Пептидная вакцина, включающая пептид ras, содержащий мутации, и химиотерапевтический агент

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для применения пептида, соответствующего фрагменту белка RAS, для лечения рака. Пептид подходит для инициирования иммунного ответа и соответствует фрагменту белка RAS, но включает одну аминокислотную замену, пептид включает область из по крайней мере 8 аминокислот, которая содержит положение 12 или 13 белка RAS, и аминокислотная замена пептида находится в указанном положении 12 или 13, соответственно, и выбрана из замен G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, G12A, G12C, G12D, G12R, G12S или G12V. Пептид вводят одновременно или последовательно с антиметаболическим химиотерапевтическим агентом. Группа изобретений относится также к применению ex vivo Т-клетки, специфичной в отношении указанного пептида, и включает способы лечения рака. Использование данной группы изобретений позволяет индуцировать стойкий иммунный ответ при лечении рака путем введения комбинации указанного пептида и антиметаболического химиотерапевтического агента. 5 н. и 16 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 1 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к как минимум одному пептиду белка RAS для применения в лечении рака. Кроме того, изобретение относится к фармацевтическому препарату этого как минимум одного пептида для указанного применения.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Генетической предпосылкой начала рака являются изменения в прото-онкогенах, онкогенах и генах супрессорах опухолей. Прото-онкогены являются нормальными генами клеток, которые имеют потенциал превращения в онкогены. Все онкогены кодируют белки и действуют через белки. В большинстве случаев эти белки, как было показано, являются компонентами путей передачи сигнала. В природе онкогены возникают из прото-онкогенов в результате точечных мутаций или транслокаций что приводит к трансформации состояния клетки, несущей такую мутацию. Рак развивается в результате многостадийного процесса, включающего несколько событий мутации в онкогенах и онкосупрессорных клетках.

В простейшей форме, замена одного основания в протоонкогене может приводить к тому, что закодированный белок будет отличаться одной аминокислотой.

В экспериментальных моделях, в т.ч. мышиных опухолях, было показано, что точечные мутации во внутриклеточных «собственных» белках, могут давать начало антигенам отторжения опухоли, состоящих из пептидов, которые отличаются от нормальных пептидов одной аминокислотой. T-клетки, распознающие эти пептиды, в контексте молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) на поверхности опухолевых клеток, способны уничтожать опухолевые клетки и таким образом вызывать отторжение опухоли из организма хозяина (Boon, T et al., Cell 1989, Vol.58, p.293-303).

В течение трех последних десятилетий особое внимание уделялось анализу антител к антигенам человеческих опухолей. Предполагалось, что такие антитела могли бы применяться, как для диагностических, так и для терапевтических целей, например, в связи с противораковыми агентами. Одна из проблем заключается в том, что антитела могут связываться только с опухолевыми антигенами, которые экспонированы на поверхности опухолевых клеток. Поэтому усилия, направленные на разработку способов лечения рака, опирающихся на иммунную систему организма, оказались менее успешными, чем ожидалось.

Антитела обычно распознают свободные антигены в нативной конформации и потенциально способны распознавать практически любой сайт, экспонированный на поверхности антигена. В противоположность антителам, которые продуцируются B-клетками, T-клетки у людей распознают антигены, только при участии молекул MHC, именуемых HLA (лейкоцитарными антигенами человека), и только после соответствующего процессирования антигенов, которое обычно заключается в протеолитической фрагментации белка, которая приводит к образованию пептидов, соответствующих полостям в молекулах MHC. Это позволяет T-клеткам распознавать пептиды, образовавшиеся из внутриклеточных белков. Поэтому T-клетки могут распознавать аномальные пептиды, образовавшиеся в опухолевых клетках в любом месте, если они появляются на поверхности опухолевых клеток, с помощью молекул MHC. Следовательно, T-клетки могут быть активированы для удаления опухолевых клеток, в которых имеются аномальные пептиды.

T-клетки могут препятствовать развитию и росту раковой опухоли посредством целого ряда механизмов. Цитотоксичные T-клетки, как HLA класса I, ограниченные CD8+, так и HLA класса II, ограниченные CD4+, могут непосредственно уничтожать опухолевые клетки, несущие соответствующие опухолевые антигены. CD4+ хелперные T-клетки необходимы для инициирования и поддержания ответов цитотоксичных T-клеток и ответов антител, а также для инициирования уничтожения макрофагов и лимфокин-активированных клеток-киллеров (клеток LAK).

Были выявлены многие онкогены и их белковые продукты. Кроме того, было показано, что ассортимент T-клеток здорового человека включает T-клетки, обладающие специфичностью против синтетического пептидного фрагмента, образовавшегося из одного онкогенного продукта p21 RAS, если они презентируются на соответствующих молекулах HLA. Кроме того, предполагается, что примерно 20% всех раковых заболеваний связаны с мутацией онкогена RAS.

В заявке WO 92/14756 раскрыты синтетические пептиды и фрагменты онкогенных белковых продуктов, которые вызывают T-клеточный иммунитет, для применения в вакцинах против раковых опухолей, связанных с RAS, и композиции для лечения рака. Эти пептиды соответствую активному фрагменту онкогена, представленному раковой клеткой, и включают мутацию в одном или нескольких положениях, соответствующих мутации онкогена. В этом документе раскрыты мутации в положениях 12, 13 и 61 белка RAS и конкретно раскрыты мутации G12A, G12V, G12C, G12S, G12K, G12D, G12R, Q61R, Q61K, Q61L, Q61H, G13V и G13D. Хотя в этом документе упомянуто, что вакцины могут включать набор пептидов, имеющих наиболее распространенные мутации, обнаруженные в онкогенных белках, в заявке не предлагаются какие-либо конкретные комбинации пептидов.

В заявке WO 00/66153 обсуждаются смеси синтетических пептидов, которые инициируют T-клеточный иммунитет для применения в вакцинах против рака. Пептидные смеси состоят из RAS p21 пептидов, включающих мутации, и в документе конкретно раскрыты мутации G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, Q61H, Q61K, Q61L, Q61R и G13D. В документе указано также, что иммунный ответ, вызванный смесью пептидов, значительно превышал эффект, вызванный индивидуальным пептидом. Однако в данной заявке не предлагается применение пептидной вакцины в комбинированном лечении рака вместе с другими формами терапии.

Gjertsen et al. (Int.J.Cancer 2001, 92, p.441-450) описали клиническое исследование фазы I/II, в которое были включены пациенты с аденокарциномой поджелудочной железы, которых вакцинировали синтетическими пептидами RAS, включающими мутации, в комбинации с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором. В этом исследовании применялась вакцина, включающая единственный пептид или смесь четырех пептидов с мутациями. Комбинированная вакцина состояла из четырех наиболее распространенных K-RAS мутаций, обнаруженных в аденокарциноме поджелудочной железы, а именно пептидов с мутациями G12V, G12D, G12C или G12R. В этом документе не предполагается, что комбинированная терапия с антиметаболическим химиотерапевтическим агентом может оказаться эффективной.

Weden et al. (Int.J.Cancer 2010, 128(5), p.1120-1128) сообщают о продолжительном наблюдении за пациентами с аденокарциномой поджелудочной железы, которых вакцинировали синтетическими пептидами RAS, содержащими мутации. Вакцина состояла либо из индивидуального пептида RAS, либо из смеси семи пептидов RAS. Конкретно, семь пептидов RAS, использованных в этом исследовании, включали мутации G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V или G13D. Отсутствует упоминание о комбинированной терапии с применением антиметаболических химиотерапевтических агентов.

Prior et al. (Cancer Res. 2012, 72(10), p.2457-2467) установили, что различные типы рака сопряжены с мутацией конкретной изоформы RAS, и что каждая изоформа имеет собственный набор мутаций кодонов. Кроме того, Prior et al. установили, что в положениях 12, 13 и 61 белка RAS возникает в общей сложности 18 мутаций, причем в каждом положении проявляется по шесть мутаций. В данном обзоре также обсуждается влияние этих мутаций на функции RAS и потенциальные механизмы, ведущие к различным моделям мутаций изоформ RAS.

Системное введение химиотерапевтического агента гемцитабина ранее считалось отдельным способом лечения раковых больных. В настоящее время введение гемцитабина является часто применяемым способом лечения пациентов с различными видами рака, например, немелкоклеточным раком легких, раком поджелудочной железы, раком мочевого пузыря и раком груди. В частности, гемцитабин часто применяется для лечения рака поджелудочной железы на поздних стадиях.

Гемцитабин представляет собой антиметаболический химиотерапевтический агент, и конкретно является аналогом пиримидина. Трифосфатное производное гемцитабина замещает цитидин при репликации ДНК, и его включение в растущую нить ДНК останавливает дальнейший синтез ДНК после присоединения еще одного нуклеотида, поскольку ДНК полимераза неспособна продолжать синтез цепи. Другие механизмы действия, как полагают, включают ингибирование рибонуклеозид редуктазы, ведущее к истощению запасов дезоксирибонуклеазы, необходимых для синтеза ДНК, и конкуренцию с дезоксицитидин трифосфатом в качестве ингибитора ДНК полимеразы. Эти механизмы приводят к некрозу, который влечет за собой остановку роста опухоли. Кроме того, указанное действие означает, что антиметаболические химиотерапевтические агенты являются токсичными для других активно делящихся клеток, например, T-клеток. Предпочтительная схема лечения включает применение химиотерапии на первом этапе с последующим введением вакцины для усиления стимулирования иммунного ответа, вызванного уничтоженными раковыми клетками.

