-тио-β-D-галактопиранозы и этил 3,4,6,7-тетра-O-ацетил-2-дезокси-1,5-дитио-α-D-глюко-гептопиранозида.

В некоторых вариантах реализации «GalNac» или «Gal-NAc» относится к 2-(ацетиламино)-2-дезокси-D-галактопиранозе, обычно упоминаемой в литературе как N-ацетилгалактозамин. В некоторых вариантах реализации «N-ацетилгалактозамин» относится к 2-(ацетиламино)-2-дезокси-D-галактопиранозе. В некоторых вариантах реализации «GalNac» или «Gal-NAc» относится к 2-(ацетиламино)-2-дезокси-D-галактопиранозе. В некоторых вариантах реализации «GalNac» или «Gal-NAc» относится к 2-(ацетиламино)-2-дезокси-D-галактопиранозе, которая включает и β-форму: 2-(ацетиламино)-2-дезокси-β-D-галактопиранозу, и α-форму: 2-(ацетиламино)-2-дезокси-D-галактопиранозу. В некоторых вариантах реализации обе формы, β-форма: 2-(ацетиламино)-2-дезокси-β-D-галактопираноза, и α-форма: 2-(ацетиламино)-2-дезокси-D-галактопираноза, могут быть использованы взаимозаменяемо. Соответственно, в структурах, в которых изображена одна форма, подразумевается, что эти структуры включают также и другую форму. Например, если показана структура для α-формы: 2-(ацетиламино)-2-дезокси-D-галактопиранозы, то подразумевается, что эта структура включает также и другую форму. В некоторых предпочтительных вариантах реализации β-форма 2-(ацетиламино)-2-дезокси-D-галактопиранозы является предпочтительным вариантом реализации.

В некоторых вариантах один или более лигандов имеют структуру, выбранную из:

и

где каждый R₁ выбран из ОН и NHCOOH.

В некоторых вариантах один или более лигандов имеют структуру, выбранную из:

; ; ; ;

; ; ; и

.

В некоторых вариантах один или более лигандов имеют структуру, выбранную из:

.

В некоторых вариантах один или более лигандов имеют структуру, выбранную из:

.

i. Некоторые конъюгаты

В некоторых вариантах реализации конъгирующей группы содержат структурные особенности, представленные выше. В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

где каждый n независимо равен от 1 до 20.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

где каждый n независимо равен от 1 до 20;

Z представляет собой Н или связанную твердую подложку;

Q представляет собой антисмысловое соединение;

Х представляет собой О или S; и

Вх представляет собой гетероциклический основной фрагмент.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгаты не содержат пирролидин.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых таких вариантах реализации конъгирующей группы имеют следующую структуру:

.

В некоторых вариантах реализации фрагмент конъгирующей группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:

где Х представляет собой замещенную или незамещенную связку из шести-одиннадцати последовательно свзязанных атомов.

В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент, нацеливающий на клетку, конъгирующей группы имеет следующую структуру:

где X представляет собой замещенную или незамещенную связку из десяти последовательно свзязанных атомов.

В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент, нацеливающий на клетку, конъгирующей группы имеет следующую структуру:

где Х представляет собой замещенную или незамещенную связку из четырех-одиннадцати последовательно свзязанных атомов, и при этом эта связка содержит только одну амидную связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент, нацеливающий на клетку, конъгирующей группы имеет следующую структуру:

где Y и Z независимо выбраны из C₁-C₁₂ замещенной или незамещенной алкильной, алкенильной или алкинильной группы или группы, содержащей эфир, кетон, амид, сложный эфир, карбамат, амин, пиперидин, фосфат, фосфодиэфир, тиофосфат, триазол, пирролидин, дисульфид или тиоэфир.

В некоторых таких вариантах реализации фрагмент конъгирующей группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:

где Y и Z независимо выбраны из C₁-C₁₂ замещенной или незамещенной алкильной группы или группы, содержащей только один эфир или только два эфира, амид, амин, пиперидин, фосфат, фосфодиэфир или тиофосфат.

В некоторых таких вариантах реализации фрагмент конъгирующей группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:

где Y и Z независимо выбраны из С₁-С₁₂ замещенной или незамещенной алкильной группы.

В некоторых таких вариантах реализации фрагмент конъгирующей группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:

где m и n независимо выбраны из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12.

В некоторых таких вариантах реализации фрагмент конъгирующей группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:

где m равен 4, 5, 6, 7 или 8, и n равен 1, 2, 3 или 4.

В некоторых вариантах реализации фрагмент конъгирующей группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:

где Х представляет собой замещенную или незамещенную связку из четырех-тринадцати последовательно связанных атомов, и при этом Х не содержит эфирную группу.

В некоторых вариантах реализации фрагмент конъгирующей группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:

где Х представляет собой замещенную или незамещенную связку из восьми последовательно связанных атомов, и при этом Х не содержит простую эфирную группу.

В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент, нацеливающий на клетку, конъгирующей группы имеет следующую структуру:

где X представляет собой замещенную или незамещенную связку из четырех до тринадцати последовательно связанных атомов, и при этом указанная связка содержит только одну амидную связь, и Х не содержит простую эфирную группу.

В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент, нацеливающий на клетку, конъгирующей группы имеет следующую структуру:

где Х представляет собой замещенную или незамещенную связку из четырех до тринадцати последовательно связанных атомов, и при этом указанная связка состоит из амидной связи и замещенной или незамещенной С₂-С₁₁ алкильной группы.

В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент, нацеливающий на клетку, конъгирующей группы имеет следующую структуру:

где Y выбран из C₁-C₁₂ замещенной или незамещенной алкильной, алкенильной или алкинильной группы или группы, содержащей простой эфир, кетон, амид, сложный эфир, карбамат, амин, пиперидин, фосфат, фосфодиэфир, тиофосфат, триазол, пирролидин, дисульфид или тиоэфир.

В некоторых таких вариантах реализации изобретения фрагмент, нацеливающий на клетку, конъгирующей группы имеет следующую структуру:

где Y выбран из C₁-C₁₂ замещенной или незамещенной алкильной группы или группы, содержащей простой эфир, амин, пиперидин, фосфат, фосфодиэфир или тиофосфат.

В некоторых таких вариантах реализации изобретения фрагмент, нацеливающий на клетку, конъгирующей группы имеет следующую структуру:

где Y выбран из C₁-C₁₂ замещенной или незамещенной алкильной группы.

В некоторых таких вариантах реализации изобретения фрагмент, нацеливающий на клетку, конъгирующей группы имеет следующую структуру:

где n равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12.

В некоторых таких вариантах реализации изобретения фрагмент, нацеливающий на клетку, конъгирующей группы имеет следующую структуру:

где n равен 4, 5, 6, 7 или 8.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгат не содержит пирролидин.

b. Некоторые конъюгированные антисмысловые соединения

В некоторых вариантах реализации конъюгаты связаны с нуклеозидом антисмыслового олигонуклеотида в 2', 3' или 5' положении нуклеозида. В некоторых вариантах реализации конъюгированное антисмысловое соединение имеет следующую структуру:

где

А представляет собой антисмысловый олигонуклеотид;

В представляет собой расщепляемый фрагмент

С представляет собой конъюгирующий линкер

D представляет собой группу ветвления

каждый Е представляет собой связку;

каждый F представляет собой лиганд; и

q представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах реализации конъюгированное антисмысловое соединение имеет следующую структуру:

где

А представляет собой антисмысловый олигонуклеотид;

С представляет собой конъюгирующий линкер

D представляет собой группу ветвления

каждый Е представляет собой связку;

каждый F представляет собой лиганд; и

q представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых таких вариантах реализации конъюгирующий линкер содержит по меньшей мере одну расщепляемую связь.

В некоторых таких вариантах реализации группа ветвления содержит по меньшей мере одну расщепляемую связь.

В некоторых вариантах реализации каждая связка содержит по меньшей мере одну расщепляемую связь.

В некоторых вариантах реализации конъюгаты связаны с нуклеозидом антисмыслового олигонуклеотида в 2', 3' или 5' положении нуклеозида.

В некоторых вариантах реализации конъюгированное антисмысловое соединение имеет следующую структуру:

где

А представляет собой антисмысловый олигонуклеотид;

В представляет собой расщепляемый фрагмент

С представляет собой конъюгирующий линкер

каждый Е представляет собой связку;

каждый F представляет собой лиганд; и

q представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах реализации конъюгаты связаны с нуклеозидом антисмыслового олигонуклеотида в 2', 3' или 5' положении нуклеозида. В некоторых вариантах реализации конъюгированное антисмысловое соединение имеет следующую структуру:

где

А представляет собой антисмысловый олигонуклеотид;

С представляет собой конъюгирующий линкер

каждый Е представляет собой связку;

каждый F представляет собой лиганд; и

q представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах реализации конъюгированное антисмысловое соединение имеет следующую структуру:

где

А представляет собой антисмысловый олигонуклеотид;

В представляет собой расщепляемый фрагмент

D представляет собой группу ветвления

каждый Е представляет собой связку;

каждый F представляет собой лиганд; и

q представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах реализации конъюгированное антисмысловое соединение имеет следующую структуру:

где

А представляет собой антисмысловый олигонуклеотид;

D представляет собой группу ветвления

каждый Е представляет собой связку;

каждый F представляет собой лиганд; и

q представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых таких вариантах реализации конъюгирующий линкер содержит по меньшей мере одну расщепляемую связь.

В некоторых вариантах реализации каждая связка содержит по меньшей мере одну расщепляемую связь.

В некоторых вариантах реализации конъюгированное антисмысловое соединение имеет структуру, выбранную из следующих:

В некоторых вариантах реализации конъюгированное антисмысловое соединение имеет структуру, выбранную из следующих:

В некоторых вариантах реализации конъюгированное антисмысловое соединение имеет структуру, выбранную из следующих:

Типичные патенты Соединенных штатов Америки, публикации патентных заявок Соединенных штатов Америки и публикации международных патентных заявок, в которых описано получение некоторых из указанных выше конъюгатов, конъюгированных антисмысловых соединений, связок, линкеров, групп ветвления, лигандов, расщепляемых фрагментов, а также других модификаций, включают, без ограничения, US 5994517, US 6300319, US 6660720, US 6906182, US 7262177, US 7491805, US 8106022, US 7723509, US 2006/0148740, US 2011/0123520, WO 2013/033230 и WO 2012/037254, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

Типичные публикации, в которых описано получение некоторых из указанных выше конъюгатов, конъюгированных антисмысловых соединений, связок, линкеров, групп

ветвления, лигандов, расщепляемых фрагментов, а также других модификаций, включают, без ограничения, BIESSEN et al., "The Cholesterol Derivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor: a Potent Cholesterol Lowering Agent" J. Med. Chem. (1995) 38: 1846-1852, BIESSEN et al., "Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1995) 38: 1538-1546, LEE et al., "New and more efficient multivalent glyco-ligands for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes" Bioorganic & Medicinal Chemistry (2011) 19: 2494-2500, RENSEN et al., "Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo" J. Biol. Chem. (2001) 276(40): 37577-37584, RENSEN et al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (2004) 47: 5798-5808, SLIEDREGT et al., "Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1999) 42: 609-618 и Valentijn et al., "Solid-phase synthesis of lysine-based cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor" Tetrahedron, 1997, 53(2), 759-770, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

В некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения содержат олигонуклеотид на основе РНКазы Н (такой как гэпмер) или сплайс-модулирующий олигонуклеотид (такой как полностью модифицированный олйгонуклеотид) и любую конъгирующую группу, содержащую по меньшей мере одну, две или три группы GalNAc. В некоторых вариантах реализации конъюгированное антисмысловое соединение содержит любую конъгирующую группу, представленную в следующих ссылках: Lee, Carbohydr Res, 1978, 67, 509-514; Connolly et al., J Biol Chem, 1982, 257, 939-945; Pavia et al., Int J Pep Protein Res, 1983, 22, 539-548; Lee et al., Biochem, 1984, 23, 4255-4261; Lee et al., Glycoconjugate J, 1987, 4, 317-328; Toyokuni et al., Tetrahedron Lett, 1990, 31, 2673-2676; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1538-1546; Valentijn et al., Tetrahedron, 1997, 53, 759-770; Kim et al., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 3487-3490; Lee et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 762-765; Kato et al., Glycobiol, 2001, 11, 821-829; Rensen et al., J Biol Chem, 2001, 276, 37577-37584; Lee et al., Methods Enzymol, 2003, 362, 38-43; Westerlind et al., Glycoconj J, 2004, 21, 227-241; Lee et al., Bioorg Med Chem Lett, 2006, 16(19), 5132-5135; Maierhofer et al., Bioorg Med Chem, 2007, 15, 7661-7676; Khorev et al., Bioorg Med Chem, 2008, 16, 5216-5231; Lee et al., Bioorg Med

Chem, 2011, 19, 2494-2500; Kornilova et al., Analyt Biochem, 2012, 425, 43-46; Pujol et al., Angew Chemie Int Ed Engl, 2012, 51, 7445-7448; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1846-1852; Sliedregt et al., J Med Chem, 1999, 42, 609-618; Rensen et al., J Med Chem, 2004, 47, 5798-5808; Rensen et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26, 169-175; van Rossenberg et al., Gene Ther, 2004, 11, 457-464; Sato et al., J Am Chem Soc, 2004, 126, 14013-14022; Lee et al., J Org Chem, 2012, 77, 7564-7571; Biessen et al., FASEB J, 2000, 14, 1784-1792; Rajur et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 935-940; Duff et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297-321; Maier et al., Bioconjug Chem, 2003, 14, 18-29; Jayaprakash et al., Org Lett, 2010, 12, 5410-5413; Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12, 103-128; Merwin et al., Bioconjug Chem, 1994, 5, 612-620; Tomiya et at., Bioorg Med Chem, 2013, 21, 5275-5281; Международные заявки WO 1998/013381; WO 2011/038356; WO 1997/046098; WO 2008/098788; WO 2004/101619; WO 2012/037254; WO 2011/120053; WO 2011/100131; WO 2011/163121; WO 2012/177947; WO 2013/033230; WO 2013/075035; WO 2012/083185; WO 2012/083046; WO 2009/082607; WO 2009/134487; WO 2010/144740; WO 2010/148013; WO 1997/020563; WO 2010/088537; WO 2002/043771; WO 2010/129709; WO 2012/068187; WO 2009/126933; WO 2004/024757; WO 2010/054406; WO 2012/089352; WO 2012/089602; WO 2013/166121; WO 2013/165816; патенты США 4751219; 8552163; 6908903; 7262177; 5994517; 6300319; 8106022; 7491805; 7491805; 7582744; 8137695; 6383812; 6525031; 6660720; 7723509; 8541548; 8344125; 8313772; 8349308; 8450467; 8501930; 8158601; 7262177; 6906182; 6620916; 8435491; 8404862; 7851615; опубликованные заявки на патент США US 2011/0097264; US 2011/0097265; US 2013/0004427; US 2005/0164235; US 2006/0148740; US 2008/0281044; US 2010/0240730; US 2003/0119724; US 2006/0183886; US 2008/0206869; US 2011/0269814; US 2009/0286973; US 2011/0207799; US 2012/0136042; US 2012/0165393; US 2008/0281041; US 2009/0203135; US 2012/0035115; US 2012/0095075; US 2012/0101148; US 2012/0128760; US 2012/0157509; US 2012/0230938; US 2013/0109817; US 2013/0121954; US 2013/0178512; US 2013/0236968; US 2011/0123520; US 2003/0077829; US 2008/0108801; и US 2009/0203132; каждая из которых включена посредством ссылки в полном объеме.

С. Некоторые применения и особенности

В некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения демонстрируют эффективное снижение целевой РНК in vivo. В некоторых вариантах реализации неконъюгированные антисмысловые соединения накапливаются в почках. В некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения

накапливаются в печени. В некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения являются хорошо переносимыми. Такие свойства делают конъюгированные антисмысловые соединения особенно пригодными для ингибирования многих целевых РНК, включая, но не ограничиваясь ими, те, которые участвуют в метаболических, сердечно-сосудистых и других заболеваниях, расстройствах или патологических состояниях. Таким образом, в настоящем документе представлены способы лечения таких заболеваний, расстройств или патологических состояний приведением тканей печени в контакт с конъюгированными антисмысловыми соединениями, нацеленными на РНК, связанные с такими заболеваниями, расстройствами или патологическими состояниями. Следовательно, представлены также способы облегчения любых из множества метаболических, сердечно-сосудистых и других заболеваний, расстройств или патологических состояний при помощи конъюгированных антисмысловых соединений настоящего изобретения.

В некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения являются более эффективными, чем неконъюгированные аналоги при определенной концентрации в ткани. Не ограничиваясь какой-либо теорией или механизмом, в некоторых вариантах реализации конъюгат может обеспечивать возможность более эффективного вхождения конъюгированного антисмыслового соединения в клетку или возможность более продуктивного вхождения в клетку. Например, в некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения могут демонстрировать более значительное снижение мишени, по сравнению с неконъюгированным аналогом, при этом и конъюгированное антисмысловое соединение, и его неконъюгированный аналог находятся в ткани в одинаковых концентрациях. Например, в некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения могут демонстрировать более значительное снижение мишени, по сравнению с их неконъюгированными аналогами, при этом и конъюгированное антисмысловое соединение, и его неконъюгированный аналог находятся в печени в одинаковых концентрациях.

Ранее был рассмотрен продуктивный и непродуктивный захват олигонуклеотидов (см., например, Geary, R.S., E. Wancewicz, et al. (2009). "Effect of Dose and Plasma Concentration on Liver Uptake and Pharmacologic Activity of a 2'-Methoxyethyl Modified Chimeric Antisense Oligonucleotide Targeting PTEN." Biochem. Pharmacol. 78(3): 284-91; и Koller, E., Т.M. Vincent, et al. (2011). "Mechanisms of single-stranded phosphorothioate modified

antisense oligonucleotide accumulation in hepatocytes." Nucleic Acids Res. 39(11): 4795-807). Группы конъюгатов, описанные в настоящем документе, могут улучшать продуктивный захват.

В некоторых вариантах реализации группы конъюгатов, описанные в настоящем документе, могут дополнительно усиливать эффективность путем увеличения аффинности конъюгированного антисмыслового соединения к конкретному типу клетки или ткани. В некоторых вариантах реализации группы конъюгатов, описанные в настоящем документе, могут дополнительно усиливать эффективность путем увеличения распознавания конъюгированного антисмыслового соединения одним или более рецепторами клеточной поверхности. В некоторых вариантах реализации группы конъюгатов, описанные в настоящем документе, могут дополнительно усиливать эффективность путем облегчения эндоцитоза конъюгированного антисмыслового соединения.

В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент может дополнительно усиливать эффективность путем обеспечения возможности расщепления конъюгата из антисмыслового олигонуклеотида после попадания конъюгированного антисмыслового соединения в клетку. Соответственно, в некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения могут быть введены в более низких дозах, чем необходимы для неконъюгированных антисмысловых олигонуклеотидов.

Ранее в антисмысловые олигонуклеотиды уже были внедрены тиофосфатные связи. Такие тиофосфатные связи являются устойчивыми к нуклеазам и за счет этого улучшают стабильность олигонуклеотида. Кроме того, тиофосфатные связи связывают также некоторые белки, что приводит к накоплению антисмыслового олигонуклеотида в печени. Олигонуклеотиды с меньшим количеством тиофосфатных связей меньше накапливаются в печени и больше - в почках (см., например, Geary, R., "Pharmacokinetic Properties of 2'-O-(2-Methoxyethyl)-Modified Oligonucleotide Analogs in Rats," Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, том 296, №3, 890-897; и Pharmacological Properties of 2'-O-Methoxyethyl Modified Oligonucleotides in Antisense a Drug Technology, глава 10, Crooke, S.T., ред., 2008). В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды с меньшим количеством тифосфатных межнуклеозидных связей и с большим количеством фосфодиэфирных межнуклеозидных связей меньше накапливаются в печени и больше - в почках. При лечении заболеваний печени это нежелательно по нескольким причинам: (1) меньше лекарства

попадает в центр желаемого действия (печень); (2) лекарство выводится с мочой; (3) почки подвергаются воздействию относительно высокой концентрации лекарства, что может приводить к токсичности в почках. Следовательно, для заболеваний печени тиофосфатные связи обеспечивают важное преимущество.

Однако в некоторых вариантах реализации введение олигонуклеотидов, равномерно связанных тиофосфатными межнуклеозидными связями, вызывает одну или более провоспалительных реакций. (См., например: J Lab Clin Med. 1996 Sep; 128(3): 329-38. "Amplification of antibody production by phosphorothioate oligodeoxynucleotides". Branda et al.; и см. также, например: Toxicologic Properties in Antisense a Drug Technology, глава 12, страницы 342-351, Crooke, S.T., ред., 2008). В некоторых вариантах реализации введение олигонуклеотидов, в которых большая часть межнуклеозидных связей содержи" тиофосфатные межнуклеозидные связи, вызывает одну или более провоспалительных реакций.

В некоторых вариантах реализации степень провоспалительного эффекта может зависеть от нескольких переменных (например, модификация скелета, нецелевое действие, модификации азотистых оснований и/или модификации нуклеозида), см., например: Toxicologic Properties in Antisense a Drug Technology, глава 12, страницы 342-351, Crooke, S.T., ред., 2008). В некоторых вариантах реализации степень провоспалительного эффекта может быть ослаблена путем подбора одной или более переменных. Например, степень провоспалительного эффекта данного олигонуклеотида может быть ослаблена путем замены любого количества тиофосфатных межнуклеозидных связей на фосфодиэфирные межнуклеозидные связи с уменьшением посредством этого общего количества тиофосфатных межнуклеозидных связей.

В некоторых вариантах реализации может быть желательно снизить количество тиофосфатных связей, если это может быть выполнено без потери стабильности и без сдвига распределения из печени в почки. Например, в некоторых вариантах реализации количество тиофосфатных связей может быть уменьшено путем замены тиофосфатных связей на фосфодиэфирные связи. В таком варианте реализации антисмысловое соединение, имеющее меньшее количество тиофосфатных связей и большее количество фосфодиэфирных связей, может вызывать меньшее количество провоспалительных реакций или не вызывать провоспалительных реакций. Хотя антисмысловое соединение, имеющее меньшее

количество тиофосфатных связей и большее количество фосфодиэфирных связей, может вызывать меньшее количество провоспалительных реакций, антисмысловое соединение, имеющее меньшее количество тиофосфатных связей и большее количество фосфодиэфирных связей, может не накапливаться в печени и может быть менее эффективным в такой же или аналогичной дозе, по сравнению с антисмысловым соединением, имеющим большее количество тиофосфатных связей. Поэтому в некоторых вариантах реализации желательно разработать антисмысловое соединение, которое имеет множество фосфодиэфирных связей и множество тиофосфатных связей, но которое при этом обладает также стабильностью и хорошим распределением в печени.

В некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения больше накапливаются в печени и меньше - в почках, чем неконъюгированные аналоги, даже если некоторые тиофосфатные связи заменены менее провоспалительными фосфодиэфирными межнуклеозидными связями. В некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения больше накапливаются в печени и не так сильно выводятся с мочой, как их неконъюгированные аналоги, даже если некоторые тиофосфатные связи заменены менее провоспалительными фосфодиэфирными межнуклеозидными связями. В некоторых вариантах реализации применение конъюгата обеспечивает возможность разрабатывать более эффективные и лучше переносимые антисмысловые лекарства. Действительно, в некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения имеют более широкий терапевтический индекс, чем неконъюгированные аналоги. Это позволяет вводить конъюгированное антисмысловое соединение в более высокой абсолютной дозе благодаря меньшему риску провоспалительной реакции и меньшему риску токсичности для почек. Такая более высокая доза дает возможность вводить дозу реже, поскольку ожидается такой же коэффициент очищения (метаболизм). Кроме того, поскольку соединение является более эффективным, как описано выше, то можно допускать снижение концентрации перед введением следующей дозы, без потери терапевтической активности, что обеспечивает еще более продолжительные периоды между введениями доз.

В некоторых вариантах реализации сохраняется необходимость во внедрении некоторого количества тиофосфатных связей. Например, концевые связи легко подвергаются действию экзонуклеаз, и поэтому в некоторых вариантах реализации эти связи представляют собой тиофосфатные или другие модифицированные связи. Межнуклеозидные связи,

соединяющие два дезоксинуклеозида, легко подвергаются действию эндонуклеаз, и поэтому в некоторых вариантах реализации эти связи представляют собой тиофосфатные или другие модифицированные связи. Межнуклеозидные связи между модифицированным нуклеозидом и дезоксинуклеозидом, где дезоксинуклеозид расположен на 5'-стороне связывающего дезоксинуклеозида, легко подвергаются действию эндонуклеаз, и поэтому в некоторых вариантах реализации эти связи представляют собой тиофосфатные или другие модифицированные связи. Межнуклеозидные связи между двумя модифицированными нуклеозидами определенных типов и между дезоксинуклеозидом и модифицированным нуклеозидом определенного типа, где модифицированный нуклеозид расположен на 5'-стороне линкера, являются достаточно устойчивыми к нуклеазному расщеплению, поэтому связь может быть фосфодиэфиром.

В некоторых вариантах реализации антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 16 тиофосфатных связей. В некоторых вариантах реализации антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 15 тиофосфатных связей. В некоторых вариантах реализации антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 14 тиофосфатных связей. В некоторых вариантах реализации антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 13 тиофосфатных связей. В некоторых вариантах реализации антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 12 тиофосфатных связей. В некоторых вариантах реализации антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 11 тиофосфатных связей. В некоторых вариантах реализации антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 10 тиофосфатных связей. В некоторых вариантах реализации антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 9 тиофосфатных связей. В некоторых вариантах реализации антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 8 тиофосфатных связей.

В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, содержащие одну или более конъюгирующих групп, описанных в настоящем документе, обладают повышенной активностью и/или эффективностью, и/или переносимостью, по сравнению с исходным антисмысловым соединением, не имеющим такой одной или нескольких

конъюгирующих групп. Соответственно, в некоторых вариантах реализации присоединение таких конъюгирующих групп к олигонуклеотиду является желательным. Такие конъгирующей группы могут быть присоединены на 5'- и/или 3'-конце олигонуклеотида. В некоторых случаях синтетически желательно присоединение на 5'-конце. Как правило, олигонуклеотиды синтезируют присоединением 3'-концевого нуклеозида к твердой подложке с последующим связыванием нуклеозидов от 3' к 5' при помощи методик, общеизвестных в данной области техники. Соответственно, если конъгирующая группа необходима на 3'-конце, то можно (1) присоединить конъгирующую группу к 3'-концевому нуклеозиду и присоединить этот конъюгированный нуклеозид к твердой подложке для последующего получения олигонуклеотида или (2) присоединить конъгирующую группу к 3'-концевому нуклеозиду готового олигонуклеотида после синтеза. Ни один из этих подходов не является особенно эффективным, и поэтому оба они затратны. В частности, присоединение конъюгированного нуклеозида к твердой подложке, хотя и представлено в настоящем документе в разделе «Примеры», не является эффективным способом. В некоторых вариантах реализации присоединение конъгирующей группы к 5'-концевому нуклеозиду синтетически проще, чем присоединение к 3'-концу. Можно присоединить неконъюгированный 3'-концевой нуклеозид к твердой подложке и получить олигонуклеотид по стандартным и хорошо описанным реакциям. Затем нужно лишь присоединить 5'-нуклеозид, имеющий конъгирующую группу, на последней стадии связывания. В некоторых вариантах реализации это более эффективно, чем присоединение конъюгированнсго нуклеозида непосредственно к твердой подложке, как это обычно делают для получения 3'-конъюгированного олигонуклеотида. В представленных в настоящем документе Примерах показано присоединение к 5'-концу. Кроме того, некоторые группы конъюгатов имеют синтетические преимущества. Например, некоторые конъгирующей группы, содержащие фосфорные связывающие группы, получают синтетически проще и более эффективно, чем другие конъгирующей группы, включая конъгирующей группы, описанные ранее (например, WO/2012/037254).

В некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения вводят субъекту. В таких вариантах реализации антисмысловые соединения, содержащие одну или более конъюгирующих групп, описанных в настоящем документе, обладают повышенной активностью и/или эффективностью, и/или переносимостью, по сравнению с исходным антисмысловым соединением, не имеющим такой одной или нескольких

конъюгирующих групп. Не ограничиваясь механизмом, предполагается, что конъгирующая группа способствует распределению, доставке и/или поглощению в целевой клетке или ткани. В некоторых вариантах реализации, после попадания в целевую клетку или ткань желательно, чтобы вся или часть конъгирующей группы расщеплялась с высвобождением активного олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации не обязательно, чтобы из олигонуклеотида расщеплялась вся конъгирующая группа. Например, в Примере 20 конъюгированный олигонуклеотид вводили мышам и обнаруживали множество различных химических частиц, каждая из которых содержала различные части конъгирующей группы, оставшиеся на олигонуклеотиде (Таблица 10а). Это конъюгированное антисмысловое соединение показало хорошую эффективность (Таблица 10). Так, в некоторых вариантах реализации такой метаболитный профиль многократного частичного расщепления конъгирующей группы не влияет на активность/эффективность. Тем не менее, в некоторых вариантах реализации желательно, чтобы пролекарство (конъюгированный олигонуклеотид) давало одно активное соединение. В некоторых случаях, при обнаружении многочисленных форм активного соединения, может быть необходимо определить относительные количества и действие для каждой из них. В некоторых вариантах реализации, при необходимости регуляционного тестирования (например, FDA США или другого органа), желательно иметь одну (или преимущественно одну) активную частицу. В некоторых таких вариантах реализации желательно, чтобы такая одна активная частица представляла собой антисмысловый олигонуклеотид, не содержащий никаких частей конъгирующей группы. В некоторых вариантах реализации конъгирующей группы на 5'-конце более вероятно приводят к полному метаболизму конъгирующей группы. Не ограничиваясь механизмом, может быть, что эндогенные ферменты, отвечающие за метаболизм на 5'-конце (например, 5'-нуклеазы), более активны/эффективны, чем 3'-аналоги. В некоторых вариантах реализации определенные конъгирующей группы более подвержены метаболизму до одной активной частицы. В некоторых вариантах реализации некоторые конъгирующей группы более подвержены метаболизму до олигонуклеотида.

