Способ выделения ферментного препарата липазы

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

27l412

Сома Соеетскик

Социалистическкк

Республик

Зависимое от авт. свидетельства ¹

Кл. 6а, 22/04

Заявлено 25.М1.1968 (№ 1260469/28-13) с присоединением заявки ¹

Приоритет

Опубликовано 26Х.1970. Бюллетень ¹ 18

Дата опубликования описания 27Л III.1970

ЦПК С 07д 7/026

УД1 577.15.85(088.8) Комитет по делам иаооретений и открытий ори Сосете Мииистрое

СССР

Авторы изобретения

Л. Б. Полонская, Н. Д. Попова и В. Н. Цыганкова

Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский институт мясной промышленности

СПОСОБ ВЪ1ДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ЛИПАЗЬ!

Изобретение относится к ферментной промышленности и представляет собой способ выделения ферментных препаратов, например липазы, из сырья животного происхождения.

Препарат может быть использован как реактив для исследовательских работ.

Уже известен способ получения препарата липазы из сухой, обезжиренной и измельченной поджелудочной железы свиней.

Липазу получают экстрагированием измельченной обезжиренной и высушенной ацетоном железы с последующим удалением балластных белков и осаждением липазы путем многократного высаливания сульфатом аммония и дальнейшей сушкой липазы.

Большие объемы реакционных смесей, получающихся в результате применения насыщенного раствора сульфата аммония в качестве осаждающего реагента, а также наличие большого количества слизистых и балластных веществ затрудняет фильтрацию раствора. Это значительно усложняет процесс производства липазы и увеличивает его трудоемкость.

Для повышения выхода ферментного препарата предлагается на первой ступени высаливания резко изменять рН среды вначале от

6,0 до 9,0 и вновь от 9,0 до 6,0. Осаждающий реа гент — сульфат аммония используют в кристаллическом виде. Очистку липазы осуществляют дпализом против 0,02 и. ацетатпого буфера прп рН, равном 5,0.

Предлагаемый способ осуществляют по следующей технолопш.

Сухую измельченную и обезжиренную поджелудочную железу свиней экстрагпруют водой в соотношении 1: 10, затем при перемешиванпи отделяют жмых. После этого высаливают балластные белки и осаждают липазу

10 путем многократного высаливания сульфатом аммония.

Прп первой ступени высаливанпе балластных белков из экстракта кристаллическим сульфатом аммония осуществляют до степени

15 насыщения 0,2, прп этом резко изменяют рН среды от 60 до 90 и от90до 6.0.

После фильтрации лппазу высалпвают из фпльтрата кристаллическим сульфатом аммония до степени насыщения 0,5, затем опять

20 фильтруют и растворяют осадок лппазы в

v0äå в соотношении 1: 4 к весу осадка.

Высаливание балластных белков кристаллическим сульфатом аммония до степени насыщения 0,2 осуществляют на следующей сту25 пени ч фильтруют

Затем лппазу высаливают пз фильтрата кристаллическим сульфатом аммония до степени насыщения 0,45, фильтруют и растворяют осадок лппазы в воде в об.ьеме 1: 4 с

30 добавлением 1 Л1 раствора сульфата аммония

27147,2

Предмет изобретения

Составитель 11. Селиверстова

Редактор С. Лазарева Техред Л. В. Куклина Корректор И. С. Хлыстова

Заказ 2317/!4 Тираж 480 Подписное

ЦНИИПИ Когнитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, )K,-35, Раугнская наб., д. 415

Типография, пр. Сапунова, 2 в соотношении 1: 0,4 соответственно к весу осадка.

После этого лппазу осаждают ацетоном прп — 12 С до концентрации 46 /о, отстаивают при температуре — 12 С, фильтруют и растворяют осадок липазы в воде в соотношении 1: 10 к весу осадка при рН 7,6.

Затем осуществляют дпализ раствора лппазы против 0,02 и. ацетатного буфера прп рН 5,0 в течение 48 час и лиофильную сушку липазы.

П р и и е р. 50 г сухой, измельченной и обезжиренной поджелудочной железы свиней экстрагируют в 500 нл воды в течение 2 час при перемешивании и отделяют жмых. Затем измеряют объем полученного экстракта и высаливают балластные белки до степени насыщения 0,2 кристаллическим сульфатом аммония. Для коагуляции балластных белков производят быструю смену рН раствора, увеличивая его от 6,0 до 9,0 добавлением аммиака и затем резко снижая от 9,0 до 6,0 подкислением 50о/о-ным раствором серной кислоты. Балластные белки отделяют фильтрацией. Из фильтрата липазу осаждают кристаллическим сульфатом аммония до степени насыщения 0,5 и отделяют фильтрацией под вакуумом. Полученный осадок липазы растворяют в 4 об. воды с последующим высаливанием балластных белков кристаллическим сульфатом аммония до 0,2 насыщения. Балластные вещества удаляют фильтрацией. Из полученного фильтрата вновь осаждают липазу кристаллическим сульфатом аммония до

0,45 насыщения и отфильтровывают под вакуумом. Осадок липазы растворяют в 4 об. воды с добавлением 0,4 об. (к весу осадка) 4

1 М раствора сульфата аммония. Осаждение липазы пз раствора производят ацетоном прп температуре — 12 С и 46 о -ном насыщегпш.

После 30-минутного перемешивания при той же температуре осадок липазы отфильтровывают и растворяют в 10 об. воды, подщелоченной раствором аммиака до рН 7 6. Раствор деалпзуют против 0,02 и. ацетатного буфера при рН 5,0 в течение двух суток и лпо10 фильпо высушивают.

Выход лиофильно высушенного препарата липазы 0,15 г.

Активность препарата 55000, 83000 (по трибутприну).

1. Способ выделения ферментного препарата липазы из животного сырья, например

20 поджелудочной железы свиньи, путем экстрагирования измельченной обезжиренной и высушенной ацетоном железы с последующим удалением балластных белков и осаждением липазы путем многократного выса lивания

25 сульфатом аммония, и дальнейшей очисткой липазы, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода ферментного препарата, на первой ступени высаливания резко изменяют рН среды вначале от 6,0 до 9,0 и вновь от

30 9,0 до 6,0.

2. Способ по п. 1, отлича ощийся тем, что сульфат аммония используется в кристаллическом виде

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что

35 очистку липазы осуществляют диализом против 0,02 н ацетатного буфера при рН, равном 5,0.