Хотя было показано, что некоторые комбинации лекарственных средств, например, FOLFIRINOX, являются более эффективными, чем гемцитабин у пациентов с метастатической аденокарциномой поджелудочной железы, лечение этими комбинациями связано с высокой частотой появления побочных эффектов (Conroy et al., N Engl J Med 2011, vol. 364(19), p.1817-1825). Поэтому желательно разработать новые стратегии лечения рака.

Oettle et al. (JAMA 2007, 297(3), p.267-277) описали исследование, посвященное применению гемцитабина в качестве вспомогательной химиотерапии при операбельном раке поджелудочной железы и установили, что влияние гемцитабина на срок выживаемости без признаков заболевания было статистически достоверным у пациентов с резекцией R0 (радикальной) или R1. В частности, в этом исследовании было обнаружено, что послеоперационное применение гемцитабина достоверно отсрочивает развитие рецидива заболевания после полной резекции рака поджелудочной железы, по сравнению с пациентами, которым не вводили гемцитабин после проведения операции. Однако в этом исследовании не предполагалось, что гемцитабин мог бы применяться в комбинации с другими способами лекарственного лечения рака.

Bauer et al. (Cancer Immunol.Immunother. 2014, 63, p.321-333) установили, что гемцитабин оказывает отрицательное влияние на пролиферацию T-клеток, инициированную вакциной на основе дендритных клеток (DC). В частности, это исследование показало, что отсроченное введение гемцитабина по сравнению с DC вакциной не улучшало иммунный ответ пациента, тогда как одновременное введение гемцитабина и DC вакцины значительно ослабляло иммунный ответ, вызванный вакциной.

Таким образом, существует потребность в дополнительных и более эффективных способах лечения рака.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Основой для настоящего изобретения послужило неожиданное обнаружение того, что введение вакцины на основе пептидов RAS в комбинации с антиметаболическим химиотерапевтическим агентом (гемцитабином) значительно улучшало иммунный ответ пациентов по сравнению с введением только вакцины на основе пептидов RAS. Это стало неожиданным, поскольку раньше считалось, что введение пациенту антиметаболического химиотерапевтического агента, такого как гемцитабин, вызывает смерть пролиферирующих иммунных клеток, в т.ч. пролиферирующих T-клеток, что снижает активность иммунной системы пациента и за счет этого ослабляет иммунный ответ пациента на пептидную вакцину, которую вводят одновременно или последовательно. Не желая ограничиваться каким-либо объяснением, можно предположить, что фактически гибель клеток, вызванная антиметаболическим химиотерапевтическим агентом, может приводить к высвобождению сигнальных молекул, которые создают системную иммуногенную среду, тем самым, способствуя уже вызванному иммунному ответу и усиливая дополнительно инициированные иммунные ответы. Таким образом, под действием антиметаболического химиотерапевтического агента иммунный ответ на пептидную вакцину в действительности усиливается, а не ослабляется.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к как минимум одному пептиду, подходящему для инициирования иммунного ответа, где этот один пептид или каждый из пептидов соответствует фрагменту белка RAS, но включает от одной до трех точечных мутаций этого фрагмента, для применения в лечении рака при одновременном или последовательном введении антиметаболического химиотерапевтического агента.

Преимущественно, указанный один или каждый из пептидов содержит область как минимум из 8 аминокислотных остатков, которая включает положения 12 или 13 белка RAS, где указанная область содержит как минимум 6 аминокислотных остатков, помимо остатков в положениях 12 или 13 соответственно, которые идентичны соответствующей области белка RAS, и где один или каждый из пептидов содержит точечную мутацию по аминокислотному остатку, соответствующему указанным положениям 12 или 13 соответственно.

Одна из указанных точечных мутаций, которые подходят для применения по настоящему изобретению, выбрана из мутаций G13A, G13C, G13D, G13R, G13C, G13V, G12A, G12C, G12D, G12R, G12S или G12V.

Предпочтительно, указанный как минимум один пептид включает два или несколько пептидов, причем каждый из этих пептидов содержит различные точечные мутации.

Преимущественно, указанный как минимум один пептид включает:

пептид, содержащий мутацию G13D

пептид, содержащий мутацию G12A

пептид, содержащий мутацию G12C

пептид, содержащий мутацию G12D

пептид, содержащий мутацию G12R

пептид, содержащий мутацию G12S, и

пептид, содержащий мутацию G12V,

предпочтительно, где указанный как минимум один пептид включает пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO:13, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO:14, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO:15, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO:16, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO:17, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO:18, и пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO:19.

Как минимум один пептид, подходящий для применения в настоящем изобретении, включает:

пептид, содержащий мутацию G13D

пептид, содержащий мутацию G13C

пептид, содержащий мутацию G12A

пептид, содержащий мутацию G12C

пептид, содержащий мутацию G12D

пептид, содержащий мутацию G12R

пептид, содержащий мутацию G12S, и

пептид, содержащий мутацию G12V,

предпочтительно, где указанный как минимум один пептид включает пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO:13, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO:14, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO:15, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO:16, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO:17, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO:18, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO:19 и пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO:20.

Предпочтительно, антиметаболический химиотерапевтический агент представляет собой аналог пиримидина или его фармацевтически приемлемую соль.

Преимущественно, аналог пиримидина является гемцитабином или его фармацевтически приемлемой солью.

Согласно настоящему изобретению, рак включает клетки, которые экспрессируют мутировавший белок RAS.

Предпочтительно, рак представляет собой рак поджелудочной железы.

Согласно настоящему изобретению, рак поджелудочной железы представляет собой рак резецированной поджелудочной железы.

Преимущественно, антиметаболический химиотерапевтический агент впервые вводят как минимум через три недели после первой дозы как минимум одного пептида.

Согласно настоящему изобретению, первое введение антиметаболического химиотерапевтического агента осуществляют через 12 недель или менее после хирургического удаления раковой опухоли поджелудочной железы.

Предпочтительно, антиметаболический химиотерапевтический агент вводят в течение 24 часов относительно времени введения как минимум одного пептида.

Преимущественно, антиметаболический химиотерапевтический агент вводят после того, как был введен как минимум один пептид.

Согласно настоящему изобретению, указанный как минимум один пептид вводят в дозировке 0,01-10 мг, предпочтительно 0,1-2 мг и более предпочтительно 0,7 мг за одно введение.

Предпочтительно, антиметаболический химиотерапевтический агент вводят в дозировке 100-10000 мг/м², предпочтительно 500-2000 мг/м² и более предпочтительно 1000 мг/м².

Преимущественно, упомянутый как минимум один пептид и упомянутый антиметаболический химиотерапевтический агент вводят одновременно или последовательно, как минимум в два введения и, более предпочтительно, как минимум в три введения, где каждый случай введения отделен от другого как минимум одной неделей и более предпочтительно как минимум 2 неделями.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится как минимум к одной T-клетке, специфичной в отношении как минимум одного пептида по описанному выше первому аспекту изобретения, или препарату T-клеток, включающему T-клетки, специфичные в отношении как минимум одного пептида по описанному выше первому аспекту изобретения, в случае их присутствия на молекуле MHC, для применения в лечении рака, путем одновременного или последовательного введения с антиметаболическим химиотерапевтическим агентом.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей как минимум один пептид по изложенному выше первому аспекту, или по крайней мере одну T-клетку или препарат T-клеток по изложенному выше второму аспекту, для применения в лечении рака путем комбинированного или последовательного введения с антиметаболическим химиотерапевтическим агентом.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к набору, включающему первый продукт, содержащий по крайней мере один пептид, T-клетку или фармацевтическую композицию по первому, второму или третьему аспекту, которые описаны выше, соответственно, а также второй продукт, включающий определенное количество антиметаболического химиотерапевтического агента, соответствующего описанным выше аспектам.

В пятом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака, включающему введение пациенту, которому это необходимо, по крайней мере одного пептида, T-клетки или фармацевтической композиции, согласно описанным выше первому, второму или третьему аспекту, соответственно, а также антиметаболического химиотерапевтического агента, соответствующего описанным выше аспектам.

Термин «пептид» в настоящем описании относится к полимеру, состоящему из аминокислотных остатков, который является фрагментом более длинного белка (или имеет последовательность, которая соответствует такому фрагменту). Этот термин применяется также к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков являются модифицированными остатками, или остатками, которые не встречаются в природе, например, искусственными химическими миметиками соответствующих природных аминокислот, а также к природным аминокислотным полимерам.

«Идентичность» в процентах между двумя последовательностями можно определить с помощью программы BLASTP версии 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402), используя параметры по умолчанию. В частности, программу BLAST можно получить по интернету, по электронному адресу URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/.

Термин «иммунный ответ» в настоящем описании, в некоторых вариантах осуществления, относится к опосредованному T-клетками иммунному ответу, развивающемуся после презентации пептида молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) на поверхности клеток и, в частности, относится к активации T-клеток после презентации пептида.

Термин «белок RAS» в настоящем описании относится к классу малых белковых ГТФаз (гуанозинтрифосфатаз), кодируемых прото-онкогеном ras, который включает три изоформы белка RAS: HRAS, KRAS и NRAS. В некоторых вариантах осуществления, термин «белок RAS» относится к белку, соответствующему UniProtKB/Swiss-Prot учетный номер P01112.1, последовательность которого представлена SEQ ID NO:23.

Термин «положение 13 белка RAS», в настоящем описании относится к тринадцатому остатку в аминокислотной цепи, формирующей первичную структуру белка RAS дикого типа, считая от N-конца.

Термин «положение 12 белка RAS», в настоящем описании относится к двенадцатому остатку в аминокислотной цепи, формирующей первичную структуру белка RAS дикого типа, считая от N-конца.