D. Антисенс

В некоторых вариантах реализации олигомерные соединения настоящего изобретения представляют собой антисмысловые соединения. В таких вариантах реализации олигомерное соединение комплементарно целевой нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации целевая нуклеиновая кислота представляет собой РНК. В некоторых

вариантах реализации целевая нуклеиновая кислота представляет собой некодирующую РНК. В некоторых вариантах реализации целевая нуклеиновая кислота кодирует белок. В некоторых вариантах реализации целевая нуклеиновая кислота выбрана из мРНК, пре-мРНК, микроРНК, некодирующей РНК, включая малую некодирующую РНК, и промотор-нацеливаемой РНК. В некоторых вариантах реализации олигомерные соединения по меньшей мере частично комплементарны более чем одной целевой нуклеиновой кислоте. Например, олигомерные соединения настоящего изобретения могут представлять собой миметики микроРНК, которые обычно связываются с несколькими мишенями.

В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения содержат часть, имеющую последовательность азотистых оснований, которая по меньшей мере на 70% комплементарна последовательности азотистых оснований целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения содержат часть, имеющую последовательность азотистых оснований, которая по меньшей мере на 80% комплементарна последовательности азотистых оснований целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения содержат часть, имеющую последовательность азотистых оснований, которая по меньшей мере на 90% комплементарна последовательности азотистых оснований целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения содержат часть, имеющую последовательность азотистых оснований, которая по меньшей мере на 95% комплементарна последовательности азотистых оснований целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения содержат часть, имеющую последовательность азотистых оснований, которая по меньшей мере на 98% комплементарна последовательности азотистых оснований целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения содержат часть, имеющую последовательность азотистых оснований, которая на 100% комплементарна последовательности азотистых оснований целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения по меньшей мере на 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или на 100% комплементарны последовательности азотистых оснований целевой нуклеиновой кислоты по всей длине антисмыслового соединения.

Антисмысловые механизмы включают любой механизм, затрагивающий гибридизацию олигомерного соединения с целевой нуклеиновой кислотой, при этом гибридизация приводит к биологическому эффекту. В некоторых вариантах реализации такая

гибридизация приводит либо к разрушению, либо к применению целевой нуклеиновой кислоты с сопутствующим подавлением или стимулированием клеточного механизма, затрагивающего, например, трансляцию, транскрипцию или полиаденилированией целевой нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты, с которой целевая кислота может взаимодействовать иным образом.

Один из типов антисмыслового механизма, затрагивающий разрушение целевой РНК представляет собой антисмысл, опосредованный РНКазой Н. РНКаза Н представляет собой клеточную эндонуклеазу, которая расщепляет спираль РНК дуплекса РНК: ДНК. В данной области техники известно, что односпиральные антисмысловые соединения, которые являются «ДНК-подобными», вызывают активность РНКазы Н в клетках млекопитающих. Следовательно, активация РНКазы Н приводит к расщеплению РНК-мишени, посредством этого в значительной степени усиливая эффективность подавления генной экспрессии, опосредованного ДНК-подобным олигонуклеотидом.

Антисмысловые механизмы включают также, без ограничения, РНКи механизмы, в которых используется путь RISC. Такие РНКи механизмы включают, без ограничения, миРНК, оцРНК и микроРНК механизмы. Такие механизмы включают создание миметика микроРНК и/или анти-микро РНК.

Антисмысловые механизмы включают также, без ограничения, механизмы, которые гибридизуют или имитируют некодирующую РНК, отличную от микроРНК или мРНК. Такие некодирующие РНК включают, но не ограничиваются ими, промотор-нацеленную РНК и малую и длинную РНК, которая влияет на транскрипцию или трансляцию одной или более нуклеиновых кислот.

В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды, содержащие описанные в настоящем документе конъюгаты, представляют собой РНКи соединения. В некоторых вариантах реализации олигомерные олигонуклеотиды, содержащие описанные в настоящем документе конъюгаты, представляют собой оцРНК соединения. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды, содержащие описанные в настоящем документе конъюгаты, спарены со вторым олигомерным соединением с образованием миРНК. В некоторых таких вариантах реализации второе олигомерное соединение также содержит конъюгат. В некоторых вариантах реализации второе олигомерное соединение представляет собой любую модифицированную или немодифицированную нуклеиновую кислоту. В некоторых

вариантах реализации олигонуклеотиды, содержащие описанные в настоящем документе конъюгаты, представляют собой антисмысловую цепь в миРНК соединении. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды, содержащие описанные в настоящем документе конъюгаты, представляют собой смысловую цепь в миРНК соединении. В тех вариантах реализации, в которых конъюгированное олигомерное соединение представляет собой двухцепочечную миРНК, конъюгат может находиться на смысловой цепи, антисмысловой цепи или и на смысловой цепи, и на антисмысловой цепи.

D. Целевые нуклеиновые кислоты, области и сегменты

В некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения нацелены на любую нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах реализации целевая нуклеиновая кислота кодирует белок-мишень, который является клинически значимым. В таких вариантах реализации модулирование целевой нуклеиновой кислоты призодит к клиническому преимуществу. Некоторые целевые нуклеиновые кислоты включают, но не ограничиваются ими, целевые нуклеиновые кислоты, представленные в Таблице 1.

Процесс таргетинга обычно включает определение по меньшей мере одной целевой области, сегмента или сайта в целевой нуклеиновой кислоте для антисмыслового взаимодействия с возникновением в результате такого желаемого эффекта.

В некоторых вариантах реализации целевая область представляет собой структурно определенную область нуклеиновой кислоты. Например, в некоторых таких вариантах реализации целевая область может охватывать 3' UTR, 5' UTR, экзон, интрон, кодирующую область, область инициации трансляции, область терминации трансляции или другую определенную область или целевой сегмент нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах реализации целевой сегмент представляет собой часть целевой области по меньшей мере примерно из 8 азотистых оснований, на которую нацелено конъюгированное антисмысловое соединение. Целевые сегменты могут содержать последовательности ДНК или РНК, которые содержат по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований от 5'-конца одного из целевых сегментов (остальные азотистые основания тянутся друг за другом из той же ДНК или РНК, начинаясь сразу перед 5'-концом целевого сегмента и продолжаясь до момента, когда ДНК или РНК будет содержать от около 8 до около 30 азотистых оснований). Целевые сегменты представлены также последовательностми ДНК или РНК, которые содержат по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований от 3'-конца одного из целевых сегментов (остальные азотистые основания тянутся друг за другом из той же ДНК или РНК, начинаясь сразу после 3'-конца целевого сегмента и продолжаясь до момента, когда ДНК или РНК будет содержать от около 8 до около 30 азотистых оснований). Целевые сегменты также могут быть представлены последовательностями ДНК или РНК, которые содержат по меньшей мере 8 смежных

азотистых оснований из внутренней части последовательности целевого сегмента, и могут тянуться в любом или в обоих направлениях до момента, когда конъюгированное антисмысловое соединение будет содержать от около 8 до около 30 азотистых оснований.

В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоты, перечисленные в Таблице 1, могут быть модифицированы так, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения могут иметь модифицированный сахарный фрагмент, немодифицированный сахарный фрагмент или смесь модифицированных и немодифицированных сахарных фрагментов, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения могут иметь модифицированная межнуклеозидная связь, немодифицированная межнуклеозидная связь или смесь модифицированных и немодифицированных межнуклеозидных связей, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения могут иметь модифицированное азотистое основание, немодифицированное азотистое основание или смесь модифицированных и немодифицированных азотистых оснований, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения могут иметь мотив, описанный в настоящем документе.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновые кислоты, перечисленные в Таблице 1, могут быть конъюгированы так, как описано в настоящем документе.

1. Протеин-тирозинфосфатаза 1В (РТР1В)

Протеин-тирозинфосфатаза 1В (РТР1В) является членом семейства РТР (Barford, et al., Science 1994. 263: 1397-1404) и цитозольным ферментом (Neel and Tonks, Curr. Opin. Cell Biol. 1997. 9: 193-204). РТР1В экспрессируется повсеместно, включая ткани, которые являются ключевыми регуляторами метаболизма инсулина, такие как печень, мышцы и жировая ткань (Goldstein, Receptor 1993. 3: 1-15), где она является главным ферментом РТР.

РТР1В считают отрицательным регулятором сигналинга инсулина. РТР1В взаимодействует с инсулировыми рецепторами и дефосфорилирует их, таким образом, ослабляя и потенциально прекращая сигналинг инсулина (Goldstein et al., J. Biol. Chem. 2000. 275: 4383-4389). Физиологическая роль РТР1В в сигналинге инсулина была показана в

моделях на нокаутных мышах. Мыши с недостатком гена РТР1В были защищены от инсулинорезистентности и ожирения (Elchebly et al., Science 1999. 283: 1544-1548). PTP1B-дефицитные мыши имели низкое содержание жира, повышенную исходную скорость метаболизма, а также общий расход энергии, и они были защищены от ожирения, вызванного питанием. Стимулированное инсулином потребление глюкозы было повышено в скелетных мышцах, тогда как жировая ткань осталась без изменений, что обеспечивает данные о том, что повышенная чувствительность к инсулину у PTPlB-дефицитных мышей была тканеспецифичной (Klaman et al., Mol. Cell. Biol. 2000. 20: 5479-5489). Эти мыши были фенотипически нормальными, а также устойчивыми к ожирению, вызванному питанием, инсулинорезистентности и имели значительно более низкие уровни триглицеридов при питании с высоким содержанием жиров. Следовательно, ингибирование РТР1В будет иметь преимущество у пациентов, страдающих от диабета II типа, метаболического синдрома, диабетической дислипидемии или родственных метаболических заболеваний.

Антисмысловое ингибирование РТР1В обеспечивает уникальное преимущество по сравнению с традиционными низкомолекулярными ингибиторами в том, что действие антисмысловых ингибиторов основано не на конкурентном связывании соединения с белком, а на прямом подавлении активности путем снижения экспрессии РТР1В. Антисмыеловая технология развивается как эффективное средство снижения экспрессии определенных генных продуктов, и, следовательно, может быть подтверждена ее уникальная полезность в ряде терапевтических, диагностических и исследовательских применений для модулирования РТР1В.

В настоящее время существует недостаток приемлемых возможностей лечения метаболических расстройств. Следовательно, задача настоящего изобретения заключается в обеспечении соединений и способов для лечения таких заболеваний и расстройств.

Все документы или части документов, которые упомянуты в настоящей заявке, включая, но не ограничиваясь ими, патенты, патентные заявки, статьи, книги и трактаты, в явной форме включены в настоящий документ путем ссылки в отношении фрагментов указанных документов, рассматриваемых в настоящем документе, а также в полном объеме.

Некоторые конъюгированные антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту РТР1В

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения нацелены на нуклеиновую кислоту РТР1В, имеющую последовательность с номером доступа GENBANK® NM_002827.2, включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 1 или с номером доступа GENBANK NT_011362.9, усеченную по нуклеотидам с 14178000 по 14256000 (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 2. В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарно SEQ ID NO: 1 и/или 2.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 54.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 55.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 56. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 56.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 57.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 142082 и конъгирующей группы. ISIS 142082 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Aes Aes Aes Tes Ges Gds Tds Tds Tds Ads Tds Tds mCds mCds Ads Tes Ges Ges mCes mCe, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 404173 и конъгирующей группы. ISIS 404173 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Aes Aes Tes Ges Ges Tds Tds Tds Ads Tds Tds mCds mCds Ads Tds Ges Ges mCes mCes Ae, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

е = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 409826 и конъгирующей группы. ISIS 409826 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges Ges Tes Tes Tes Ads Tds Tds mCds mCds Ads Tds Gds Gds mCds mCes Aes Tes Tes Ge, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

е = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 446431 и конъгирующей группы. ISIS 446431 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Aes Aes Tes Ges Gds Tds Tds Tds Ads Tds Tds mCds mCds Ads Tes Ges Ges mCe, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

е = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, описанный в US 7563884 и WO 2007/131237, которые включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 17-96 и 244-389, описанных в US 7563884, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 886-1552 в последовательностях SEQ ID NO WO 2007/131237, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, описанный в US 7563884 и WO 2007/131237, которые включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO, описанных a US 7563884 и WO 2007/131237, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. Последовательности азотистых оснований всех вышеупомянутых перечисленных SEQ ID NO включены в настоящий документ посредством ссылки.

Терапевтические показания РТР1В

В некоторых вариантах реализации в настоящем документе представлены способы лечения индивидуума, включающие введение одной или более конъюгированных фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения индивидуум страдает от заболевания, связанного с метаболизмом.

Как показано ниже в примерах, конъюгированные соединения, нацеленные на РТР1В, как описано в настоящем документе, демонстрировали снижение тяжести физиологических симптомов метаболических заболеваний, включая метаболический синдром, сахарный диабет, инсулинорезистентность, диабетическую дислипидемию, гипертриглицеридемию, ожирение и рост массы тела. В некоторых экспериментах конъюгированные соединения снижали уровни глюкозы в крови, например, животные продолжали испытывать симптомы, но эти симптомы были менее тяжкими, по сравнению с животными, не проходившими лечение. В то же время в других экспериментах конъюгированные соединения снижали

симптомы диабета; например, животные, проходившие лечение в течение более продолжительного периода времени, испытывали менее тяжкие симптомы, чем животные, которым вводили эти соединения в течение более короткого периода времени. В то же время в других экспериментах конъюгированные соединения замедляли прирост массы тела; например, животные, проходившие лечение в течение более продолжительного периода времени, испытывали менее тяжкие симптомы, чем животные, которым вводили эти соединения в течение более короткого периода времени. В то же время в других экспериментах конъюгированные соединения подавляли гипертриглицеридемию; например, животные, проходившие лечение в течение более продолжительного периода времени, испытывали менее тяжкие симптомы, чем животные, которым вводили эти соединения в течение более короткого периода времени. Следовательно, способность конъюгированных соединений, представленных ниже в примерах, восстанавливать функцию демонстрирует, что симптомы заболевания могут быть реверсированы путем лечения с применением соединения, описанного в настоящем документе.

Сахарный диабет характеризуется рядом физических и физиологических симптомов. Любой симптом, известный специалистам в данной области техники как связанный с диабетом 2 типа, может быть облегчен или иным образом изменен, как указано выше в описанных выше способах. В некоторых вариантах реализации изобретения симптом представляет собой физический симптом, выбранный из группы, состоящей из повышенных уровней глюкозы, повышенного прироста массы тела, частого мочеиспускания, необычной жажды, чрезмерного чувства голода, избыточной утомляемости, расплывчатого зрения, частых инфекций, покалывания или онемения конечностей, сухой и зудящей кожи, потери массы тела, медленно заживающих ран и набухших десен.

В некоторых вариантах реализации изобретения симптом представляет собой физиологический симптом, выбранный из группы, состоящей из повышенной инсулинорезистентности, повышенных уровней глюкозы, повышенной жировой массы, сниженной скорости метаболизма, сниженного клиренса глюкозы, сниженной переносимости глюкозы, сниженной чувствительности к инсулину, сниженной печеночной чувствительности к инсулину, повышенного размера и массы жировой ткани, повышенного уровня телесного жира и повышенной массы тела.

Ученые Liu и Chernoff показали, что РТР1В связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и служит субстратом для него (Liu and Chernoff, Biochem. J., 1997, 327, 139-145). Кроме того, было обнаружено, что РТ1В в клетках человеческой эпидермоидной

карциномы А431 инактивируется в присутствии H₂O₂, образующегося при добавлении EGF. Эти исследования показывают, что РТР1В может отрицательно регулироваться за счет окислительного состояния клетки, которая зачастую дерегулируется во время опухолегенеза (Lee et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 15366-15372).

Сверхэкспрессия РТР1В была продемонстрирована в злокачественных раковых образованиях яичников, и эта корреляция сопровождалась сопутствующим увеличением экспрессии ассоциированного рецептора фактора роста (Wiener et al., Am. J. Obstet: Gynecol., 1994, 170, 1177-1183).

Было показано, что РТР1В подавляет трансформацию в клетках NIH3T3, вызванную онкогеном neu (Brown-Shimer et al., Cancer Res.,1992, 52, 478-482), а также в фибробластах крыс 3Y1, вызванную v-srk, v-src и v-ras (Liu et al., Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 250-259), и в крысиных фибробластах 1, вызванную bcr-abl (LaMontagne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 95, 14094-14099). Также было показано, что РТР1В ускоряет дифференцировку клеток K562, клеточной линии хронического миелогенного лейкоза, таким же образом, кал ингибитор онкобелка bcr-abl. Эти исследования описывают возможную роль РТР1В в контролировании патогенеза хронического миелоидного лейкоза (LaMontagne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 95, 14094-14099).

Соответственно, в настоящем документе представлены способы облегчения симптома, связанного с гиперпролиферативными расстройствами, у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах реализации изобретения гиперпролиферативное расстройство представляет собой рак. В некоторых вариантах реализации в настоящем документе представлены способы облегчения симптома, связанного с раком. В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения скорости возникновения симптома, связанного с гиперпролиферативными расстройствами. В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения скорости возникновения симптома, связанного с раком. В некоторых вариантах реализации представлен способ уменьшения тяжести симптома, связанного с гиперпролиферативными расстройствами. В некоторых вариантах реализации изобретения представлен способ уменьшения тяжести симптома, связанного с раком. В таких вариантах реализации указанные способы включают введение терапевтически эффективного количества соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту РТР1В, индивидууму, нуждающемуся в этом.

В некоторых вариантах реализации представлены способы лечения индивидуума, включающие введение одной или более конъюгированных фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения индивидуум страдает от заболевания, связанного с метаболизмом.

В некоторых вариантах реализации введение антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту РТР1В, приводит к снижению экспрессии РТР1В по меньшей мере на около 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или в диапазоне, определенном любыми двумя из этих значений.

В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции, включающие антисмысловое соединение, нацеленное на РТР1В, используют для получения лекарственных средств для лечения пациента, страдающего от или восприимчивого к метаболическому заболеванию.

В некоторых вариантах реализации изобретения способы, описанные в настоящем документе, включают введение соединения, содержащего конъгирующую группу и модифицированный олигонуклеотид, имеющий непрерывную часть азотистых оснований, как описано в настоящем документе, последовательности, указанной в SEQ ID NO: 54-57.

Следует понимать, что любые соединения, описанные в настоящем документе, могут быть использованы в вышеупомянутых способах и применениях. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту РТР1В в вышеупомянутых способах и применениях, может содержать, но не ограничивается им, конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, которое содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 54-57; конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, которое содержит последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 54-57; соединение, содержащее или состоящее из ISIS 142082, ISIS 404173, ISIS 409826 или ISIS 446431 и конъгирующей группы; соединение, содержащее антисмысловый олигонуклеотид, описанный в US 7563884 и WO 2007/131237, которые включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, и конъгирующую группу; соединение, содержащее антисмысловые олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 17-96 и 244-389, описанных в US 7563884, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе; или соединение, содержащее антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых

оснований любой из SEQ ID NO 886-1552, описанных в WO 2007/131237, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе.

2. FGFR4

Ожирение считают долговременным метаболическим заболеванием. Существует несколько тяжелых медицинских осложнений, связанных с ожирением. Во всем мире насчитывается свыше 1 миллиарда людей с избыточным весом, из них 100 миллионов имеют клиническое ожирение. Растущие затраты на здравоохранение для лечения заболеваний, связанных с ожирением, только в США оценивают ежегодно в сумму более 100 миллиардов долларов. Существующие способы лечения ожирения включают изменение поведения, диету, хирургическое вмешательство (гастропластику), введение фармацевтических агентов, которые блокируют сигналы, стимулирующие аппетит, или абсорбцию питательных веществ (жира), а также введение агентов, которые увеличивают термогенез или метаболизм жира. Некоторые из этих способов имеют такие недостатки, что они основаны на решении пациента, являются инвазивными или имеют неблагоприятные побочные эффекты. Понимание механизмов, по которым регулируется ожирение, может обеспечить важную терапевтическую информацию.

Ожирение зачастую связано с инсулинорезистентностью, и оба эти фактора представляют собой факторы риска дальнейшего развития диабета 2 типа и сердечнососудистых заболеваний. Инсулинорезистентность возникает гораздо раньше развития диабета 2 типа, при этом происходит избыточная выработка инсулина для компенсаций инсулинорезистентности и сохранения нормальных уровней глюкозы. За ним следует диабет 2 типа, поскольку поджелудочная железа больше не может вырабатывать достаточное количество инсулина для поддержания нормальных уровней глюкозы. Ранние стадии диабета 2 типа связаны с повышенными уровнями инсулина, но при прогрессировании заболевания поджелудочная железа может перестать вырабатывать инсулин, что приводит к повышению уровней глюкозы в крови. Диабет представляет собой существенный фактор риска и для заболеваний сердца, и для инсульта, и является главной причиной слепоты и конечной стадии почечной недостаточности.

Диабет представляет собой расстройтсво, которое характеризуется гиперглицемией на фоне недостаточного действия инсулина, которое может быть обусловлено пониженной выработкой инсулина или инсулинорезистентностью, или обоими факторами. Сахарный

диабет представляет собой полигенное расстройство, поражающее значительное количество людей во всем мире. Его подразделяют на два типа. При диабете I типа, или инсулинозависимом сахарном диабете (IDDM) в организме пациентов вырабатывается мало или совсем не вырабатывается инсулин, гормон, который регулирует утилизацию глюкозы. При диабете 2 типа, или инсулинонезависимом сахарном диабете (NIDDM) уровни инсулина в плазме пациентов зачастую сравнимы с уровнями в плазме людей, не страдающих диабетом; однако у этих пациентов развилась резистентность к инсулиностимулирующему действию глюкозы и метаболизму липидов в главных инсулиночувствительных тканях, т.е. мышцах, печени и адипозной тканях, а уровни инсулина в плазме недостаточны для преодоления выраженной инсулинорезистентности. Кроме того, глюкотоксичность, которая возникает в результате длительной гиперглицемии, вызывает тканезависимую инсулинорезистентность (Nawano et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 278, E535-543), обостряя заболевание. На долю диабета 2 типа приходится более 90% всех случаев диабета. Он представляет собой метаболическое расстройство, которое характеризуется гиперглицемией, приводящей к вторичным осложнениям, таким как нейропатия, нефропатия, ретинопатия, гипертриглицеридемия, ожирение и другие сердечно-сосудистые заболевания, обычно упоминаемые как метаболический синдром.

Метаболический синдром представляет собой комбинацию медицинских нарушений, которые повышают риск развития у пациента сердечно-сосудистых заболеваний и диабета. Сисетомы, включая высокое кровяное давление, высокий уровень триглицеридов, сниженное содержание HDL и ожирение, обычно проявляются у некоторых индивидуумов совместно. Метаболический синдром известен под многочисленными другими названиями, такими как (метаболический) синдром X, синдром инсулинорезистентности или синдром Ривена.

Диабет и ожирение (иногда в совокупности упоминаемые как («диажирение») взаимосвязаны так, что ожирение, как известно, отягощает патологию диабета, и более 60% больных диабетом страдают также от ожирения. Большинство случаев ожирения у людей связано с инсулинорезистентностью и резистентностью к лептину. Фактически, было сделано предположение, что ожирение может оказывать еще большее влияние на действие инсулина, чем сам диабет (Sindelka et al., Physiol Res., 51, 85-91). Кроме того, известно, что некоторые соединения, имеющиеся на рынке для лечения диабета, вызывают увеличение массы, что является крайне нежелательным побочным эффектом при лечении этого заболевания.

Поэтому соединение, которое обладает способностью лечить диабет и ожирение, обеспечит существенное улучшение существующих способов лечения.

Рецептор фактора роста фибробластов 4 (известный также как рецептор FGF-4, TKF; тирозинкиназа, связанная с рецептором фактора роста фибробластов; гидроксиарил-протеинкиназа; тирозилпротеинкиназа; Fgfr4; FGFR-4; FGFR4; CD334, FGFR4_HUMAN и JTK2) обладает высокой аффинностью к кислотным и/или основным факторам роста фибробластов. (Armstrong et al., Genes Chromosomes Cancer, 4, 94-98).

Хотя было показано, что FGFR, в целом, имеют широкое распределение в организме, в настоящее время в некоторых тканях был обнаружен только FGFR4. Среди большого разнообразия испытанных клеток и тканей, включая человеческие лимфоциты и макрофаги, было обнаружено, что FGFR4 экспрессируется в легких и в некоторых легочных опухолях, а также в злокачественных образованиях, полученных из тканей, не относящихся к легким. (Holtrich et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 88, 10411-10415). Было также обнаружено, что FGFR4 экспрессируется в печеночной и жировой ткани. (Patel et al., JCEM, 90(2), 1226-1232). Было обнаружено также, что FGFR4 экспрессируется в некоторых клеточных линиях карцином. (Bange et al., Cancer Res., 62, 840-847).

Кроме того, было показано, что FGFR4 играет роль в системном гомеостазе липидов и глюкозы. PGFR4-дефицитные мыши при нормальном питании продемонстрировали симптомы метаболического синдрома, которые включают увеличенную массу, инсулинорезистентность, а также гиперхолестеринемию. Было показано, что недостаток FGFR4 способствует жировой дегенерации печени, инициированной питанием с высоким содержанием жиров, в некоторых моделях мышей с ожирением, что коррелирует также с метаболическим синдромом. Возвращение FGFR4, особенно в гепатоциты FGFR4-дефицитных мышей, снижает уровень липидов в плазме и приводит к выздоровлению от жировой дегенерации печени, инициированной питанием с высоким содержанием жиров, но не приводит к восстановлению переносимости глюкозы и чувствительности к инсулину. (Huang et al., Diabetes, 56, 2501-2510).

Антисмысловое ингибирование FGFR4 обеспечивает уникальное преимущество по сравнению с традиционными низкомолекулярными ингибиторами в том, что действие антисмысловых ингибиторов основано не на конкурентном связывании соединения с белком, а на прямом подавлении активности путем снижения экспрессии FGFR4. Типичный патент

Соединенных штатов Америки, в котором представлены антисмысловые ингибиторы FGFR4, включает публикацию патента США № US 2010/0292140, которая включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Антисмысловая технология развивается как эффективное средство снижения экспрессии определенных генных продуктов, и, следовательно, может быть подтверждена ее уникальная полезность в ряде терапевтических, диагностических и исследовательских применений для модулирования FGFR4.

В настоящее время существует недостаток приемлемых возможностей лечения метаболических расстройств. Следовательно, задача настоящего изобретения заключается в обеспечении соединений и способов для лечения таких заболеваний и расстройств. Настоящее изобретение относится к открытию новых, высокоэффективных ингибиторов генной экспрессии FGFR4.

Все документы или части документов, которые упомянуты в настоящей заявке, включая, но не ограничиваясь ими, патенты, патентные заявки, статьи, книги и трактаты, в явной форме включены в настоящий документ путем ссылки в отношении фрагментов указанных документов, рассматриваемых в настоящем документе, а также в полном объеме.

Некоторые конъюгированные антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту FGFR4

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения нацелены на нуклеиновую кислоту FGFR4, имеющую последовательность с номером доступа GENBANK NM_002011.3, включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 3), с номером доступа GENBANK: NT_023133.11, усеченную по нуклеозидам с 21323018 по 21335213 (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 4); и с номером доступу GENBANK AB209631.1, включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 5); и с номером доступа GENBANK NM_022963.2 (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 6). В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3-6, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарно SEQ ID NO: 3-6.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 58-65. В некоторых вариантах реализации изобретения

конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 12-19.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 58. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 59.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 59. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 59.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 60. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 60.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 61. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 61.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 62. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 62.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 63. В некоторых вариантах реализации

изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 63.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 64. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 64.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 65.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 299005 и конъгирующей группы. ISIS 299005 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges Ges mCes Aes mCes Ads mCds Tds mCds Ads Gds mCds Ads Gds Gds Aes mCes mCes mCes mCe, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 463588 и конъгирующей группы. ISIS 463588 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges mCes Aes mCes Aes mCds Tds mCds Ads Gds mCds Ads Gds Gds Ads mCes mCes mCes mCes mCe, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

e = 2'-О-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 463589 и конъгирующей группы. ISIS 463589 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Aes Ges Ges mCes Aes mCds Ads mCds Tds mCds Ads Gds mCds Ads Gds Ges Aes mCes mCes mCe, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

е = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 463690 и конъгирующей группы. ISIS 463690 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges mCes mCes Aes Ges Gds mCds Gds Ads mCds Tds Gds mCds mCds mCds Tes mCes mCes Tes Те, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

е = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 463691 и конъгирующей группы. ISIS 463691 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Tes Ges mCes mCes Aes Gds Gds mCds Gds Ads mCds Tds Gds mCds mCds mCes Tes mCes mCes Те, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

е = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 463835 и конъгирующей группы. ISIS 463835 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: mCes Ges mCes Tes mCes Tds mCds mCds Ads Tds mCds Ads mCds Gds Ads Ges Aes mCes Tes mCe, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 463837 и конъгирующей группы. ISIS 463837 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: mCes Aes mCes Ges mCes Tds mCds Tds mCds mCds Ad; Tds mCds Ads mCds Ges Aes Ges Aes mCe, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 464225 и конъгирующей группы. ISIS 464225 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: mCes Tes Tes mCes mCes Ads Gds mCds Tds Tds mCds Tds mCds Tds Gds Ges Ges mCes Tes mCe, где

А = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

е = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, описанный в WO 2009/046141, который включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, и конъгирующую группу. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 21-24, 28, 29, 36, 38, 39, 43, 48, 51, 54-56, 58-60, 64-66, 92-166, описанных в WO 2009/046141, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований, комплементарную предпочтительному целевому сегменту любой из SEQ ID NO 21-24, 28, 29; 36, 38, 39, 43, 48, 51, 54-56, 58-60, 64-66, 92-166, описанных в WO 2009/046141 и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. Последовательности азотистых оснований всех вышеупомянутых перечисленных SEQ ID NO включены в настоящий документ посредством ссылки.

