Связывающие белки и способы их применения

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложено антитело, способное связываться с белком бета-клото человека, и его антигенсвязывающий фрагмент. Также представлены: полинуклеотид, вектор экспрессии, клетка, фармацевтическая композиция, способы улучшения параметров метаболизма глюкозы и различных метаболических параметров, способы лечения сахарного диабета 2 типа, ожирения, неалкогольного стеатогепатита (НАСГ), неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) и способ индукции FGF19- и/или FGF21-подобной передачи сигнала. Данное изобретение может быть использовано для лечения различных заболеваний, связанных с бета-клото, таких как ожирение, дислипидемия и т.д. 14 н. и 21 з.п. ф-лы, 6 ил., 31 табл., 9 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №61/931531, поданной 24 января 2014 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Настоящее изобретение в целом относится к связывающим белкам, таким как антитела, которые связываются с бета-клото, включая бета-клото человека, а также способам их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Бета-клото, который принадлежит к семейству белков клото, представляет собой белок с одним трансмембранным доменом I типа. Бета-клото имеет внеклеточный домен, состоящий из двух внутренних повторов, которые гомологичны последовательностям членов семейства гликозидаз 1, но не обладают глюкозидазной каталитической активностью. Экспрессия бета-клото детектируется главным образом в печени, поджелудочной железе и жировой ткани. Ito и его коллеги сообщили, что мыши, дефицитные 110 гену бета-клото (KLB^-/-), имеют повышенные уровни мРНК CYP7A1 и CY8B1 и для них характерен повышенный синтез и выведение желчных кислот (Ito et ah, 2005, J Clin Invest 115: 2202-2208). Бета-клото образует комплекс с рецепторами фактора роста фибробластов (FGF) и функционирует как ко-рецептор FGF, включая FGF19 и FGF21.

[0004] Были идентифицированы двадцать два члена семейства FGF человека и четыре рецептора, обладающих тирозинкиназной активностью, которые связываются с FGF (FGFR1-FGFR4). Взаимодействие между FGF и его рецептором приводит к димеризации FGFR, что позволяет цитоплазматическому домену рецептора трансфосфорилироваться и активироваться, что в свою очередь ведет к фосфорилированию и активации нисходящих сигнальных молекул.

[0005] FGFR4 представляет собой высокоаффинный рецептор FGF19, и связывание FGF19 с FGFR4 усиливается белком бета-клото. Имеются сообщения том, что мыши, трансгенные 110 гену FGF19, имеют сниженный уровень ожирения, повышенную скорость обмена веществ, сниженные уровни триглицеридов в печени, повышенное окисление жирных кислот, сниженные уровни глюкозы и повышенную чувствительность к инсулину (Tomlinson et ah, 2002, Endocrinology 143: 1741-1747). Помимо этого, у трансгенных мышей указанной линии, как сообщалось, не развивается ожирение или диабет при использовании рациона с высоким содержанием жиров (Tomlinson et ah, 2002, Endocrinology 143: 1741-1747). Также сообщалось, что лечение с применением FGF19 предотвращало или обращало развитие диабета у мышей, страдающих ожирением вследствие генетической абляции бурой жировой ткани или генетически обусловленного отсутствия лептина (Fu etah, 2004, Endocrinology 145: 2594-2603).

[0006] FGF21 действует посредством взаимодействия с FGFR и бета-клото. FGFR1 является широко распространенным рецептором в белой жировой ткани и, вероятно, представляет собой главный функциональный рецептор для FGF21 в белой жировой ткани. Экспрессия FGF21 детектируется в печени, тимусе, жировой ткани и бета-клетках островков Лангерганса в поджелудочной железе. Имеются сообщения о том, что взаимодействие FGF21 с комплексом бета-клото-FGFR стимулирует поглощение глюкозы, уменьшает секрецию глюкагона, улучшает чувствительность к инсулину и клиренс глюкозы, стимулирует белую жировую ткань в ответ на голодание, увеличивает кетогенез в печени в ответ на голодание, уменьшает уровни триглицеридов в плазме крови и увеличивает расход энергии (Iglesias et ah, 2012, European Journal of Endocrinology 167: 301-309).

[0007] Поскольку FGF19 и FGF21 нуждаются в наличии FGFR и бета-клото для передачи сигналов в клетке, агенты, которые имитируют FGF19 и/или FGF21, могут быть желательными вследствие их влияния на метаболизм глюкозы или метаболизм липидов. Однако не ясно, какими признаками должен обладать агент, чтобы обеспечить активность при передаче сигналов в клетке, которая будет аналогична таковой для FGF19 или FGF21.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] В настоящем изобретении предложены белки, которые связываются с бета-клото, включая связывающие белки, такие как антитела, которые связываются с бета-клото. Указанные связывающие белки, включая антитела, могут связываться с полипептидом бета-клото, фрагментом бета-клото и/или эпитопом бета-клото. Указанные связывающие белки, включая антитела, могут представлять собой агонисты (например, индуцировать передачу сигналов в клетке с участием рецептора FGF, которая будет аналогична таковой для FGF19 или FGF21, или активировать комплекс бета-клото/рецептор FGF).

[0009] В настоящем изобретении также предложены связывающие белки, включая антитела или их фрагменты, которые (i) связываются с бета-клото человека, (ii) индуцируют передачу сигналов, которая аналогична таковой для FGF19 и/или FGF21, и (iii) не конкурируют с FGF19 и/или FGF21 за взаимодействие с бета-клото.

[00010] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела к бета-клото представляют собой гуманизированные антитела, которые связываются с полипептидом бета-клото, фрагментом бета-клото или эпитопом бета-клото. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело к бета-клото содержит гипервариабельную область (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (VH), CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 вариабельной области легкой цепи (VL), CDR2 VL и/или CDR3 VL моноклонального антитела, обозначенного 5Н23, 1С17, 1D19, 2L12, 3L3, 3N20, 4Р5, 5С23, 5F7 или 1G19, описанного в настоящей заявке, или его гуманизированного варианта. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело к бета-клото может дополнительно содержать каркасный участок (FR) 1 VH, FR2 VH, FR3 VH, FR4 VH, FR1 VL, FR2 VL, FR3 VL и/или FR4 VL аминокислотной последовательности иммуноглобулина человека или ее варианта.