Термин «аминокислота, соответствующая положению 13» в настоящем описании означает аминокислоту в пептиде, который является производным белка RAS, расположенную в аминокислотной цепи пептида в положении, соответствующей тринадцатому остатку аминокислотной последовательности белка RAS, считая от N-конца. Аналогичный смысл придается термину «аминокислота, соответствующая положению 12».

Термин «мутации белка RAS» в настоящем описании относится к одной или нескольким точечным мутациям, имеющимся в белках RAS, которые присутствуют в образце, отобранном у субъекта.

Термин «точечная мутация» в настоящем описании относится к замене одного аминокислотного остатка в полипептидной цепи белкового продукта другим аминокислотным остатком.

Термин «от одной до трех точечных мутаций» в настоящем описании означает одну точечную мутацию или две точечные мутации, или три точечные мутации.

Термин, например, «G12V» в настоящем описании относится к точечной мутации, которая возникает при замене глицина (G) в положении 12 белка RAS дикого типа, валином (V). Аналогичные определения применимы к похожим терминам, таким как G13C, G13R и т.д.

Термин «фармацевтическая композиция» в настоящем описании означает фармацевтический препарат, который подходит для введения намеченному пациенту из числа людей или животных с терапевтическими целями.

Термин «антиметаболический химиотерапевтический агент» в настоящем описании означает продукт, оказывающий ингибирующее действие на рост или деление клеток пациента и применяется для терапевтического лечения рака.

Термин «гемцитабин» в настоящем описании означает соединение, имеющее наименование по IUPAC 4-амино-1-(2-дезокси-2,2-дезокси-2,2-дифтор-β-D-эритро-пентофуранозил)пиримидин-2(1H)-он и представленное следующей структурной формулой:

Термин «его фармацевтически приемлемая соль» в настоящем описании означает соль, сформированную при взаимодействии соединения в свободной форме с кислотой или основанием. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают соли галогеноводородных кислот, такие как гидрофториды, гидрохлориды, гидробромиды и гидройодиды; соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, нитраты, перхлораты, сульфаты и фосфаты; соли низших алкансульфоновых кислот, такие как метансульфонаты, трифторметансульфонаты и этансульфонаты; соли арилсульфоновых кислот, такие как бензолсульфонаты и п-толуолсульфонаты; соли органических кислот, такие как ацетаты, малаты, фумараты, сукцинаты, цитраты, аскорбаты, тартраты, оксалаты и малеаты; соли щелочных металлов, например, соли натрия, соли калия и соли лития; соли щелочноземельных металлов, например, соли кальция и соли магния; соли металлов, например, соли алюминия и соли железа; соли неорганических оснований, например, соли аммония; соли аминов, в т.ч. органические соли, например, соли т-октиламина, соли дибензиламина, соли морфолина, соли глюкозамина, соли алкилового эфира фенилглицина, соли этилендиамина, соли N-метилглюкамина, соли гуанидина, соли диэтиламина, соли триэтиламина, соли дициклогексиламина, соли N,Nʹ-дибензилэтилендиамина, соли хлорпрокаина, соли прокаина, соли диэтаноламина, соли N-бензилфенэтиламина, соли пиперазина, соли тетраметиламмония и соли трис(гидроксиметил)аминометана; а также соли аминокислот, например, соли глицина, соли лизина, соли аргинина, соли орнитина, глутаматы и аспартаты.

Термин «последовательное введение» в настоящем описании означает введение двух продуктов пациенту, где эти два продукта не вводятся одновременно. В некоторых вариантах осуществления, каждое событие «последовательного введения» означает, что два продукта вводят с промежутком менее 5 дней, 4 дней, 3 дней, 2 дней или 1 дня друг относительно друга.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Фиг.1 представляет собой таблицу, демонстрирующую момент времени, в который была зафиксирована положительная реакция DTH у каждого пациента. ¹DTH не была достигнута; ²NT: введение не осуществлялось.

Фиг.2 представляет собой график, демонстрирующий синергетическое усиливающее действие при стимулировании иммунного ответа на DTH реакцию после начала введения гемцитабина.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO:1 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS, включающего мутацию G13C.

SEQ ID NO:2 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS, включающего мутацию G13R.

SEQ ID NO:3 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS, включающего мутацию G13D.

SEQ ID NO:4 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS, включающего мутацию G13V.

SEQ ID NO:5 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS, включающего мутацию G13A.

SEQ ID NO:6 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS, включающего мутацию G13S.

SEQ ID NO:7 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS, включающего мутацию G12A.

SEQ ID NO:8 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS, включающего мутацию G12C.

SEQ ID NO:9 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS, включающего мутацию G12D.

SEQ ID NO:10 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS, включающего мутацию G12R.

SEQ ID NO:11 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS, включающего мутацию G12S.

SEQ ID NO:12 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS, включающего мутацию G12V.

SEQ ID NO:13 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS TG01 и TG02, включающего мутацию G13D.

SEQ ID NO:14 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS комбинаций пептидов TG01 и TG02, включающего мутацию G12A.

SEQ ID NO:15 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS комбинаций пептидов TG01 и TG02, включающего мутацию G12C.

SEQ ID NO:16 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS комбинаций пептидов TG01 и TG02, включающего мутацию G12D.

SEQ ID NO:17 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS комбинаций пептидов TG01 и TG02, включающего мутацию G12R.

SEQ ID NO:18 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS комбинаций пептидов TG01 и TG02, включающего мутацию G12S.

SEQ ID NO:19 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS комбинаций пептидов TG01 и TG02, включающего мутацию G12V.

SEQ ID NO:20 показывает аминокислотную последовательность пептида RAS комбинации пептидов TG02, включающего мутацию G13C.

SEQ ID NO:21 показывает альтернативную аминокислотную последовательность пептида RAS комбинации пептидов, включающего мутацию G13R.

SEQ ID NO:22 показывает альтернативную аминокислотную последовательность пептида RAS, включающего мутацию G13V.

SEQ ID NO:23 показывает полноразмерную аминокислотную последовательность белка RAS дикого типа.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение, говоря обобщенно, относится к как минимум одному пептиду белка RAS для применения в лечении рака путем одновременного или последовательного введения с антиметаболическим химиотерапевтическим агентом. Каждый пептид из как минимум одного пептида включает от одной до трех точечных мутаций белка RAS.

Один или каждый из пептидов для применения согласно настоящему изобретению может являться пептидом, соответствующим любому из белков HRAS, KRAS или NRAS. Все три указанные изоформы RAS обладают идентичной последовательностью во всех областях, ответственных за связывание с GDP/GTP, т.е. областей, подвергающихся мутациям при раке.

В предпочтительных вариантах осуществления, по крайней мере одна из указанных от одной до трех мутаций, является точечной мутацией, которая соответствует мутации, закодированной онкогеном RAS, например, в положениях 12, 13 или 61 белка RAS.

В некоторых вариантах осуществления, один или каждый из пептидов включает как минимум 8, как минимум 9, как минимум 10, как минимум 12, как минимум 16, как минимум 17, как минимум 18, как минимум 20, как минимум 24 или как минимум 30 аминокислотных остатков. В предпочтительных вариантах осуществления, один или каждый из как минимум одного пептида включает как минимум 8 аминокислотных остатков. В других предпочтительных вариантах осуществления, один или каждый из как минимум одного пептида включает по крайней мере 17 аминокислотных остатков.

В некоторых вариантах осуществления, один или каждый из пептидов по настоящему изобретению содержит область из как минимум 8 аминокислотных остатков, которая включает положения 12 или 13 белка RAS. В предпочтительных вариантах осуществления, точечная мутация одного или каждого из пептидов происходит по аминокислотному остатку в указанном положении 12 или 13.

В некоторых вариантах осуществления, один или каждый из пептидов имеет как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 37%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность последовательности по положениям, которые не входят в область, включающую положение 13 в белке RAS. В некоторых вариантах осуществления, один или каждый из пептидов имеет как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность по положениям, которые не входят в область, включающую положение 13, одной из последовательностей SEQ ID Nos 1-6. В предпочтительных вариантах осуществления, один или каждый из пептидов имеет как минимум 95% идентичность по положениям, которые не входят в область, включающую положение 13, одной из последовательностей SEQ ID Nos 1-6. В других вариантах осуществления, один или каждый из пептидов имеет 100% идентичность по положениям, которые не входят в область, включающую положение 13, одной из последовательностей SEQ ID Nos 1-6.

В некоторых вариантах осуществления, указанный как минимум один пептид включает первый пептид, имеющий определенную процентную идентичность по положениям, которые не входят в область, включающую положение 13, одной из последовательностей SEQ ID Nos 1-6, и второй пептид, имеющий другую процентную идентичность по положениям, которые не входят в область, включающую положение 13, одной из последовательностей SEQ ID Nos 1-6. В других вариантах осуществления, первый пептид имеет определенную процентную идентичность по положениям, которые не входят в область, включающую положение 13, одной из последовательностей SEQ ID Nos 1-6, и второй пептид имеет ту же самую процентную идентичность по положениям, которые не входят в область, включающую положение 13, одной из последовательностей SEQ ID Nos 1-6. Во всех вариантах осуществления, один или каждый из пептидов способен вызывать иммунный ответ.

Каждый из первого и второго пептида из числа как минимум одного пептида по описанному выше варианту осуществления, содержит точечную мутацию в положении 13 белка RAS, где эта точечная мутация в первом пептиде отличается от точечной мутации во втором пептиде. Белок RAS дикого типа содержит глицин (G) в положении 13. Таким образом, мутация в положении 13 может быть точечной заменой глицина на любую другую аминокислоту. Тем не менее, было обнаружено, что с раком конкретно связаны мутации G13A, G13C, G13D, G13R, G13S и G13V. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления, точечная мутация одного или каждого из пептидов независимо является одной из мутаций G13A, G13C, G13D, G13R, G13S или G13V. В более предпочтительных вариантах осуществления, точечная мутация в положении 13 одного из первого и второго пептидов независимо является мутацией G13C или G13D. В особенно предпочтительных вариантах осуществления, точечная мутация в положении 13 одного из первого или второго пептидов является мутацией G13C. В других особенно предпочтительных вариантах осуществления, точечная мутация в положении 13 одного из первого или второго пептидов является мутацией G13D.