Терапевтические показания FGFR4

В некоторых вариантах реализации в настоящем документе представлены способы лечения индивидуума, включающие введение одной или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения индивидуум страдает от метаболического заболевания.

Как показано ниже в примерах, конъюгированные соединения, нацеленные на FGFR4, как описано в настоящем документе, демонстрируют снижение тяжести физиологических симптомов метаболического заболевания, включая ожирение или адипозность,

метаболический синдром, сахарный диабет, инсулинорезистентность, диабетическую дислипидемию и гипертриглицеридемию. В некоторых экспериментах конъюгированные соединения снижали массу тела, например, животные продолжали испытывать симптомы, но эти симптомы были менее тяжкими, по сравнению с животными, не проходившими лечение. В некоторых экспериментах конъюгированные соединения снижали содержание телесного жира, например, животные продолжали испытывать симптомы, но эти симптомы были менее тяжкими, по сравнению с животными, не проходившими лечение. В некоторых экспериментах конъюгированные соединения снижали содержание жировой ткани, например, животные продолжали испытывать симптомы, но эти симптомы были менее тяжкими, по сравнению с животными, не проходившими лечение. Однако в других экспериментах конъюгированные соединения снижали симптомы ожирения; например, животные, проходившие лечение в течение более продолжительного периода времени, испытывали менее тяжкие симптомы, чем животные, которым вводили эти соединения в течение более короткого периода времени. Однако в других экспериментах конъюгированные соединения снижали симптомы диабета; например, животные, проходившие лечение в течение более продолжительного периода времени, испытывали менее тяжкие симптомы, чем животные, которым вводили эти соединения в течение более короткого периода времени. В то же время в других экспериментах конъюгированные соединения замедляли прирост массы тела; например, животные, проходившие лечение в течение более продолжительного периода времени, испытывали менее тяжкие симптомы, чем животные, которым вводили эти соединения в течение более короткого периода времени. В то же время в других экспериментах конъюгированные соединения снижали уровни глюкозы; например, животные, проходившие лечение в течение более продолжительного периода времени, испытывали менее тяжкие симптомы, чем животные, которым вводили эти соединения в течение более короткого периода времени. В то же время в других экспериментах конъюгированные соединения усиливали окисление жирных кислот; например, животные, проходившие лечение в течение более продолжительного периода времени, испытывали менее тяжкие симптомы, чем животные, которым вводили эти соединения в течение более короткого периода времени. Следовательно, способность конъюгированных соединений, представленных ниже в примерах, восстанавливать функцию демонстрирует, что симптомы заболевания могут быть реверсированы путем лечения с применением соединения, описанного в настоящем документе.

Ожирение характеризуется рядом физических и физиологических симптомов. Любой симптом, известный специалистам в данной области техники как связанный с ожирением, может быть облегчен или иным образом изменен, как указано выше в описанных выше способах. В некоторых вариантах реализации изобретения симптом представляет собой физический симптом, выбранный из группы, состоящей из повышенной массы жировой ткани или массы тела, повышенного приросту массы тела, повышенной массы жировой подушки, дисбаланса между потреблением калорий и расходом энергии, повышения содержания телесного жира, повышения массы тела, индекса массы тела (ИМТ), составляющего 30 или более, повышения размера тела, повышенного потоотделения, апноэ во сне, нарушений сна, неспособности справляться с неожиданной физической активностью, сонливости, нарушений в спине и суставах, усиления одышки, увеличения ожирения в области груди, увеличения размера или содержания жира в брюшной области, избыточного чувства голода или чрезмерной усталости.

В некоторых вариантах реализации изобретения симптом представляет собой физиологический симптом, выбранный из группы, состоящей из высокого кровяного давления, гипертензии, высоких уровней холестерина, диабета 2 типа, инсульта, сердечной недостаточности, болезни сердца, обструкции коронарной артерии, рака молочной железы у женщин, желудочно-пищеводного рефлюкса, артроза бедер и коленей и сниженной ожидаемой продолжительности жизни.

В некоторых вариантах реализации изобретения физический симптом представляет собой избыточную массу тела. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой избыточную массу жира. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой индекс массы тела, равный 30 или более. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой одышку. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой повышенное потоотделение. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой апноэ во сне. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой нарушение сна. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой неспособность справляться с неожиданной физической активностью. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой сонливость. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой нарушения в спине и суставах.

В некоторых вариантах реализации изобретения физиологический симптом представляет собой повышенное кровяное давление. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой гипертензию. В некоторых вариантах реализации симптом

представляет собой высокие уровни холестерина. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой диабет 2 типа. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой инсульт. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой сердечную недостаточность. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой болезнь сердца. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой обструкцию коронарной артерии. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой рак груди у женщин. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой желудочно-пищеводный рефлюкс. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой артроз бедер и коленей. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой сниженную ожидаемую продолжительность жизни.

Сахарный диабет характеризуется рядом физических и физиологических симптомов. Любой симптом, известный специалистам в данной области техники как связанный с диабетом 2 типа, может быть облегчен или иным образом изменен, как указано выше в описанных выше способах. В некоторых вариантах реализации изобретения симптом представляет собой физический симптом, выбранный из группы, состоящей из повышенных уровней глюкозы, повышенного роста массы тела, частого мочеиспускания, необычной жажды, чрезмерного чувства голода, избыточной утомляемости, расплывчатого зрения, частых инфекций, покалывания или онемения конечностей, сухой и зудящей кожи, потери массы тела, медленно заживающих ран и набухших десен.

В некоторых вариантах реализации изобретения симптом представляет собой физиологический симптом, выбранный из группы, состоящей из повышенной инсулинорезистентности, повышенных уровней глюкозы, повышенной жировой массы, сниженной скорости метаболизма, сниженного клиренса глюкозы, сниженной переносимости глюкозы, сниженной чувствительности к инсулину, сниженной печеночной чувствительности к инсулину, повышенного размера и массы жировой ткани, увеличенного телесного жира и повышенной массы тела.

В некоторых вариантах реализации изобретения физический симптом представляет собой повышенный прирост массы тела. В некоторых вариантах реализации симптом. представляет собой частое мочеиспускание. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой необычную жажду. В некоторых вариантах реализации симптом представляет чрезмерное чувство голода. В некоторых вариантах реализации симптом представляет чрезмерную усталость. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой расплывчатое зрение. В некоторых вариантах реализации симптом

представляет собой частые инфекционные заболевания. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой покалывание или онемение конечностей. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой сухую и зудящую кожу. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой потерю массы тела. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой медленно заживающие раны. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой набухшие десна. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой повышенную инсулинорезистентность. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой повышенную массу жира. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой сниженную скорость метаболизма. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой сниженный клиренс глюкозы. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой сниженную переносимость глюкозы. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой сниженную чувствительность к инсулину. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой сниженную чувствительность к инсулину в печени. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой увеличенный размер и массу жировой ткани. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой повышенное содержание телесного жира. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой повышенную массу тела.

В некоторых вариантах реализации представлены способы лечения индивидуума, включающие введение одной или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения индивидуум страдает от заболевания, связанного с метаболизмом.

В некоторых вариантах реализации введение конъюгированного антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту FGFR4, приводит к снижению экспрессии FGFR4 по меньшей мере на около 15, 20, 25, 30, 35, 40,45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или в диапазоне, определенном любыми двумя из этих значений.

В некоторых вариантах реализации, фармацевтические композиции, включающие антисмысловое соединение, нацеленное на FGFR4, используют для получения лекарственных средств для лечения пациента, страдающего от или восприимчивого к метаболическому заболеванию.

В некоторых вариантах реализации изобретения способы, описанные в настоящем документе, включают введение конъюгированного соединения, содержащего

модифицированный олигонуклеотид, имеющий непрерывную часть азотистых оснований, как описано в настоящем документе, последовательности, указанной в SEQ ID NO: 58-65.

Следует понимать, что любые соединения, описанные в настоящем документе, могут быть использованы в вышеупомянутых способах и применениях. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту FGFR4 в вышеупомянутых способах и применениях, может содержать, но не ограничивается им, конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, которое содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 58-65; конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 3, которое содержит последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 58-65; соединение, которое содержит или состоит из ISIS 299005, ISIS 463588, ISIS 463589, ISIS 463690, ISIS 463691, ISIS 463835, ISIS 463837 или ISIS 464225 и конъгирующей группы; соединение, которое содержит антисмысловый олигонуклеотид, описанный в WO 2009-046141, который включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, и конъгирующую группу; соединение, содержащее антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований лбой из SEQ ID NO 21-24, 28, 29, 36, 38, 39, 43, 48, 51, 54-56, 58-60, 64-66, 92-166, описанных в WO 2009/046141, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе; или соединение, содержащее антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований, комплементарную предпочтительному целевому сегменту любой из SEQ ID NO 21-24, 28, 29, 36, 38, 39, 43, 48, 51, 54-56, 58-60, 64-66, 92-166, описанных в WO 2009/046141, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. Последовательности азотистых оснований всех вышеупомянутых перечисленных SEQ ID NO включены в настоящий документ посредством ссылки.

3. GCCR

Диабет представляет собой хроническое метаболическое расстройство, которое характеризуется нарушенной секрецией и/или действием инсулина. При диабете 2 типа (T2DM) инсулинорезистентность приводит к неспособности инсулина регулировать активность глюконеогенных ферментов, и многие субъекты демонстрируют также ненадлежащие уровни циркулирующего глюкагона (GC) в состоянии натощак и после еды. Глюкагон секретируется из α-клеток панкреатических островков и регулирует гомеостаз

глюкозы путем модулирования выработки глюкозы в печени (Quesada et al., J. Endocrinol. 2008. 199: 5-19).

Глюкагон действует на целевые ткани путем активации глюкокортикоидного рецептора (GCCR). Глюкокортикоидный рецептор представляет собой белок размером 62 кДа, который является членом класса В семейства рецепторов, связанных с G-белком (Brubaker et al., Recept. Channels. 2002. 8: 179-88). Активация GCCR приводит к сигналингу G-белками (G_sα и G_q), посредством чего G_sα активирует аденилатциклазу, которая вызывает выработку цАМФ, что приводит к повышению уровней протеинкиназы А. Сигналинг GCCR в печени приводит к повышенной выработке глюкозы в печени путем инициации гликогенолиза и глюконеогенеза наряду с подавлением гликогенеза (Jiang and Zhang. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2003. 284: E671-E678). GCCR экспрессируется также во внепеченочных тканях, которые включают сердце, гладкую мускулатуру кишечника, почки, головной мозг и жировую ткань (Hansen et al., Peptides. 1995. 16: 1163-1166).

Разработка ингибиторов GCCR затруднена неблагоприятными побочными эффектами, связанными с системным подавлением GCCR, включая активацию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (НРА) оси. Подавление активности GCCR в головном мозге может приводить к повышению циркулирующего адренокортикотропного гормона из-за обратной регуляции и последующего повышения секреции стероидов надпочечников (Philibert et at., Front. Horm. Res. 1991. 19: 1-17). Это, в свою очередь, может вызывать множество отрицательных хронических побочных эффектов, связанных со стероидами. В других, исследованиях было показано, что специфическая активация GCCR приводит к гипоглицемии при длительном воздержании от пищи (Opherk et al., Mol. Endocronol. 2004. 58: 1346-1353).

Ранее в доклинических моделях было показано, что введение GCCR антисмысловых олигонуклеотидов приводит к тканеспецифическому накоплению и снижению экспрессии GCCR в печени и жировой ткани (публикация РСТ № WO 2005/071080; публикация РСТ № WO 2007/035759) без изменения уровней мРНК GCCR в ЦНС или надпочечниках. Так, было показано, что антисмысловое ингибирование экспрессии мРНК GCCR улучшает гипергликемию и гиперлипидемию без активации оси НРА. В настоящем изобретении представлены композиции и способы модулирования экспрессии GCCR. В вышеупомянутых опубликованных патентных заявках описаны антисмысловые соединения для модулирования экспрессии GCCR. Однако сохраняется необходимость в дополнительных,

усовершенствованных соединениях. Соединения и способы лечения, описанные в настоящем документе, обеспечивают значительное преимущество, по сравнению с возможностями лечения, которые существуют в настоящее время для лечения расстройств, связанных с GCCR. Все документы или части документов, которые упомянуты в настоящей заявке, включая, но не ограничиваясь ими, патенты, патентные заявки, статьи, книги и трактаты, в явной форме включены в настоящий документ путем ссылки в отношении фрагментов указанных документов, рассматриваемых в настоящем документе, а также в полном объеме. Некоторые конъюгированные антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту GCCR

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения нацелены на нуклеиновую кислоту GCCR, имеющую последовательность, комплемент GENBANK с номером доступа NT_029289.10, усеченную по нуклеозидам с 3818000 по 3980000 (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 7). В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарно SEQ ID NO: 7.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 66-77. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 66-77.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 66.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO; 7, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 67.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 68.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 69. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 69.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 70. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 70.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 71. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 71.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 72.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 73. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 73.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 74. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 74.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 75. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 75.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 76. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 76.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 77. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 77.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 420470 и конъгирующей группы. ISIS 420470 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges Ges Tes Aes Ges Ads Ads Ads Tds Ads Tds Ads Gds Tds Tds Ges Tes Tes mCes mCe, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 420476 и конъгирующей группы. ISIS 420476 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Tes Tes mCes Aes Tes Gds Tds Gds Tds mCds Tds Gds mCds Ads Tds mCes Aes Tes Ges Те, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

е = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 426115 и конъгирующей группы. ISIS 426115 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges mCes Aes Ges mCes mCds Ads Tds Gds Gds Tds Gds Ads Tds mCds Aes Ges Ges Aes Ge, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

е = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 426130 и конъгирующей группы. ISIS 426130 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges mCes Aes Tes mCes mCds Ads Gds mCds Gds Ads Gds mCds Ads mCds mCes Aes Aes Aes Ge, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

е = 2'-O-метоксиэтил-модифициро ванный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 426168 и конъгирующей группы. ISIS 426168 представляет собой модифицированный

олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges Tes mCes Tes Ges Gds Ads Tds Tds Ads mCds Ads Gds mCds Ads Tes Aes Aes Aes mCe, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 426172 и конъгирующей группы. ISIS 426172 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: mCes mCes Tes Tes Ges Gds Tds mCds Tds Gds Gds Ads Tds Tds Ads mCes Aes Ges mCes Ae, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 426183 и конъгирующей группы. ISIS 426183 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Aes Ges mCes mCds Ads Tds Gds Gds Tds Gds Ads Tds mCds Ads Gds Gds Ads Ges Ges mCe, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

е = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 426246 и конъгирующей группы. ISIS 426246 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges Ges Tes mCds Tds Gds Gds Ads Tds Tds Ads mCds Ads Gds mCds Ads Tds Aes Aes Ae, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

е = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 426261 и конъгирующей группы. ISIS 426261 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Aes Ges mCds mCds Ads Tds Gds Gds Tds Gds Ads Tds mCds Ads Gds Ges Aes Ges Ges mCe, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

е = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 426262 и конъгирующей группы. ISIS 426262 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: mCes Aes Gds mCds mCds Ads Tds Gds Gds Tds Gds Ads Tds mCds Ads Ges Ges Aes Ges Ge, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 426267 и конъгирующей группы. ISIS 426267 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges Tes Gds mCds Tds Tds Gds Tds mCds mCds Ads Gds Gds Ads Tds Ges Aes Tes Ges mCe, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 426325 и конъгирующей группы. ISIS 426325 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: mCes mCes Tds Tds Gds Gds Tds mCds Tds Gds Gds Ads Tds Tds Ads mCes Aes Ges mCes Ae, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

е = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, описанный в WO 2005/071080, WO 2007/035759 или WO 2007/136988, которые включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, и конъгирующую группу. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 30-216 и 306-310, описанных в WO 2005/071080, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 26-113, описанных в WO 2007/035759, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 413-485, описанных в WO 2007/136988, и конъгирующую группу, описанную ^р. настоящем документе. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований, комплементарную предпочтительному целевому сегменту любой из SEQ ID NO 30-216 и 306-310, описанных в WO 2005/071080, 26-113, описанных в WO 2007/035759, и 413-485, описанных в WO 2007/136988, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. Последовательности азотистых оснований всех вышеупомянутых перечисленных SEQ ID NO включены в настоящий документ посредством ссылки.

Терапевтические показания GCCR

В некоторых вариантах реализации в настоящем документе представлены способы лечения индивидуума, включающие введение одной или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения индивидуум страдает от заболевания, связанного с метаболизмом.

Как показано ниже в примерах, конъюгированные соединения, нацеленные на GCCR, как описано в настоящем документе, демонстрируют снижение тяжести физиологических симптомов заболеваний, связанных с метаболизмом, включая метаболический синдром, сахарный диабет, инсулинорезистентность, диабетическую дислипидемию, гипертриглицеридемию, ожирение и рост массы тела, например, животные продолжали испытывать симптомы, но эти симптомы были менее тяжкими, по сравнению с животными, не проходившими лечение. В некоторых экспериментах конъюгированные соединения снижали уровни глюкозы в крови. В других экспериментах конъюгированные соединения уменьшают симптомы диабета. В других экспериментах конъюгированные соединения замедляют прирост массы тела. В других экспериментах конъюгированные соединения замедляют гипертриглицеридемию. В некоторых вариантах реализации конъюгированные соединения восстанавливают функцию, демонстрируя, таким образом, реверсирование заболевания путем лечения соединением, описанным в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации животные, которые подвергались лечению в течение более продолжительного периода времени, испытывали менее тяжкие симптомы, чем животные, которым соединения вводили в течение более короткого периода времени.

Сахарный диабет характеризуется рядом физических и физиологических признаков и/или симптомов. Любой симптом, известный специалистам в данной области техники как связанный с диабетом 2 типа, может быть облегчен или иным образом изменен, как указано выше в описанных выше способах. В некоторых вариантах реализации изобретения признак или симптом представляет собой физический симптом, такой как повышенные уровни глюкозы, повышенный рост массы тела, частое мочеиспускание, необычная жажда, чрезмерное чувство голода, избыточная утомляемость, расплывчатое зрение, частые инфекционные заболевания, покалывание или онемение конечностей, сухая и зудящая кожа, потеря массы тела, медленно заживающие ран и набухшие десна. В некоторых вариантах реализации изобретения признак или симптом симптом представляет собой физиологический симптом, такой как повышенная инсулинорезистентность, повышенные уровни глюкозы, повышенная жировая масса, сниженная скорость метаболизма, сниженный клиренс глюкозы, сниженная переносимость глюкозы, сниженная чувствительность к инсулину, сниженная печеночная чувствительность к инсулину, повышенный размер и масса жировой ткани, увеличенный телесный жир и повышенная масса тела.

В некоторых вариантах реализации изобретения физический признак или симптом представляет собой повышенные уровни глюкозы. В некоторых вариантах реализации

изобретения признак или симптом представляет собой прирост массы тела. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой частое мочеиспускание. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой необычную жажду. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет чрезмерное чувство голода. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет чрезмерную усталость. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой расплывчатое зрение. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой частые инфекционные заболевания. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой покалывание или онемение конечностей. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой сухую и зудящую кожу. В некоторых вариантах реализации изобретения признак или симптом представляет собой потерю массы тела. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой медленно заживающие раны. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой набухшие десна. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой повышенную инсулинорезистентность. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой повышенные уровни глюкозы. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой повышенную массу жира. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой сниженную скорость метаболизма. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой сниженный клиренс глюкозы. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой сниженную переносимость глюкозы. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой сниженную чувствительность к инсулину. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой сниженную печеночную чувствительность к инсулину. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой увеличенный размер и массу жировой ткани. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой повышенное содержание телесного жира. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой повышенную массу тела.

В некоторых вариантах реализации представлены способы лечения индивидуума, включающие введение одной или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения индивидуум страдает от заболевания, связанного с метаболизмом.

В некоторых вариантах реализации введение конъюгированного антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту GCCR, приводит к снижению экспрессии GCCR по меньшей мере на около 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или в диапазоне, определенном любыми двумя из этих значений.

В некоторых вариантах реализации, фармацевтические композиции, включающие антисмысловое соединение, нацеленное на GCCR, используют для получения лекарственных средств для лечения пациента, страдающего от или восприимчивого к метаболическому заболеванию.

В некоторых вариантах реализации изобретения способы, описанные в настоящем документе, включают введение конъюгированного соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, имеющий непрерывную часть азотистых оснований, как описано в настоящем документе, последовательности, указанной в SEQ ID NO: 66-77.

Следует понимать, что любые соединения, описанные в настоящем документе, могут быть использованы в вышеупомянутых способах и применениях. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту GCCR в вышеупомянутых способах и применениях, может содержать, но не ограничивается им, конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, которое содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 66-77; конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 7, которое содержит последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 66-77; соединение, содержащее или состоящее из ISIS 420470, ISIS 420476, ISIS 426115, ISIS 426130, ISIS 426168, ISIS 426172, ISIS 426183, ISIS 426246, ISIS 426262, ISIS 426267 или ISIS 426325 и конъгирующей группы; соединение, содержащее антисмысловый олигонуклеотид, описанный в WO 2005/071080, WO 2007/035759 или WO 2007/136988, которые включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, и конъгирующую группу; соединение, содержащее антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 26-113, описанных в WO 2007/035759, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе; соединение, содержащее антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 26-113, описанных в WO 2007/035759, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе; или соединение, содержащее анитсмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой

из SEQ ID NO 413-485, описанных в WO 2007/136988, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе; последовательности азотистых оснований всех вышеупомянутых перечисленных SEQ ID NO включены в настоящий документ посредством ссылки.

4. GCGR

Инсулин и глюкагон представляют собой два гормона поджелудочной железы, участвующих в регуляции гомеостаза и метаболизма глюкозы. Глюкагон секретируется из α-клеток панкреатических островков и регулирует гомеостаз глюкозы путем модулирования выработки глюкозы в печени (Quesada et al., J. Endocrinol. 2008. 199: 5-19). Главная функция глюкагона заключается в противостоянии действию инсулина.

Дисрегуляция метаболизма глюкозы может быть обусловлена нарушением секреции и/или действия инсулина, или может быть нарушенным подавлением глюкагона после приема пищи (Shah et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 1999. 277: E283-E290). Было показано, что у субъектов с диабетом ингибирование секреции глюкагона после приема пищи существенно снижает содержание глюкозы в крови, позволяя предположить, что глюкагон существенно способствует гиперглицемии, наблюдаемой у субъектов с сахарным диабетом 2 типа (Shah et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 2000. 85: 4053-4059).

Диабет 2 типа характеризуется нарушенной секрецией и/или действием инсулина, и многие субъекты демонстрируют также ненадлежащие уровни циркулирующего глюкагона в состоянии натощак и после приема пищи. Повышение соотношения глюкагона/инсулина, вероятно, представляет собой важную детерминанту гиперглицемии, наблюдаемой у пациентов с диабетом 2 типа (Baron et al., Diabetes. 1987. 36: 274-283). Недостаток подавления секреции глюкагона после приема пищи у субъектов с T2DM также играет важную роль в патогенезе гиперглицемии после приема пищи (Henkel et al., Metabolism. 2005. 54: 1168-1173).

Глюкагон действует на целевые ткани путем активации своего рецептора, GCCR. Рецептор глюкагона представляет собой белок размером 62 кДа, который является членом класса В семейства рецепторов, связанных с G-белком (Brubaker et al., Recept. Channels. 2002. 8: 179-88). Активация GCGR приводит к сигналингу G-белками (G_sα и G_q), посредством чего G_sα активирует аденилатциклазу, которая вызывает выработку цАМФ, что приводит к повышению уровней протеинкиназы А. Сигналинг GCGR в печени приводит к повышенной выработке глюкозы в печени за счет инициации гликогенолиза и глюконеогенеза наряду с

подавлением гликогенеза (Jiang and Zhang. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2003. 284: E671-E678). GCGR экспрессируется также во внепеченочных тканях, которые включают сердце, гладкую мускулатуру кишечника, почки, головной мозг и жировую ткань (Hansen et al., Peptides. 1995. 16: 1163-1166).

Антисмысловое ингибирование GCGR обеспечивает уникальное преимущество по сравнению с традиционными низкомолекулярными ингибиторами в том, что действие антисмысловых ингибиторов основано не на конкурентном связывании соединения с белком, а на прямом подавлении активности путем снижения экспрессии GCGR. Типичный патент Соединенных штатов Америки, в котором представлены антисмысловые ингибиторы GCGR, включает патент США №7750142, который включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Антисмысловая технология развивается как эффективное средство снижения экспрессии определенных генных продуктов, и, следовательно, может быть подтверждена ее уникальная полезность в ряде терапевтических, диагностических и исследовательских применений для модулирования GCGR.

В настоящее время существует недостаток приемлемых возможностей лечения метаболических расстройств. Следовательно, задача настоящего изобретения заключается в обеспечении соединений и способов для лечения таких заболеваний и расстройств. Настоящее изобретение относится к открытию новых, высокоэффективных ингибиторов генной экспрессии GCGR. Все документы или части документов, которые упомянуты в настоящей заявке, включая, но не ограничиваясь ими, патенты, патентные заявки, статьи, книги и трактаты, в явной форме включены в настоящий документ путем ссылки в отношении фрагментов указанных документов, рассматриваемых в настоящем документе, а также в полном объеме.

Некоторые конъюгированные антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту GCGR

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения нацелены на нуклеиновую кислоту GCGR, имеющую последовательность с номером доступа GENBANK NM_000160.3, включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 8) или с номером доступа GENBANK: NW_926918.1, усеченную по нуклеотидам с 16865000 по 16885000 (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 9). В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение,

нацеленное на SEQ ID NO: 8 и/или 9, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарно SEQ ID NO: 8 и/или 9.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 8 и/или 9, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 78-83. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 8 и/или 9, содержит последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 78-83.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 8, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 78. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 8, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 78.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 9, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 79. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 9, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 79.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 9, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 80. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 9, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 80.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 9, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 81. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 9, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 81.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 8 и 9, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 82. В некоторых вариантах, реализации

изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 8 и 9, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 82.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 9, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 83. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 9, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 83.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 325568 и конъгирующей группы. ISIS 325568 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges mCes Ads mCds Tds Tds Tds Gds Tds Gds Gds Tds Gds mCds mCds Ads Ads Gds Ges mCe, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 398471 и конъгирующей группы. ISIS 398471 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Tes mCes mCes Aes mCes Ads Gds Gds mCds mCds Ads mCds Ads Gds Gds Tes Ges Ges Ges mCe, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 448766 и конъгирующей группы. ISIS 448766 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges mCes Aes Aes Ges Gds mCds Tds mCds Gds Gds Tds Tds Gds Gds Ges mCes Tes Tes mCe, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 449884 и конъгирующей группы. ISIS 449884 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges Ges Tes Tds mCds mCds mCds Gds Ads Gds Gds Tds Gds mCes mCes mCes Ae, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 459014 и конъгирующей группы. ISIS 459014 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges Ges Ges mCds Ads Ads Tds Gds mCds Ads Gds Tds mCds mCes Tes Ges Ge, где

А = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

е = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 459157 и конъгирующей группы. ISIS 459157 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges Ges Ges Tes Tes mCds mCds mCds Gds Ads Gds Gds Tds Gds mCds mCes mCes Aes Aes Tes Ge, где

A = аденин,

mC = 5'-метилцитозин,

G = гуанин,

Т = тимин,

е = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,

d = 2'-дезоксинуклеозид, и

s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, описанный в US 7750142, US 7399853, WO 2007/035771 или WO 2007/134014, которые включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, и конъгирующую группу. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 20-399, описанных в US 7750142, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 20-399, описанных в US 7399853, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации соединение содержит

антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 2, описанных в WO 2007/035771, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 486-680, описанных в WO 2007-134014, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований, комплементарную предпочтительному целевому сегменту SEQ ID NO 20-399 в US 7750142, SEQ ID NO: 20-399 в US 7399853, SEQ ID NO 2 в WO 2007/035771 или SEQ ID NO 486-680 в WO 2007/134014, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. Последовательности азотистых оснований всех вышеупомянутых перечисленных SEQ ID NO включены в настоящий документ посредством ссылки.

Терапевтические показания GCGR

В некоторых вариантах реализации в настоящем документе представлены способы лечения индивидуума, включающие введение одной или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения индивидуум страдает от заболевания, связанного с метаболизмом.

Как показано ниже в примерах, конъюгированные соединения, нацеленные на GCGR, как описано в настоящем документе, демонстрируют снижение тяжести физиологических симптомов метаболических заболеваний, включая метаболический синдром, сахарный диабет, инсулинорезистентность, диабетическую дислипидемию, гипертриглицеридемию, ожирение и рост массы тела. В некоторых экспериментах конъюгированные соединения снижали уровни глюкозы в крови, например, животные продолжали испытывать симптомы, но эти симптомы были менее тяжкими, по сравнению с животными, не проходившими лечение. Однако в других экспериментах конъюгированные соединения снижали симптомы диабета; например, животные, проходившие лечение в течение более продолжительного периода времени, испытывали менее тяжкие симптомы, чем животные, которым вводили эти соединения в течение более короткого периода времени. В то же время в других экспериментах конъюгированные соединения замедляли прирост массы тела; например, животные, проходившие лечение в течение более продолжительного периода времени, испытывали менее тяжкие симптомы, чем животные, которым вводили эти соединения в течение более короткого периода времени. В то же время в других экспериментах

конъюгированные соединения подавляли гипертриглицеридемию; например, животные, проходившие лечение в течение более продолжительного периода времени, испытывали менее тяжкие признаки и/или симптомы, чем животные, которым вводили эти соединения в течение более короткого периода времени. Следовательно, способность конъюгирозанных соединений, представленных ниже в примерах, восстанавливать функцию демонстрирует, что симптомы заболевания могут быть реверсированы путем лечения с применением соединения, описанного в настоящем документе.