[00011] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения связывающий белок (например, антитело к бета-клото) содержит шесть CDR или менее шести CDR. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения связывающий белок (например, антитело к бета-клото) содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть областей CDR, выбранных из CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и/или CDR3 VL. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения связывающий белок (например, антитело к бета-клото) содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть областей CDR, выбранных из CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и/или CDR3 VL моноклонального антитела, обозначенного как 5Н23, 1С17, 1D19, 2L12, 3L3, 3N20, 4Р5, 5С23, 5F7 или 1G19, описанного в настоящей заявке, или его гуманизированного варианта. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения связывающий белок (например, антитело к бета-клото) дополнительно содержит участок остова или каркасный участок, включая FR1 VH, FR2 VH, FR3 VH, FR4 VH, FR1 VL, FR2 VL, FR3 VL и/или FR4 VL аминокислотной последовательности иммуноглобулина человека или ее варианта.

[00012] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело, моноклональное антитело, рекомбинантное антитело, антигенсвязывающий фрагмент или любую их комбинацию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфично связывается с полипептидом бета-клото (например, бета-клото, экспрессируемым на поверхности клетки, или растворимым бета-клото), фрагментом бета-клото или эпитопом бета-клото.

[00013] В настоящем изобретении также предложены связывающие белки, такие как антитела к бета-клото (i) которые конкурентно блокируют (например, в зависимости от дозы) связывание антитела к бета-клото согласно настоящему изобретению с полипептидом бета-клото (например, бета-клото, который экспрессируется на поверхности клетки, или растворимым бета-клото), фрагментом бета-клото или эпитопом бета-клото и/или (ii) которые связываются с эпитопом бета-клото, который связан с антителом к бета-клото согласно настоящему изобретению. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения связывающие белки, такие как антитело к бета-клото, конкурентно блокируют (например, в зависимости от дозы) связывание моноклонального антитела 5Н23 или 1G19, описанного в настоящей заявке, или его гуманизированного варианта с полипептидом бета-клото (например, бета-клото, который экспрессируется на поверхности клетки, или растворимым бета-клото), фрагментом бета-клото или эпитопом бета-клото. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения связывающие белки, такие как антитело к бета-клото, связываются с эпитопом бета-клото, который связывается (например, распознается) с моноклональным антителом 5Н23 или 1G19, описанным в настоящей заявке, или его гуманизированным вариантом.

[00014] В настоящем изобретении также предложены связывающие белки, включая антитела или их фрагменты, которые (i) связываются с эпитопом бета-клото человека и бета-клото яванских макак, который распознается антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 26; или (ii) конкурируют за связывание с бета-клото человека с антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 26. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены связывающие белки, включая антитела или их фрагменты, которые связываются с областью, включая эпитоп, бета-клото человека или бета-клото яванских макак. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения связывающие белки, включая антитела или их фрагменты, связываются с областью бета-клото человека или бета-клото яванских макак, включая, например, те, которые связываются с: (i) доменом KLB2 бета-клото человека, содержащим остатки аминокислот с 509 110 1044 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297; (ii) областью гликозилгидролазы 1 домена KLB2 бета-клото человека, содержащей остатки аминокислот с 517 110 967 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297; (iii) областью бета-клото человека, содержащей остатки аминокислот с 657 110 703 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297; или (iv) областью бета-клото яванских макак, содержащей остатки аминокислот с 657 110 703 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 299.

[00015] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены связывающие белки, включая антитела или их фрагменты, которые связываются со специфичным эпитопом бета-клото человека, включая, например, те, которые связываются с: (i) эпитопом бета-клото человека, содержащим 110 меньшей мере один из остатков аминокислот 657, 701 и/или 703 бета-клото человека (SEQ ID NO: 297); (ii) эпитопом бета-клото человека, содержащим 110 меньшей мере остаток аминокислоты 657 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297; (iii) эпитопом бета-клото человека, содержащим 110 меньшей мере остаток аминокислоты 701 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297; (iv) эпитопом бета-клото человека, содержащим 110 меньшей мере остаток аминокислоты 703 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297; (v) эпитопом бета-клото человека, содержащим 110 меньшей мере остатки аминокислот 657 и 701 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297; (vi) эпитопом бета-клото человека, содержащим 110 меньшей мере остатки аминокислот 657 и 703 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297; (vii) эпитопом бета-клото человека, содержащим 110 меньшей мере остатки аминокислот 701 и 703 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297; или (viii) эпитопом бета-клото человека, содержащим 110 меньшей мере остатки аминокислот 657, 701 и 703 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297. Указанные антитела, описанные выше, могут, согласно некоторым вариантам реализации, индуцировать передачу сигналов, которая аналогична таковой для FGF19 и/или FGF21, или активировать комплекс бета-клото/рецептор FGF в клетке, которая экспрессирует бета-клото человека и рецептор FGF. Помимо этого, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, антитело представляет собой моноклональное антитело, например, гуманизированное, человеческое или химерное антитело.

[00016] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения связывающие белки, такие как антитела к бета-клото согласно настоящему изобретению конъюгированы или рекомбинантно связаны с диагностическим агентом, детектируемым агентом или терапевтическим агентом. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения терапевтический агент представляет собой лекарственный препарат, включая один или более лекарственных препаратов, таких как бигуаниды и препараты сульфонилмочевины (например, метформин толбутамид, хлорпропамид, ацетогексамид, толазамид, глибенкламид, глибурид и глипизид), тиазолидиндионы (например, розиглитазон, пиоглитазон), аналоги GLP-1, агонисты PPARγ (например, пиоглитазон и розиглитазон), ингибиторы дипептидилпептидазы-4 (ДПП-4), (например, янувин (JANUVIN^®), онглиза (ONGLYZA^®)), составы бромокриптина и препараты, усиливающие выведение желчных кислот (например, колесевелам), а также инсулин (например, болюсный инсулин и аналоги базального инсулина), ингибиторы альфа-глюкозидазы (например, акарбоза, роглибоза), метформин (например, гидрохлорид метформина) с добавлением или без тиазолидиндиона (ТЗД), ингибиторы SGLT-2, препараты для подавления аппетита или снижения массы тела (например, меридиа (Meridia^®)/сибутрамин, ксеникал/ористат). Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения детектируемый агент представляет собой радиоактивный изотоп, фермент, флуоресцентное соединение, биолюминесцентное соединение или хемилюминесцентное соединение.