В некоторых вариантах осуществления, точечная мутация в положении 13 первого или второго пептида представляет собой мутацию G13C, и точечная мутация в положении 13 другого пептида представляет собой мутацию G13D.

В других вариантах осуществления, точечная мутация в положении 13 первого или второго пептида представляет собой мутацию G13R, и точечная мутация в положении 13 другого пептида представляет собой мутацию G13V.

В некоторых вариантах осуществления, изобретение относится к двум или нескольким пептидам белка RAS, включающим от одной до трех точечных мутаций, для применения в способе лечения рака путем одновременного или последовательного введения вместе с антиметаболическим химиотерапевтическим агентом. Каждый из второго или остальных пептидов независимо включает как минимум 8, как минимум 9, как минимум 10, как минимум 12, как минимум 16, как минимум 17, как минимум 18, как минимум 20, как минимум 24 или как минимум 30 аминокислотных остатков. В предпочтительных вариантах осуществления, каждый из пептидов включает как минимум 8 аминокислотных остатков. В других предпочтительных вариантах осуществления, каждый из пептидов включает как минимум 17 аминокислотных остатков. В других вариантах осуществления, каждый из пептидов включает как минимум 18 аминокислотных остатков. Как правило, каждый пептид в смеси пептидов может включать отличающееся число аминокислотных остатков по сравнению с одним или несколькими другими пептидами. Каждый из пептидов включает как минимум одну точечную мутацию, которая отличается от точечной мутации другого пептида(ов).

В альтернативных вариантах осуществления изобретения, указанный как минимум один пептид может включать как минимум третий пептид белка RAS, содержащий фрагмент из как минимум 8 аминокислот, включающий положение 13 белка RAS. Этот как минимум третий пептид может иметь точечную мутацию по аминокислотному остатку, соответствующему положению 13 белка RAS, которая отличается от мутаций по положению 13 первого и второго пептидов. Эта точечная мутация может быть одной из мутаций G13A, G13C, G13D, G13R, G13S или G13V, независимо от точечных мутаций первого и второго пептидов.

Указанный как минимум один пептид по настоящему изобретению может дополнительно включать по крайней мере один другой пептид белка RAS, включающий область из как минимум 8 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, указанная область этого как минимум одного другого пептида включает положение 12 белка RAS.

В тех вариантах осуществления, где как минимум один пептид включает как минимум третий пептид, каждый из пептидов независимо включает как минимум 8, как минимум 9, как минимум 10, как минимум 12, как минимум 16, как минимум 17, как минимум 18, как минимум 20, как минимум 24 или как минимум 30 аминокислотных остатков. В предпочтительных вариантах осуществления, каждый из пептидов включает как минимум 8 аминокислотных остатков. В других предпочтительных вариантах осуществления, каждый из пептидов включает как минимум 17 аминокислотных остатков. В других вариантах осуществления, каждый из пептидов включает как минимум 18 аминокислотных остатков. В основном, каждый пептид из как минимум одного пептида может включать отличающееся число аминокислотных остатков по сравнению с одним или несколькими другими пептидами из числа как минимум одного пептида.

В тех вариантах осуществления, где как минимум один пептид включает как минимум один пептид, содержащий область, включающую положение 12 белка RAS, аминокислотный остаток, соответствующий положению 12 белка RAS, имеет точечную мутацию. В белке RAS дикого типа, аминокислотный остаток в положении 12 представляет собой глицин (G). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, точечная мутация в положении 12 может являться аминокислотой, отличной от глицина. В некоторых вариантах осуществления, каждая из мутаций независимо представляет собой мутацию G12A, G12C, G12D, G12R, G12S или G12V. В других вариантах осуществления, этот как минимум один другой пептид имеет как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность по положениям, находящимся за пределами области, включающей положение 12, с белком RAS. В некоторых вариантах осуществления, как минимум один пептид имеет как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность по положениям, находящимся за пределами области, включающей положение 12, с одной из последовательностей SEQ ID NO:7-12. В некоторых вариантах осуществления, имеется более, чем один пептид белка RAS, включающий область, состоящую из как минимум 8 аминокислотных остатков, включающую положение 12 белка RAS, и содержащая точечную мутацию по аминокислоте, соответствующей положению 12 белка RAS. В таких вариантах осуществления, каждый из пептидов, содержащих мутацию в положении 12, имеет отличающуюся от других точечную мутацию.

В некоторых вариантах осуществления, указанный как минимум один пептид включает как минимум два пептида белка RAS, каждый из которых содержит область по крайней мере из 8 аминокислотных остатков, включающую положение 12 белка RAS. Точечная мутация в положении 12 может являться одной из мутаций G12A, G12C, G12D, G12R, G12S или G12V. Эти как минимум два пептида, включающие положение 12 белка RAS, могут иметь как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность по положениям, которые находятся за пределами области, включающей положение 12, с белком RAS. В некоторых вариантах осуществления, эти как минимум два пептида, включающие область из как минимум 8 аминокислот, содержащую положение 12, имеют как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность по положениям, которые находятся за пределами области, включающей положение 12, с одной из последовательностей SEQ ID Nos: 7-12 и 14-19. В как минимум одном пептиде, предназначенном для применения согласно настоящему изобретению, предусмотрены любые комбинации указанных выше мутаций и последовательностей SEQ ID Nos.

В некоторых вариантах осуществления, указанный как минимум один пептид состоит из пептида, включающего мутацию G13D, пептида, включающего мутацию G12A, пептида, включающего мутацию G12C, пептида, включающего мутацию G12D, пептида, включающего мутацию G12R, пептида, включающего мутацию G12S, и пептида, включающего мутацию G12V. В этих вариантах осуществления, пептиды, входящие в упомянутый как минимум один пептид, независимо имеют как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность по положениям, которые находятся за пределами области, включающей положения 12 или 13, соответственно, последовательностям SEQ ID Nos: 3, 7, 8, 9, 10, 11 и 12. В некоторых вариантах осуществления, пептидная смесь состоит из пептидов, независимо имеющих как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность по положениям, которые находятся за пределами области, включающей положения 12 или 13, соответственно, последовательностям SEQ ID Nos:13-19. Этот вариант осуществления изобретения в настоящем описании именуется TG01 в случае, если имеется 100% идентичность последовательностям SEQ ID Nos:13-19. В таблице 3 показаны пептиды, которые предпочтительно присутствуют в TG01.

В некоторых вариантах осуществления, указанный как минимум один пептид состоит из пептида, включающего мутацию G13C, пептида, включающего мутацию G13D, пептида, включающего мутацию G12A, пептида, включающего мутацию G12C, пептида, включающего мутацию G12D, пептида, включающего мутацию G12R, пептида, включающего мутацию G12S, и пептида, включающего мутацию G12V. В этих вариантах осуществления, пептиды, входящие в упомянутый как минимум один пептид, независимо имеют как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность по положениям, которые находятся за пределами области, включающей положения 12 или 13, соответственно, последовательностям SEQ ID Nos: 1, 3, 7, 8, 9, 10, 11 и 12. В некоторых вариантах осуществления, пептидная смесь состоит из пептидов, независимо имеющих как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность по положениям, которые находятся за пределами области, включающей положения 12 или 13, соответственно, последовательностям SEQ ID Nos:13-20. Этот вариант осуществления изобретения в настоящем описании именуется TG02 в случае, если имеется 100% идентичность последовательностям SEQ ID Nos:13-20. В таблице 4 показаны пептиды, которые предпочтительно присутствуют в TG02.

В основном, один или каждый из как минимум одного пептида, предназначенного для применения согласно настоящему изобретению, в области из 8 аминокислотных остатков, включающей положения 12 или 13, содержит как минимум 6 аминокислотных остатков помимо остатков в положениях 12 и 13, соответственно, которые идентичны соответствующей области белка RAS. Кроме того, в основном, один или каждый из как минимум одного пептида, предназначенного для применения согласно настоящему изобретению, в положениях, которые находятся за пределами области, включающей положения 12 или 13 белка RAS, имеют как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность одной из последовательностей SEQ ID Nos:1-20, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления, указанный как минимум один пептид состоит из первого, второго, третьего и четвертого пептида. Каждый из первого и второго пептида содержит точечную мутацию в положении 13 белка RAS, где точечная мутация в первом пептиде отличается от точечной мутации во втором пептиде. Точечная мутация каждого из первого и второго пептидов независимо является одной из мутаций G13A, G13C, G13D, G13R, G13S или G13V. Каждый из третьего и четвертого пептидов включает область из как минимум 8 аминокислотных остатков, содержащую положение 13 белка RAS, и каждый из третьего или четвертого пептидов независимо имеет как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность по положениям, которые находятся за пределами области, включающей положение 13, с белком RAS. Каждый из третьего или четвертого пептидов может независимо иметь как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность по положениям, которые находятся за пределами области, включающей положение 13, с одной из последовательностей SEQ ID NOs: 1-6, 20, 13, 21 или 22. Каждый из третьего или четвертого пептида включает точечную мутацию по аминокислотному остатку, соответствующему положению 13 пептида RAS, и каждый из первого, второго, третьего и четвертого пептидов содержит точечную мутацию, которая отличается от точечных мутаций других пептидов. В одном из вариантов осуществления, первый пептид является пептидом, включающим мутацию G13R, второй пептид является пептидом, включающим мутацию G13A, третий пептид является пептидом, включающим мутацию G13S, и четвертый пептид является пептидом, включающим мутацию G13V.