Сахарный диабет характеризуется рядом физических и физиологических признаков и/или симптомов. Любой симптом, известный специалистам в данной области техники как связанный с диабетом 2 типа, может быть облегчен или иным образом изменен, как указано выше в описанных выше способах. В некоторых вариантах реализации изобретения симптом или признак представляет собой физический симптом или признак, такой как повышенные уровни глюкозы, повышенный рост массы тела, частое мочеиспускание, необычная жажда, чрезмерное чувство голода, избыточная утомляемость, расплывчатое зрение, частые инфекционные заболевания, покалывание или онемение конечностей, сухая и зудящая кожа, потеря массы тела, медленно заживающие ран и набухшие десна. В некоторых вариантах реализации изобретения симптом или признак представляет собой физиологический симптом или признак, выбранный из группы, состоящей из повышенной инсулинорезистентности, повышенных уровней глюкозы, повышенной жировой массы, сниженной скорости метаболизма, сниженного клиренса глюкозы, сниженной переносимости глюкозы, сниженной чувствительности к инсулину, сниженной печеночной чувствительности к инсулину, повышенного размера и массы жировой ткани, увеличенного телесного жира и повышенной массы тела.

В некоторых вариантах реализации изобретения физический симптом или признак представляет собой повышенные уровни глюкозы. В некоторых вариантах реализации изобретения признак или симптом представляет собой прирост массы тела. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой частое мочеиспускание. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой необычную жажду. В некоторых вариантах реализации симптом представляет чрезмерное чувство голода. В некоторых вариантах реализации симптом представляет чрезмерную усталость. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой расплывчатое зрение. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой частые инфекционные заболевания. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой покалывание или онемение конечностей.

В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой сухую и зудящую кожу. В некоторых вариантах реализации изобретения признак или симптом представляет собой потерю массы тела. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой медленно заживающие раны. В некоторых вариантах реализации симптом представляет собой набухшие десна. В некоторых вариантах реализации симптом или признак представляет собой повышенную инсулинорезистентность. В некоторых вариантам реализации симптом или признак представляет собой повышенные уровни глюкозы. В некоторых вариантах реализации симптом или признак представляет собой повышенную массу жира. В некоторых вариантах реализации симптом или признак представляет собой сниженную скорость метаболизма. В некоторых вариантах реализации симптом или признак представляет собой сниженный клиренс глюкозы. В некоторых вариантах реализации симптом или признак представляет собой сниженную переносимость глюкозы. В некоторых вариантах реализации симптом или признак представляет собой сниженную чувствительность к инсулину. В некоторых вариантах реализации симптом или признак представляет собой сниженную печеночную чувствительность к инсулину. В некоторых вариантах реализации симптом или признак представляет собой увеличенный размер и массу жировой ткани. В некоторых вариантах реализации симптом или признак представляет собой повышенное содержание телесного жира. В некоторых вариантах реализации признак или симптом представляет собой повышенную массу тела.

В некоторых вариантах реализации представлены способы лечения индивидуума, включающие введение одной или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения индивидуум страдает от заболевания, связанного с метаболизмом.

В некоторых вариантах реализации введение конъюгированного антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту GCGR, приводит к снижению экспрессии GCGR по меньшей мере на около 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или в диапазоне, определенном любыми двумя из этих значений.

В некоторых вариантах реализации, фармацевтические композиции, включающие антисмысловое соединение, нацеленное на GCGR, используют для получения лекарственных средств для лечения пациента, страдающего от или восприимчивого к метаболическому заболеванию.

В некоторых вариантах реализации изобретения способы, описанные в настоящем документе, включают введение конъюгированного соединения, содержащего

модифицированный олигонуклеотид, имеющий непрерывную часть азотистых оснований, как описано в настоящем документе, последовательности, указанной в SEQ ID NO: 78-83.

Следует понимать, что любые соединения, описанные в настоящем документе, могут быть использованы в вышеупомянутых способах и применениях. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту GCGR в вышеупомянутых способах и применениях, может содержать, но не ограничивается им, конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 8 и/или 9, которое содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 78-83; конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 8 и/или 9, которое содержит последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 78-83; соединение, которое содержит или состоит из ISIS 325568, ISIS 398471, ISIS 448766, ISIS 449884, ISIS 459014 или ISIS 459157, и конъгирующей группы; соединение, которое содержит антисмысловый олигонуклеотид, описанный в US 7750142, US 7399853, WO 2007/035771 или WO 2007/134014, которые включены в настоящий в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, и конъгирующую группу; последовательности азотистых оснований всех вышеупомянутых перечисленных SEQ ID NO включены в настоящий документ посредством ссылки.

4. Фактор коагуляции 7

Для кровеносной системы необходимы механизмы, которые предотвращают потерю крови, а также механизмы, противодействующие неправильной внутрисосудистой окклюзии. В целом, коагуляция включает каскад реакций, приводящих к превращению растворимого фибриногена в нерастворимый фибриновый гель. Стадии этого каскада включают превращение неактивного зимогена в активированный фермент. Затем активный фермент катализирует следующую стадию каскада.

Каскад коагуляции

Каскад коагуляции может быть замедлен двумя путями, по пути тканевого фактора (также «внешний путь активации свертывания крови»), который является основным путем, и по пути контактной активации (также «внутренний путь активации свертывания крови»).

Путь тканевого фактора инициируется тканевым фактором рецептора клеточной поверхности (TF, упоминаемым также как фактор III), который конститутивно

экспрессируется внесосудистыми клетками (перицитами, кардиомиоцитами, клетками гладких мышц и кератиноцитами) и экспрессируется сосудистыми моноцитами и эндотелиальными клетками при индукции воспалительными цитокинами или эндотоксинами. (Drake et al., Am J Pathol 1989, 134: 1087-1097). TF представляет собой высокоаффинный клеточный рецептор для фактора коагуляции VIIa, серинпротезы. В отсутствие TF VIIa имеет очень слабую каталитическую активность, и связывание с TF необходимо для обеспечения функциональности VIIa по аллостерическому механизму. (Drake et al., Am J Pathol 1989. 134: 1087-1097). Комплекс TF-VIIa активирует фактор X до Ха. Ха, в свою очередь, связывается с его кофакторным фактором Va в комплекс протромбиназы, который, в свою очередь, активирует протромбин (известный также как фактор II или фактор 2) до тромбина (известный также как фактор IIa или фактор 2а). Тромбин активирует тромбоциты, превращает фибриноген в фибрин и ускоряет перекрестное связывание фибрина с активирующим фактором XIII, образуя, таким образом, устойчивую пробку в местах, где TF выходит на поверхность внесосудистых клеток. Кроме того, тромбин усиливает ответ каскада коагуляции за счет активирующих факторов V и VIII.

Контактный путь активации запускается активацией фактора XII до XIIa. Фактор XIIa превращает XI в XIa, a XIa превращает IX в IXa. IXa связывается со своим кофактором VIII и превращает Х в Ха. В этой точке указанные два пути сходятся, поскольку фактор Ха связывает фактор Va для активации протромбина (фактора II) до тромбина (фактора IIa).

Подавление коагуляции

Каскад коагуляции контролируют по меньшей мере три механизма, а именно действие активированного белка С, антитромбина и ингибитора пути тканевого фактора. Активированный белок С представляет собой серинпротеазу, которая разрушает кофакторы Va и VIIIa. Белок С активируется тромбином при помощи тромбомодулина, и для его действия необходим кофермент белок S. Антитромбин представляет собой ингибитор серинпротеазы (серпин), который ингибирует серинпротеазы: тромбин, Ха, XIIa, XIa и IXa. Ингибитор пути тканевого фактора подавляет действие Ха и комплекса TF-VIIa. (Schwartz AL et al., Trends Cardiovasc Med. 1997; 7: 234-239.)

Заболевания

Тромбоз представляет собой патологическое образование кровяных сгустков, и при миграции кровяного сгустка в другую часть организма возникает эмболия, которая нарушает функцию органа. Тромбоэмболия может вызывать такие патологические состояния, как тромбоз глубоких вен, легочная эмболия, инфаркт миокарда и инсульт. Важно, что тромбоэмболия является основной причиной смертности, ежегодно поражающей более 2 миллионов жителей США. (Adcock et al. American Journal of Clinical Pathology. 1997; 108: 434-49). Хотя большинство случаев тромбоза обусловлены приобретенными внешними факторами, например, хирургическим вмешательством, раком, неподвижностью, некоторые случаи обусловлены генетической предрасположенностью, например, антифосфолипидным синдромом и аутосомно-доминантным состоянием, фактором V Ляйдена. (Bertina RM et al. Nature 1994; 369: 64-67).

Лечение

Большинство общепринятых антикоагулянтов, варфарин, гепарин и низкомолекулярный гепарин (LMWH) имеют существенные недостатки.

Варфарин обычно используют для лечения пациентов, страдающих от фибрилляции предсердий. Лекарство взаимодействует с витамин K-зависимыми факторами коагуляции, которые включают факторы II, VII, IX и X. Варфарин ингибирует также противокоагулирующие белки С и S. Лекарственная терапия с применением варфарина дополнительно осложняется тем фактом, что варфарин взаимодействует с другими лекарственными средствами, включая лекарства, используемые для лечения фибрилляции предсердий, такие как амиодарон. Поскольку терапия с варфарином труднопредсказуема, то пациентов следует внимательно наблюдать для обнаружения любых признаков патологического кровотечения.

Гепарин действует путем активации антитромбина, который пнгибирует тромбин и фактор Х (Bjork I, Lindahl U. Mol Cell Biochem. 1982 48: 161-182). Лечение гепарином может вызывать иммунологическую реакцию, которая обусловливает скопление тромбоцитов в кровеносных сосудах, что может привести к тромбозу. Этот побочный эффект известен как гепарин-индуцированная тромбоцитопения (HIT) и требует наблюдения пациентов. Продолжительное лечение гепарином также может приводить к остеопорозу. LMWH может ингибировать также фактор 2, но в меньшей степени, чем нефракционированный гепарин (UFH). LMWH участвует в развитии HIT.

Следовательно, существующие противокоагулирующие агенты имеют недостаточную предсказуемость и специфичность и, следовательно, требуют внимательного наблюдения пациентов для предупреждения неблагоприятных побочных эффектов, таких как осложнения, связанные с кровотечением. В настоящее время не существует антикоагулянтов, которые нацелены только на внутренний или внешний путь.

Антисмысловые соединения, нацеленные на фактор VII, были описаны ранее в WO 2013/119979 и WO 2009/061851, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Продолжаются клинические испытания для оценки влияния на пациентов антисмысловых соединений, нацеленных на фактор VII. Однако сохраняется необходимость в обеспечении пациентов дополнительными и более эффективными возможностями лечения.

Некоторые конъюгированные антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора VII

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения нацелены на нуклеиновую кислоту фактора VII, имеющую последовательность GENBANK с номером доступа NT_027140.6, усеченную по нуклеозидам с 1255000 по 1273000 (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 10, GENBANK с номером доступа NM_019616.2, включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 11; DB 184141.1, обозначенную в настоящем документе как SEQ ID NO: 12; и GENBANK с номером доступа NW_001104507.1, усеченную по нуклеотидам с 691000 по 706000, обозначенную в настоящем документе как SEQ ID NO: 13. В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 11, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарно SEQ ID NO: 11.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 11, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 84-92. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 11, содержит последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 84-92.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 11, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистые оснований последовательности SEQ ID NO: 84. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 11, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 84.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 11, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 85. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 11, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 85.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 11, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 86. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 11, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 86.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 11, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 87. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 11, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 87.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 11, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 88. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 11, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 88.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 11, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 89. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 11, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 89.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 11, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 90. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 11, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 90.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 420915 и конъгирующей группы. ISIS 407935 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Aes Tes Ges mCes Aes Tds Gds Gds Tds Gds Ads Tds Gels mCds Tds Tes mCes Tes Ges Ae, где

A = аденин;

Т = тимин;

G = гуанин;

mC = 5-метилцитозин; где

каждый сахарный фрагмент указан в соответствии с:

k = cEt;

d = 2'-дезоксирибоза;

е = 2'-МОЕ; где

каждая межнуклеозидная связь указана в соответствии с:

s = тиофосфат.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 304299 и конъгирующей группы. ISIS 473589 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Gks mCds Tks Ads Aks Ads mCds Ads Ads mCds mCds Gds mCds mCds Tes Те; где

каждое азотистое основание указано в соответствии с:

А = аденин;

Т = тимин;

G = гуанин;

mC = 5-метилцитозин; где

каждый сахарный фрагмент указан в соответствии с:

k = cEt;

d = 2'-дезоксирибоза;

е = 2'-МОЕ; где

каждая межнуклеозидная связь указана в соответствии с:

s = тиофосфат.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 420921 и конъгирующей группы. ISIS 490279 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: mCes mCes mCes Tes mCes mCds Tds Gds Tds Gds mCds mCds Tds Gds Gds Aes Tes Ges mCes Те; где

каждое азотистое основание указано в соответствии с:

А = аденин;

Т = тимин;

G = гуанин;

mC = 5-метилцитозин; где

каждый сахарный фрагмент указан в соответствии с:

k = cEt;

d = 2'-дезоксирибоза;

е = 2'-МОЕ; где

каждая межнуклеозидная связь указана в соответствии с:

s = тиофосфат.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 420922 и конъгирующей группы. ISIS 529804 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: mCks Ads Tds Gds Gds Tds Gds Ads Tds Gds mCds Tks Tes mCks Tes Ge, где

A = аденин;

Т = тимин;

G = гуанин;

mC = 5-метилцитозин; где

каждый сахарный фрагмент указан в соответствии с:

k = cEt;

d = 2'-дезоксирибоза;

е = 2'-МОЕ; где

каждая межнуклеозидная связь указана в соответствии с:

s = тиофосфат.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 420950 и конъгирующей группы. ISIS 534796 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Aes Gks Aks Gds mCds Tds Ads Ads Ads mCds Ads Ads mCds mCks Gks mCe, где

A = аденин;

Т = тимин;

G = гуанин;

mC = 5-метилцитозин; где

каждый сахарный фрагмент указан в соответствии с:

k = cEt;

d = 2'-дезоксирибоза;

е = 2'-МОЕ; где

каждая межнуклеозидная связь указана в соответствии с:

s = тиофосфат.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 420955 и конъгирующей группы. ISIS 540162 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges Aes Aes Tes Ges Tds Tds Tds Tds Ads Tds Tds Gds Tds mCds Tes mCes Tes Ges mCe, где

A = аденин;

Т = тимин;

G = гуанин;

mC = 5-метилцитозин; где

каждый сахарный фрагмент указан в соответствии с:

k = cEt;

d = 2'-дезоксирибоза;

е = 2'-МОЕ; где

каждая межнуклеозидная связь указана в соответствии с:

s = тиофосфат.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 420957 и конъгирующей группы. ISIS 540175 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges Ges Aks mCds Ads mCds mCds mCds Ads mCds Gds mCds mCds mCks mCks mCe; где

каждое азотистое основание указано в соответствии с:

А = аденин;

Т = тимин;

G = гуанин;

mC = 5-метилцитозин; где

каждый сахарный фрагмент указан в соответствии с:

k = cEt;

d = 2'-дезоксирибоза;

е = 2'-МОЕ; где

каждая межнуклеозидная связь указана в соответствии с:

s = тиофосфат.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 420959 и конъгирующей группы. ISIS 540182 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Aes mCes Aks mCds mCds mCds Tds mCds Gds mCds mCds Tds mCds mCks Gks Ge, где

A = аденин;

Т = тимин;

G = гуанин;

mC = 5-метилцитозин; где

каждый сахарный фрагмент указан в соответствии с:

k = cEt;

d = 2'-дезоксирибоза;

е = 2'-МОЕ; где

каждая межнуклеозидная связь указана в соответствии с:

s = тиофосфат.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 420959 и конъгирующей группы. ISIS 540191 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу: Ges mCes mCks Tds mCds mCds Gds Gds Ads Ads mCds Ads mCds mCks mCks Ae, где

A = аденин;

Т = тимин;

G = гуанин;

mC = 5-метилцитозин; где

каждый сахарный фрагмент указан в соответствии с:

k = cEt;

d = 2'-дезоксирибоза;

е = 2'-МОЕ; где

каждая межнуклеозидная связь указана в соответствии с:

s = тиофосфат.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, описанный в WO 2013/119979 и WO 2009/061851, которые включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 21-659, описанных, в WO 2013/119979, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 4-159 и 168-611, описанных в WO 2009/061851, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. Последовательности азотистых оснований всех вышеупомянутых ссылочных SEQ ID NO включены в настоящий документ посредством ссылки.

Терапевтические показания фактора VII

В некоторых вариантах реализации в настоящем документе представлены соединения и композиции, описанные в настоящем документе, для применения в терапии.

В некоторых вариантах реализации в настоящем документе представлены конъюгированные антисмысловые соединения и композиции, описанные в настоящем документе, для применения при лечении, предупреждении или замедлении прогрессирования тромбоэмболического осложнения.

В некоторых вариантах реализации в настоящем документе представлены конъюгированные антисмысловые соединения и композиции, описанные в настоящем документе, для применения при лечении, предупреждении или замедлении прогрессирования гиперпролиферативного расстройства.

В некоторых вариантах реализации в настоящем документе представлены конъюгированные антисмысловые соединения и композиции, описанные в настоящем документе, для применения при лечении, предупреждении или замедлении прогрессирования воспалительного состояния.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приведены способы применения конъюгированного антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту фактора VII, для модулирования экспрессии фактора VII в организме субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения снижают экспрессию фактора VII.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приведены способы применения конъюгированного антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту фактора VII, в фармацевтической композиции для лечения субъекта. В некоторых вариантах реализации субъект страдает от заболевания, расстройства или патологического состояния, связанного с фактором VII, или от его симптома. В некоторых вариантах реализации заболевание, расстройство или патологическое состояние, связанное с фактором VII, представляет собой тромбоэмболическое осложнение, гиперпролиферативное расстройство или воспалительное состояние.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приведены способы применения конъюгированного антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту фактора VII, при получении лекарственного средства.

В некоторых вариантах реализации изобретения представлено конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту фактора VII, или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии.

В некоторых вариантах реализации представлено конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту фактора VII, для применения при лечении заболевания, расстройства или патологического состояния, связанного с фактором VII, или его симптома. В некоторых вариантах реализации заболевание, расстройство или патологическое состояние, связанное с фактором VII, представляет собой тромбоэмболическое осложнение, гиперпролиферативное расстройство или воспалительное состояние.

В некоторых вариантах реализации в настоящем документе представлены конъюгированные антисмысловые соединения и композиции, описанные в настоящем документе, для применения при лечении, предупреждении или замедлении прогрессирования тромбоэмболического осложнения.

В некоторых вариантах реализации в настоящем документе представлены конъюгированные антисмысловые соединения и композиции, описанные в настоящем документе, для применения при лечении, предупреждении или замедлении прогрессирования гиперпролиферативного расстройства.

В некоторых вариантах реализации в настоящем документе представлены конъюгированные антисмысловые соединения и композиции, описанные в настоящем документе, для применения при лечении, предупреждении или замедлении прогрессирования воспалительного состояния.

Следует понимать, что любые соединения, описанные в настоящем документе, могут быть использованы в вышеупомянутых способах и применениях. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту фактора VII в вышеупомянутых способах и применениях, может содержать, но не ограничивается им, конъюгированное антисмысловое соединение,

нацеленное на SEQ ID NO: 11, которое содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 84-92; конъюгированное антисмысловое соединение. нацеленное на SEQ ID NO: 11, которое содержит последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 84-92; соединение, содержащее или состоящее из ISIS 407935, ISIS 473589, ISIS 490279, ISIS 529804, ISIS 534796, ISIS 540162, ISIS 540175, ISIS 540182 или ISIS 540191 и конъгирующей группы; соединение, содержащее антисмысловый олигонуклеотид, описанный в WO 2013/119979 и WO 2009/061851, которые включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, и конъгирующую группу; соединение, содержащее антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 21-659, описанных в WO 2013/119979, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе; антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 4-159 и 168-611, описанных в WO 2009/061851, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. Последовательности азотистых оснований всех вышеупомянутых ссылочных SEQ ID NO включены в настоящий документ посредством ссылки.

4. Фактор коагуляции 11

Для кровеносной системы необходимы механизмы, которые предотвращают потерю крови, а также механизмы, противодействующие неправильной внутрисосудистой окклюзии. В целом, коагуляция включает каскад реакций, приводящих к превращению растворимого фибриногена в нерастворимый фибриновый гель. Стадии этого каскада включают превращение неактивного зимогена в активированный фермент. Затем активный фермент катализирует следующую стадию каскада.

Каскад коагуляции

Каскад коагуляции может быть замедлен двумя путями, по пути тканевого фактора (также «внешний путь активации свертывания крови»), который является основным путем, и по пути контактной активации (также «внутренний путь активации свертывания крови»).

Путь тканевого фактора инициируется тканевым фактором рецептора клеточной поверхности (TF, упоминаемым также как фактор III), который конститутивно экспрессируется внесосудистыми клетками (перицитами, кардиомиоцитами, клетками гладких мышц и кератиноцитами) и экспрессируется сосудистыми моноцитами и

эндотелиальными клетками при индукции воспалительными цитокинами или эндотоксинами. (Drake et al., Am J Pathol 1989, 134: 1087-1097). TF представляет собой высокоаффинный клеточный рецептор для фактора коагуляции VIIa, серинпротезы. Вх отсутствие TF VIIa имеет очень слабую каталитическую активность, и связывание с TF необходимо для обеспечения функциональности VIIa по аллостерическому механизму. (Drake et al., Am J Pathol 1989, 134: 1087-1097). Комплекс TF-VIIa активирует фактор X до Ха. Ха, в свою очередь, связывается с его кофакторным фактором Va в комплекс протромбиназы, который, в свою очередь, активирует протромбин (известный также как фактор II или фактор 2) до тромбина (известный также как фактор IIa или фактор 2а). Тромбин активирует тромбоциты, превращает фибриноген в фибрин и ускоряет перекрестное связывание фибрина с активирующим фактором XIII, образуя, таким образом, устойчивую пробку в местах, где TF выходит на поверхность внесосудистых клеток. Кроме того, тромбин усиливает ответ каскада коагуляции за счет активирующих факторов V и VIII.

Контактный путь активации запускается активацией фактора XII до XIIa. Фактор XIIa превращает XI в XIa, a XIa превращает IX в IXa. IXa связывается со своим кофактором VIII и превращает Х в Ха. В этой точке указанные два пути сходятся, поскольку фактор Ха связывает фактор Va для активации протромбина (фактора II) до тромбина (фактора IIa).

Подавление коагуляции

Каскад коагуляции контролируют по меньшей мере три механизма, а именно действие активированного белка С, антитромбина и ингибитора пути тканевого фактора. Активированный белок С представляет собой серинпротеазу, которая разрушает кофакторы Va и VIIIa. Белок С активируется тромбином при помощи тромбомодулина, и для его действия необходим кофермент белок S. Антитромбин представляет собой ингибитор серинпротеазы (серпин), который ингибирует серинпротеазы: тромбин, Ха, XIIa, XIa и IXa. Ингибитор пути тканевого фактора подавляет действие Ха и комплекса TF-VIIa. (Schwartz AL et al., Trends Cardiovasc Med. 1997; 7: 234-239).

Заболевания

Тромбоз представляет собой патологическое образование кровяных сгустков, и при миграции кровяного сгустка в другую часть организма возникает эмболия, которая нарушает

функцию органа. Тромбоэмболия может вызывать такие патологические состояния, как тромбоз глубоких вен, легочная эмболия, инфаркт миокарда и инсульт. Важно, что тромбоэмболия является основной причиной смертности, ежегодно поражающей более 2 миллионов жителей США. (Adcock et al. American Journal of Clinical Pathology. 1997; 108: 434-49). Хотя большинство случаев тромбоза обусловлены приобретенными внешними факторами, например, хирургическим вмешательством, раком, неподвижностью, некоторые случаи обусловлены генетической предрасположенностью, например, антифосфолипидным синдромом и аутосомно-доминантным состоянием, фактором V Ляйдена. (Bertina RM et al. Nature 1994; 369: 64-67).

Лечение

Большинство общепринятых антикоагулянтов, варфарин, гепарин и низкомолекулярный гепарин (LMWH) имеют существенные недостатки.

Варфарин обычно используют для лечения пациентов, страдающих от фибрилляции предсердий. Лекарство взаимодействует с витамин K-зависимыми факторами коагуляции, которые включают факторы II, VII, IX и X. Варфарин ингибирует также противокоагулирующие белки С и S. Лекарственная терапия с применением варфарина дополнительно осложняется тем фактом, что варфарин взаимодействует с другими лекарственными средствами, включая лекарства, используемые для лечения фибрилляции предсердий, такие как амиодарон. Поскольку терапия с варфарином труднопредсказуема, то пациентов следует тщательно контролировать для обнаружения любых признаков патологического кровотечения.

Гепарин действует путем активации антитромбина, который пнгибирует тромбин и фактор Х (Bjork I, Lindahl U. Mol Cell Biochem. 1982 48: 161-182.) Лечение гепарином может вызывать иммунологическую реакцию, которая обусловливает скопление тромбоцитов в кровеносных сосудах, что может привести к тромбозу. Этот побочный эффект известен как гепарин-индуцированная тромбоцитопения (HIT) и требует наблюдения пациентов. Продолжительное лечение гепарином также может приводить к остеопорозу. LMWH может ингибировать также фактор 2, но в меньшей степени, чем нефракционированный гепарин (UFH). LMWH участвует в развитии HIT.

Следовательно, существующие противокоагулирующие агенты имеют недостаточную предсказуемость и специфичность и, следовательно, требуют внимательного наблюдения пациентов для предупреждения неблагоприятных побочных эффектов, таких как осложнения, связанные с кровотечением. В настоящее время не существует антикоагулянтов, которые нацелены только на внутренний или внешний путь.

Антисмысловые соединения, нацеленные на фактор XI, были описаны ранее в WO 2010/045509 и WO 2010/121074, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Продолжаются клинические испытания для оценки влияния на пациентов антисмысловых соединений, нацеленных на фактор XI. Однако сохраняется необходимость в обеспечении пациентов дополнительными и более эффективными возможностями лечения.

Некоторые конъюгированные антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора XI

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения нацелены на нуклеиновую кислоту фактора XI, имеющую последовательность с номером доступа GENBANK NM_000128.3 (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 14), с номером доступа GENBANK NT_022792.17, усеченной с 19598000 по 19624000 (включена в настоящий документ как SEQ ID NO: 15), GENBANK с номером доступа NM_028066.1, (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 16), экзоны 1-15 GENBANK с номером доступа NW_001118167.1 (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 17). В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарно SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 12-19. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 12-19.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 14, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых

оснований последовательности SEQ ID NO: 93. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 14, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 93.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 14, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 94. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 14, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 94.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 14, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 95. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 14, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 95.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 14, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 96. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 14, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 96.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 14, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 97. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 14, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 97.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 14, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 98. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 14, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 98.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 14, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых

оснований последовательности SEQ ID NO: 99. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 14, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 99.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 14, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 100. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 14, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 100.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, описанный в WO 2010/045509 и WO 2010/121074, которые включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, и конъгирующую группу. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 15-270, описанных в WO 2010/045509, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. В

некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 15-270, описанных в WO 2010/121074, и конъгирующую группу, описанную в настоящем документе. Последовательности азотистых оснований всех вышеупомянутых ссылочных SEQ ID NO включены в настоящий документ посредством ссылки.

Е. Некоторые фармацевтические композиции

В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены фармацевтические композиции, содержащие одно или более антисмысловых соединений. В некоторых вариантах реализации такая фармацевтическая композиция содержит подходящий фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит стерильный солевой раствор и одно или более антисмысловых соединений. В некоторых вариантах реализации такая фармацевтическая композиция состоит из стерильного солевого раствора и одного или более антисмысловых соединений. В некоторых вариантам реализации стерильный солевой раствор представляет собой солевой раствор фармацевтической марки. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит одно или более антисмысловых соединений и стерильную воду. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция состоит из одного или более антисмысловых соединений и стерильной воды. В некоторых вариантах реализации стерильный солевой раствор представляет собой воду фармацевтической марки. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит одно или более антисмысловых соединений и фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция состоит из одного или более антисмысловых соединений и фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). В некоторых вариантах реализации стерильный солевой раствор представляет собой PBS фармацевтической марки.

В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми активными и/или инертными веществами для получения фармацевтических композиций или составов. Композиции и способы составления фармацевтических композиций зависят от множества критериев, включая, но не ограничиваясь этим, способ введения, тяжесть заболевания или дозу, подлежащую введению.

Фармацевтические композиции, содержащие антисмысловые соединения, охватывают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров. В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции, содержащие антисмысловые соединения, содержат один или более олигонуклеотидов, которые при введении млекопитающему, включая человека, могут обеспечивать (прямо или косвенно) его биологически активный метаболит или остаток. Соответственно, например, настоящее описание относится также к фармацевтически приемлемым солям антисмысловых соединений, пролекарствам, фармацевтически приемлемым солям таких пролекарств и к другим биоэквивалентам. Подходящие фармацевтически приемлемые соли включают, но не ограничиваются ими, соли натрия и калия.