[00017] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены композиции, содержащие связывающий белок, такой как антитело к бета-клото, описанное в настоящей заявке. В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие связывающий белок, такой как антитело к бета-клото, описанное в настоящей заявке.

[00018] В настоящем изобретении также предложены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих тяжелую цепь иммуноглобулина, легкую цепь иммуноглобулина, область VH, область VL, CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и/или CDR3 VL связывающих белков (например, антител к бета-клото), которые связываются с полипептидом бета-клото, фрагментом полипептида бета-клото или эпитопом бета-клото. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты кодирует область VH, область VL, CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и/или CDR3 VL моноклонального антитела, обозначенного 5Н23, 1С17, 1D19, 2L12, 3L3, 3N20,4Р5, 5С23, 5F7 или 1G19, описанного в настоящей заявке, или его гуманизированного варианта. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно кодирует участок остова или каркасный участок, включая FR1 VH, FR2 VH, FR3 VH, FR4 VH, FR1 VL, FR2 VL, FR3 VL и/или FR4 VL аминокислотной последовательности иммуноглобулина человека или ее варианта. В настоящем изобретении также предложены векторы и клетки-хозяева, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих связывающий белок, такой как антитело к бета-клото, а также способы получения связывающего белка, такого как антитело к бета-клото, путем культивирования клеток-хозяев согласно настоящему изобретению в условиях, которые способствуют выработке связывающего белка, такого как антитело к бета-клото.

[00019] В настоящем изобретении также предложены способы лечения, предотвращения или облегчения заболевания, расстройства или состояния (например, одного или более симптомов), включающие введение терапевтически эффективного количества связывающего белка, такого как антитело к бета-клото согласно настоящему изобретению, субъекту, включая субъекта, нуждающегося в этом, обеспечивая тем самым лечение, предупреждение или облегчение заболевания, расстройства или состояния. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения заболевание, расстройство или состояние вызвано или иным образом связано с бета-клото, например, такое как те, которые связаны с передачей сигналов, аналогичной таковой для FGF19 и/или FGF21, у субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения заболевание поддается лечению путем снижения уровня глюкозы в крови, инсулина или липидов в сыворотке крови (например, сахарный диабет 2 типа, ожирение, дислипидемия, НАСГ, сердечно-сосудистые заболевания, метаболический синдром).

[00020] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения заболевание, расстройство или состояние связано с метаболизмом глюкозы или метаболизмом липидов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения заболевание, расстройство или состояние выбрано из группы гипергликемических состояний (например, видов сахарного диабета, таких как сахарный диабет 1 типа, сахарный диабет 2 типа, видов гестационного диабета, резистентности к инсулину, гиперинсулинемии, нарушения толерантности к глюкозе, метаболического синдрома или ожирения).

[00021] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способы лечения, предотвращения или улучшения включают способы улучшения метаболизма глюкозы и/или способы улучшения метаболизма липидов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способы лечения, предотвращения или улучшения приводят к снижению уровня глюкозы (например, снижению уровня глюкозы в крови), повышенной чувствительности к инсулину, сниженной резистентности к инсулину, сниженному уровню гликогена, улучшенной толерантности к глюкозе, улучшенному метаболизму глюкозы, улучшенному гомеостазу, улучшенной функции поджелудочной железы, сниженному уровню триглицеридов, сниженному уровню холестерина, сниженному уровню ЛПСП, сниженному уровню ЛПНП, сниженному уровню ЛПОНП, снижению артериального давления, снижению внутреннего утолщения кровеносных сосудов и/или снижению массы тела или прибавки массы тела.

[00022] В настоящем изобретении предложены способы лечения заболевания, расстройства или состояния, связанного с FGF19 человека и/или FGF21 человека, которое включает любое заболевание, расстройство или состояние, начало развития которого у субъекта (например, пациента) вызвано, 110 меньшей мере частично, индукцией передачи сигналов, которая аналогична таковой для FGF19 и/или FGF21, которая инициируется в условиях in vivo путем образования комплекса, содержащего FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c или FGFR4 и бета-клото и FGF19 или FGF21. Степень тяжести заболевания или состояния также может быть уменьшена путем индукции передачи сигналов, которая аналогична таковой для FGF19 и/или FGF21. Примеры заболеваний и состояний, которые можно лечить с помощью связывающих белков, таких как антитела к бета-клото, включают сахарный диабет 2 типа, ожирение, дислипидемию, НАСГ, сердечно-сосудистые заболевания и метаболический синдром.

[00023] Следовательно, связывающие белки, такие как антитела к бета-клото, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для лечения сахарного диабета 2 типа, ожирения, дислипидемии (например, гипертриглицеридемии), НАСГ, сердечнососудистых заболеваний и/или метаболического синдрома, а также любого заболевания, расстройства или состояния, при котором желательной является имитация или усиление действия FGF19 и/или FGF21 в условиях in vivo, или могут быть использованы в качестве профилактического лечения, применяемого, например, ежедневно, еженедельно, раз в две недели, раз в месяц, раз в два месяца, раз в два года и т.д., чтобы предотвратить или снизить частоту и/или степень тяжести симптомов (например, повышенного уровня глюкозы в плазме крови, повышенного уровня триглицеридов и холестерина в крови), включая, например, обеспечение улучшенного профиля факторов риска гликемии и/или сердечно-сосудистых заболеваний. В настоящем изобретении предложены способы улучшения метаболических параметров путем введения субъекту связывающего белка, включая антитело или его фрагмент, описанный в настоящей заявке, или фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке, включая, например, случаи, при которых улучшение включает уменьшение массы тела, индекса массы тела, окружности живота, толщины кожных складок, уровней глюкозы, инсулина и/или триглицеридов.