В некоторых вариантах осуществления, указанный как минимум один пептид состоит из максимум 8 различных пептидов. В других вариантах осуществления, как минимум один пептид включает максимум 10, 12, 14 или 16 различных пептидов. В вариантах осуществления, включающих более одного пептида, указанный как минимум один пептид может включать 1, 2, 3, 4, 5 или 6 пептидов, содержащих область из как минимум 8 аминокислотных остатков, включающую положение 12 белка RAS. В других вариантах осуществления, включающих более одного пептида, указанный как минимум один пептид может включать 1, 2, 3, 4, 5 или 6 пептидов, содержащих область из как минимум 8 аминокислотных остатков, включающую положение 13 белка RAS. В еще одной группе вариантов осуществления, указанный как минимум один пептид включает 1, 2, 3, 4, 5 или 6 пептидов, независимо содержащих область из как минимум 8 аминокислотных остатков, включающих положение 12 или 13 белка RAS.

В некоторых вариантах осуществления, один или каждый из пептидов, содержащих область из как минимум 8 аминокислотных остатков, включающую положение 13 белка RAS, включают положения 1-30 белка RAS. В альтернативных вариантах осуществления, один или каждый из пептидов, содержащих область из как минимум 8 аминокислотных остатков, включающую положение 13 белка RAS, включает положения 5-21 белка RAS. В другой группе вариантов осуществления, аминокислотный остаток, соответствующий положению 13 белка RAS, находится на C-конце каждого из пептидов. В следующей группе вариантов осуществления, аминокислотный остаток, соответствующий положению 13 белка RAS, находится на N-конце каждого из пептидов. Как правило, область, содержащая как минимум 8 аминокислотных остатков, включающая положение 13 белка RAS, может состоять из 8-и положений белка RAS, включающих положение 13. Например, область, содержащая как минимум 8 аминокислотных остатков, включающая положение 13, может состоять из аминокислотных остатков от положения 6 до положения 13, от положения 7 до положения 14, от положения 8 до положения 15, от положения 9 до положения 16, от положения 10 до положения 17, от положения 11 до положения 18, от положения 12 до положения 19 или от положения 13 до положения 20 белка RAS.

В некоторых вариантах осуществления, пептиды, содержащие область из как минимум 8 аминокислотных остатков, включающую положение 12 белка RAS, включают положения 1-30 белка RAS. В других вариантах осуществления, пептиды, содержащие область из как минимум 8 аминокислотных остатков, включающую положение 12 белка RAS, включает положения 5-21 белка RAS. В альтернативных вариантах осуществления, аминокислотный остаток, соответствующий положению 12 белка RAS, находится на C-конце пептида. В другой группе вариантов осуществления, аминокислотный остаток, соответствующий положению 12 белка RAS, находится на N-конце пептида. Как правило, область, содержащая как минимум 8 аминокислотных остатков, включающая положение 12 белка RAS, может состоять из 8-и положений белка RAS, включающих положение 12. Например, область, содержащая как минимум 8 аминокислотных остатков, включающая положение 12, может состоять из аминокислотных остатков от положения 5 до положения 12, от положения 6 до положения 13, от положения 7 до положения 14, от положения 8 до положения 15, от положения 9 до положения 16, от положения 10 до положения 17, от положения 11 до положения 18, или от положения 12 до положения 19 белка RAS.

В вариантах осуществления, включающих более одного пептида, этот более чем один пептид может включать различные пептиды в равных или отличающихся долях. Например, в вариантах осуществления, состоящих из первого и второго пептида, эти первый и второй пептид применяются в равных долях, т.е. каждый из пептидов составляет 50% от общего количества применяемых пептидов. В других вариантах осуществления, применяется более высокая доля первого пептида по сравнению со вторым. Например, первый пептид может составлять не менее 55%, не менее 60%, не менее 70%, не менее 80% или не менее 90% от общего количества применяемых пептидов. В альтернативных вариантах осуществления применяется более высокая доля второго пептида по сравнению с первым. Например, второй пептид может составлять не менее 55%, не менее 60%, не менее 70%, не менее 80% или не менее 90% от общего количества применяемых пептидов. В вариантах осуществления, где применяется более двух пептидов, эти пептиды могут применяться в равных или различных долях по отношению друг к другу. Например, каждый из пептидов может независимо составлять не менее 1%, не менее 5%, не менее 10%, не менее 20%, не менее 30%, не менее 40%, не менее 50%, не менее 60%, не менее 70%, не менее 80% или не менее 90% от общего количества применяемых пептидов.

Альтернативные варианты осуществления включают указанный как минимум один пептид, включающий по крайней мере пять пептидов белка RAS, где каждый из этих пяти пептидов содержит область из как минимум 8 аминокислотных остатков, включающую положение 13 белка RAS. Каждый из этих по крайней мере пяти пептидов независимо имеет как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность по положениям, которые находятся за пределами области, включающей положение 13, с белком RAS, и/или независимо имеет как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность по положениям, которые находятся за пределами области, включающей положение 13, с одной из последовательностей SEQ ID NOs: 1-6, 13, 20, 21 и 22. Каждый из упомянутых по крайней мере пяти пептидов содержит точечную мутацию в аминокислотном остатке, соответствующем положению 13 белка RAS, независимо выбранную из мутации G13A, G13C, G13D, G13R, G13S или G13V, и точечная мутация каждого пептида отличается от точечных мутаций остальных пептидов.

В другом варианте осуществления, указанный как минимум один пептид, подходящий для инициирования иммунного ответа, состоит из шести пептидов белка RAS, где каждый пептид содержит область из как минимум 8 аминокислотных остатков, включающую положение 12 белка RAS. Каждый из этих пептидов независимо имеет как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность по положениям, которые находятся за пределами области, включающей положение 12, с белком RAS, и/или независимо имеет как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность по положениям, которые находятся за пределами области, включающей положение 12, с одной из последовательностей SEQ ID NOs: 7-12 и 14-19. Каждый из этих пептидов содержит точечную мутацию в аминокислотном остатке, соответствующем положению 12 белка RAS, независимо выбранную из мутации G12A, G12C, G12D, G12R, G12S или G12V, и точечная мутация каждого пептида отличается от точечных мутаций остальных пептидов.

В следующем варианте осуществления, указанный как минимум один пептид, подходящий для инициирования иммунного ответа, состоит из первого, второго, третьего и четвертого пептида белка RAS, где каждый из первого, второго и третьего пептида включает область из по крайней мере 8 аминокислотных остатков, включающую положение 12 белка RAS, и четвертый пептид белка RAS содержит область из по крайней мере 8 аминокислотных остатков, включающую положение 13 белка RAS. Каждый из первого, второго, третьего и четвертого пептидов независимо имеет как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность по положениям, которые находятся за пределами области, включающей положение 12 или 13 соответственно, с белком RAS, и/или независимо имеет как минимум 20%, как минимум 25%, как минимум 30%, как минимум 40%, как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 66%, как минимум 75%, как минимум 85%, как минимум 95%, как минимум 99% или 100% идентичность по положениям, которые находятся за пределами области, включающей положение 12 или 13 соответственно, с одной из последовательностей SEQ ID NOs: 7-12, 14-19, 1-6, 13, 20, 21 и 22, соответственно. Каждый из упомянутых первого, второго, третьего и четвертого пептида содержит точечную мутацию по аминокислотному остатку, соответствующему указанному положению 12 или 13 белка RAS, соответственно. В некоторых вариантах осуществления, первый пептид является пептидом, имеющим мутацию G12A, второй пептид является пептидом, имеющим мутацию G12R, третий пептид является пептидом, имеющим мутацию G12S, и четвертый пептид является пептидом, имеющим мутацию G13C.

Указанный как минимум один пептид, применяемый согласно настоящему изобретению, является пептидом, который соответствует фрагменту белка RAS, экспонируемому молекулами MHC II на поверхности клеток. Таким образом, этот как минимум один пептид, применяемый согласно настоящему изобретению, является пептидом, который соответствует белковым фрагментам, которые возникают в результате внутриклеточного протеолитического разрушения белков RAS, которые затем могут быть экспонированы на молекулах HLA, и для которых у индивидуумов в ассортименте T-клеток обычно имеются реактивные T-клетки.

В другом аспекте настоящего изобретения разработана как минимум одна T-клетка или препарат T-клеток, включающий T-клетки, специфичные в отношении как минимум одного пептида, описанного выше по тексту заявки, когда он презентируется на молекуле MHC, для применения в лечении рака путем одновременного или последовательного введения с антиметаболическим химиотерапевтическим агентом. Эту как минимум одну T-клетку можно получить стимулированием как минимум одной реактивной T-клетки как минимум одним пептидом белка RAS. Например, в одном из вариантов осуществления, указанная как минимум одна T-клетка включает множество T-клеток, в котором первые и вторые T-клетки специфичны в отношении первого и второго пептида, соответственно, соответствующих фрагменту белка RAS, где каждый пептид содержит область из как минимум 8 аминокислотных остатков, включающую положение 13 белка RAS, и где каждая из первой и второй T-клеток специфична в отношении точечной мутации по аминокислотному остатку пептида, соответствующему указанному положению 13, причем точечная мутация, в отношении которой специфична первая T-клетка, отличается от точечной мутации, в отношении которой специфична вторая T-клетка. В другом варианте осуществления, например, указанная T-клетка включает множество T-клеток, специфичных в отношении пептида, соответствующего фрагменту белка RAS, где этот пептид содержит область как минимум из 8 аминокислотных остатков, включающую положение 13 белка RAS, где каждая T-клетка специфична в отношении точечной мутации по аминокислотному остатку пептида, соответствующему указанному положению 13.