Пролекарство может включать внедрение дополнительных нуклеозидов у одного или обоих концов олигонуклеотида, которые расщепляются в организме под действием эндогенных нуклеаз с образованием активного антисмыслового олигонуклеотида.

В многочисленных способах в терапиях с нуклеиновыми кислотами были примененны липидные фрагменты. В некоторых таких способах нуклеиновую кислоту вводят в предварительно сформированные липосомы или липоплексы, полученные из смесей катионных липидов и нейтральных липидов. В некоторых способах получают ДНК комплексы с моно- или поликатионными липидами без участия нейтрального липида. В некоторых вариантах реализации липидный фрагмент выбирай для улучшения распределения фармацевтического агента в определенной клетке или ткани. В некоторых вариантах реализации липидный фрагмент выбирай для улучшения распределения фармацевтического агента в жировой ткани. В некоторых вариантах реализации липидный фрагмент выбирай для улучшения распределения фармацевтического агента в мышечной ткани.

В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции, представленные в настоящем документе, содержат один или более модифицированных олигонуклеотидов и одно или более вспомогательных веществ. В некоторых таких вариантах реализации вспомогательные вещества выбраны из воды, солевых растворов, спирта. полиэтиленгликолей, желатина, лактозы, амилазы, стеарата магния, талька, кремниевой кислоты, вязкого парафина, гидроксиметилцеллюлозы и поливинилпирролидона.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, содержит систему доставки. Примеры систем доставки включают, но

не ограничиваются ими, липосомы и эмульсии. Некоторые системы доставки подходят для получения некоторых фармацевтических композиций, включая композиции, содержащие гидрофобные соединения. В некоторых вариантах реализации применяют некоторое органические растворители, такие как диметилсульфоксид.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, содержит одну или более тканеспецифичных молекул доставки, предназначенных для доставки одного или более фармацевтических агентов настоящего описания в определенную ткань или типы клеток. Например, в некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции включают липосомы, покрытые тканеспецифичным антителом.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, содержит систему совместного растворителя. Некоторые такие системы совместных растворителей содержат, например, бензиловый спирт, неполярное поверхностно-активное вещество, смешиваемый с водой органический полимер и водную фазу. В некоторых вариантах реализации такие системы совместных растворителей применяют для гидрофобных соединений. Не ограничивающий пример такой системы совместных растворителей представляет собой система совместных растворителей VPD. которая представляет собой раствор абсолютного этанола, содержащего 3% масс./об. бензилового спирта, 8% масс./об. неполярного поверхностно-активного вещества Polysorbate 80™ и 65% масс./об. полиэтиленгликоля 300. Пропорции таких систем совместных растворителей могут существенно варьироваться без значителного изменения их характеристик растворимости и токсичности. Кроме того, может варьироваться сущность компонентов совместных растворителей: например, вместо Polysorbate 80™ могут быть применены другие поверхностно-активные вещества; может варьироваться размер фракции полиэтиленгликоля; вместо полиэтиленгликоля могут быть применены другие биосовместимые полимеры, например, поливинилпирролидон; и вместо декстрозы могут быть применены другие сахара или полисахариды.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическую композицию, представленную в настоящем документе, получают для перорального введения. В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции получают для буккального введения.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическую композицию получают для введения инъекцией (например, внутривенной, подкожной, внутримышечной и т.д.). В некоторых таких вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит носитель и составлена в водном растворе, таком как вода или физиологически совместимые буферы, такие как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. В некоторых вариантах реализации включены другие ингредиенты (например, ингредиенты, улучшающие растворимость или служащие консервантами). В некоторых вариантах реализации суспензии для инъекций получают при помощи подходящих жидких носителей, суспендирующих агентов и т.п. Некоторые фармацевтические композиции для инъекций представлены в форме разовой дозы, например, в ампулах, или в многодозовых контейнерах. Некоторые фармацевтические композиции для инъекций представляют собой суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных жидких носителях, и они могут содержать вспомогательные агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Некоторые растворители, подходящие для применения в фармацевтических композициях для инъекций, включают, но не ограничиваются ими, липофильные растворители и жирные масла, такие как кунжутное масло, синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, и липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит или декстран. Такие суспензии могут также необязательно содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые увеличивают растворимость фармацевтических агентов с обеспечением возможности получения высококонцентрированных растворов.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическую композицию получают для трансмукозального введения. В некоторых таких вариантах реализации в составе применяют пенетранты, соответствующие барьеру, через который необходимо проникнуть. Такие пенетранты общеизвестны в данной области техники.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, содержит олигонуклеотид в терапевтически эффективном количестве. В некоторых вариантах реализации терапевтически эффективное количество является достаточным для предотвращения, облегчения или улучшения симптомов заболевания или для увеличения продолжительности жизни субъекта, подлежащего лечению. Определение

терапевтически эффективного количества находится в пределах возможностей специалистов в данной области техники.

В некоторых вариантах реализации один или более модифицированных олигонуклеотидов, представленных в настоящем документе, составляют в виде пролекарства. В некоторых вариантах реализации при введении in vivo пролекарство химически превращается в биологически, фармацевтически или терапевтически более активную форму олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации пролекарства пригодны благодаря тому, что их проще вводить, чем соответствующую активную форму. Например, в некоторых случаях пролекарство может быть более биодоступным (например, при пероральном введении), чем соответствующая активная форма. В некоторых случаях пролекарство может обладать улучшенной растворимостью, по сравнению с соответствующей активной формой. В некоторых вариантах реализации пролекарства менее растворимы в воде, чем соответствующая активная форма. В некоторых случаях такие пролекарства обладают превосходной проходимостью через клеточные мембраны, при этом растворимость в воде ухудшает их подвижность. В некоторых вариантах реализации пролекарство представляет собой сложный эфир. В некоторых таких вариантах реализации сложный эфир при введении метаболически гидролизуется до карбоновой кислоты. В некоторых случаях соединение, содержащее карбоновую кислоту, представляет собой соответствующую активную форму. В некоторых вариантах реализации пролекарство содержит короткий пептид (полиаминокислоту), связанный с кислотной группой. В некоторых таких вариантах реализации пептид расщепляется при введении с образованием соответствующей активной формы.

В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены композиции и способы снижения количества или активности целевой нуклеиновой кислоты в клетке. В некоторых вариантах реализации клетка находится в организме животного. В некоторых вариантах реализации животное представляет собой млекопитающее. В некоторых вариантах реализации животное представляет собой грызуна. В некоторых вариантах реализации животное представляет собой примата. В некоторых вариантах реализации животное представляет собой примата, не являющегося человеком. В некоторых вариантах реализации животное представляет собой человека.

В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены способы

введения животному фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотид настоящего описания. Подходящие способы введения включают, но не ограничиваются ими, пероральный, ректальный, трансмукозальный, интестинальный, энтеральный, местный, суппозитории, через ингаляции, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, внутрибрюшинный, интраназальный, интраокулярный, внутриопухолевый и парентеральный (например, внутривенный, внутримышечный, интрамедуллярный и подкожный). В некоторых вариантах реализации вводят фармацевтические интратекальные средства для достижения местного, а не системного воздействия. Например, фармацевтические композиции могут быть введены инъекцией непосредственно в область желаемого эффекта (например, в печень).

Неограничивающее описание и включение посредством ссылки

Несмотря на то, что некоторые соединения, композиции и способы, описанные в настоящем документе, были подробно описаны в соответствии с некоторыми вариантами реализации изобретения, следующие примеры служат лишь для иллюстрации соединений, описанных в настоящем документе, и их не следует считать их ограничением. Каждая из ссылок, номера доступа GenBank и подобные ссылки, упоминаемые в настоящей заявке, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

Несмотря на то, что перечень последовательностей, сопровождающий этот файл, указывает каждую последовательность либо как «РНК», либо как «ДНК», по необходимости, в действительности эти последовательности могут быть модифицированы любой комбинацией химических модификаций. Специалистам в данной области техники понятно, что такое означение как «РНК» или «ДНК» для описания модифицированных олигонуклеотидов, является в некоторых случаях произвольным. Например, олигонуклеотид, содержащий нуклеозид, содержащий 2'-ОН сахарный фрагмент и тиминовое основание, может быть описан как ДНК, имеющая модифицированный сахар (2'-ОН вместо природного 2'-Н в ДНК) или как РНК, имеющая модифицированное основание (тимин (метилированный урацил) вместо природного урацила в РНК).

Соответственно, последовательности нуклеиновых кислот, представленные в настоящем документе, включая, но не ограничиваясь ими, последовательности в перечне последовательностей, предназначены для охвата нуклеиновых кислот, содержащих любую

комбинацию природных или модифицированных РНК и/или ДНК, включая, но не ограничиваясь ими, такие нуклеиновые кислоты, которые содержат модифицированные азотистые основания. В качестве дополнительного примера и без ограничения, олигонуклеотид, содержащий последовательность азотистых оснований «ATCGATCG», хватывает любые олигонуклеотиды, имеющие такую последовательность азотистых оснований, модифицированных или немодифицированных, включая, но не ограничиваясь ими, такие соединения, которые содержат РНК основания, такие как те, которые имеют последовательность «AUCGAUCG», и те, которые имеют некоторые ДНК основания и некоторые РНК основания, такие как «AUCGATCG», а также олигонуклеотиды, имеющие другие модифицированные основания, такие как «AT^meCGAUCG», где ^meC означает цитозиновое основание, содержащее метиловую группу в 5-положении.

Примеры

Следующие примеры иллюстрируют некоторые варианты реализации настоящего описания и не являются ограничивающими. Более того, если представлены конкретные варианты реализации, авторы изобретения подразумевают общее применение указанных конкретных вариантов реализации. Например, описание олигонуклеотида, содержащего конкретный мотив, дает обоснованное основание для дополнительных олигонуклеотидов, содержащих такой же или похожий мотив. И, например, если конкретная высокоаффинная модификация возникает в определенном положении, то в этом же положении считаются подходящими другие высокоаффинные модификации, если не указано иное.

Пример 1. Общий способ получения фосфорамидитов, Соединений 1, 1а и 2

Соединения 1, 1а и 2 получили по методикам, общеизвестным в данной области техники, описанным в данном описании (см. Seth et al., Bioorg. Med. Chem., 2011, 21(4), 1122-

1125, J. Org. Chem., 2010, 75(5), 1569-1581, Nucleic Acids Symposium Series, 2008, 52(1), 553-554); и см. также опубликованные Международные заявки РСТ (WO 2011/115818, WO 2010/077578, WO 2010/036698, WO 2009/143369, WO 2009/006478 и WO 2007/090071) и патент США 7569686).

Пример 2. Получение Соединения 7

Соединение 3 (2-ацетамидо-1,3,4,6-тетра-O-ацетил-2-дезокси-β-D-галактопираноза или галактозамина пентаацетат) имеется в продаже. Соединение 5 получили по опубликованным методикам (Weber et al., J. Med. Chem., 1991, 34, 2692).

Пример 3. Получение Соединения 11

Соединения 8 и 9 имеются в продаже.

Пример 4. Получение Соединения 18

Соединение 11 получили по способам, описанным в Примере 3. Соединение 14 имеется в продаже. Соединение 17 получили по такому же способу, как описан в публикации Rensen et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 5798-5808.

Пример 5. Получение Соединения 23

Соединения 19 и 21 имеются в продаже.

Пример 6. Получение Соединения 24

Соединения 18 и 23 получили так, как описано в способах в Примерах 4 и 5.

Пример 7. Получение Соединения 25

Соединение 24 получили по способам, представленным в Примере 6.

Пример 8. Получение Соединения 26

Соединение 24 получили по способам, представленным в Примере 6.

Пример 9. Общее получение конъюгированных ASO, содержащих GalNAc₃-1 на 3'-конце, Соединения 29

Где защищенный GalNAc₃-1 имеет структуру:

Кластерная часть GalNAc₃ конъгирующей группы GalNAc₃-1 (GalNAcs-1_a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом с получением различных конъюгирующих групп. При этом GalNAc₃-1_а имеет формулу:

Твердую подложку, связывающую защищенный GalNAc₃-1, Соединение 25, получили по способам, представленным в Примере 7. Олигомерное Соединение 29, содержащее GalNAc₃-1 на 3'-конце, получили по стандартным методика в автоматическом синтезаторе ДНК/РНК (см. Dupouy et al., Angew. Chem. Int. ред., 2006, 45, 3623-3627). Фосфорамидитные строительные блоки, Соединения 1 и 1а, получили по способам, представленным в Примере 1. Изображенные фосфорамидиты являются иллюстративными и не предназначены для ограничения, поскольку могут быть применены другие фосфорамидитные строительные блоки для получения олигомерных соединений, имеющих желаемую последовательность и состав. Порядок и количество фосфорамидитов, добавляемых к твердой подложке, может быть подобрано для получения разорванных олигомерных соединений, описанных в настоящем документе. Такие разорванные олигомерные соединения могут иметь желаемый состав и последовательность оснований, продиктованную любой данной мишенью.

Пример 10. Общее получение конъюгированных ASO, содержащих GalNAc₃-1 на 5'-конце, Соединения 34

Unylinker™ 30 имеется в продаже. Олигомерное соединение 34, содержащее кластер GalNAc₃-1 на 5'-конце, получили по стандартным способам в автоматическом синтезаторе ДНК/РНК (см. Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627). Фосфорамидитные строительные блоки. Соединения 1 и 1а, получили по способам, представленным в Примере 1. Изображенные фосфорамидиты являются иллюстративными и не предназначены для ограничения, поскольку могут быть применены другие фосфорамидитные строительные блоки для получения олигомерного соединения, имеющего желаемую последовательность и состав. Порядок и количество фосфорамидитов, добавляемых к твердой подложке, может быть подобрано для получения разорванных олигомерных соединений, описанных в настоящем документе. Такие разорванные олигомерные соединения могут иметь желаемый состав и последовательность оснований, продиктованную любой данной мишенью.

Пример 11. Получение Соединения 39

Соединения 4, 13 и 23 получили по способам, описанным в Примерах 2, 4 и 5. Соединение 35 получили по таким же способам, как описаны в публикации Rouchaud et al., Eur. J. Org. Chem.. 2011, 72, 2346-2353.

Пример 12. Получение Соединения 40

Соединение 38 получили по способам, представленным в Примере 11.

Пример 13. Получение Соединения 44

Соединения 23 и 36 получили по способам, представленным в Примерах 5 и 11. Соединение 41 получили по таким же способам, как описаны в публикации WO 2009082607.

Пример 14. Получение Соединения 45

Соединение 43 получили по способам, представленным в Примере 13.

Пример 15. Получение Соединения 47

Соединение 46 имеется в продаже.

Пример 16. Получение Соединения 53

Соединения 48 и 49 имеются в продаже. Соединения 17 и 47 получили так, как описано в способах в Примерах 4 и 15.

Пример 17. Получение Соединения 54

Соединение 53 получили по способам, представленным в Примере 16.

Пример 18. Получение Соединения 55

Соединение 53 получили по способам, представленным в Примере 16.

Пример 19. Общий способ получения конъюгированных ASO, содержащих GalNAc₃-1 в 3'-положении, при помощи твердофазных методик (получение ISIS 647535, 647536 и 651900)

Если не указано иное, все реагенты и растворы, применяемые для синтеза олигомерных соединений, приобретены у коммерческих поставщиков. Стандартные фосфорамидитные строительные блоки и твердую подложку применили для внедрения нуклеозидных остатков, которые включают, например, остатки Т, A, G и ^mC. 0,1 М раствор фосфорамидита в безводном ацетонитриле применили для β-D-2'-дезоксирибонуклеозида и 2'-МОЕ.

Синтез антисмысловых олигонуклеотидов (ASO) выполнили на синтезаторе ABI 394 (в масштабе 1-2 мкмоль) или на синтезаторе Oligopilot производства GE Healthcare Bioscience (в масштабе 40-200 мкмоль) по способу фосфорамидитного связывания на твердой подложке VIMAD, наполненной GalNAc₃-1 (110 мкмоль/г, Guzaev et al., 2003), упакованной в колонку. Для стадии связывания фосфорамидиты вводили в 4-кратном избытке по сравнению с загрузкой на твердой подложке, а конденсацию фосфорамидита выполняли в течение 10 минут. Все остальные стадии выполняли по протоколам, предоставленным производителем. Для удаления диметокситритильной (DMT) группы с 5'-гидроксильной группы нуктеотида применили 6% раствор дихлоруксусной кислоты в толуоле. На стадии связывания в качестве активатора применили 4,5-дицианоимидазол (0,7 М) в безводном CH₃CN. Тиофосфатные связи внедряли сульфированием при помощи 0,1 М раствора гидрида ксантана в 1:1 смеси пиридина/CH₃CN в течение 3 минут времени контакта. В качестве окислительного агента для обеспечения фосфодиэфирных межнуклеозидных связей применили 20% раствор трет-бутилгидропероксида в CH₃CN, содержащий 6% воды, в течение 12 минут времени контакта.

После сборки требуемой последовательности цианоэтил-фосфатные защитные группы снимали при помощи 1:1 (об./об.) смеси триэтиламина и ацетонитрила в течение 45 минут времени контакта. Связанные с твердой подложкой ASO суспендировали в водном растворе аммиака (28-30 масс. %) и нагревали при 55°С в течение 6 часов.

Затем отфильтровывали несвязанные ASO и выпаривали аммиак кипячением. Остаток очищали жидкостной хроматографией высокого давления на сильной анионообменной колонке (GE Healthcare Bioscience, Source 30Q, 30 мкм, 2,54×8 см, А=100 мМ ацетата аммония в 30% водном CH₃CN, В=1,5 М NaBr в А, 0-40% В за 60 мин., скорость потока 14 мл.мин-1, λ=260 нм). Остаток обессоливали при помощи ВЭЖХ на обращенно-фазовой колонке с получением желаемых ASO с выделенным выходом 15-30% относительно первоначальной загрузки на твердую подложку. ASO характеризовали при помощи ион-парной ВЭЖХ, совмещенной с МС-анализом на системе Agilent 1100 MSD.

Были синтезированы антисмысловые олигонуклеотиды, не содержащие конъюгата, при помощи стандартных методик синтеза олигонуклеотидов, известных в данной области техники.

Применяя эти способы, получили три отдельных антисмысловых соединения, нацеленных на АроС III. Как показано ниже в Таблице 4, каждое из трех антисмысловых

соединений, нацеленных на АроС III, имеет одну и ту же последовательность азотистых оснований. ISIS 304801 представляет собой 5-10-5 МОЕ гэпмер, содержащий только тиофосфатные связи; ISIS 647535 является таким же, как ISIS 304801, за исключением того, что он содержит GalNAc₃-1, конъюгированный у его 3'-конца; и ISIS 647536 является таким же, как ISIS 647535, за исключением того, что некоторые межнуклеозидные связи этого соединения представляют собой фосфодиэфирные связи. Как дополнительно показано в Таблице 4, были синтезированы два отдельных антисмысловых соединения, нацеленных на SRB-1. ISIS 440762 представляет собой 2-10-2 cEt гэпмер, содержащий только тиофосфатные межнуклеозидные связи; ISIS 651900 является таким же, как ISIS 440762, за исключением того, что он содержит GalNAc₃-1 у его 3'-конца.

Нижние индексы: «е» означает 2'-МОЕ модифицированный нуклеозид; «d» означает β-D-2'-дезоксирибонуклеозид; «k» означает 6'-(S)-СН₃ бициклический нуклеозид (например, cEt); «s» означает тиофосфатные межнуклеозидные связи (PS); «о» означает фосфодиэфирные межнуклеозидные связи (РО); и «о'» означает -O-Р(=O)(ОН)-. Верхний индекс «m» означает 5-метилцитозины. «GalNAc₃-1» означает конъгирующую группу, имеющую структуру, изображенную ранее в Примере 9. Следует отметить, что GalNAc₃-1 содержит расщепляемый аденозин, который связывает ASO с остальной частью конъюгата, который означен как «GalNAc₃-1_a». Номенклатура, используемая в представленной выше таблице, показывает полную последовательность азотистых оснований, включая аденозин, который является

частью конъюгата. Следовательно, в представленной выше таблице последовательности также могут быть перечислены с окончанием «GalNAc₃-1», без «A_do». Такое условное применение нижнего индекса «а» для означения части конъгирующей группы, не содержащей расщепляемого нуклеозида или расщепляемого фрагмента, используется во всех представленных Примерах. Эта часть конъгирующей группы, не содержащая расщепляемого фрагмента, упоминается в настоящем документе как «кластер» или «кластер конъюгата» или «кластер GalNAc₃». В некоторых случаях конъгирующая группа для удобства описана путем отдельного представления ее кластера и ее расщепляемого фрагмента.

Пример 20. Дозозависимое антисмысловое ингибирование человеческого АроС III у huApoC III трансгенных мышей

ISIS 304801 и ISIS 647535, каждый из которых нацелен на человеческий ApoC III и описан выше, отдельно испытывали и оценивали в дозозависимом исследовании на их способность ингибировать человеческий АроС III у трансгенных мышей с человеческим АроС III.

Лечение

Трансгенных мышей с человеческим ApoCIII содержали при 12-часовом цикле освещения/темноты и обеспечивали свободный доступ к пище Teklad lab. До начала эксперимента животных акклиматизировали по меньшей мере в течение 7 дней в исследовательской лаборатории. Приготовили ASO в PBS и стерилизовали фильтрованием через фильтр 0,2 микрона. ASO растворили в 0,9% PBS для инъекций.

Трансгенным мышам с человеческим АроС III один раз в неделю в течение двух неделю внутрибрюшинно вводили инъекции ISIS 304801 или 647535 при 0,08, 0,25, 0,75, 2,25 или 6,75 мкмоль/кг или PBS в качестве контрольного образца. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Через сорок восемь часов после введения последней дозы каждую мышь обескровили и усыпили, и собрали ткани.

Анализ мРНК АроС III

Уровни мРНК АроС III в печени мышей определили при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Уровни мРНК АроС III определяли

относительно общей РНК (при помощи Ribogreen), затем нормализовали к контрольному образцу, обработанному PBS. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК АроС III для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному PBS, и означены как «% PBS». Ниже в Таблице 5 представлена также полумаксимальная эффективная доза (ED₅₀) для каждого ASO.

Показано, что оба антисмысловых соединения снижают РНК АроС III, по сравнению с контрольным образцом, обработанным PBS. Кроме того, антисмысловое соединение, конъюгированное с GalNAc₃-1 (ISIS 647535), было значительно более эффективным, чем антисмысловое соединение, не содержащее конъюгат GalNAc₃-1 (ISIS 304801).

Анализ белка АроС III (турбидиметрический анализ)

Анализ белка АроС III в плазме выполнили по способам, описанным в работе Graham et al, Circulation Research, до печати опубликованной онлайн 29 марта 2013 года.

Приблизительно 100 мкл плазмы, выделенной из мышей, анализировали без разбавления, применяя клинический анализатор Olympus и имеющийся в продаже турбидиметрический аналитический набор АроС III (Kamiya, кат. № KAI-006, Kamiya Biomedical, Сиэтл, штат Вашингтон). Протокол анализа выполняли по описанию поставщика.

Как показано ниже в Таблице 6, оба антисмысловых соединения снижают белок АроС III, по сравнению с PBS контрольным образцом. Кроме того, антисмысловое соединение, конъюгированное с GalNAc₃-1 (ISIS 647535), было значительно более эффективным, чем антисмысловое соединение, не содержащее конъюгат GalNAc₃-1 (ISIS 304801).

Триглицериды и холестерин плазмы выделили по способу Bligh и Dyer (Bligh, E.G. and Dyer, W.J. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917, 1959) (Bligh, E and Dyer, W, Can J Biochem Physiol, 37, 911-917, 1959) (Bligh, E and Dyer, W, Can J Biochem Physiol, 37, 911-917, 1959) и измерили при помощи клинического анализатора Beckmann Coulter и имеющихся в продаже реагентов.

Уровни триглицеридов измерили относительно мышей, инъецированных PBS, и выразили как «% PBS». Результаты представлены в Таблице 7. Показано, что оба антисмысловых соединения снижают уровни триглицеридов. Кроме того, антисмысловое соединение, конъюгированное с GalNAc₃-1 (ISIS 647535), было значительно более эффективным, чем антисмысловое соединение, не содержащее конъюгат GalNAc₃-1 (ISIS 304801).

Образцы плазмы анализировали при помощи ВЭЖХ для определения количества общего холестерина и различных фракций холестерина (HDL и LDL). Результаты представлены в Таблицах 8 и 9. Показано, что оба антисмысловых соединения снижают общие уровни холестерина; оба снижают LDL; и оба повышают HDL. Кроме того. антисмысловое соединение, конъюгированное с GalNAc₃-1 (ISIS 647535), было значительно более эффективным, чем антисмысловое соединение, не содержащее конъюгат GalNAc₃-1 (ISIS 304801). Увеличение уровней HDL и снижение уровней LDL представляет собой преимущественный сердечно-сосудистый эффект антисмыслового ингибирования АроС III.

Фармакокинетический анализ (ФК)

Оценили также ФК ASO. Образцы печени и почек измельчили и экстрагировали по стандартным протоколам. Образцы анализировали на MSD1 при помощи ИП-ВЭЖХ-МС. Определили содержание (мкг/г) в ткани ISIS 304801 и 647535 полной длины, и результаты представлены в Таблице 10. Показано, что концентрации в печени антисмысловых соединений полной длины были схожими для двух антисмысловых соединений. Следовательно, даже несмотря на то, что GalNAc₃-1-конъюгированное антисмысловое соединение является более активным в печени (как показано по данным РНК и белка, представленным выше), его содержание в печени не намного выше. Действительно, рассчитанное значение ЕС₅₀ (представленное в Таблице 10) подтверждает, что наблюдаемое увеличение эффективности конъюгированного соединения не может быть приписано исключительно повышенному накоплению. Такой результат позволяет предположить, что конъюгат улучшает эффективность по другому механизму, чем простое накопление в печени, возможно путем увеличения продуктивного захвата антисмыслового соединения в клетки.

Эти результаты показывают также, что концентрация GalNAc₃-1-конъюгированного антисмыслового соединения почках ниже, чем концентрация антисмыслового соединения, не содержащего конъюгата GalNAc. Это имеет несколько преимущественных терапевтических применений. Для терапевтических показаний, в которых не требуется проявление активности в почках, воздействие на почки подвергает их риску токсичности без соответствующем пользы. Более того, высокая концентрация в почках обычно приводит к выводу соединения с мочой, обеспечивая более быстрое выведение. Соответственно, для внепочечных мишеней накопление в почках является нежелательным. Эти данные позволяют предположить, что конъюгирование с GalNAc₃-1 снижает накопление в почках.

Идентифицировали также метаболиты ISIS 647535 и подтвердили их массы при помощи масс-спектрометрического анализа высокого разрешения. Сайты расщепления и структуры наблюдаемых метаболитов представлены ниже. Относительный % от общей длины ASO рассчитали по стандартным приемам, а результаты представлены в Таблице 10а. Основной метаболит ISIS 647535 представляет собой ASO полной длины без всего конъюгата (то есть ISIS 304801), который образуется в результате расщепления по сайту расщепления А, представленному ниже. Кроме того, наблюдали также дополнительные метаболиты, образующиеся из других сайтов расщепления. Эти результаты позволяют предположить, что может быть пригодным также внедрение других расщепляемых связей, таких как сложные эфиры, пептиды, дисульфиды, фосфорамидаты или ацил-гидразоны, между сахаром GalNAc₃-1 и ASO, которые могут расщепляться под действием ферментов внутри клетки или которые могут расщепляться в восстановительной среде цитозоля, или которые лабильны в кислотном рН внутри эндосом и лизосом.

Сайты расщепления

Пример 21. Антисмысловое ингибирование человеческого АроС III у трансгенных мышей с АроС III в исследовании одного введения

ISIS 304801, 647535 и 647536, каждый из которых нацелен на человеческий АроС III и описан в Таблице 4, дополнительно оценивали в исследовании однокраного введения на их способность ингибировать человеческий АроС III у трансгенных мышей с человеческим АроС III.

Лечение

Трансгенных мышей с человеческим ApoCIII содержали при 12-часовом цикле освещения/темноты и обеспечивали свободный доступ к пище Teklad lab. До начала эксперимента животных акклиматизировали по меньшей мере в течение 7 дней в исследовательской лаборатории. Приготовили ASO в PBS и стерилизовали фильтрованием через фильтр 0,2 микрона. ASO растворили в 0,9% PBS для инъекций.

Трансгенным мышам с человеческим АроС III внутрибрюшинно ввели однократную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 304801, 647535 или 647535 (описанных выше), или PBS в качестве контрольного образца. Экспериментальная группа состояла из 3 животных, а контрольная группа состояла из 4 животных. Перед лечением, а также после последней дозы у каждой мыши брали кровь и анализировали образцы плазмы. Мышей усыпили через 72 часа после последнего введения.

Образцы собрали и анализировали для определения уровней мРНК АроС III и белка в печени; триглицеридов в плазме; и холестерина, включая фракции HDL и LDL, которые анализировали так, как описано выше (Пример 20). Данные этих анализов представлены ниже в Таблицах 11-15. Уровни трансаминазы в печени, аланин-аминотрансферазы (ALT) и аспартат-аминотрансферазы (AST) в сыворотке измеряли относительно мышей, инъецированных солевым раствором, применяя стандартные протоколы. Уровни ALT и AST показали, что антисмысловые соединения хорошо переносятся при всех введенные дозах.

Эти результаты демонстрируют усиление эффективности антисмысловых соединений, содержащих конъюгат GalNAc₃-1 на 3'-конце (ISIS 647535 и 647536), по сравнению с антисмысловым соединением, не содаржащим конъюгат GalNAc₃-1 (ISIS 304801). Кроме того, ISIS 647536, который содержит конъюгат GalNAc₃-1 и несколько

фосфодиэфирных связей, был таким же эффективным, как ISIS 647535, который содержит тот же конъюгат, и все межнуклеозидные связи в этом ASO являются тиофосфатными.