[00024] В настоящем изобретении также предложены способы индукции передачи сигналов, которая аналогична таковой для FGF19 и/или FGF21, в клетках, экспрессирующих на поверхности бета-клото и один или более рецепторов FGF, таких как FGFR1, FGFR2, FGFR3 или FGFR4, включающие приведение указанных клеток в контакт с эффективным количеством связывающего белка (например, антитела), который связывается с бета-клото, описанного в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка представляет собой адипоцит или гепатоцит. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения клетка представляет собой клетку, трансфецированную геном, кодирующим бета-клото, и необязательно геном, кодирующим рецептор FGF. Дополнительные способы согласно настоящему изобретению включают использование антитела к бета-клото, описанного в настоящей заявке, которое способно индуцировать передачу сигналов в клетке, аналогичную таковой для FGF19 и/или FGF21.

[00025] В настоящем изобретении также предложены способы модулирования передачи сигналов в клетке, аналогичной таковой для FGF19 и/или FGF21, у субъекта, включающие введение субъекту эффективного количества связывающего белка, такого как антитело к бета-клото, описанное в настоящей заявке, включая субъекта, нуждающегося в этом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модулирование включает FGF19-подобную активацию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модулирование включает FGF21-подобную активацию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модулирование включает увеличение метаболизма глюкозы (например, снижение уровня глюкозы, такого как уровень глюкозы в крови).

[00026] В настоящем изобретении также предложены способы детектирования бета-клото в образце, включающие приведение образца в контакт со связывающим белком, таким как антитело к бета-клото, описанным в настоящей заявке, который содержит детектируемый агент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения образец включает клетку, экспрессирующую бета-клото на своей поверхности.

[00027] В настоящем изобретении также предложены наборы, содержащие связывающий белок, такой как антитело к бета-клото, который связывается с полипептидом бета-клото, фрагментом бета-клото или эпитопом бета-клото, описанным в настоящей заявке.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[00028] На фигуре 1А-1В приведены результаты выравнивания последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи антител к бета-клото, обозначенных 5Н23, 1С17, 1D19, 2L12, 3L3, 3N20, 4Р5, 5С23, 5F7 и 1G19. Границы CDR указаны в соответствии с системой нумерации Kabat, AbM, Chothia, Contact и IMGT.

[00029] На фигуре 2А-1 и 2А-2 приведены результаты выравнивания последовательностей вариабельных областей тяжелых цепей антител к бета-клото, обеспечивающие консенсусные последовательности CDR. Верхняя группа включает антитела, обозначенные 5Н23, 1D19, 2L12, 3L3, 4Р5, 5С23 и 5F7. Расположенная ниже группа включает антитела, обозначенные 1С17 и 1G19. Нижняя группа включает только антитело, обозначенное 3N20. Вариабельные остатки обозначены как «X». Границы CDR указаны в соответствии с системой нумерации Kabat, AbM, Chothia, Contact и IMGT.

[00030] На фигуре 2В-1 и 2В-2 приведены результаты выравнивания последовательностей вариабельных областей легких цепей антител к бета-клото, обеспечивающие консенсусные последовательности CDR. Верхняя группа включает антитела, обозначенные 5Н23, 1D19, 2L12, 3L3, 4Р5, 5С23 и 5F7. Расположенная ниже группа включает антитела, обозначенные 1С17 и 1G19. Нижняя группа включает только антитело, обозначенное 3N20. Вариабельные остатки обозначены как «X». Границы CDR указаны в соответствии с системой нумерации Kabat, AbM, Chothia, Contact и IMGT.

[00031] На фигуре 3А-1 и 3А-2 приведены результаты выравнивания последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела к бета-клото, обозначенного 5Н23, и гуманизированных последовательностей (vH1-vH9). Остатки, которые выделены жирным шрифтом, указывают типичные остатки, которые были модифицированы относительно исходного антитела. Остатки, которые выделены жирным шрифтом и подчеркнуты, указывают остатки, которые подвергали обратной мутации, чтобы получить остаток из последовательности мыши.

[00032] На фигуре 3В приведены результаты выравнивания последовательности вариабельной области легкой цепи антитела к бета-клото, обозначенного 5Н23, и гуманизированных последовательностей (vL1-vL5). Остатки, которые выделены жирным шрифтом, указывают типичные остатки, которые были модифицированы. Остатки, которые выделены жирным шрифтом и подчеркнуты, указывают остатки, которые подвергали обратной мутации, чтобы получить остаток из последовательности мыши.

[00033] На фигуре 3С-1 и 3С-2 приведены результаты выравнивания последовательности вариабельной области легкой цепи антитела к бета-клото, обозначенного 5Н23, и гуманизированных последовательностей (v1-39a-v1-39p). Остатки, которые выделены жирным шрифтом, указывают типичные остатки, которые были модифицированы.

[00034] На фигуре 3D-1 и 3D-2 приведены результаты выравнивания последовательности вариабельной области легкой цепи антитела к бета-клото, обозначенного 5Н23, и гуманизированных последовательностей (v3-20a-v3-20j). Остатки, которые выделены жирным шрифтом, указывают типичные остатки, которые были модифицированы.

[00035] На фигуре 4А-4С приведены результаты выравнивания последовательностей бета-клото человека, бета-клото мыши и химерных полипептидов бета-клото. Химерный полипептид chMoHu обозначает KLB мыши (M1-F506)-KLB человека (S509-S1044). Химерный полипептид chHuMo обозначает KLB человека (M1-F508)-KLB мыши (Р507-S1043). Остатки, соответствующие остаткам из последовательности мыши, выделены жирным шрифтом и курсивом.

[00036] На фигуре 5A-5F приведены результаты выравнивания последовательностей полипептидов бета-клото из различных видов, описанных в настоящей заявке.