Описанные выше как минимум один пептид, как минимум одна T-клетка и препараты T-клеток предназначены для применения в лечении рака и вводятся одновременно или последовательно с антиметаболическим химиотерапевтическим агентом. В некоторых вариантах осуществления, этот антиметаболический химиотерапевтический агент является аналогом пиримидина или его фармацевтически приемлемой солью. В предпочтительных вариантах осуществления, антиметаболический химиотерапевтический агент представляет собой гемцитабин или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтически приемлемая соль гемцитабина представляет собой гемцитабина гидрохлорид.

Как минимум один пептид, как минимум одна T-клетка или препарат T-клеток, предназначенные для применения по настоящему изобретению, применяются для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления, этот рак является раковым заболеванием, которое возникает из-за мутации белка RAS, в частности мутации, которая соответствует точечной мутации во вводимом пептиде или пептидах. В некоторых вариантах осуществления, рак является одним или несколькими раковыми заболеваниями из числа немелкоклеточного рака легких, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака яичников и рака груди. В предпочтительных вариантах осуществления, рак является раком поджелудочной железы. В более предпочтительных вариантах осуществления, рак является раком резецированной поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления, указанный как минимум один пептид включает точечную мутацию G13C, как минимум одна T-клетка специфична в отношении пептида, имеющего мутацию G13C, или T-клеточный препарат включает T-клетки, специфичные в отношении пептида, имеющего мутацию G13C, и они предназначены для применения в лечении рака путем одновременного или последовательного введения с антиметаболическим химиотерапевтическим агентом. В таких вариантах осуществления предпочтительно, чтобы рак был раком поджелудочной железы. В другом варианте осуществления, указанный как минимум один пептид включает пептид, имеющий мутацию G13D, как минимум одна T-клетка специфична в отношении пептида, имеющего мутацию G13D, или T-клеточный препарат включает T-клетки, специфичные в отношении пептида, имеющего мутацию G13D, и они предназначены для применения в лечении рака путем одновременного или последовательного введения с антиметаболическим химиотерапевтическим агентом. В частности было обнаружено, что лечение рака путем одновременного или последовательного введения как минимум одного пептида статистически достоверно улучшает иммунный ответ на как минимум один пептид по сравнению с введением только пептидной вакцины после реализации следующей схемы введения: неделя 1 - только пептид; неделя 2 - только пептид; неделя 3 - только пептид; неделя 4 - пептид и антиметаболический химиотерапевтический агент; неделя 5 - только антиметаболический химиотерапевтический агент; неделя 6 - пептид и антиметаболический химиотерапевтический агент; неделя 7 - введение не производится; и неделя 8 - пептид и антиметаболический химиотерапевтический агент.

Фармацевтические композиции, включающие как минимум один пептид, как минимум одну T-клетку или T-клеточный препарат, которые описаны выше, также предназначены для применения по настоящему изобретению. Такие фармацевтические композиции могут также включать как минимум один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или эксципиент. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция кроме того включает один или несколько дополнительных действующих ингредиентов и/или адъювантов. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция может дополнительно включать один или несколько ингредиентов, терапевтически эффективных для лечения проявлений того же самого заболевания. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция также включает гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF).

В некоторых вариантах осуществления, антиметаболический химиотерапевтический агент вводят одновременно с как минимум одним пептидом, как минимум одной T-клеткой, препаратом T-клеток или фармацевтической композицией. Так, например, в этих вариантах осуществления, антиметаболический химиотерапевтический агент вводят в то же время, что и как минимум один пептид, как минимум одну T-клетку, препарат T-клеток или фармацевтическую композицию.

В других вариантах осуществления, антиметаболический химиотерапевтический агент вводят последовательно с как минимум одним пептидом, как минимум одной T-клеткой, препаратом T-клеток или фармацевтической композиций. В некоторых вариантах осуществления, вводят как минимум один пептид, как минимум одну T-клетку, препарат T-клеток или фармацевтическую композицию, после чего осуществляют введение антиметаболического химиотерапевтического агента. В некоторых вариантах осуществления, в каждом случае последовательного введения антиметаболический химиотерапевтический агент вводят в течение 6 часов относительно введения как минимум одного пептида, как минимум одной T-клетки, препарата T-клеток или фармацевтической композиции. В других вариантах осуществления, в каждом случае последовательного введения антиметаболический химиотерапевтический агент вводят в течение 12 часов относительно времени введения как минимум одного пептида, как минимум одной T-клетки, препарата T-клеток или фармацевтической композиции. В других вариантах осуществления, в каждом случае последовательного введения антиметаболический химиотерапевтический агент вводят в течение 18 часов относительно времени введения как минимум одного пептида, как минимум одной T-клетки, препарата T-клеток или фармацевтической композиции. В следующей группе вариантов осуществления, в каждом случае последовательного введения антиметаболический химиотерапевтический агент вводят в течение 24 часов относительно времени введения как минимум одного пептида, как минимум одной T-клетки, препарата T-клеток или фармацевтической композиции. В предпочтительных вариантах осуществления, в каждом случае последовательного введения, антиметаболический химиотерапевтический агент вводят в течение 24 часов непосредственно после введения как минимум одного пептида, как минимум одной T-клетки, препарата T-клеток или фармацевтической композиции.

В некоторых вариантах осуществления, как минимум один пептид, как минимум одну T-клетку, препарат T-клеток или фармацевтическую композицию, и антиметаболический химиотерапевтический агент вводят одновременно и последовательно более, чем один раз одному и тому же пациенту. В некоторых вариантах осуществления, как минимум один пептид и антиметаболический химиотерапевтический агент вводят по крайней мере дважды (т.е. имеет место как минимум два случая введения). В других вариантах осуществления, как минимум один пептид и антиметаболический химиотерапевтический агент вводят по крайней мере три раза (т.е. три случая введения). В следующей группе вариантов осуществления, как минимум один пептид, как минимум одну T-клетку, препарат T-клеток или фармацевтическую композицию и антиметаболический химиотерапевтический агент вводят более чем три раза (т.е. более трех случаев введения). В некоторых вариантах осуществления, в каждом случае введение как минимум одного пептида, как минимум одной T-клетки, препарата T-клеток или фармацевтической композиции с одной стороны и антиметаболического химиотерапевтического агента с другой стороны разделено сроком как минимум одна неделя. В других вариантах осуществления, в каждом случае введение как минимум одного пептида, как минимум одной T-клетки, препарата T-клеток или фармацевтической композиции с одной стороны и антиметаболического химиотерапевтического агента с другой стороны разделено сроком как минимум две недели. В некоторых вариантах осуществления, каждый случай введения отделен от других более чем двумя неделями.

В некоторых вариантах осуществления, антиметаболический химиотерапевтический агент вводят индивидуально один или несколько раз, до или после одновременного или последовательного введения с как минимум одним пептидом, как минимум одной T-клеткой, препаратом T-клеток или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В других вариантах осуществления, как минимум один пептид, как минимум одну T-клетку, препарат T-клеток или фармацевтическую композицию вводят индивидуально один или несколько раз, до или после одновременного или последовательного введения с антиметаболическим химиотерапевтическим агентом.

Так, например, в некоторых вариантах осуществления, первое введение антиметаболического химиотерапевтического агента отсрочивается по отношению к первому введению как минимум одного пептида, как минимум одной T-клетки, препарата T-клеток или фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления, первое введение антиметаболического химиотерапевтического агента осуществляют как минимум через одну неделю после первого введения как минимум одного пептида, как минимум одной T-клетки, препарата T-клеток или фармацевтической композиции. В других вариантах осуществления, первое введение антиметаболического химиотерапевтического агента осуществляют как минимум через две недели после первого введения как минимум одного пептида, как минимум одной T-клетки, препарата T-клеток или фармацевтической композиции. В следующей группе вариантов осуществления, первое введение антиметаболического химиотерапевтического агента осуществляют как минимум через три недели после первого введения как минимум одного пептида, как минимум одной T-клетки, препарата T-клеток или фармацевтической композиции. В особенно предпочтительных вариантах осуществления, независимо от промежутка времени между первым введением каждого из как минимум одного пептида, как минимум одной T-клетки, препарата T-клеток или фармацевтической композиции и антиметаболического химиотерапевтического агента, антиметаболический химиотерапевтический агент вводят в течение 24 часов относительно времени введения как минимум одного пептида, как минимум одной T-клетки, препарата T-клеток или фармацевтической композиции. В частности, было установлено, что задержка в три недели между первым введением как минимум одного пептида, как минимум одной T-клетки, препарата T-клеток или фармацевтической композиции, и первым антиметаболического химиотерапевтического агента, оказывает статистически достоверное влияние на зафиксированный иммунный ответ.

В некоторых вариантах осуществления, где рак представляет собой рак резецированной поджелудочной железы, первое введение антиметаболического химиотерапевтического агента производится через 12 недель или менее после хирургического удаления раковой опухоли поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления, первое введение производится через 10 недель или менее после хирургического удаления раковой опухоли поджелудочной железы. В других вариантах осуществления, первое введение антиметаболического химиотерапевтического агента производится через 8 недель или менее после хирургического удаления раковой опухоли поджелудочной железы.