Эти результаты подтверждают, что конъюгат GalNAc₃-1 улучшает эффективность антисмыслового соединения. Эти результаты показывают также равную эффективности GalNAc₃-1-конъюгированных антисмысловых соединений, в которых антисмысловые олигонуклеотиды имеют смешанные связи (ISIS 647536, который имеет шесть фосфодиэфирных связей), и полностью тиофосфатной версии того же антисмыслового соединения (ISIS 647535).

Тиофосфатные связи обеспечивают несколько свойств антисмысловых соединений. Например, они устойчивы к нуклеазному расщеплению и связываются с белками, что приводит к накоплению соединения в печени, а не в почках/моче. Эти свойства являются желательными, особенно при лечении показаний в печени. Однако тиофосфатные связи связаны также с воспалительной реакцией. Соответственно, уменьшение количества тиофосфатных связей в соединении предположительно снижает риск воспаления, но снижает также концентрацию соединения в печени, повышает концентрацию в почках и моче, снижает стабильность в присутствии нуклеаз и уменьшает общую эффективность.

Представленные результаты демонстрируют, что GalNAc₃-1-конъюгированное антисмысловое соединение, в котором некоторые тиофосфатные связи заменены фосфодиэфирными связями, настолько же эффективно против мишени в печени, как и аналог, содержащий только тиофосфатные связи. Такие соединения предположительно являются менее провоспалительными (см. Пример 24, в котором описан эксперимент, демонстрирующий, что уменьшение тиофосфатов (PS) приводит к снижению воспалительного действия).

Пример 22. Влияние модифицированного GalNAc₃-1-конъюгированного ASO, нацеленного на SRB-1, in vivo

ISIS 440762 и 651900, каждый из которых нацелен на SRB-1 и описан в Таблице 4, оценили в дозозависимом исследовании на их способность ингибировать SRB-1 у Balb/c мышей.

Лечение

Шестинедельным самцам мышей Balb/c (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) ввели однократную подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 440762, 651900 или PBS в качестве контрольного образца. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей усыпили через 48 часов после последнего введения для определения уровней мРНК SRB-1 в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Уровни мРНК SRB-1 определяли относительно общей РНК (при помощи Ribogreen), затем нормализовали к контрольному образцу, обработанному PBS. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному PBS, и означены как «% PBS».

Как показано в Таблице 16, оба антисмысловых соединения снижают уровни мРНК SRB-1. Кроме того, антисмысловое соединение, содержащее конъюгат GalNAc₃-1 (ISIS 651900), было значительно более эффективным, чем антисмысловое соединение, не содержащее конъюгат GalNAc₃-1 (ISIS 440762). Эти результаты демонстрируют, что преимущество эффективности конъюгатов GalNAc₃-1 наблюдается при применении

антисмысловых олигонуклеотидов, комплементарных различным мишеням и имеющих различные химически модифицированные нуклеозиды, в этом случае модифицированные нуклеозиды содержат стерически затрудненные этил-сахарные фрагменты (бициклический сахарный фрагмент).

Пример 23. Протокол анализа человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (hPBMC)

Анализ hPBMC выполнили при помощи пробирочного способа BD Vautainer CPT. Получили образец цельной крови, полученной от доноров-добровольцев, давших информированное согласие в Медицинской клинике США (Faraday & El Carnino Real, Карлсбад), и собрали его в 4-15 пробирки BD Vacutainer CPT по 8 мл (VWR, кат. № BD362753). Приблизительный исходный общий объем цельной крови в пробирка CPT для каждого донора записали в формуляре анализа РВМС.

Перед центрифугированием образец крови незамедлительно повторно перемешали, осторожно переворачивая пробирки 8-10 раз. Пробирки CPT центрифугировали при комнатной температуре (18-25°С) в горизонтальном (с избыточной поворачиваемостью) роторе в течение 30 минут с фактором разделения (RCF) 1500-1800 с затормаживанием (2700 об./мин. Beckman Allegra 6R). Клетки сняли с лейкоцитарной поверхности раздела (между

слоями фиколла и полимерного геля); перенесли в стерильную 50 мл коническую пробирку и сгруппировали по 5 СРТ пробирок/50 мл коническая пробирка/донор. Затем клетки дважды промыли PBS (без Са⁺⁺, Mg⁺⁺; GIBCO). Пробирки пополнили до 50 мл и перемешали, переворачивая несколько раз. Затем образец центрифугировали при 330×g в течение 15 при комнатной температуре (1215 об./мин в Beckman Allegra 6R) и аспирировали максимальное количество надосадочной жидкости, не нарушая осадок. Клеточный осадок сняли, осторожно поворачивая пробирку, и повторно суспендировали клетки в RPMI + 10% FBS + пенициллин/стрептомицин (~1 мл / 10 мл исходного объема цельной крови). Пипеткой взяли 600 мкл образца и поместили во флакон с пробой (Beckman Coulter), содержащий 600 мкл реагента VersaLyse (Beckman Coulter, кат. № А09777), и осторожно перемешивали на вортексе в течение 10-15 секунд. Образец оставили инкубироваться в течение 10 минут при комнатной температуре, и снова перемешали перед подсчетом. Суспензию клеток считывали на анализаторе жизнеспособности клеток Vicell XR (Beckman Coulter), используя клетки типа РВМС (сохранили фактор разбавления 1:11 с другими параметрами). Записали количество живых клеток/мл и жизнеспособность. Клеточную суспензию разбавили до 1×10⁷ живых РВМС/мл в RPMI + 10% FBS + пенициллин/стрептомицин.

Клетки поместили на планшет при 5×10⁵ в 50 мкл/лунку 96-луночного тканевого культурального планшета (Falcon Microtest). 50 мкл/лунку 2х концентрации олигомеров/контроля, разбавленных в RPMI + 10% FBS + пенициллин/стрептомицин, добавили в соответствии с экспериментальной матрицей (в целом 100 мкл/лунку). Планшеты поместили на шейкер и оставили перемешиваться приблизительно на 1 минуту. После инкубации в течеие 24 часов при 37°С; 5% CO₂, планшеты центрифугировали при 400×g в течение 10 минут, затем удалили надосадочную жидкость для анализа цитокинов MSD (то есть человеческих IL-6, IL-10, IL-8 и МСР-1).

Пример 24. Оценка провоспалительных эффектов в анализе hPBMC для GalNAc₃-1-конъюгированных ASO

Антисмысловые олигонуклеотиды (ASO), перечисленные в Таблице 17, оценили на провоспалительное действие в анализе hPBMC, используя протокол, описанный в Примере 23. ISIS 353512 представляет собой внутренний стандарт, который, как известно, обладает высоким ответом на высвобождение IL-6 в этом анализе. hPBMC выделили из свежых

образцов, полученных от доноров-добровольцев, и обработали ASO в концентрациях 0, 0,0128, 0,064, 0,32, 1,6, 8, 40 и 200 мкМ. Через 24 часа обработки измерили уровни цитокинов.

Уровни IL-6 применили в качестве первичного показания. ЕС₅₀ и E_max рассчитали по стандартным способам. Результаты выразили как среднее отношение E_max/ЕС₅₀ для двух доноров и означили как «E_max/ЕС₅₀». Более низкое соотношение означает относительное снижение провоспалительного ответа, а более высокое соотношение означает относительное увеличение провоспалительного ответа.

В отношении исследуемых соединений, наименее провоспалительным соединением было ASO, соединенное при помощи PS/PO (ISIS 616468). GalNAc₃-1-конъюгированное ASO, ISIS 647535, было немного менее провоспалительным, чем его неконъюгированный аналог, ISIS 304801. Эти результаты показывают, что внедрение нескольких РО связей снижает провоспалительную реакцию, а добавление конъюгата GalNAc₃-1 не делает соединение более провоспалительным, и может снижать провоспалительную реакцию. Соответственно, можно ожидать, что антисмысловое соединение, содержащее смешанные PS/PO связи и конъюгат GalNAc₃-1, может вызывать более слабые провоспалительные реакции, по сравнению с антисмысловым соединением, связанным только посредством PS, с конъюгатом GalNAc₃-1 или без него. Эти результаты показывают, что GalNAc₃-1-конъюгированные антисмысловые соединения, в частности, соединения, имеющие меньшее содержание PS, являются менее провоспалительными.

В целом, эти результаты позволяют предположить, что GalNAc₃-1-конъюгированное соединение, в частности, соединение со сниженным содержанием PS, может быть введено в более высокой дозе, чем аналогичное полностью PS антисмысловое соединение без конъюгата GalNAc₃-1. Поскольку не ожидается, что период полувыведения для этих соединений будет существенно различаться, то такое введение в более высокой доче обусловит менее частое введение доз. В действительности, такое введение может быть еще более редким, поскольку GalNAc₃-1-конъюгированные соединения являются более эффективными (см. Примеры 20-22), а повторное введение дозы необходимо только при снижении концентрации соединения ниже желаемого уровня, при этом такой желаемый уровень обусловлен эффективностью.

Нижние индексы: «е» означает 2'-МОЕ модифицированный нуклеозид; «d» означает β-D-2'-дезоксирибонуклеозид; «k» означает 6'-(S)-СН₃ бициклический нуклеозид (например, cEt); «s» означает тиофосфатные межнуклеозидные связи (PS); «о» означает фосфодиэфирные межнуклеозидные связи (РО); и «о'» означает -O-Р(=O)(ОН)-. Верхний индекс «m» означает 5-метилцитозины. «A_do'-GalNAc₃-1_a» означает конъюгат, имеющий структуру GalNAc₃-1, представленную в Примере 9, присоединенный к 3'-концу указанного антисмыслового олигонуклеотида.

Пример 25. Влияние модифицированного GalNAc₃-1-конъюгированного ASO, нацеленного на человеческий АроС III, in vitro

ISIS 304801 и 647535, описанные выше, испытали in vitro. Первичные гепатоцитарные клетки трансгенных мышей при плотности 25000 клеток на лунку обработали концентрациями 0,03, 0,08, 0,24, 0,74, 2,22, 6,67 и 20 мкМ модифицированных олигонуклеотидов. После обработки в течение приблизительно 16 часов, из клеток выделили РНК и измерили уровни мРНК при помощи количественной ПЦР в реальном времени, а уровни мРНК hApoC III скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным при помощи RIBOGREEN.

IC₅₀ рассчитали по стандартным способам, а результаты представлены в Таблице 19. Показано, что наблюдали сравнимую эффективность в клетках, обработанных ISIS 647535, по сравнению с контрольным образцом, ISIS 304801.

В этом эксперименте in vitro не наблюдали такого большого преимущества эффективности конъюгирования с GalNAc₃-1, как наблюдали in vivo. Последующие

эксперименты свободного захвата в первичных гепатоцитах in vitro не показали повышенной эффективности олигонуклеотидов, содержащих различные конъюгаты GalNAc, по сравнению с олигонуклеотидами, не содержащими конъюгаты GalNAc (см. Примеры 60, 82 и 92).

Пример 26. Влияние связей PO/PS на кативность ASO в отношении АроС III

Трансгенным мышам с человеческим АроС III внутрибрюшинной инъекцией вводили 25 мг/кг ISIS 304801 или ISIS 616468 (оба описаны выше) или PBS в качестве контрольного образца, один раз в неделю в течение двух недель. Экспериментальная группа состояла из 3 животных, а контрольная группа состояла из 4 животных. Перед лечением, а также после последней дозы у каждой мыши брали кровь и анализировали образцы плазмы. Мышей усыпили через 72 часа после последнего введения.

Образцы собрали и анализировали для определения уровней белка АроС III в печени, как описано выше (Пример 20). Данные этих анализов представлены ниже в Таблице 20.

Эти результаты демонстрируют снижение эффективности антисмысловых соединений с PO/PS (ISIS 616468) в крыльях, по сравнению с соединениями, содержащими только PS (ISIS 304801).

Пример 27. Соединение 56

Соединение 56 имеется в продаже у компании Glen Research или может быть получено по опубликованным методикам, описанным авторами Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454.

Пример 28. Получение Соединения 60

Соединение 4 получили по способам, описанным в Примере 2. Соединение 57 имеется в продаже. Соединение 60 подтвердили структурным анализом.

Соединение 57 является иллюстративным, и его не следует считать ограничивающим, поскольку могут быть применены другие монозащищенные замещенные или незамещенные алкилдиолы, включая, но не ограничиваясь ими, те, которые представлены в данном описании, для получения фосфорамидитов, имеющих желаемый состав.

Пример 29. Получение Соединения 63

Соединения 61 и 62 получили по таким же способам, как описаны авторами Tober et al., Eur. J. Org. Chem., 2013, 3, 566-577; и Jiang et al.. Tetrahedron, 2007, 62(19), 3982-3988.

Альтернативно, Соединение 63 получили по таким же способам, как описаны в научной и патентной литературе авторами Kim et al., Synlett, 2003, 12, 1838-1840; и Kim et al., в опубликованной Международной заявке РСТ WO 2004063208.

Пример 30. Получение Соединения 63b

Соединение 63а получили по таким же способам, как описаны авторами Hanessian et al., Canadian Journal of Chemistry, 1996, 74(9), 1731-1737.

Пример 31. Получение Соединения 63d

Соединение 63 с получили по таким же способам, как описаны авторами Chen et al., Chinese Chemical Letters, 1998, 9(5), 451-453.

Пример 32. Получение Соединения 67

Соединение 64 получили по способам, представленным в Примере 2. Соединение 65 получили по таким же способам, как описаны авторами Or et al., в опубликованной Международной заявке РСТ WO 2009003009. Защитные группы, применяемые для Соединения 65, являются иллюстративными, и их не следует считать ограничением, поскольку могут быть применены другие защитные группы, включая, но не ограничиваясь ими, те, которые представлены в данном описании.

Пример 33. Получение Соединения 70

Соединение 64 получили по способам, описанным в Примере 2. Соединение 68 имеется в продаже. Защитная группа, примененная для Соединения 68, является иллюстративной, и ее не следует считать ограничением, поскольку могут быть применены другие защитные группы, включая, но не ограничиваясь ими, те, которые представлены в данном описании.

Пример 34. Получение Соединения 75а

Соединение 75 получили по опубликованным методикам, описанным авторами Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454.

Пример 35. Получение Соединения 79

Соединение 76 получили по опубликованным методикам, описанным авторами Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454.

Пример 36. Получение Соединения 79а

Соединение 77 получили по способам, представленным в Примере 35.

Пример 37. Общий способ получения конъюгированного олигомерного соединения 82, содержащего фосфодиэфир-связанный конъюгат GalNAc₃-2 на 5'-конце, на твердой подложке (Способ I)

где GalNAc₃-2 имеет структуру:

Кластерная часть GalNAc₃ конъгирующей группы GalNAc₃-2 (GalNAc₃-2_a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом с получением различных конъюгирующих групп. При этом GalNAc₃-2_a имеет формулу:

VIMAD-связанное олигомерное соединение 79b получили по стандартным способам в автоматическом синтезаторе ДНК/РНК (см. Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627). Фосфорамидитные Соединения 56 и 60 получили так, как описано в способах в Примерах 27 и 28, соответственно. Изображенные фософорамидиты являются иллюстративными, и их не следует считать ограничением, поскольку могут быть применены другие фосфорамидитные строительные блоки, включая, но не ограничиваясь ими, те, которые представлены в данном описании, для получения олигомерного соединения, содержащего фосфодиэфир-связанную конъгирующую группу на 5'-конце. Порядок и количество фосфорамидитов, добавляемых к твердой подложке, может быть подобрано для получения олигомерных соединений, описанных в настоящем документе, которые имеют любую желаемую последовательность и состав.

Пример 38. Альтернативный способ получения олигомерного соединения 82. содержащего фосфодиэфир-связанный конъюгат GalNAc₃-2 на 5'-конце (Способ II)

VIMAD-связанное олигомерное соединение 79b получили по стандартным способам в автоматическом синтезаторе ДНК/РНК (см. Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627). GalNAc₃-2-кластерный фосфорамидит. Соединение 79, получили по способам, представленным в Примере 35. Альтернативный способ обеспечивает возможность

одностадийной установки фосфодиэфир-связанного GalNAc₃-2 конъюгата на олигомерное соединение на последней стадии синтеза. Изображенные фософорамидиты являются иллюстративными, и их не следует считать ограничением, поскольку могут быть применены другие фосфорамидитные строительные блоки, включая, но не ограничиваясь ими, те, которые представлены в данном описании, для получения олигомерных соединений, содержащих фосфодиэф ирный конъюгат на 5'-конце. Порядок к количество фосфорамидитов, добавляемых к твердой подложке, может быть подобрано для получения олигомерных соединений, описанных в настоящем документе, которые имеют любую желаемую последовательность и состав.

Пример 39. Общий способ получения олигомерного соединения 83h, содержащего конъюгат GalNAc₃-3 на 5'-конце (GalNAc₃-1, модифицированный для 5'-концевого присоединения), на твердой подложке

Соединение 18 получили по способам, описанным в Примере 4. Соединения 83а и 83b имеются в продаже. Олигомерное Соединение 83е, содержащее связанный через фосфодиэфир гексиламин, получили по стандартным способам синтеза олигонуклеотидов. В результате обработки защищенного олигомерного соединения водным раствором аммиака получили 5'-GalNAc₃-3 конъюгированное олигомерное соединение (83h).

где GalNAc₃-3 имеет структуру:

.

Кластерная часть GalNAc₃ конъгирующей группы GalNAc₃-3 (GalNAc₃-3_a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом с получением различных конъюгирующих групп. При этом GalNAc₃-3_a имеет формулу:

.

Пример 40. Общий способ получения олигомерного соединения 89, содержащего фосфодиэфир-связанный конъюгат GalNAc₃-4 на 3'-конце, на твердой подложке

где GalNAc₃-4 имеет структуру:

Где СМ представляет собой расщепляемый фрагмент. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент представляет собой:

Кластерная часть GalNAc₃ конъгирующей группы GalNAc₃-4 (GalNAc₃-4_a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом с получением различных конъюгирующих групп. При этом GalNAc₃-4_a имеет формулу:

Защищенное Соединение 30 на функционализированной твердой подложке Unylinker имеется в продаже. Соединение 84 получили по таким же способам, как описаны в литературе (см. Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454; Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1999, 27, 3035-3041; и Hornet et al.. Nucleic Acids Research, 1997. 25, 4842-4849).

Фосфорамидитные строительные блоки, Соединения 60 и 79а, получили по способам, представленным в Примерах 28 и 36. Изображенные фосфорамидиты являются иллюстративными и не предназначены для ограничения, поскольку могут быть применены другие фосфорамидитные строительные блоки для получения олигомерного соединения, имеющего фосфодиэфир-связанный конъюгат на 3'-конце, которое имеет желаемую последовательность и состав. Порядок и количество фосфорамидитов, добавляемых к твердой подложке, может быть подобрано для получения олигомерных соединений, описанных в настоящем документе, которые имеют любую желаемую последовательность и состав.

Пример 41. Общий способ получения ASO, содержащих фосфодиэфир-связанный конъюгат GalNAc₃-2 (см. Пример 37, Вх представляет собой аденин) в 5'-положении, по твердофазному способу (получение ISIS 661134)

Если не указано иное, все реагенты и растворы, примененные для синтеза олигомерных соединений, приобретены у коммерческих поставщиков. Стандартные фосфорамидитные строительные блоки и твердую подложку применили для внедрения нуклеозидных остатков, которые включают, например, остатки Т, A, G и ^mC. Фосфорамидитные соединения 56 и 60 применили для синтеза фосфодиэфир-связанного конъюгата GalNAc₃-2 на 5'-конце. 0,1 М раствор фосфорамидита в безводном ацетонитриле применили для β-D-2'-дезоксирибонуклеозида и 2'-МОЕ.

Синтез антисмысловых олигонуклеотидов (ASO) выполнили на синтезаторе ABI 394 (в масштабе 1-2 мкмоль) или на синтезаторе Oligopilot производства GE Healthcare Bioscience (в масштабе 40-200 мкмоль) по способу фосфорамидитного связывания на твердой подложке VIMAD (110 мкмоль/г, Guzaev et al., 2003), упакованной в колонку. Для стадии связывания фосфорамидиты вводили в 4-кратном избытке по сравнению с первоначальной загрузкой на твердой подложке, а связывание фосфорамидита выполняли в течение 10 минут.

Все остальные стадии выполняли по протоколам, предоставленным производителем. Для удаления диметокситритильных (DMT) групп с 5'-гидроксильных групп нуклеотида применили 6% раствор дихлоруксусной кислоты в толуоле. На стадии связывания в качестве активатора применили 4,5-дицианоимидазол (0,7 М) в безводном CH₃CN. Тиофосфатчые связи внедряли сульфированием при помощи 0,1 М раствора гидрида ксантана в 1:1 смеси пиридина/CH₃CN в течение 3 минут времени контакта. В качестве окислительного агента для обеспечения фосфодиэфирных межнуклеозидных связей применили 20% раствор трет-бутилгидропероксида в CH₃CN, содержащий 6% воды, в течение 12 минут времени контакта.

После сборки требуемой последовательности цианоэтил-фосфатные защитные группы снимали при помощи 20% диэтиламина в толуоле (об./об.) в течение 45 минут времени контакта. Связанные с твердой подложкой ASO суспендировали в водном растворе аммиака (28-30 масс. %) и нагревали при 55°С в течение 6 часов.

Затем отфильтровывали не связанные ASO и выпаривали аммиак кипячением. Остаток очищали жидкостной хроматографией высокого давления на сильной анионообменной колонке (GE Healthcare Bioscience, Source 30Q, 30 мкм, 2,54×8 см, А=100 мМ ацетата аммония в 30% водном CH₃CN, В=1,5 М NaBr в А, 0-40% В за 60 мин., скорость потока 14 мл.мин-1, λ=260 нм). Остаток обессоливали при помощи ВЭЖХ на обращенно-фазовой колонке с получением желаемых ASO с выделенным выходом 15-30% относительно первоначальной загрузки на твердую подложку. ASO характеризовали при помощи ион-парной ВЭЖХ, совмещенной с МС-анализом на системе Agilent 1100 MSD.

Нижние индексы: «е» означает 2'-МОЕ модифицированный нуклеозид; «d» означает β-D-2'-дезоксирибонуклеозид; «k» означает 6'-(S)-СН₃ бициклический нуклеозид (например, cEt); «s» означает тиофосфатные межнуклеозидные связи (PS); «о» означает фосфодиэфирные межнуклеозидные связи (РО); и «о'» означает -O-Р(=O)(ОН)-. Верхний индекс «m» означает 5-метилцитозины. Структура GalNAc₃-2_a представлена в Примере 37.

Пример 42. Общий способ получения ASO, содержащих конъюгат GalNAc₃-3 в 5'-положении, по твердофазным методикам (получение ISIS 661166)

Синтез ISIS 661166 выполнили по таким же способам, как представлены в Примерах 39 и 41.

ISIS 661166 представляет собой 5-10-5 МОЕ гэпмер, в котором 5'-положение содержит конъюгат GalNAc₃-3. Это ASO характеризовали при помощи ион-парной ВЭЖХ, совмещенной с МС-анализом на системе Agilent 1100 MSD.

Нижние индексы: «е» означает 2'-МОЕ модифицированный нуклеозид; «d» означает β-D-2'-дезоксирибонуклеозид; «s» означает тиофосфатные межнуклеозидные связи (PS); «о» означает фосфодиэфирные межнуклеозидные связи (РО); и «о'» означает -O-Р(=O)(ОН)-. Верхний индекс «m» означает 5-метилцитозины. Структура «5'-GalNAc₃-3_a» представлена в Примере 39.

Пример 43. Дозозависимое исследование фосфодиэфир-связанного GalNAc₃-1 (см. Примеры 37 и 41, Вх представляет собой аденин) на 5'-конце, нацеленного на SRB-1, in vivo

ISIS 661134 (см. Пример 41), содержащий фосфодиэфир-связанный конъюгат GalNAc₃-2 на 5'-конце, испытывали в дозозависимом исследовании на антисмысловое ингибирование SRB-1 у мышей. Неконъюгированные ISIS 440762 и 651900 (конъюгат GalNAc₃-1 на 3'-конце, см. Пример 9) включены в исследование для сравнения и описаны ранее в Таблице 4.

Лечение

Шестинедельным самцам мышей Balb/c (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) ввели однократную подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 440762, 651900, 661134 или PBS в качестве контрольного образца. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей усыпили через 72 часов после последнего введения для определения уровней мРНК SRB-1 в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Уровни мРНК SRB-1 определяли относительно общей РНК (при помощи Ribogreen), затем нормализовали к контрольному образцу, обработанному PBS. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному PBS, и означены как «% PBS». ED₅₀ измеряли по таким же способам, как описаны ранее, и они представлены ниже.

Как показано в Таблице 22, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК SRB-1 дозозависимым образом. Действительно, антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие фосфодиэфир-связанный конъюгат GalNAc₃-2 на 5'-конце (ISIS 661134) или конъюгат GalNAc₃-1, связанный на 3'-конце (ISIS 651900), демонстрируют значительное улучшение эффективности, по сравнению с неконъюгированным антисмысловым олигонуклеотидом (ISIS 440762). Кроме того, ISIS 661134, который содержит фосфодиэфир-связанный конъюгат GalNAc₃-2 на 5'-конце, был настолько же эффективным, как ISIS 651900, который содержит конъюгат GalNAc₃-1 на 3'-конце.

Фармакокинетический анализ (ФК)

ФК для ASO из группы высокой дозы (7 мг/кг) исследовали и оценили таким же образом, как описано в Примере 20. Образцы печени измельчили и экстрагировали по стандартным протоколам. Идентифицировали метаболиты полной длины 661134 (5' GalNAc₃-2) и ISIS 651900 (3' GalNAc₃-1) и подтвердили их массы при помощи масс-спектрометрического анализа высокого разрешения. Результаты показали, что основной метаболит, обнаруженный для ASO, содержащего фосфодиэфир-связанный конъюгат GalNAc₃-2 на 5'-конце (ISIS 661134), представлял собой ISIS 440762 (данные не показаны). Не наблюдали никаких дополнительных метаболитов в обнаруживаемом количестве. В отличие от него, для ASO, содержащего конъюгат GalNAc₃-1 на 3'-конце (ISIS 651900), наблюдали дополнительные метаболиты, аналогичные тем, которые описаны ранее в Таблице 10а. Эти результаты позволяют предположить, что наличие фосфодиэфир-связанного конъюгата GalNAc₃-1 или GalNAc₃-2 может улучшать ФК профиль ASO без ухудшения их эффективности.

Пример 44. Влияние PO/PS связей на антисмысловое ингибирование ASO, содержащих конъюгат GalNAc₃-1 (см. Пример 9) на 3'-конце, нацеленных на SRB-1

ISIS 655861 и 655862, содержащие конъюгат GalNAc₃-1 на 3'-конце, каждый из которых нацелен на SRB-1, испытали в исследовании однократного введения на их способность ингибировать SRB-1 у мышей. Исходное неконъюгированное соединение, ISIS 353382, включили в исследование для сравнения.

Эти ASO представляют собой 5-10-5 МОЕ гэпмеры, в которых гэп-область содержит десять 2'-дезоксирибонуклеозидов, и каждая область крыльев содержит пять 2'-МОЕ модифицированных нуклеозидов. Эти ASO получили по таким же способам, как показаны ранее в Примере 19, и они описаны ниже в Таблице 23.

Нижние индексы: «е» означает 2'-МОЕ модифицированный нуклеозид; «d» означает β-D-2'-дезоксирибонуклеозид; «s» означает тиофосфатные межнуклеозидные связи (PS); «о» означает фосфодиэфирные межнуклеозидные связи (РО); и «о'» означает -O-Р(=O)(ОН)-. Верхний индекс «m» означает 5-метилцитозины. Структура «GalNAc₃-1» представлена в Примере 9.

Лечение

Шестинедельным самцам мышей Balb/c (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) ввели однократную подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 353382, 655861, 655862 или PBS в качестве контрольного образца. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Перед лечением, а также после последней дозы у каждой мыши брали кровь и анализировали образцы плазмы. Мышей усыпили через 72 часов после последнего введения для определения уровней мРНК SRB-1 в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Уровни мРНК SRB-1 определяли относительно общей РНК (при помощи Ribogreen), затем нормализовали к контрольному образцу, обработанному PBS. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному PBS, и означены как «% PBS». ED₅₀ измеряли по таким же способам, как описаны ранее, и они представлены ниже.

Как показано в Таблице 24, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК SRB-1 дозозависимым образом, по сравнению с контрольным образцом, обработанным PBS. Действительно, антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие конъюгат GalNAc₃-1 на 3'-конце (ISIS 655861 и 655862), демонстрируют значительное усиление эффективности, по сравнению с неконъюгированным антисмысловым олигонуклеотидом (ISIS 353382). Кроме того, ISIS 655862 со смешанными PS/PO связями демонстрирует усиление эффективности, по сравнению с соединением, содержащим только PS (ISIS 655861).

Уровни трансаминазы в печени, аланин-аминотрансферазы (ALT) и аспартат-аминотрансферазы (AST) в сыворотке измеряли относительно мышей, инъецированных солевым раствором, применяя стандартные протоколы. Оценили также массу органов. Результаты показывают, что не наблюдали какого-либо увеличения уровней трансаминазы (Таблица 25) или массы органов (данные не показаны) у мышей, обработанных ASO, по сравнению с PBS контролем. Кроме того, ASO со смешанными PS/PO связями (ISIS 655862) демонстрирует схожие уровни трансаминазы, по сравнению с соединением, содержащим только PS (ISIS 655861).