[00037] На фигуре 6 представлена трехмерная модель трех выявленных связывающих остатков (темные круги) в эквивалентных положениях на цитозольной бета-глюкозидазе человека. Структура показывает эквивалент остатков 521-963 бета-клото.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[00038] В настоящем изобретении предложены связывающие белки, такие как антитела, которые связываются с бета-клото, включая бета-клото человека и/или яванских макак. Уникальное свойство указанных связывающих белков, включая антитела, раскрытые в настоящей заявке, заключается в их агонистическом действии, включая способность имитировать влияние FGF19 и/или FGF21 в условиях in vivo и индуцировать передачу сигналов в клетке, аналогичную таковой для FGF19 и/или FGF21. Более существенно и конкретно, некоторые из связывающих белков, таких как антитела к бета-клото, раскрытые в настоящей заявке, (i) связываются с бета-клото человека и яванских макак, (ii) не конкурируют за связывание с FGF19 и/или FGF21, и (iii) индуцируют передачу сигналов в клетке, аналогичную таковой для FGF19 и/или FGF21, включая, например, в нескольких клеточных количественных исследованиях в условиях in vitro. Указанные количественные исследования могут включать (1) количественное исследование на основе ELK-гена-репортера люциферазы (см., например, пример 4); (2) клеточное количественное исследование фосфорилирования ERK, опосредованного рекомбинантным рецептором FGF19 (см., например, пример 4); и (3) количественное исследование адипоцитов человека для определения фосфорилирования ERK (см., например, пример 5). Следовательно, как ожидается, связывающие белки, такие как антитела к бета-клото, описанные в настоящей заявке, проявят активность в условиях in vivo, которая соответствует природной биологической функции FGF19 и/или FGF21. Это свойство делает раскрытые связывающие белки, включая антитела к бета-клото, перспективными терапевтическими средствами для лечения метаболических заболеваний (например, сахарного диабета 2 типа, ожирения, дислипидемии, НАСГ, сердечнососудистых заболеваний, метаболического синдрома) и в целом любого заболевания, расстройства или состояния, при котором желательной является имитация или усиление действия FGF19 и/или FGF21 в условиях in vivo.

[00039] Общим признаком связывающих белков, таких как антитела, которые связываются с бета-клото, предложенных в настоящем изобретении, является их способность конкурировать друг с другом за связывание с бета-клото (см., например, пример 3, в котором описаны антитела, принадлежащие эпитопной группе 5Н23). Упомянутое конкурентное ингибирование указывает на то, что каждое антитело связывается с одной и той же областью бета-клото (например, одним и тем же эпитопом), подтверждая тем самым аналогичное действие. Антитела к бета-клото согласно настоящему изобретению включают гуманизированные антитела к бета-клото, включая гуманизированные антитела к бета-клото, полученные или основанные на 5Н23, 1С17, 1D19, 2L12, 3L3, 3N20, 4Р5, 5С23, 5F7 и/или 1G19, содержащие последовательность CDR, приведенную в таблицах 1-10 или фигурах 1-3, указанные антитела к бета-клото, включая гуманизированные антитела к бета-клото, связываются со специфичным доменом бета-клото человека (например, KL2 (остатки S509-S1044); см. пример 9). Помимо этого, связывание может быть в значительной степени обусловлено конкретными остатками аминокислот в пределах области KL2 (например, Н657, Y701 и R703), которые содержат эпитоп, распознаваемый антителами к бета-клото, описанными в настоящей заявке. В совокупности, результаты, описанные в настоящей заявке, свидетельствуют о том, что действие, наблюдаемое для антитела к бета-клото, которое получено или основано на 5Н23, или антитела, принадлежащего к эпитопной группе 5Н23, включая антитело, содержащее одну или более CDR, приведенных в таблицах 1-10 или на фигурах 1-3, могут быть экстраполированы на другие антитела к бета-клото, описанные в настоящей заявке, имеющие аналогичную или сходную эпитопную специфичность (например, аналогичные или сходные CDR). Например, виды активности антител в условиях in vitro, как показано в примерах 4-7 и 9, а также действие в условиях in vivo, описанное в примере 8 для типичного гуманизированного антитело к бета-клото, являются типичными для видов активности и действия антител к бета-клото, описанных в настоящей заявке.

[00040] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения связывающие белки, такие как антитела к бета-клото, могут содержать вариабельные области иммуноглобулинов, которые содержат одну или более гипервариабельных областей (CDR), описанных в таблицах 1-10. CDR, входящие в состав указанных связывающих белков (например, антител к бета-клото), могут быть соединены с одним или более участками остова или каркасными участками, которые ориентируют CDR так, что обеспечивают достижение надлежащих антигенсвязывающих свойств области(ей) CDR. Указанные связывающие белки, включая антитела к бета-клото, описанные в настоящей заявке, могут облегчить или усилить взаимодействие между FGFR1c и бета-клото и могут индуцировать передачу сигналов в клетке, аналогичную таковой для FGF19 и/или FGF21. Общие методики

[00041] Методики и процедуры, описанные или упомянутые в настоящей заявке, включают те, которые в целом хорошо известны и/или обычно применяются с использованием обычной методологии специалистами в данной области техники, такие как, например, широко используемые методики, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, Z. An, ed, Wiley, Hoboken N.J. (2009); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols, M. Albitar, ed., Humana Press, Totawa, N.J. (2010); и Antibody Engineering, 2nd Ed., Vols 1 и 2, Kontermann and Dubel, eds., Springer-Verlag, Heidelberg, 2010.

ТЕРМИНОЛОГИЯ

[00042] Если не указано иное, в настоящей заявке все технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области техники. Для понимания данного описания будет применимо нижеследующее описание терминов и, в зависимости от ситуации, термины, используемые в единственном числе, также будут включать множественное число и наоборот. Все патенты, заявки на патенты, опубликованные заявки на патенты и другие публикации полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки. В том случае, если какое-либо описание приведенных терминов противоречит любому документу, включенному в настоящую заявку посредством ссылки, описание термина, приведенное ниже, должно иметь преимущественную силу.