Указанный как минимум один пептид, как минимум одна T-клетка, препарат T-клеток или фармацевтическая композиция для применения в настоящем изобретении могут вводиться субъекту с помощью любой подходящей методики доставки, известной специалисту в данной области техники. Например, среди прочих методик, минимум один пептид, как минимум одна T-клетка, препарат T-клеток или фармацевтическая композиция могут вводиться субъекту инъекцией в форме раствора, в форме липосом или в сухой форме (например, в форме частиц с покрытием и т.д.). В некоторых вариантах осуществления, как минимум один пептид или фармацевтическую композицию вводят в количестве от 0,01 мг до 10 мг как минимум одного пептида за одно введение. В других вариантах осуществления, как минимум один пептид или фармацевтическую композицию вводят в количестве от 0,1 мг до 2 мг как минимум одного пептида за одно введение. В некоторых вариантах осуществления, как минимум один пептид или фармацевтическую композицию вводят в количестве 0,1 мг как минимум одного пептида за одно введение. В другом варианте осуществления, как минимум один пептид или фармацевтическую композицию вводят в количестве 0,7 мг как минимум одного пептида за одно введение. Дозировка зависит от числа различных пептидов, вводимых пациенту. Например, если как минимум один пептид состоит из пептида с одним типом точечной мутации, как минимум один пептид или фармацевтическую композицию предпочтительно вводят в количестве 0,1 мг как минимум одного пептида за одно введение. В другом примере, если указанный как минимум один пептид включает семь или более типов точечных мутаций, этот как минимум один пептид или фармацевтическую композицию предпочтительно вводят в количестве 0,7 мг как минимум одного пептида за одно введение.

В некоторых вариантах осуществления, как минимум одну T-клетку или препарат T-клеток вводят внутривенной инъекцией и/или инфузией, и введение осуществляется в количестве, например, от 10⁶ до 10¹² каждой из T-клеток, специфичных в отношении пептида по настоящему изобретению.

Антиметаболический химиотерапевтический агент можно вводить субъекту с помощью любой методики доставки, известной специалисту в данной области техники. Например, в некоторых вариантах осуществления, антиметаболический химиотерапевтический агент вводят с помощью канюли, центрального катетера или центрального катетера, введенного периферийно. В некоторых вариантах осуществления, антиметаболический химиотерапевтический агент вводят в количестве от примерно 100 до примерно 10 000 мг/м² площади поверхности тела. В некоторых вариантах осуществления, антиметаболический химиотерапевтический агент вводят в количестве от 500 до 2000 мг/м² площади поверхности тела. В других вариантах осуществления, антиметаболический химиотерапевтический агент вводят в количестве 1000 мг/м² площади поверхности тела.

В других вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к набору, включающему первый продукт, содержащий как минимум один пептид, T-клетку или фармацевтическую композицию, которые описаны выше, и второй продукт включающий источник антиметаболического химиотерапевтического агента, который описан выше. Первый и второй продукты поставляются в отдельных флаконах или отсеках. В некоторых вариантах осуществления, этот набор дополнительно включает инструкции по введению первого и второго продуктов.

Таблицы

Таблица 1: Пептиды RAS, включающие мутацию в положении 13, последовательности SEQ ID NOs: 1-6

1 13 30

MTEYKLVVVGAGCVGKSALTIQLIQNHFVD

MTEYKLVVVGAGRVGKSALTIQLIQNHFVD

MTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQNHFVD

MTEYKLVVVGAGVVGKSALTIQLIQNHFVD

MTEYKLVVVGAGAVGKSALTIQLIQNHFVD

MTEYKLVVVGAGSVGKSALTIQLIQNHFVD

Таблица 2: Пептиды RAS, включающие мутацию в положении 12, последовательности SEQ ID NOs: 7-12

1 12 30

MTEYKLVVVGAAGVGKSALTIQLIQNHFVD

MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQNHFVD

MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQNHFVD

MTEYKLVVVGARGVGKSALTIQLIQNHFVD

MTEYKLVVVGASGVGKSALTIQLIQNHFVD

MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQNHFVD

Таблица 3: Пептиды, входящие в вариант осуществления TG01, последовательности SEQ ID NOs:13-19

5 21

KLVVVGAGDVGKSALTI

KLVVVGAAGVGKSALTI

KLVVVGACGVGKSALTI

KLVVVGADGVGKSALTI

KLVVVGARGVGKSALTI

KLVVVGASGVGKSALTI

KLVVVGAVGVGKSALTI

Таблица 4: Пептиды, входящие в вариант осуществления TG02, последовательности SEQ ID NOs:13-20

5 21

KLVVVGAGCVGKSALTI

KLVVVGAGDVGKSALTI

KLVVVGAAGVGKSALTI

KLVVVGACGVGKSALTI

KLVVVGADGVGKSALTI

KLVVVGARGVGKSALTI

KLVVVGASGVGKSALTI

KLVVVGAVGVGKSALTI

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Проводили клинические исследования фазы I/II для определения безопасности и иммунологической реакции при вспомогательном лечении рака резецированной поджелудочной железы вакцинацией пептидом RAS (TG01) индивидуально и затем в комбинации с дополнительной химиотерапией гемцитабином.

Пациенты получали TG01 вместе с иммуномодулятором, а именно GM-CSF, в течение 1-8 недель после хирургического вмешательства. В период 3-7 недель после начала введения TG01/GM-CSF, пациенты также получали гемцитабин. Пациентов обследовали с целью определения безопасности и иммунной реакции на 11 неделе после получения по крайней мере одного цикла гемцитабина.

В начале исследования, шести пациентам вводили TG01 и GM-CSF, и на 11 неделе использовали критерии безопасности и иммунной реакции, для оценки того, как можно было бы продолжать исследование, где возможные варианты показаны ниже.

Если на 11 неделе:

- 0 из 6 пациентов продемонстрируют иммунный ответ и/или 3 из 6 пациентов продемонстрируют токсичность, ограничивающую дозировку (DLT), исследование можно будет прекратить,

- 1-3 из 6 пациентов продемонстрируют иммунный ответ и/или 3 из 6 пациентов продемонстрируют DLT, тогда в исследование можно будет включить еще 6 пациентов,

-4 или более из 6 пациентов продемонстрируют иммунный ответ и/или 2 или менее из 6 пациентов продемонстрируют DLT, тогда будет начато исследование стадии II.

Было принято решение, что если список участников фазы I расширится до 12 пациентов, тогда на 11 неделе, если:

- менее 4 пациентов из 12 продемонстрируют иммунный ответ и/или более 4 из 12 пациентов продемонстрируют DLT, то исследование можно будет прекратить,

- 4 или более пациентов из 12 продемонстрируют иммунный ответ и/или 4 или менее пациентов из 12 продемонстрируют DLT, могут быть инициированы исследования фазы II.

Таким образом, исследования фазы II могли бы начаться, если:

a) 4 или более пациентов из 6 продемонстрируют иммунный ответ и 2 или менее пациентов из 6 продемонстрируют DLT на 11 неделе, или

b) 4 или более пациентов из 12 продемонстрируют иммунный ответ и 4 или менее пациентов из 12 продемонстрируют DLT на 11 неделе.

Получение препаратов для исследования

TG01 готовили в 2R стеклянных флаконах, содержащих 2,1 мг TG01, и содержимое одного флакона TG01 растворяли в 0,3 мл стерильной воды для инъекций (7 мг/мл). Раствор использовали в течение 6 часов после разбавления.

GM-CSF готовили во флаконах, содержавших 0,1 мг препарата, и содержимое флакона растворяли в 0,33 мл стерильной воды для инъекций (0,30 мг/мл). Раствор использовали в течение 6 часов после разбавления.

Гемцитабин вводили в дозировке 1000 мг/м². Препарат поставлялся во флаконах 200 мг и 1 г для разбавления солевым раствором с целью введения путем внутривенной инъекции.

Для инициирования DTH, содержимое флакона с TG01 растворяли в 0,3 мл стерильной воды для инъекций. Полученный раствор использовали в течение 6 часов после приготовления.

Дозировки и введение TG01 и GM-CSF

TG01 и GM-CSF вводили в дни 1, 3, 5, 8, 15, 22 и один раз в две недели до окончания химиотерапии (причем день 1 определяли как первый день введения TG01, которое начинали через 1-8 недель после хирургического вмешательства). После окончания химиотерапии, пациенты, у которых не обнаруживался рецидив и/или у которых имелся позитивный иммунный ответ в период введения в рамках исследования, получали усиленные инъекции, которые проводили один раз в 4 недели до 52 недели и затем один раз в 12 недель вплоть до 2 лет или до отзыва согласия на участие в исследовании, или до проявления токсического действия, смотря по тому, что наступит раньше.

Дозировка TG01 составляла 0,70 мг (инъекция 0,10 мл раствора TG01 в концентрации 7 мг/мл, восстановленного с использованием воды для инъекций). Дозировка GM-CSF составляла 0,03 мг (инъекция 0,10 мл раствора GM-CSF в концентрации 0,3 мг/мл, восстановленного с использованием воды для инъекций).

Оба исследуемых препарата вводили интрадермальной инъекцией в заднюю поверхность плеча, причем GM-CSF вводили за 10-15 минут до инъекции TG01.

Дозировка и введение химиотерапевтических препаратов

Введение пациентам гемцитабина начинали как минимум через 3 недели после начала введения TG01 и GM-CSF (день 22, 36 или 50 начального периода введения), но не позднее 12 недель с даты хирургического вмешательства. День первого введения TG01 и GM-CSF считали днем 1 периода введения химиотерапевтических препаратов. Гемцитабин вводили в дозировке 1000 мг/м² внутривенно, в течение 30 минут в дни 1, 8 и 15 четырехнедельного цикла, осуществляя в общей сложности шесть циклов введения.