Пример 45. Получение PFP эфира. Соединения 110а

Соединение 4 (9,5 г, 28,8 ммоль) обработали по отдельности соединением 103а или 103b (38 ммоль) и TMSOTf (0,5 экв.), и молекулярными ситами в дихлорметане (200 мл), и перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре. Затем органический слой отфильтровали через целит, затем промыли бикарбонатом натрия, водой и насыщенным солевым раствором. Затем отделили органический слой и высушили над сульфатом натрия, отфильтровали и упарили под пониженным давлением. Полученное маслянистое вещество очистили силикагелевой хроматографией (2%->10% метанол/дихлорметан) с получением соединений 104а и 104b с выходом >80%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.

Соединения 104а и 104b обработали в тех же условиях, что и соединения 100a-d (Пример 47), с получением соединений 105а и 105b с выходом >90%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.

Соединения 105а и 105b по отдельности обработали соединением 90 при тех же условиях, что и соединения 901a-d, с получением соединений 106а (80%) и 106b (20%). Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.

Соединения 106а и 106b обработали в тех же условиях, что и соединения 96a-d (Пример 47), с получением соединения 107а (60%) и 107b (20%). Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.

Соединения 107а и 107b обработали в тех же условиях, что и соединения 97a-d (Пример 47), с получением соединений 108а и 108b с выходом 40-60%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.

Соединения 108а (60%) и 108b (40%) обработали в тех же условиях, что и соединения 100a-d (Пример 47), с получением соединений 109а и 109b с выходом >80%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.

Соединение 109а обработали в тех же условиях, что и соединения 101a-d (Пример 47), с получением соединения 110а с выходом 30-60%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой. Альтернативно, Соединение 110b может быть получено таким же образом, исходя из Соединения 109b.

Пример 46. Общий способ конъюгирования с PFP эфирами (олигонуклеотид 111); получение ISIS 666881 (GalNAc₃-10)

Синтезировали и очистили 5'-гексиламино-модифицированный олигонуклеотид по стандартным способам твердофазного получения олигонуклеотидов. 5'-Гексиламино-модифицированный олигонуклеотид растворили в 0,1 М растворе тетрабората натрия, рН 8,5 (200 мкл) и добавили 3 эквивалента выбранного PFP-эстерифицированного кластера GalNAc₃, растворенного в ДМСО (50 мкл). Если при добавлении раствора ASO эфир PFP выпадал в осадок, то добавляли ДМСО до перехода всего эфира PFP в раствор. Реакция была завершена примерно через 16 часов перемешивания при комнатной температуре. Полученный раствор разбавили водой до 12 мл, а затем центрифугировали при 3000 об./мин.

в центробежном фильтре с отсечением по массе 3000 Да. Этот прием повторили два раза для удаления низкомолекулярных примесей. Затем раствор лиофилизировали до сухости и повторно растворили в концентрированном водном растворе аммиака, и перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 часов, затем концентрировали in vacuo для удаления большей части аммиака. Конъюгированный олигонуклеотид очистили и обессолили при помощи ОФ-ВЭЖХ, и лиофилизировали с получением GalNAc₃ конъюгированного олигонуклеотида.

Олигонуклеотид 111 конъюгирован с GalNAc₃-10. Кластерная часть GalNAc₃ конъгирующей группы GalNAc₃-10 (GalNAc₃-10_a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом с получением различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-A_d-Р(=O)(ОН)-, как показано ниже в олигонуклеотиде (ISIS 666881), синтезированном с GalNAc₃-10. Структура GalNAc₃-10 (GalNAc₃-10_а-СМ-) представлена ниже:

По указанному общему способу получили ISIS 666881. Синтезировали и очистили 5'-гексиламино-модифицированный олигонуклеотид, ISIS 660254, по стандартным способам твердофазного получения олигонуклеотидов. ISIS 660254 (40 мг, 5,2 мкмоль) растворили в 0,1 М растворе тетрабората натрия, рН 8,5 (200 мкл) и добавили 3 эквивалента PFP эфира (Соединения 110а), растворенного в ДМСО (50 мкл). Эфир PFP выпал в осадок при добавлении раствора ASO, поэтому потребовалось добавление дополнительного количества ДМСО (600 мкл) для полного растворения PFP эфира. Реакция была завершена через 16 часов перемешивания при комнатной температуре. Раствор разбавили водой до общего объема 12 мл, а затем центрифугировали при 3000 об./мин. в центробежном фильтре с отсечением по массе 3000 Да. Этот прием повторили два раза для удаления низкомолекулярных примесей. Раствор лиофилизировали до сухости и повторно растворили в концентрированном водном растворе аммиака, перемешивая при комнатной температуре в течение 2,5 часов, затем концентрировали in vacuo для удаления большей части аммиака. Конъюгированный олигонуклеотид очистили и обессолили при помощи ОФ-ВЭЖХ, и лиофилизировали с получением ISIS 666881 с выходом 90% по массе (42 мг, 4,7 мкмоль).

GalNAc₃-10-конъюгированный олигонуклеотид

Заглавные буквы указывают азотистое основание для каждого нуклеозида, а ^mC означает 5-метилцитозин. Нижние индексы: «е» означает 2'-МОЕ модифицированный нуклеозид; «d» означает β-D-2'-дезоксирибонуклеозид; «s» означает тиофосфатную межнуклеозидную связь (PS); «о» означает фосфодиэфирную межнуклеозидную связь (РО); и «о'» означает -O-Р(=O)(ОН)-. Конъгирующей группы выделены жирным шрифтом.

Пример 47. Получение олигонуклеотида 102, содержащего GalNAc₃-8

Трехкислотное соединение 90 (4 г, 14,43 ммоль) растворили в ДМФА (120 мл) и N,N-диизопропилэтиламине (12,35 мл, 72 ммоль). По каплям добавили пентафторфенила трифторацетат (8,9 мл, 52 ммоль) под аргоном и оставили реакционную смесь перемешиваться при комнатной температуре в течение 30 минут. Добавили Boc-диамин 91а или 91b (68,87 ммоль) вместе с N,N-диизопропилэтиламином (12,35 мл, 72 ммоль) и оставили реакционную смесь перемешиваться при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем упарили ДМФА на >75% под пониженным давлением, а затем растворили смесь в дихлорметане. Органический слой промыли бикарбонатом натрия, водой и насыщенным солевым раствором. Затем отделили органический слой и высушили над сульфатом натрия, отфильтровали и упарили под пониженным давлением до маслянистого остатка. Полученное маслянистое вещество очистили силикагелевой хроматографией (2%->10%

метанол/дихлорметан) с получением соединений 92а и 92b с приблизительным выходом 80%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.

Соединение 92а или 92b (6,7 ммоль) обрабатывали 20 мл дихлорметана и 20 мл трифторуксусной кислоты при комнатной температуре в течение 16 часов. Полученный раствор выпарили, а затем растворили в метаноле и обрабатывали смолой DOWEX-OH в течение 30 минут. Полученный раствор отфильтровали и упарили до маслянистого вещества под пониженным давлением с получением 85-90% выхода соединений 93а и 93b.

Соединения 7 или 64 (9,6 ммоль) обрабатывали HBTU (3,7 г, 9,6 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламином (5 мл) в ДМФА (20 мл) в течение 15 минут. К смеси добавили либо соединение 93а, либо 93b (3 ммоль) и оставили перемешиваться при комнатной температуре на 16 часов. Затем упарили ДМФА на >75% под пониженным давлением, а затем растворили смесь в дихлорметане. Органический слой промыли бикарбонатом натрия, водой и насыщенным солевым раствором. Затем отделили органический слой и высушили над сульфатом натрия, отфильтровали и упарили под пониженным давлением до маслянистого остатка. Полученное маслянистое вещество очистили силикагелевой хроматографией (5%->20% метанол/дихлорметан) с получением соединений 96a-d с выходом 20-40%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.

Соединения 96a-d (0,75 ммоль) по отдельности гидрировали на никеле Ренея в течение 3 часов в этаноле (75 мл). Затем катализатор удалили фильтрованием через целит, а этанол удалили под пониженным давлением с получением соединений 97a-d с выходом 80-90%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.

Соединение 23 (0,32 г, 0,53 ммоль) обрабатывали HBTU (0,2 г, 0,53 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламином (0,19 мл, 1,14 ммоль) в ДМФА (30 мл) в течение 15 минут. К смеси по отдельности добавили соединения 97a-d (0,38 ммоль) и оставили перемешиваться при комнатной температуре на 16 часов. Затем упарили ДМФА на >75% под пониженным давлением, а затем растворили смесь в дихлорметане. Органический слой промыли бикарбонатом натрия, водой и насыщенным солевым раствором. Затем отделили органический слой и высушили над сульфатом натрия, отфильтровали и упарили пса пониженным давлением до маслянистого остатка. Полученное маслянистое вещество очистили силикагелевой хроматографией (2%->20% метанол/дихлорметан) с получением

соединений 98a-d с выходом 30-40%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.

Соединение 99 (0,17 г, 0,76 ммоль) обрабатывали HBTU (0,29 г, 0,76 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламином (0,35 мл, 2,0 ммоль) в ДМФА (50 мл) в течение 15 минут. К смеси по отдельности добавили соединения 97a-d (0,51 ммоль) и оставили перемешиваться при комнатной температуре на 16 часов. Затем упарили ДМФА на >75% под пониженным давлением, а затем растворили смесь в дихлорметане. Органический слой промыли бикарбонатом натрия, водой и насыщенным солевым раствором. Затем отделили органический слой и высушили над сульфатом натрия, отфильтровали и упарили под пониженным давлением до маслянистого остатка. Полученное маслянистое вещество очистили силикагелевой хроматографией (5%->20% метанол/дихлорметан) с получением соединений 100а-d с выходом 40-60%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.

Соединения 100а-d (0,16 ммоль) по отдельности гидрировали на 10% Pd(OH)₂/C в течение 3 часов в метаноле/этилацетате (1:1, 50 мл). Затем катализатор удалили фильтрованием через целит, а органические растворители удалили под пониженным давлением с получением соединений 101a-d с выходом 80-90%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.

Соединения 101a-d (0,15 ммоль) по отдельности растворили в ДМФА (15 мл) и пиридине (0,016 мл, 0,2 ммоль). По каплям добавили пентафторфенила трифторацетат (0,034 мл, 0,2 ммоль) под аргоном и оставили реакционную смесь перемешиваться при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем упарили ДМФА на >75% под пониженным давлением, а затем растворили смесь в дихлорметане. Органический слой промыли бикарбонатом натрия, водой и насыщенным солевым раствором. Затем отделили органический слой и высушили над сульфатом натрия, отфильтровали и упарили под пониженным давлением до маслянистого остатка. Полученное маслянистое вещество очистили силикагелевой хроматографией (2%->5% метанол/дихлорметан) с получением соединений 102a-d с приблизительным выходом 80%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.

Олигомерное Соединение 102, содержащее конъгирующую группу GalNAc₃-8, получили по общим способам, представленным в Примере 46. Кластерная часть GalNAc₃ конъгирующей группы GalNAc₃-8 (GalNAc₃-8_a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. Я предпочтительном варианте реализации расщепляемый фрагмент представляет собой -Р(=O)(ОН)-A_d-Р(=O)(ОН)-.

Структура GalNAc₃-8 (GalNAc₃-8_a-CM-) представлена ниже:

Пример 48. Получение олигонуклеотида 119, содержащего GalNAc₃-7

Соединение 112 синтезировали по способу, описанному в литературе (J. Med. Chem. 2004, 47, 5798-5808).

Соединение 112 (5 г, 8,6 ммоль) растворили в 1:1 смеси метанола/этилацетата (22 мл/22 мл). Добавили гидроксид палладия на углероде (0,5 г). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре под водородом в течение 12 часов. Реакционную смесь отфильтровали через слой целита и промыли этот слой 1:1 смесью метанола/этилацетата. Фильтрат и промывочные растворы объединили и концентрировали до сухости с получением Соединения 105а (количественно). Структуру подтвердили по ЖХМС.

Соединение 113 (1,25 г, 2,7 ммоль), HBTU (3,2 г, 8,4 ммоль) и DIEA (2,8 мл, 16,2 ммоль) растворили в безводном ДМФА (17 мл) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 5 минут. К этой смеси добавили раствор Соединения 105а

(3,77 г, 8,4 ммоль) в безводном ДМФА (20 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов. Растворитель удалили под пониженным давлением с получением маслянистого вещества. Остаток растворили в CH₂Cl₂ (100 мл) и промыли насыщенным водным раствором NaHCO₃ (100 мл) и насыщенным солевым раствором (100 мл). Органическую фазу отделили, высушили (Na₂SO₄), отфильтровали и выпарили. Остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией и элюировали от 10 до 20% МеОН в дихлорметане с получением Соединения 114 (1,45 г, 30%). Структуру подтвердили анализом ЖХМС и ¹Н ЯМР.

Соединение 114 (1,43 г, 0,8 ммоль) растворили в 1:1 смеси метанола/этила цетата (4 мл/4 мл). Добавили палладий на углероде (влажный, 0,14 г). Реакционную смесь продували водородом и перемешивали при комнатной температуре под водородом в течение 12 часов. Реакционную смесь отфильтровали через слой целита. Слой целита промыли метанолом/этилацетатом (1:1). Фильтрат и промывочные растворы объединили и выпарили под пониженным давлением с получением Соединения 115 (количественно). Структуру подтвердили анализом ЖХМС и ¹Н ЯМР.

Соединение 83а (0,17 г, 0,75 ммоль), HBTU (0,31 г, 0,83 ммоль) и DIEA (0,26 мл, 1,5 ммоль) растворили в безводном ДМФА (5 мл) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 5 минут. К этой смеси добавили раствор Соединения 115 (1,22 г, 0,75 ммоль) в безводном ДМФА и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 6 часов. Растворитель удалили под пониженным давлением, а остаток растворили в CH₂Cl₂. Органический слой промыли насыщенным водным раствором NaHCO₃ и насыщенным солевым раствором, и высушили над безводным Na₂SO₄, и отфильтровали. Органический слой концентрировали до сухости, а полученный остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией и элюировали от 3 до 15% МеОН в дихлорметане с получением Соединения 116 (0,84 г, 61%). Структуру подтвердили анализом ЖХМС и ¹Н ЯМР.

Соединение 116 (0,74 г, 0,4 ммоль) растворили в 1:1 смеси метанола/этилацетата (5 мл/5 мл). Добавили палладий на углероде (влажный, 0,074 г). Реакционную смесь продували водородом и перемешивали при комнатной температуре под водородом в течение 12 часов. Реакционную смесь отфильтровали через слой целита. Слой целита промыли метанолом/этилацетатом (1:1). Фильтрат и промывочные растворы объединили и выпарили под пониженным давлением с получением соединения 117 (0,73 г, 98%). Структуру подтвердили анализом ЖХМС и ¹Н ЯМР.

Соединение 117 (0,63 г, 0,36 ммоль) растворили в безводном ДМФА (3 мл). К этому раствору добавили N,N-диизопропилэтиламин (70 мкл, 0,4 ммоль) и пентафторфенила трифторацетат (72 мкл, 0,42 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов и вылили в насыщенный водный раствор NaHCO₃. Смесь экстрагировали дихлорметаном, промыли насыщенным солевым раствором и высушили над безводным Na₂SO₄. Дихлорметановый раствор концентрировали до сухости и очистили силикагелевой колоночной хроматографией, и элюировали от 5 до 10% МеОН в

дихлорметане с получением соединения 118 (0,51 г, 79%). Структуру подтвердили по ЖХМС и ¹Н, а также ¹H и ¹⁹F ЯМР.

Олигомерное Соединение 119, содержащее конъгирующую группу GalNAc₃-7, получили по общим способам, представленным в Примере 46. Кластерная часть GalNAc₃ конъгирующей группы GalNAc₃-7 (GalNAc₃-7_a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-A_d-Р(=O)(ОН)-.

Структура GalNAc₃-7 (GalNAc₃-7_a-CM-) представлена ниже:

.

Пример 49. Получение олигонуклеотида 132, содержащего GalNAc₃-5

Соединение 120 (14,01 г, 40 ммоль) и HBTU (14,06 г, 37 ммоль) растворили в безводном ДМФА (80 мл). Добавили триэтиламин (11,2 мл, 80,35 ммоль) и перемешивали в течение 5 минут. Реакционную смесь охладили на ледяной бане и добавили раствор соединения 121 (10 г, ммоль) в безводном ДМФА (20 мл). Добавили дополнительное количество триэтиламина (4,5 мл, 32,28 ммоль) и перемешивали реакционную смесь в течение 18 часов под атмосферой аргона. Реакцию контролировали по ТСХ (этилацетат : гексан; 1:1; Rf=0,47). Растворитель удалили под пониженным давлением. Остаток растворили в EtOAc (300 мл) и промыли 1 М раствором NaHSO₄ (3×150 мл), насыщенным водным раствором NaHCO₃ (3×150 мл) и насыщенным солевым раствором (2×100 мл). Органический слой высушили при помощи Na₂SO₄. Высушивающий агент удалили фильтрованием, а органический слой концентрировали на ротационном испарителе. Неочищенную смесь очистили силикагелевой колоночной хроматографией и элюировали при

помощи 35-50% EtOAc в гексане с получением соедиения 122 (15,50 г, 78,13%). Структуру подтвердили анализом ЖХМС и ¹Н ЯМР. Масса m/z 589,3 [М+Н]⁺.

К охлажденному раствору соединения 122 (7,75 г, 13,16 ммоль), растворенного в метаноле (15 мл) добавили раствор LiOH (92,15 ммоль) в воде (20 мл) и ТГФ (10 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 45 минут и контролировали по ТСХ (EtOAc : гексан; 1:1). Реакционную смесь концентрировали до половины объема под пониженным давлением. Оставшийся раствор охладили на ледяной бане и нейтрализовали добавлением концентрированной HCl. Реакционную смесь разбавили, экстрагировали EtOAc (120 мл) и промыли насыщенным солевым раствором (100 мл). При стоянии в течение ночи образовалась и осветлилась эмульсия. Органический слой отделили, высушили (Na₂SO₄), отфильтровали и выпарили с получением Соединения 123 (8,42 г). Избыточную массу вероятно обусловливает остаточная соль. ЖХМС согласовался со структурой. Продукт применили без какой-либо дополнительной очистки. Мол. масса, расчетная: 574,36% мол. масса, найденная: 575,3 [М+Н]⁺.

Соединение 126 синтезировали по способу, описанному в литературе (J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 958-963).

Соединение 123 (7,419 г, 12,91 ммоль), HOBt (3,49 г, 25,82 ммоль) и соединение 126 (6,33 г, 16,14 ммоль) растворили в ДМФА (40 мл), а полученную реакционную смесь охладили на ледяной бане. К этой смеси добавили N,N-диизопропилэтиламин (4,42 мл, 25,82 ммоль), PyBop (8,7 г, 16,7 ммоль), затем связывающий агент Вор (1,17 г, 2,66 ммоль) под атмосферой аргона. Ледяную баню убрали, а раствор оставили нагреваться до комнатной температуры. Реакция завершилась через 1 час, что определили по ТСХ (ДХМ : МеОН : АА; 89:10:1). Реакционную смесь концентрировали под пониженным давлением. Остаток растворили в EtOAc (200 мл) и промыли 1 М раствором NaHSO₄ (3×100 mмл), насыщенным водным раствором NaHCO₃ (3×100 мл) и насыщенным солевым раствором (2×100 мл).

Органическую фазу отделили, высушили (Na₂SO₄), отфильтровали и концентрировали. Остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией с градиентом от 50% гексанов в EtOAc до 100% EtOAc с получением Соединения 127 (9,4 г) в виде белого пенистого вещества. ЖХМС и ¹Н ЯМР согласовались со структурой. Масса m/z 778,4 [М+H]⁺.

Трифторуксусную кислоту (12 мл) добавили к раствору соединения 127 (1,57 г, 2,02, ммоль) в дихлорметане (12 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь выпарили совместно с толуолом (30 мл) под пониженным давлением до сухости. Полученный остаток два раза совместно выпарили с ацетонитрилом (30 мл) и толуолом (40 мл) с получением Соединения 128 (1,67 г) в виде трифторацетатной соли, и применили его на следующей стадии без дополнительной очистки. ЖХМС и ¹Н ЯМР согласовались со структурой. Масса m/z 478,2 [М+Н]⁺.

Соединение 7 (0,43 г, 0,963 ммоль), HATU (0,35 г, 0,91 ммоль) и HOAt (0,035 г, 0,26 ммоль) смешали вместе и высушивали в течение 4 часов над P₂O₅ под пониженным давлением в круглодонной колбе, а затем растворили в безводном ДМФА (1 мл) и перемешивали в течение 5 минут. К этой смеси добавили раствор соединения 128 (0,20 г, 0,26 ммоль) в безводном ДМФА (0,2 мл) и добавили N,N-диизопропилэтиламин (0,2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре под атмосферой аргона. Реакция завершилась через 30 минут, что определили по ЖХМС и ТСХ (7% МеОН/ДХМ). Реакционную смесь концентрировали под пониженным давлением. Остаток растворили в ДХМ (30 мл) и промыли 1 М раствором NaHSO₄ (3×20 мл), насыщенным водным раствором NaHCO₃ (3×20 мл) и насыщенным солевым раствором (3×20 мл). Органическую фазу отделили, высушили над Na₂SO₄, отфильтровали и концентрировали. Остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией, применив 5-15% МеОН в дихлорметане, с получением Соединения 129 (96,6 мг). ЖХМС и ¹H ЯМР согласовались со структурой. Масса m/z 883,4 [М+2H]⁺.

Соединение 129 (0,09 г, 0,051 ммоль) растворили в метаноле (5 мл) в 20 мл сцинтилляционной пробирке. К нему добавили небольшое количество 10% Pd/C (0,015 мг) и продували реакционный сосуд газообразным Н₂. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре под атмосферой Н₂ в течение 18 часов. Реакционную смесь отфильтровали через слой Целита, а слой Целита промыли метанолом. Фильтрат и промывочные растворы слили вместе и концентрировали под пониженным давлением с получением Соединения 130 (0,08 г). ЖХМС и ¹Н ЯМР согласовались со структурой. Продукт применили без дополнительной очистки. Масса m/z 838,3 [М+2H]⁺.

В 10 мл мерную круглодонную колбу добавили соединение 130 (75,8 мг, 0,046 ммоль), 0,37 М раствор пиридина в ДМФА (200 мкл) и установили мешалку. К этому раствору по каплям добавили 0,7 М раствор пентафторфенила трифторацетата в ДМФА (100 мкл) при перемешивании. Реакция завершилась через 1 час, что определили по ЖХМС. Растворитель удалили под пониженным давлением, а остаток растворили в CHCl₃ (~10 мл). Органический слой обработали NaHSO₄ (1 М, 10 мл), насыщенным водным раствором NaHCO₃ (10 мл) и насыщенным солевым раствором (10 мл), каждый по три раза. Органическую фазу отделили и высушили над Na₂SO₄, отфильтровали и концентрировали с получением Соединения 131 (77,7 мг). ЖХМС согласовался со структурой. Применили без дополнительной очистки. Масса m/z 921,3 [М+2H]⁺.

Олигомерное Соединение 132, содержащее конъгирующую группу GalNAc₃-5, получили по общим способам, представленным в Примере 46. Кластерная часть GalNAc₃ конъгирующей группы GalNAc₃-5 (GalNAc₃-5_a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент представляет собой -Р(=O)(ОН)-A_d-Р(=O)(ОН)-.

Структура GalNAc₃-5 (GalNAc₃-5_a-CM-) представлена ниже:

.

Пример 50. Получение олигонуклеотида 144, содержащего GalNAc₄-11

Синтез Соединения 134. В колбу Меррифилда добавили аминометиловую смолу VIMAD (2,5 г, 450 мкмоль/г), которую промыли ацетонитрилом, диметилформамидом, дихлорметаном и ацетонитрилом. Смолу оставили набухать в ацетонитриле (4 мл). Соединение 133 предварительно активировали в 100 мл круглодонной колбе путем добавления 20 (1,0 ммоль, 0,747 г), TBTU (1,0 ммоль, 0,321 г), ацетонитрила (5 мл) и DIEA (3,0 ммоль, 0,5 мл). Этот раствор оставили перемешиваться на 5 минут, а затем добавили в колбу Меррифилда при встряхивании. Суспензию оставили встряхиваться на 3 часа. Реакционную смесь слили, а смолу промыли ацетонитрилом, ДМФА и ДХМ. Заполнение новой смолы количественно определили по измерению абсорбции DMT катиона при 500 нм (коэффициент экстинкции = 76000) в ДХМ, которое составило 238 мкмоль/г. Смолу кэпировали трехкратным суспендированием в растворе уксусного ангидрида в течение десяти минут.

Соединение 141, связанное с твердой подложкой, синтезировали многократным повторением способов твердофазного синтеза пептидов при помощи Fmoc. Взяли небольшое количество твердой подложки и суспендировали в водном растворе аммиака (28-30 масс. %) в течение 6 часов. Расщепленное соединение анализировали по ЖХ-МС и наблюдали, что масса согласуется со структурой. Масса m/z 1063,8 [М+2H]⁺.

Соединение 142, связанное с твердой подложкой, синтезировали по способам твердофазного синтеза пептидов.

Соединение 143, связанное с твердой подложкой, синтезировали при помощи стандартного твердофазного синтеза на ДНК синтезаторе.

Соединение 143, связанное с твердой подложкой, суспендировали в водном аммиаке (28-30 масс. %) и нагревали при 55°С в течение 16 часов. Раствор охладили, а твердую подложку отфильтровали. Фильтрат концентрировали, а остаток растворили в воде и очистили при помощи ВЭЖХ на сильной анионообменной колонке. Фракции, содержащие соединение 144 полной длины, слили вместе и обессолили. Полученное GalNAc₄-11-конъюгированное олигомерное соединение анализировали при помощи ЖХ-МС и наблюдали, что масса согласуется со структурой.

Кластерная часть GalNAc₄ конъгирующей группы GalNAc₄-11 (GalNAc₄-11_a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом с получением различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-A_d-P(=O)(OH)-.

Структура GalNAc₄-11 (GalNAc₄-11_a-CM) представлена ниже:

.

Пример 51. Получение олигонуклеотида 155, содержащего GalNAc₃-6

Соединение 146 синтезировали так, как описано в литературе (Analytical Biochemistry 1995, 229, 54-60).

Соединение 4 (15 г, 45,55 ммоль) и соединение 35b (14,3 грамм, 57 ммоль) растворили в CH₂Cl₂ (200 мл). Добавили активированные молекулярные сита (4, 2 г, порошкообразные) и оставили реакционную смесь перемешиваться в течение 30 минут под атмосферой азота. Добавили TMS-OTf (4,1 мл, 22,77 ммоль) и оставили реакционную смесь перемешиваться при комнатной температуре в течение ночи. После завершения реакции смесь погасили, вылив в насыщенный водный раствор NaHCO₃ (500 мл) с дробленым льдом (~ 150 г). Органический слой отделили, промыли насыщенным солевым раствором, высушили над MgSO₄, отфильтровали и концентрировали до оранжевого маслянистого вещества под пониженным давлением. Неочищенный материал очистили силикагелевой колоночной

хроматографией и элюировали 2-10% МеОН в CH₂Cl₂ с получением Соединения 112 (16,53 г, 63%). Данные ЖХМС и ¹Н ЯМР согласовались с предполагаемым соединением.

Соединение 112 (4,27 г, 7,35 ммоль) растворили в 1:1 MeOH/EtOAc (40 мл). Реакционную смесь очистили пропусканием потока аргона через раствор в течение 15 минут. Добавили катализатор Перлмана (гидроксид палладия на углероде, 400 мг) и пропускали через раствор газообразный водород в течение 30 минут. После завершения (ТСХ, 10% МеОН в CH₂Cl₂, и ЖХМС), катализатор удалили фильтрованием через слой целита. Фильтрат концентрировали на ротационном испарителе и быстро высушили под высоким вакуумом с получением Соединения 105а (3,28 г). Данные ЖХМС и 1Н ЯМР согласовались с желаемым продуктом.

Соединение 147 (2,31 г, 11 ммоль) растворили в безводном ДМФА (100 мл). Добавили N,N-диизопропилэтиламин (DIEA, 3,9 мл, 22 ммоль), затем HBTU (4 г, 10,5 ммоль). Реакционную смесь оставили перемешиваться в течение ~15 минут под азотом. К этой смеси добавили раствор соединения 105а (3,3 г, 7,4 ммоль) в сухом ДМФА и перемешивали в течение 2 часов под атмосферой азота. Реакционную смесь разбавили EtOAc и промыли насыщенным водным раствором NaHCO₃ и насыщенным солевым раствором. Органическую фазу отделили, высушили (MgSO₄), отфильтровали и концентрировали до оранжевого сиропообразного вещества. Неочищенный материал очистили колоночной хроматографией с 2-5% МеОН в CH₂Cl₂ с получением Соединения 148 (3,44 г, 73%). Данные ЖХМС и ¹Н ЯМР согласовались с предполагаемым продуктом.

Соединение 148 (3,3 г, 5,2 ммоль) растворили в 1:1 MeOH/EtOAc (75 мл). Реакционную смесь очистили пропусканием потока аргона через раствор в течение 15 минут. Добавили катализатор Перлмана (гидроксид палладия на углероде (350 мг). Через раствор продували газообразный водород в течение 30 минут. После завершения (ТСХ, 10% МеОН в ДХМ, и ЖХМС), катализатор удалили фильтрованием через слой целита. Фильтрат концентрировали на ротационном испарителе и быстро высушили под высоким вакуумом с получением Соединения 149 (2,6 г). Данные ЖХМС согласовались с желаемым продуктом. Остаток растворили в сухом ДМФА (10 мл) и сразу применили на следующей стадии.