[00043] Термин «бета-клото» или «полипептид бета-клото» и аналогичные термины относятся к полипептиду (термины «полипептид» и «белок» используются в настоящем описании взаимозаменяемо) или любой нативной форме бета-клото из любого позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, человек, яванские макаки (яванские макаки)), собаки и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное, и, в некоторых вариантах реализации, включают родственные полипептиды бета-клото, в том числе их SNP-варианты. Бета-клото содержит два домена, бета-клото 1 (KLB1) и бета-клото 2 (KLB2). Каждый домен бета-клото содержит область гликозилгидролазы 1. Например, домен KLB1 бета-клото человека содержит остатки аминокислот 1-508, при этом область гликозилгидролазы 1 содержит остатки аминокислот 77-508, и домен KLB2 бета-клото человека содержит остатки аминокислот 509-1044, при этом область гликозилгидролазы 1 содержит остатки аминокислот 517-967. Аминокислотная последовательность бета-клото человека приведена ниже:

(SEQ ID NO: 297)

[00044] Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая бета-клото человека, приведена ниже:

(SEQ ID NO: 298)

[00045] Аминокислотная последовательность бета-клото яванских макак (яванские макаки), научное название Macacafascicularis, приведена ниже:

(SEQ ID NO: 299)

[00046] Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая бета-клото яванских макак, приведена ниже:

(SEQ ID NO: 300)

[00047] Аминокислотная последовательность гомолога бета-клото мыши, научное название Mus musculus, приведена ниже:

(SEQ ID NO: 301)

[00048] Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая бета-клото мыши, приведена ниже:

(SEQ ID NO: 302)

[00049] Аминокислотная последовательность бета-клото крысы, научное название Rattus norvegicus, приведена ниже:

(SEQ ID NO: 356)

[00050] Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая бета-клото крысы, приведена ниже:

(SEQ ID NO: 357)

[00051] Аминокислотная последовательность бета-клото хомяка, научное название Cricetulus griseus, приведена ниже:

(SEQ ID NO: 408)

[00052] Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая бета-клото хомяка, приведена ниже:

(SEQ ID NO: 409)

[00053] Аминокислотная последовательность бета-клото кролика, научное название Oryctolagus cuniculus, приведена ниже:

(SEQ ID N0:410)

[00054] Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая бета-клото кролика, приведена ниже:

(SEQ ID NO: 411)

[00055] Аминокислотная последовательность бета-клото собаки, научное название Canis lupus familiaris, приведена ниже:

(SEQ ID NO: 412)

[00056] Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая бета-клото собаки, приведена ниже:

(SEQ ID NO: 413).

[00057] Аминокислотная последовательность химерного белка бета-клото человека/мыши (KLB человека (M1-F508)-KLB мыши (P507-S1043)) приведена ниже:

(SEQ ID NO: 374).

[00058] Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный белок бета-клото человека/мыши, приведена ниже:

(SEQ ID NO: 375)

[00059] Аминокислотная последовательность химерного белка бета-клото мыши/человека (KLB мыши (M1-F506)-KLB человека (S509-S1044)) приведена ниже:

(SEQ ID NO: 376)

[00060] Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный белок бета-клото мыши/человека, приведена ниже:

(SEQ ID NO: 377)

[00061] Родственные полипептиды бета-клото включают аллельные варианты (например, SNP-варианты); варианты сплайсинга; фрагменты; производные; варианты, содержащие замены, делеции и вставки; гибридные полипептиды; и межвидовые гомологи, предпочтительно те, которые сохраняют активность бета-клото и/или достаточны для того чтобы вызвать иммунный ответ на бета-клото. Специалист в данной области техники поймет, что антитело к бета-клото согласно настоящему изобретению может связываться с полипептидом бета-клото, фрагментом полипептида бета-клото, антигеном бета-клото и/или эпитопом бета-клото. Эпитоп может быть частью более крупного антигена бета-клото, который может быть частью более крупного фрагмента полипептида бета-клото, который, в свою очередь, может быть частью более крупного полипептида бета-клото. Бета-клото может существовать в нативной или денатурированной форме. Полипептиды бета-клото, описанные в настоящей заявке, могут быть выделены из различных источников, таких как различные типы тканей человека, или из другого источника, или получены с помощью рекомбинантных или синтетических методов. Полипептид бета-клото может содержать полипептид, имеющий аналогичную аминокислотную последовательность, что и соответствующий полипептид бета-клото, полученный из природного источника. Полипептиды бета-клото включают усеченные или секретеру емые формы полипептида бета-клото (например, последовательность внеклеточного домена), варианты (например, формы, полученные в результате альтернативного сплайсинга) и аллельные варианты полипептида. Ортологи полипептида бета-клото также хорошо известны в данной области техники.

[00062] Термин «бета-клото» включает «полноразмерный» нерасщепленный бета-клото, а также любую форму бета-клото, которая получена в результате расщепления в клетке. Термин также включает природные варианты или мутации бета-клото (например, варианты альтернативного сплайсинга, аллельные варианты, SNP-варианты и изоформы). Полипептиды бета-клото, описанные в настоящей заявке, могут быть выделены из различных источников, таких как различные типы тканей человека, или из другого источника, или получены с помощью рекомбинантных или синтетических методов.

[00063] Термины «передача сигналов, аналогичная таковой для FGF19» и «индуцирует передачу сигналов, аналогичную таковой для FGF19», при использовании в отношении связывающего белка, такого как антитело согласно настоящему изобретению, которое связывается с бета-клото, означают, что связывающий белок (например, антитело) имитирует или модулирует биологическое действие в условиях in vivo, индуцированное связыванием (i) бета-клото; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c и FGFR4; или (iii) комплекса, содержащего бета-клото и один из FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c и FGFR4, и индуцирует биологический ответ, который в ином случае являлся бы результатом связывания FGF19 с (i) бета-клото; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c или FGFR4; или (iii) комплексом, содержащим бета-клото и один из FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c и FGFR4, в условиях in vivo. При оценке связывания и специфичности антитела к бета-клото, например, антитела или его фрагмента, который связывается с бета-клото (например, бета-клото человека), антитело или его фрагмент, как полагают, индуцирует биологический ответ, если ответ равен или более 5% и предпочтительно равен или более 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% активности стандарта FGF19 дикого типа, содержащего зрелую форму последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 304 (например, зрелую форму FGF19 человека) и обладает следующими свойствами: проявляет уровень эффективности, который равен или более 5% от эффективности стандарта FGF19, с величиной ЭК50, которая равна или менее 100 нМ, например, 90 нМ, 80 нМ, 70 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ или 10 нМ в (1) клеточном количественном исследовании с использованием гена-репортера люциферазы для определения фосфорилирования ERK, опосредованного рекомбинантным рецептором FGF19 (см., например, пример 4); (2) клеточном количественном исследовании фосфорилирования ERK, опосредованного рекомбинантным рецептором FGF19 (см., например, пример 4); или (3) количественном исследовании фосфорилирования ERK в адипоцитах человека (см., например, пример 5).