Дозировка и введение препаратов для инициирования DTH

TG01 вводили в дни 1, 8, 15, 22, 36, 50 и 64 в нижнюю часть другой руки.

Тестовую дозу для DTH готовили в день введения для интрадермальной инъекции в стерильном шприце, и она составляла 0,10 мл раствора TG01 в воде для инъекций в концентрации 7 мг/мл.

Критерии введения химиотерапевтических препаратов

Гемцитабин:

Перед введением гемцитабина в начале каждого нового цикла введения, оценивали состояние пациентов, чтобы гарантировать, что оно соответствует предписаниям производителя гемцитабина.

Результаты и обсуждение

Исследование было расширено с 6 до 9 пациентов, и ниже приведено обсуждение полученных результатов.

TG01-специфичный иммунный ответ был обнаружен у всех 9 субъектов на 11 неделе, причем сообщений о DLTs не поступало.

Профиль безопасности соответствовал ожидаемому для пациентов после операции на поджелудочной железе, которые получали химиотерапию. Отмечалось одно нежелательное явление, которое, как можно предположить, относится только к TG01/GM-CSF, и которое представляло собой реакцию в месте введения. У одного пациента наблюдалось три явления, которые были отнесены к TG01/GM-CSF и гемцитабину (тошнота, рвота и симптомы, напоминающие грипп). Нежелательные явления, связанные с гемцитабином, соответствовали ожидаемым для нейтропении степени 3/4 и являлись основными нежелательными явлениями, связанными с применением препаратов. В этих случаях требовался перерыв во введении гемцитабина или уменьшение дозировки.

Сообщалось о четырех серьезных нежелательных явлениях у двух пациентов. У одного пациента наблюдалась легочная инфекция и два эпизода лихорадки, причем все указанные эпизоды, как считалось, связаны с гемцитабином. У одного пациента была зафиксирована тошнота, которая также, как полагали, не была связана с введением TG01 и гемцитабина.

При том, что в начале исследования (неделя 1) имело место отсутствие реакции DTH, у четырех пациентов (44%) реакция DTH развилась перед началом введения гемцитабина в конце недели 3 (Фиг.1 и 2). Это число выросло до семи пациентов (77%) с положительной реакцией DTH после первого цикла введения гемцитабина (неделя 6) и до всех девяти пациентов (100%) после введения первой дозы гемцитабина во втором цикле (неделя 8) (Фиг. 1 и 2). Это демонстрирует, что Th1 поляризованная реакция на TG01 была инициирована у всех пациентов после совместного введения TG01 и гемцитабина на 8-й неделе.

Кроме того, было обнаружено отсутствие ослабления или прекращения достигнутой иммунной реакции, т.е. инициированные иммунные ответы являлись устойчивыми (Фиг.2). Фактически, число пациентов, демонстрирующих иммунную реакцию после совместного введения TG01 и гемцитабина во втором цикле (неделя 8), было достоверно выше, чем при индивидуальном введении TG01 (Фиг.2).

Полученные данные демонстрируют неожиданный результат, который заключается в том, что комбинация TG01 и гемцитабина эффективна для инициирования иммунного ответа у раковых пациентов, и что вызванный иммунный ответ является устойчивым. В частности, алгоритм продолжения исследования в фазе II (т.е. если на 11 неделе 4 или более из 6 пациентов продемонстрировали иммунный ответ и/или 2 или менее из 6 пациентов продемонстрировали DLT, то будут инициированы исследования фазы II) демонстрирует ожидание того, что по крайней мере у 50% пациентов мог бы проявиться иммунный ответ на 11 неделе. Таким образом, тот факт, что иммунный ответ на 11 неделе проявился у всех пациентов, оказался крайне неожиданным для специалистов, которые планировали исследование.

1. Применение пептида для лечения рака, где пептид подходит для инициирования иммунного ответа, пептид соответствует фрагменту белка RAS, но включает одну аминокислотную замену, пептид включает область из по крайней мере 8 аминокислот, которая содержит положение 12 или 13 белка RAS, и аминокислотная замена пептида находится в указанном положении 12 или 13, соответственно, и выбрана из замен G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, G12A, G12C, G12D, G12R, G12S или G12V, и где пептид вводят одновременно или последовательно с антиметаболическим химиотерапевтическим агентом.

2. Применение пептида по п.1, где пептид включает два или более пептида, причем каждый пептид содержит отличную от других аминокислотную замену.

3. Применение пептида по п.1, где пептид включает:

пептид, содержащий замену G13D

пептид, содержащий замену G12A

пептид, содержащий замену G12C

пептид, содержащий замену G12D

пептид, содержащий замену G12R

пептид, содержащий замену G12S, и

пептид, содержащий замену G12V,

предпочтительно, где указанный пептид включает пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 13, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 14, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 15, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 16, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 17, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 18, и пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 19.

4. Применение пептида по. п.1, где пептид включает:

пептид, содержащий замену G13D

пептид, содержащий замену G13C

пептид, содержащий замену G12A

пептид, содержащий замену G12C

пептид, содержащий замену G12D

пептид, содержащий замену G12R

пептид, содержащий замену G12S, и

пептид, содержащий замену G12V,

предпочтительно, где указанный пептид включает пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 13, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 14, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 15, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 16, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 17, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 18, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 19, и пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO:20.

5. Применение пептида по п.1, где антиметаболический химиотерапевтический агент является аналогом пиримидина или его фармацевтически приемлемой солью, предпочтительно, где аналог пиримидина представляет собой гемцитабин или его фармацевтически приемлемую соль.

6. Применение пептида по п. 1, где пептид включает пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 13, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 14, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 15, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 16, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 17, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 18, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 19, и пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 20, и где антиметаболический химиотерапевтический агент представляет собой гемцитабин.

7. Применение пептида по п. 1, где рак включает клетки, которые экспрессируют мутировавший белок RAS, предпочтительно, где рак является раком поджелудочной железы.

8. Применение пептида по п.1, где антиметаболический химиотерапевтический агент впервые вводят как минимум через три недели после первого введения как минимум одного пептида.

9. Применение пептида по п.7, где рак представляет собой рак резецированной поджелудочной железы, и антиметаболический химиотерапевтический агент впервые вводят через 12 или менее недель после хирургического удаления раковой опухоли поджелудочной железы.

10. Применение пептида по п. 1, где антиметаболический химиотерапевтический агент вводят в течение 24 часов относительно времени введения как минимум одного пептида.

11. Применение пептида по п. 10, где антиметаболический химиотерапевтический агент вводят после того, как был введен один пептид.

12. Применение пептида по п. 1, где этот пептид вводят в дозировке 0,01-10 мг, предпочтительно, 0,1-2 мг и более предпочтительно 0,7 мг за одно введение.

13. Применение пептида по п. 1, где антиметаболический химиотерапевтический агент вводят в дозировке 100-10000 мг/м², предпочтительно 500-2000 мг/м² и более предпочтительно 1000 мг/м².

14. Применение пептида по п. 1, где пептид и антиметаболический химиотерапевтический агент вводят одновременно или последовательно, осуществляя как минимум два введения, и более предпочтительно как минимум три введения, где каждое введение отделено от остальных как минимум одной неделей и предпочтительно как минимум 2 неделями.

15. Применение ex vivo T-клетки, специфичной в отношении пептида, раскрытого в предшествующих пунктах, если он презентирован на молекуле MHC, для лечения рака, где Т-клетку вводят одновременно или последовательно с антиметаболическим химиотерапевтическим агентом.

16. Применение фармацевтической композиции, включающей пептид, раскрытый в любом из пп.1-14, или ex vivo T-клетку, раскрытую в п.15, для лечения рака путем комбинированного или последовательного введения с антиметаболическим химиотерапевтическим агентом.

17. Способ лечения рака, где способ включает стадию одновременного или последовательного введения пептида, подходящего для инициирования иммунного ответа, с антиметаболическим химиотерапевтическим агентом, где пептид соответствует фрагменту белка RAS, но включает одну аминокислотную замену, пептид включает область из по меньшей мере 8 аминокислот, которая включает положение 12 или 13 белка RAS, где аминокислотная замена пептида находится в указанном положении 12 или 13, соответственно, и выбрана из замен G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, G12A, G12C, G12D, G12R, G12S или G12V.

18. Способ лечения рака по п. 17, где пептид включает:

пептид, содержащий замену G13D

пептид, содержащий замену G12A

пептид, содержащий замену G12C

пептид, содержащий замену G12D

пептид, содержащий замену G12R

пептид, содержащий замену G12S, и

пептид, содержащий замену G12V пептид, содержащий замену,

предпочтительно, где пептид включает пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 13, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 14, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 15, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 16, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 17, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 18, и пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 19.

19. Способ лечения рака по п. 17, где пептид включает:

пептид, содержащий замену G13D

пептид, содержащий замену G13C

пептид, содержащий замену G12A

пептид, содержащий замену G12C

пептид, содержащий замену G12D

пептид, содержащий замену G12R

пептид, содержащий замену G12S, и

пептид, содержащий замену G12V пептид, содержащий замену,

предпочтительно, где пептид включает пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 13, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 14, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 15, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 16, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 17, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 18, пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 19, и пептид, состоящий из последовательности, представленной SEQ ID NO: 20.

20. Способ лечения рака по любому из пп. 17-19, где антиметаболический химиотерапевтический агент представляет собой аналог пиримидина или его фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно, где аналог пиримидина представляет собой гемцитабин или его фармацевтически приемлемую соль.

21. Способ лечения рака, где способ включает стадию введения в комбинации или последовательно фармацевтической композиции, включающей пептид, раскрытый в любом из пп. 1-14, или ex vivo T-клетки, раскрытой в п. 15, и антиметаболический химиотерапевтический агент.