Соединение 146 (0,68 г, 1,73 ммоль) растворили в сухом ДМФА (20 мл). К нему добавили DIEA (450 мкл, 2,6 ммоль, 1,5 экв.) и HBTU (1,96 г, 0,52 ммоль). Реакционную смесь оставили перемешиваться в течение 15 минут при комнатной температуре под азотом. Добавили раствор соединения 149 (2,6 г) в безводном ДМФА (10 мл). рН реакционной смеси довели до рН=9-10 добавлением DIEA (при необходимости). Реакционную смесь оставили перемешиваться при комнатной температуре под азотом в течение 2 часов. После завершения реакции смесь разбавили EtOAc (100 мл) и промыли насыщенным водным раствором NaHCO₃, затем насыщенным солевым раствором. Органическую фазу отделили, высушили над MgSO₄, отфильтровали и концентрировали. Остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией и элюировали 2-10% МеОН в CH₂Cl₂ с получением Соединения 150 (0,62 г, 20%). Данные ЖХМС и ¹Н ЯМР согласовались с желаемым продуктом.

Соединение 150 (0,62 г) растворили в 1:1 МеОН/EtOAc (5 л). Реакционную смесь очистили пропусканием потока аргона через раствор в течение 15 минут. Добавили

катализатор Перлмана (гидроксид палладия на углероде (60 мг). Через раствор продували газообразный водород в течение 30 минут. После завершения (ТСХ, 10% МеОН в ДХМ, и ЖХМС), катализатор удалили фильтрованием (тефлоновый фильтр с переходной канюлей шприца, 0,45 мкм). Фильтрат концентрировали на ротационном испарителе и быстро высушили под высоким вакуумом с получением Соединения 151 (0,57 г). Данные ЖХМС согласовались с желаемым продуктом. Продукт растворили в 4 мл сухого ДМФА и сразу применили на следующей стадии.

Соединение 83а (0,11 г, 0,33 ммоль) растворили в безводном ДМФА (5 мл) и добавили N,N-диизопропилэтиламин (75 мкл, 1 ммоль) и PFP-ТФК (90 мкл, 0,76 ммоль). При соприкосновении реакционная смесь стала пурпурной и постепенно изменила цвет на оранжевый в течение следующих 30 минут. Ход реакции контролировали по ТСХ и ЖХМС. После завершения (образования эфира PFP) добавили раствор соединения 151 (0,57 г, 0,33 ммоль) в ДМФА. рН реакционной смеси довели до рН=9-10 добавлением N,N-

диизопропилэтиламина (при необходимости). Реакционную смесь перемешивали под азотом в течение ~30 минут. После завершения реакции большую часть растворителя удалили под пониженным давлением. Остаток разбавили CH₂Cl₂ и промыли насыщенным водным раствором NaHCO₃, затем насыщенным солевым раствором. Органическую фазу отделили, высушили над MgSO₄, отфильтровали и концентрировали до оранжевого сиропообразного вещества. Остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией (2-10% МеОН в CH₂Cl₂) с получением Соединения 152 (0,35 г, 55%). Данные ЖХМС и ¹Н ЯМР согласовались с желаемым продуктом.

Соединение 152 (0,35 г, 0,182 ммоль) растворили в 1:1 МеОН/EtOAc (10 мл). Реакционную смесь очистили пропусканием потока аргона через раствор в течение 15 минут. Добавили катализатор Перлмана (гидроксид палладия на углероде (35 мг). Через раствор продували газообразный водород в течение 30 минут. После завершения (ТСХ, 10% МеОН в ДХМ, и ЖХМС), катализатор удалили фильтрованием (тефлоновый фильтр с переходной канюлей шприца, 0,45 мкм). Фильтрат концентрировали на ротационном испарителе и быстро высушили под высоким вакуумом с получением Соединения 153 (0,33 г, количественно). Данные ЖХМС согласовались с желаемым продуктом.

Соединение 153 (0,33 г, 0,18 ммоль) растворили в безводном ДМФА (5 мл) при перемешивании под азотом. К нему добавили N,N-диизопропилэтиламин (65 мкл, 0,3 7 ммоль) и PFP-ТФК (35 мкл, 0,28 ммоль). Реакционную смесь перемешивали под азотом в течение ~30 минут. При соприкосновении реакционная смесь стала пурпурной и постепенно изменила цвет на оранжевый. рН реакционной смеси поддерживали при рН=9-10 добавлением дополнительного количества N,N-диизопропилэтиламина. Ход реакции контролировали по ТСХ и ЖХМС. После завершения реакции большую часть растворителя удалили под пониженным давлением. Остаток разбавили CH₂Cl₂ (50 мл) и промыли насыщенным водным раствором NaHCO₃, затем насыщенным солевым раствором. Органический слой отделили, высушили над MgSO₄, отфильтровали и концентрировали до оранжевого сиропообразного вещества. Остаток очистили колоночной хроматографией и элюировали 2-10% МеОН в CH₂Cl₂ с получением Соединения 154 (0,29 г, 79%). Данные ЖХМС и ¹Н ЯМР согласовались с желаемым продуктом.

Олигомерное Соединение 155, содержащее конъгирующую группу GalNAc₃-6, получили по общим способам, представленным в Примере 46. Кластерная часть GalNAc₃ конъгирующей группы GalNAc₃-6 (GalNAc₃-6_a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-A_d-Р(=O)(ОН)-.

Структура GalNAc₃-6 (GalNAc₃-6_a-CM-) представлена ниже:

.

Пример 52. Получение олигонуклеотида 160, содержащего GalNAc₃-9

Соединение 156 синтезировали по способу, описанному в литературе (J. Med. Chem. 2004, 47, 5798-5808).

Соединение 156 (18,60 г, 29,28 ммоль) растворили в метаноле (200 мл). Добавили палладий на углероде (6,15 г, загрузка 10 масс. % (в пересчете на сухое вещество), матрица из порошкообразного углерода, влажный). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре под водородом в течение 18 часов. Реакционную смесь отфильтровали через слой целита и тщательно промыли слой целита метанолом. Объединенный фильтрат промыли и концентрировали до сухости. Остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией и элюировали 5-10% метанола в дихлорметане с получением Соединения 157(14,26 г, 89%). Масса m/z 544,1 [M-H]^-.

Соединение 157 (5 г, 9,17 ммоль) растворили в безводном ДМФА (30 мл). Добавили HBTU (3,65 г, 9,61 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (13,73 мл, 78,81 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 5 минут. К нему добавили раствор соединения 47 (2,96 г, 7,04 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 8 часов. Реакционную смесь вылили в насыщенный водный раствор NaHCO₃. Смесь экстрагировали этилацетатом, а органический слой промыли насыщенным солевым раствором и высушили (Na₂SO₄), отфильтровали и выпарили. Полученный остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией и элюировали 50% этилацетатом в гексане с получением Соединения 158 (8,25 г, 73,3%). Структуру подтвердили анализом МС и ¹Н ЯМР.

Соединение 158 (7,2 г, 7,61 ммоль) высушили над P₂O₅ под пониженным давлением. Высушенное соединение растворили в безводном ДМФА (50 мл). К нему добавили 1Н-тетразол (0,43 г, 6,09 ммоль) и N-метилимидазол (0,3 мл, 3,81 ммоль), и цианоэтил-N,N,N',N'-тетраизопропил-фосфородиамидит (3,65 мл, 11,50 ммоль). Реакционную смесь перемешивали под атмосферой аргона в течение 4 часов. Реакционную смесь разбавили этилацетатом (200 мл). Реакционную смесь промыли насыщенным раствором NaHCO₃ и насыщенным солевым раствором. Органическую фазу отделили, высушили (Na₂SO₄), отфильтровали и выпарили. Остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией и элюировали 50-90% этилацетатом в гексане с получением Соединения 159 (7,82 г, 80,5%). Структуру подтвердили анализом ЖХМС и ³¹P ЯМР.

Олигомерное соединение 160, содержащее конъгирующую группу GalNAc₃-9, получили по стандартным способам синтеза олигонуклеотидов. Три единицы соединения 159 связали с твердой подложкой, затем с фосфорамидитами нуклеотидов. В результате обработки защищенного олигомерного соединения водным аммиаком получили соединение 160. Кластерная часть GalNAc₃ конъгирующей группы GalNAc₃-9 (GalNAc₃-9_a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент представляет собой -Р(=O)(ОН)-A_d-Р(=O)(ОН)-. Структура GalNAc₃-9 (GalNAc₃-9_а-СМ) представлена ниже:

.

Пример 53. Альтернативный способ получения Соединения 18 (GalNAc₃-1a и GalNAc₃-3а)

Выполнили реакцию лактона 161 с диаминопропаном (3-5 экв.) или моно-Вос-защищинным диаминопропаном (1 экв.) с получением спирта 162а или 162b. При применении для описанной выше реакции незащищенного пропандиамина, избыток диамина удалили выпариванием под высоким вакуумом, а свободную аминогруппу в 162а защитили при помощи CbzCl с получением 162b в виде белого твердого вещества после очистки колоночной хроматографией. Спирт 162b затем взаимодействовал с соединением 4 в присутствии TMSOTf с получением 163а, которое преобразовали в 163b путем снятия Cbz группы при помощи каталитического гидрирования. Пентафторфениловый (PFP) эфир 164 получили взаимодействием трехкислотного соединения 113 (см. Пример 48) с PFP-ТФК (3,5

экв.) и пиридином (3,5 экв.) в ДМФА (от 0,1 до 0,5 М). Триэфир 164 непосредственно взаимодействовал с амином 163b (3-4 экв.) и DIPEA (3-4 экв.) с получением Соединения 18. Представленный выше способ значительно облегчает очистку промежуточных соединений и минимизирует образование побочных продуктов, которые образуются при применении способа, описанного в Примере 4.

Пример 54. Альтернативный способ получения Соединения 18 (GalNAc₃-1a и GalNAc₃-3а)

Три-PFP эфир 164 получили из кислоты 113 по способу, представленному выше в Примере 53, выполнили реакцию этого эфира с моно-Вос-защищенным диамином с

получением 165 практически с количественным выходом. Boc группы сняли хлористоводородной кислотой или трифторуксусной кислотой с получением триамина, который взаимодействовал с активированной кислотой PFP 166 в присутствии подходящего основания, такого как DIPEA, с получением Соединения 18.

PFP-защищенную кислоту Gal-NAc 166 получили из соответствующей кислоты обработкой PFP-ТФК (1-1,2 экв.) и пиридином (1-1,2 экв.) в ДМФА. Кислоту-предшественник, в свою очередь, получили из соответствующего спирта окислением с применением TEMPO (0,2 экв.) и BAIB в ацетонитриле и воде. Спирт-предшественник получили из сахарного промежуточного соединения 4 взаимодействием с 1,6-гександиолом (или 1,5-гександиолом или другим диолом для других значений n) (2-4 экв.) и TMSOTf, применив условия, описанные ранее в Примере 47.

Пример 55. Дозозависимое исследование олигонуклеотидов, содержащих либо 3', либо 5'-конъгирующую группу (сравнение GalNAc₃-1, 3, 8 и 9), нацеленных на SRB-1, in vivo

Олигонуклеотиды, перечисленные ниже, испытали в дозозависимом исследовании антисмыслового ингибирования SRB-1 у мышей. Неконъюгированный ISIS 353382 включили в качестве стандарта. Каждая из различных конъюгирующих групп GalNAc₃ была присоединена либо к 3', либо к 5'-концу соответствующего олигонуклеотида при помощи фосфодиэфир-связанного 2'-дезоксиаденозинового нуклеозида (расщепляемый фрагмент).

Заглавные буквы указывают азотистое основание для каждого нуклеозида, а ^mC означает 5-метилцитозин. Нижние индексы: «е» означает 2'-МОЕ модифицированный нуклеозид; «d» означает β-D-2'-дезоксирибонуклеозид; «s» означает тиофосфатную межнуклеозидную связь (PS); «о» означает фосфодиэфирную межнуклеозидную связь (РО); и «о'» означает -O-Р(=O)(ОН)-. Конъгирующей группы выделены жирным шрифтом.

Структура GalNAc₃-1_a показана ранее в Примере 9. Структура GalNAc₃-9 показана ранее в Примере 52. Структура GalNAc₃-3 показана ранее в Примере 39. Структура GalNAc₃-8 показана ранее в Примере 47.

Лечение

Шестинедельным самцам мышей Balb/c (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) ввели однократную подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 353382, 655861, 664078, 661161, 665001 или солевого раствора. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей усыпили через 72 часов после последнего введения для определения уровней мРНК SRB-1 в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному солевым раствором.

Как показано в Таблице 27, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК SRB-1 дозозависимым образом. Действительно, антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие фосфодиэфир-связанные конъюгаты GalNAc₃-1 и GalNAc₃-9 на 3'-конце (ISIS 655861 и ISIS 664078), а также конъюгаты GalNAc₃-3 и GalNAc₃-8, связанные на 5'-конце (ISIS 661161 и ISIS 665001) демонстрируют существенное улучшение эффективности, по сравнению с неконъюгированным антисмысловым олигонуклеотидом (ISIS 353382). Кроме того, ISIS 664078, содержащий конъюгат GalNAc₃-9 на 3'-конце, был по существу настолько же эффективным, как ISIS 655861, который содержит конъюгат GalNAc₃-1 на 3'-конце. 5'-конъюгированные антисмысловые олигонуклеотиды, ISIS 661161 и ISIS

665001, содержащие GalNAc₃-3 или GalNAc₃-9, соответственно, обладают повышенной эффективностью, по сравнению с 3'-конъюгированными антисмысловыми соединениями (ISIS 655861 и ISIS 664078).

Уровни трансаминазы в печени, аланин-аминотрансферазы (ALT) и аспартат-аминотрансферазы (AST) в сыворотке измеряли относительно мышей, инъецированных солевым раствором, применяя стандартные протоколы. Оценили также общий билирубин и азот мочевины крови (АМК). Проверили изменение массы тела, которое существенно не отличалось от группы с солевым раствором. Значения ALT, AST, общего билирубина и АМК представлены ниже в таблице.

Пример 56. Дозозависимое исследование олигонуклеотидов, содержащих либо 3', либо 5'-конъгирующую группу (сравнение GalNAc₃-1, 2, 3, 5, 6, 7 и 10), нацеленных на SRB-1, in vivo

Олигонуклеотиды, перечисленные ниже, испытали в дозозависимом исследовании антисмыслового ингибирования SRB-1 у мышей. Неконъюгированный ISIS 353382 включили в качестве стандарта. Каждая из различных конъюгирующих групп GalNAc₃ была присоединена к 5'-концу соответствующего олигонуклеотида фосфодиэфир-связанным 2'-дезоксиаденозиновым нуклеозидом (расщепляемый фрагмент), за исключением ISIS 655861, в котором конъгирующая группа GalNAc₃ присоединена к 3'-концу.

Заглавные буквы указывают азотистое основание для каждого нуклеозида, а ^mC означает 5-метилцитозин. Нижние индексы: «е» означает 2'-МОЕ модифицированный нуклеозид; «d» означает β-D-2'-дезоксирибонуклеозид; «s» означает тиофосфатную межнуклеозидную связь (PS); «о» означает фосфодиэфирную межнуклеозидную связь (РО); и «о'» означает -O-Р(=O)(ОН)-. Конъгирующей группы выделены жирным шрифтом.

Структура GalNAc₃-1_a показана ранее в Примере 9. Структура GalNAc₃-2_a показана ранее в Примере 37. Структура GalNAc₃-3_а показана ранее в Примере 39. Структура GalNAc₃-5_а показана ранее в Примере 49. Структура GalNAc₃-6_a показана ранее в Примере 51. Структура GalNAc₃-7_a показана ранее в Примере 48. Структура GalNAc₃-10_a показана ранее в Примере 46.

Лечение

Шестинедельным самцам мышей Balb/c (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) ввели однократную подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 353382, 655861, 664507, 661161, 666224, 666961, 666981, 666881 или солевого раствора. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей усыпили через 72 часов после последнего введения для определения уровней мРНК SRB-1 в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному солевым раствором.

Как показано в Таблице 30, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК SRB-1 дозозависимым образом. Действительно, конъюгированные антисмысловые олигонуклеотиды демонстрируют значительное усиление эффективности, по сравнению с неконъюгированным антисмысловым олигонуклеотидом (ISIS 353382). 5'-конъюгированные антисмысловые олигонуклеотиды демонстрируют небольшое усиление эффективности, по сравнению с 3'-конъюгированным антисмысловым олигонуклеотидом.

Уровни трансаминазы в печени, аланин-аминотрансферазы (ALT) и аспартат-аминотрансферазы (AST) в сыворотке измеряли относительно мышей, инъецированных солевым раствором, применяя стандартные протоколы. Оценили также общий билирубин и азот мочевины крови (АМК). Проверили изменение массы тела, которое существенно не отличалось от группы с солевым раствором. Значения ALT, AST, общего билирубина и АМК представлены ниже в Таблице 31.

Пример 57. Исследование продолжительности действия олигонуклеотидов, содержащих 3'-конъгирующую группу, нацеленных на АроС III, in vivo

Мышам однократно ввели инъекцию дозы, указанной ниже, и в течение 42 дней наблюдали уровни АроС-III и триглицеридов в плазме (TG в плазме). Исследование выполнили, используя в каждой группе 3 трансгенных мышей, которые экспрессируют человеческий APOC-III.

Заглавные буквы указывают азотистое основание для каждого нуклеозида, а ^mC означает 5-метилцитозин. Нижние индексы: «е» означает 2'-МОЕ модифицированный нуклеозид; «d» означает β-D-2'-дезоксирибонуклеозид; «s» означает тиофосфатную межнуклеозидную связь (PS); «о» означает фосфодиэфирную межнуклеозидную связь (РО); и «о'» означает -O-Р(=O)(ОН)-. Конъгирующей группы выделены жирным шрифтом.

Структура GalNAc₃-1_a показана ранее в Примере 9.

Как можно видеть в представленной выше таблице, продолжительность действия увеличивается при добавлении 3'-конъгирующей группы, по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом. Дополнительное увеличение продолжительности

действия наблюдали для смешанного конъюгированного PO/PS олигонуклеотида 647536, по сравнению с конъюгированным олигонуклеотидом 647535, содержащим только PS.

Пример 58. Дозозависимое исследование олигонуклеотидов, содержащих 3'-конъгирующую группу (сравнение GalNAc₃-1 и GalNAc₄-11), нацеленных на SRB-1, in vivo

Олигонуклеотиды, перечисленные ниже, испытали в дозозависимом исследовании антисмыслового ингибирования SRB-1 у мышей. Неконъюгированный ISIS 440762 включили в качестве неконъюгированного стандарта. Каждая из конъюгирующих групп была присоединена к 3'-концу соответствующего олигонуклеотида при помощи расщепляемого фрагмента фосфодиэфир-связанного 2'-дезоксиаденозинового нуклеозида.

Структура GalNAc₃-1_a показана ранее в Примере 9. Структура GalNAc₃-11_a показана ранее в Примере 50.

Лечение

Шестинедельным самцам мышей Balb/c (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) ввели однократную подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 440762, 651900, 663748 или солевого раствора. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей усыпили через 72 часов после последнего введения для определения уровней мРНК SRB-1 в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному солевым раствором.

Как показано в Таблице 34, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК SRB-1 дозозависимым образом. Антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие фосфодиэфир-связанные конъюгаты GalNAc₃-1 и GalNAc₄-11 на 3'-конце (ISIS 651900 и ISIS 663748), демонстрируют значительное усиление эффективности, по сравнению с неконъюгированным антисмысловым олигонуклеотидом (ISIS 440762). Эти два конъюгированных олигонуклеотида, GalNAc₃-1 и GalNAc₄-11, были одинаково эффективными.

Заглавные буквы указывают азотистое основание для каждого нуклеозида, а ^mC означает 5-метилцитозин. Нижние индексы: «е» означает 2'-МОЕ модифицированный нуклеозид; «k» означает 6'-(S)-СН₃ бициклический нуклеозид; «d» означает β-D-2'-дезоксирибонуклеозид; «s» означает тиофосфатные межнуклеозидные связи (PS); «о» означает фосфодиэфирные межнуклеозидные связи (РО); и «о'» означает -O-Р(=O)(ОН)-. Конъгирующей группы выделены жирным шрифтом.

Уровни трансаминазы в печени, аланин-аминотрансферазы (ALT) и аспартат-аминотрансферазы (AST) в сыворотке измеряли относительно мышей, инъецированных солевым раствором, применяя стандартные протоколы. Оценили также общий билирубин и азот мочевины крови (АМК). Проверили изменение массы тела, которое существенно не отличалось от группы с солевым раствором. Значения ALT, AST, общего билирубина и АМК представлены ниже в Таблице 35.

Пример 59. Действие GalNAc₃-1-конъюгированных ASO, нацеленных на FXI, in vivo

Олигонуклеотиды, перечисленные ниже, испытали в исследовании действия многократных нарастающих доз на антисмысловое ингибирование FXI у мышей. ISIS 404071 включили в качестве неконъюгированного стандарта. Каждая из конъюгирующих групп была присоединена к 3'-концу соответствующего олигонуклеотида при помощи расщепляемого фрагмента фосфодиэфир-связанного 2'-дезоксиаденозинового нуклеозида.

Заглавные буквы указывают азотистое основание для каждого нуклеозида, а ^mC означает 5-метилцитозин. Нижние индексы: «е» означает 2'-МОЕ модифицированный нуклеозид; «d» означает β-D-2'-дезоксирибонуклеозид; «s» означает тиофосфатную

межнуклеозидную связь (PS); «о» означает фосфодиэфирную межнуклеозидную связь (РО); и «о'» означает -O-Р(=O)(ОН)-. Конъгирующей группы выделены жирным шрифтом.

Структура GalNAc₃-1_a показана ранее в Примере 9.

Лечение

Шестинедельным самцам мышей Balb/c (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) дважды в неделю в течение 3 недель вводили подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 404071, 656172, 656173 или PBS в качестве контрольного образца. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей усыпили через 72 часов после последнего введения для определения уровней мРНК FXI в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Измерили также уровни белка FXI в плазме при помощи твердофазного иммуноферментного анализа. Уровни мРНК FXI определяли относительно общей РНК (при помощи RIBOGREEN®), затем нормализовали к контрольному образцу, обработанному PBS. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК FXI для каждой экспериментальной группы. Данные нормализовали к контрольному образцу, обработанному PBS, и означили как «% PBS». ED₅₀s измеряли по таким же способам, как описаны ранее, и они представлены ниже.

Как показано в Таблице 37, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК FXI дозозависимым образом. Олигонуклеотиды, содержащие конъгирующую группу 3'-GalNAc₃-1, демонстрируют значительное усиление эффективности, по сравнению с неконъюгированным антисмысловым олигонуклеотидом (ISIS 404071). Между эти двумя конъюгированными олигонуклеотидами дополнительное усиление эффективности было обеспечено путем замены некоторых PS связей на РО (ISIS 656173).

Как показано в Таблице 37а, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни белка FXI дозозависимым образом. Олигонуклеотиды, содержащие конъгирующую группу 3'-GalNAc₃-1, демонстрируют значительное усиление эффективности, по сравнению с неконъюгированным антисмысловым олигонуклеотидом (ISIS 404071). Между эти двумя конъюгированными олигонуклеотидами дополнительное усиление эффективности было обеспечено путем замены некоторых PS связей на РО (ISIS 656173).

Уровни трансаминазы в печени, аланин-аминотрансферазы (ALT) и аспартат-аминотрансферазы (AST) в сыворотке измеряли относительно мышей, инъецированных солевым раствором, применяя стандартные протоколы. Оценили также общий билирубин, общий альбумин, CRE и азот мочевины крови (АМК). Проверили изменение массы тела, которое существенно не отличалось от группы с солевым раствором. Значения ALT, AST, общего билирубина и АМК представлены ниже в таблице.

Пример 60. Действие конъюгированных ASO, нацеленных на SRB-1, in vitro

Олигонуклеотиды, перечисленные ниже, испытали в исследовании действия многократных нарастающих доз на антисмысловое ингибирование SRB-1 в первичных гепатоцитах мышей. ISIS 353382 включили в качестве неконъюгированного стандарта. Каждая из конъюгирующих групп была присоединена к 3' или 5'-концу соответствующего олигонуклеотида при помощи расщепляемого фрагмента фосфодиэфир-связанного 2'-дезоксиаденозинового нуклеозида.

Заглавные буквы указывают азотистое основание для каждого нуклеозида, а ^mC означает 5-метилцитозин. Нижние индексы: «е» означает 2'-МОЕ модифицированный нуклеозид; «d» означает β-D-2'-дезоксирибонуклеозид; «s» означает тиофосфатную межнуклеозидную связь (PS); «о» означает фосфодиэфирную межнуклеозидную связь (РО); и «о'» означает -O-Р(=O)(ОН)-. Конъгирующей группы выделены жирным шрифтом.

Структура GalNAc₃-1_a показана ранее в Примере 9. Структура GalNAc₃-3_a показана ранее в Примере 39. Структура GalNAc₃-8a показана ранее в Примере 47. Структура GalNAc₃-9a показана ранее в Примере 52. Структура GalNAc₃-6а показана ранее в Примере 51. Структура GalNAc₃-2a показана ранее в Примере 37. Структура GalNAc₃-10a показана ранее в Примере 46. Структура GalNAc₃-5a показана ранее в Примере 49. Структура GalNAc₃-7a показана ранее в Примере 48.

Лечение

Олигонуклеотиды, перечисленные выше, испытывали in vitro в первичных гепатоцитарных клетках мышей, помещенных на планшеты при плотности 25000 клеток на лунку и обработанных 0,03, 0,08, 0,24, 0,74, 2,22, 6,67 или 20 нМ модифицированного олигонуклеотида. После обработки в течение приблизительно 16 часов, из клеток выделили РНК и измерили уровни мРНК при помощи количественной ПЦР в реальном времени, а уровни мРНК SRB-1 III скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным при помощи RIBOGREEN®.

IC₅₀ рассчитали по стандартным способам, а результаты представлены в Таблице 40. Результаты показывают, что при условиях свободного поглощения, в которых не применяли никакие реагенты или электроимпульсные приемы для искусственного ускорения входа олигонуклеотидов в клетки, олигонуклеотиды, содержащие конъюгат GalNAc, были существенно более эффективными в гепатоцитах, чем исходный олигонуклеотид (ISIS 353382), который не содержит конъюгат GalNAc.

Пример 61. Получение олигомерного соединения 175, содержащего GalNAc₃-12

Соединение 169 имеется в продаже. Соединение 172 получили добавлением бензил(перфторфенил)глутарата к соединению 171. Бензил(перфторфенил)глутарат получили добавлением PFP-ТФК и DIEA к 5-(бензилокси)-5-оксопентановой кислоте в ДМФА. Олигомерное Соединение 175, содержащее конъгирующую группу GalNAc₃-12, получили из соединения 174 по общим способам, представленным в Примере 46. Кластерная часть GalNAc₃ конъгирующей группы GalNAc₃-12 (GalNAc₃-12_а) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент представляет собой -Р(=O)(ОН)-A_d-P(=O)(OH)-. Структура GalNAc₃-12 (GalNAc₃-12_a-CM-) представлена ниже:

Пример 62. Получение олигомерного соединения 180, содержащего GalNAc₃-13

Соединение 176 получили по общему способу, представленному в Примере 2. Олигомерное соединение 180, содержащее конъгирующую группу GalNAc₃-13, получили из соединения 177 по общим способам, представленным в Примере 49. Кластерная часть GalNAc₃ конъгирующей группы GalNAc₃-13 (GalNAc₃-13_a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-A_d-Р(=O)(ОН)-. Структура GalNAc₃-13 (GalNAc₃-13_а-СМ-) представлена ниже:

Пример 63. Получение олигомерного соединения 188, содержащего GalNAc₃-14

Соединения 181 и 185 имеются в продаже. Олигомерное Соединение 188, содержащее конъгирующую группу GalNAc₃-14, получили из соединения 187 по общим способам, представленным в Примере 46. Кластерная часть GalNAc₃ конъгирующей группы GalNAc₃-14 (GalNAc₃-14_a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент представляет собой -Р(=O)(ОН)-A_d-Р(=O)(ОН)-. Структура GalNAc₃-14 (GalNAc₃-14_a-CM-) представлена ниже:

Пример 64. Получение олигомерного соединения 197, содержащего GalNAc₃-15

1. Соединение, содержащее одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид и конъюгирующую группу или его фармацевтически приемлемая соль, при этом конъюгирующая группа содержит

где расщепляемый фрагмент (СМ) представляет собой связь или группу, которая может быть расщеплена при физиологических условиях;

и при этом модифицированный олигонуклеотид имеет формулу: Ges Ges Tes Tds mCds mCds mCds Gds Ads Gds Gds Tds Gds mCes mCes mCes Ae (SEQ ID NO: 81), где

A - аденин,

mC - 5'-метилцитозин

G - гуанин,

T - тимин,

e - 2'-O-метоксиэтиловый модифицированный нуклеозид,

d - 2'-дезоксинуклеозид, и

s - тиофосфатная межнуклеозидная связь;

и при этом конъюгирующая группа связана с модифицированным олигонуклеотидом на 5'-конце модифицированного олигонуклеотида.

2. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что

(a) конъюгирующая группа содержит

и/или

(b) соединение содержит

где Q₁₃ представляет собой Н или O(СН₂)₂-ОСН₃;

А представляет собой модифицированный олигонуклеотид и

Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания.

3. Композиция для лечения метаболического заболевания, содержащая соединение по п. 1 или 2 или его фармацевтически приемлемую соль, например соль натрия или соль калия, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или растворитель, где метаболическое заболевание представляет собой метаболический синдром, сахарный диабет, инсулинорезистентность, диабетическую дислипидемию, гипертриглицеридемию, ожирение или рост массы тела.

4. Применение соединения по п. 1 или 2 или композиции по п. 3 для лечения метаболического заболевания, где метаболическое заболевание представляет собой метаболический синдром, сахарный диабет, инсулинорезистентность, диабетическую дислипидемию, гипертриглицеридемию, ожирение или рост массы тела.

5. Применение по п. 4, включающее совместное введение указанного соединения или композиции и второго агента.