[00064] Термин «FGF19R» может относиться к мультимерному рецепторному комплексу, который, как известно или предполагают, образует FGF19 в условиях in vivo. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения FGF19R содержит (i) FGFR, например, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c или FGFR4 и (ii) бета-клото.

[00065] Термины «передача сигналов, аналогичная таковой для FGF21» и «индуцирует передачу сигналов, аналогичную таковой для FGF21», при использовании в отношении связывающего белка, такого как антитело согласно настоящему изобретению, которое связывается с бета-клото, означают, что связывающий белок (например, антитело) имитирует или модулирует биологическое действие в условиях in vivo, индуцированное связыванием с (i) бета-клото; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c и FGFR4; или (iii) комплексом, содержащим бета-клото и один из FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c и FGFR4, и вызывает биологический ответ, который в ином случае являлся бы результатом связывания FGF21 с (i) бета-клото; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c или FGFR4; или (iii) комплексом, содержащим бета-клото и один из FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c и FGFR4, в условиях in vivo. При оценке связывания и специфичности антитела к бета-клото, например, антитела или его фрагмента, который связывается с бета-клото (например, бета-клото человека), антитело или его фрагмент, как полагают, индуцирует биологический ответ, если ответ равен или более 5% и предпочтительно равен или более 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% активности стандарта FGF21 дикого типа, содержащего зрелую форму последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 306 или 429 (например, зрелую форму последовательности FGF21 человека), и обладает следующими свойствами: проявляет уровень эффективности, который равен или более 5% от эффективности стандарта FGF21, с величиной ЭК₅₀, которая равна или менее 100 нМ, например, 90 нМ, 80 нМ, 70 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ или 10 нМ в (1) клеточном количественном исследовании с использованием гена-репортера люциферазы для определения фосфорилирования ERK, опосредованного рекомбинантным рецептором FGF21 (см., например, пример 4); (2) клеточном количественном исследовании фосфорилирования ERK, опосредованного рекомбинантным рецептором FGF21 (см., например, пример 4); или (3) количественном исследовании фосфорилирования ERK в адипоцитах человека (см., например, пример 5).

[00066] Термин «FGF21R» может относиться к мультимерному рецепторному комплексу, который, как известно или предполагают, образует FGF21 в условиях in vivo. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения FGF21R содержит (i) FGFR, например, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c или FGFR4, и (ii) бета-клото. [00067] Термин «связывающий белок» относится к белку, содержащему часть (например, одну или более связывающих областей, таких как CDR), которая связывается с бета-клото, включая бета-клото человека и/или яванских макак, и необязательно каркасный остов или участок (например, один или более каркасных остовов или участков), который позволяет связывающей части принять конформацию, способствующую связыванию связывающего белка с полипептидом, фрагментом или эпитопом бета-клото. Примеры указанных связывающих белков включают антитела, такие как антитело человека, гуманизированное антитело; химерное антитело; рекомбинантное антитело; одноцепочечное антитело; диатело; триатело; тетратело; фрагмент Fab; фрагмент F(ab')₂; антитело IgD; антитело IgE; антитело IgM; антитело IgG1; антитело IgG2; антитело IgG3; или антитело IgG4 и их фрагменты. Связывающий белок может содержать, например, альтернативный белковый остов или искусственный остов с привитыми CDR или производными CDR. Такие остовы включают, но не ограничиваются ими, остовы, полученные из антител, содержащие мутации, введенные, например, для стабилизации трехмерной структуры связывающего белка, а также полностью синтетические остовы, включающие, например, биосовместимый полимер. См., например, Korndorfer etal, 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 53(1): 121-129 (2003); Roque et al., Biotechnol. Prog. 20:639-654 (2004). Помимо этого, могут быть использованы пептидные миметики антител («РАМ»), а также остовы на основе миметиков антител, в которых в качестве остова используются компоненты фибронектина. Применительно к настоящему описанию связывающий белок, как полагают, специфично связываться или селективно связывается с бета-клото, например, если константа диссоциации (K_D)≤10^-8 М. Связывающий белок (например, антитело) может специфично связываться с бета-клото с высокой аффинностью, когда K_D≤10^-9 М или K_D≤10^-10 М. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения связывающие белки (например, антитела) могут связываться с бета-клото или комплексом, содержащим FGFR1c и бета-клото, в том числе с величиной K_D, которая находится в диапазоне от приблизительно 10^-7 М до приблизительно 10^-12 М, тогда как в других вариантах реализации настоящего изобретения связывающие белки (например, антитела) могут связываться с величиной K_D составляющей 1-2×10^-9 М.

[00068] В настоящей заявке термины «антитело» и «иммуноглобулин» или «Ig» используются взаимозаменяемо и в самом широком смысле, и конкретно включают, например, индивидуальные моноклональные антитела к бета-клото (включая антитела-агонисты, антитела-антагонисты, нейтрализующие антитела, полноразмерные или интактные моноклональные антитела), композиции антител к бета-клото с полиэпитопной или моноэпитопной специфичностью, поликлональные или моновалентные антитела, поливалентные антитела, полиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела до тех пор, пока они проявляют желаемую биологическую активность), образованные 110 меньшей мере из двух интактных антител, одноцепочечные антитела к бета-клото и фрагменты антител к бета-клото, описанные ниже. Антитело может быть человеческим, гуманизированным, химерным и/или с созревшей аффинностью, а также может представлять собой антитело из других видов, например, мыши, кролика и т.д. Термин «антитело» включает полипептидный продукт В-клеток, принадлежащий к полипептидам из определенного класса иммуноглобулинов, который способен связываться с конкретным молекулярным антигеном и состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара содержит одну тяжелую цепь (около 50-70 кДа) и одну легкую цепь (около 25 кДа), и каждая амино-концевая часть каждой цепи содержит вариабельную область, содержащую от приблизительно 100 до приблизительно 130 или более аминокислот в длину, и каждая карбокси-концевая часть каждой цепи содержит константную область (см. Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, Second Ed., Oxford University Press.; Kuby (1997) Immunology, Third Ed., W.H. Freeman and Company, New York). Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения конкретный молекулярный антиген может быть связан с антителом согласно настоящему изобретению, включая полипептид бета-клото, фрагмент бета-клото или эпитоп бета-клото. Антитела также включают, но не ограничиваются ими, синтетические антитела, моноклональные антитела, антитела, полученные с помощью рекомбинантных способов, полиспецифичные антитела (включая биспецифичные антитела), антитела человека, гуманизированные антитела, антитела, содержащие части верблюжьих антител, химерные антитела, интратела, антиидиотипические (анти-Id) антитела и функциональные фрагменты (например, антигенсвязывающие фрагменты, такие как фрагменты, связывающие бета-клото) любого из вышеперечисленных, что означает часть полипептида тяжелой цепи или легкой цепи антитела, которая сохраняет некоторые или все виды связывающей активности антитела, из которого был получен фрагмент. Неограничивающие примеры функциональных фрагментов (например, антигенсвязывающих фрагментов, таких как фрагменты, связывающие бета-клото) включают одноцепочечные Fv (scFv) (например, включая моноспецифичные, биспецифичные и т.д.), фрагменты Fab, фрагменты F(ab'), фрагменты F(ab)₂, фрагменты F(ab')₂, соединенные дисульфидными связями Fv (sdFv), фрагменты Fd, фрагменты Fv, диатела, триатела, тетратела и минитела. В частности, антитела согласно настоящему изобретению включают молекулы иммуноглобулинов и иммунологически активные части молекул иммуноглобулинов, например, антигенсвязывающие домены или молекулы, которые содержат антигенсвязывающий сайт, который связывается с антигеном бета-клото (например, одну или более гипервариабельных областей (CDR), антитела к бета-клото). Описание указанных фрагментов антител можно найти, например, в Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Myers (ed.), Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, New York: VCH Publisher, Inc.; Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol, 178:497-515 (1989) и в Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990). Антитела согласно настоящему изобретению могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), любого класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или любого подкласса (например, IgG2a и IgG2b) молекулы иммуноглобулина. Антитела к бета-клото могут представлять собой антитела-агонисты или антитела-антагонисты. В настоящем изобретении предложены антитела-агонисты к бета-клото, включая антитела, которые индуцируют передачу сигналов, аналогичную таковой для FGF21 или FGF21. Предпочтительные антитела-агонисты к бета-клото не конкурируют за связывание FGF19 и/или FGF21 с рецептором FGF, включая, например, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c или FGFR4c.

[00069] Термин «факторы роста фибробластов» относится к семейству факторов роста, включающему двадцать два члена семейства FGF человека. Подсемейство факторов роста фибробластов FGF19 состоит из FGF21, FGF23 и FGF19 человека и FGF15 мыши. Действие членов семейства FGF является результатом их гепарин-зависимого связывания с одним или более членами семейства рецепторных тирозинкиназ FGF (FGFR), которое включает четыре члена, каждый из которых содержит тирозинкиназный домен, FGFR1, FGFR2, FGFR3 и FGFR4, а также два варианта сплайсинга каждого из FGFR1, FGFR2 и FGFR3. Указанные варианты сплайсинга, который происходит в экзоне 3 FGFR1, FGFR2 и FGFR3, обозначаются как варианты «b» и «с» (например, FGFR1b, FGFR2b, FGFR3c, FGFR1c, FGFR2c и FGFR3c, которые также известны как FGFR1(III)b, FGFR2(III)b, FGFR3(III)c, FGFR1(III)c, FGFR2(III)c и FGFR3(III)c, соответственно). Например, FGF19 нацелено воздействует и оказывает влияние на адипоциты и гепатоциты. Мыши, получавшие рекомбинантный FGF19 человека (rhFGF19), несмотря на рацион с высоким содержанием жиров, имеют повышенный уровень метаболизма, повышенное окисление липидов, более низкий дыхательный коэффициент и потерю массы тела. Более того, упомянутые мыши имели более низкие сывороточные уровни лептина, инсулина, холестерина и триглицеридов, а также нормальный уровень глюкозы в крови, несмотря на рацион с высоким содержанием жиров, и при этом не имели снижения аппетита. Помимо этого, мыши с ожирением, которые имели недостаток лептина, но несли трансген FGF19, имели потерю массы тела, сниженные уровни холестерина и триглицеридов, также у этих мышей не развивался диабет. Также у диабетических мышей с ожирением, которые испытывают недостаток лептина, при введении rhFGF19 наблюдали обращение метаболических характеристик в виде потери массы тела и снижения уровня глюкозы в крови. Например, FGF21 экспрессируется главным образом в печени и оказывает метаболическое действие, аналогичное таковому FGF19, например, повышенный метаболизм за счет влияния на жировую ткань, потерю массы тела, сниженный уровень глюкозы в крови, а также устойчивость к ожирению и диабету. Мыши, трансгенные 110 гену FGF21, также были устойчивы к ожирению, вызванному рационом питания, и, в моделях диабета у грызунов, введение FGF21 снижало уровень глюкозы в крови и уровни триглицеридов. Метаболическое действие FGF19 и FGF21 осуществляется посредством их связывания с рецепторами FGF, включая рецепторы FGFR1c, FGFR2c и FGFR3c, и требовало присутствия бета-клото для связывания. Связывание FGF19 и FGF21 с FGFR1c и FGFR2c играет значимую роль. Также было показано, что влияние FGF19 на метаболизм отличается от такового для FGF21, включая регулирование выработки желчи печенью, за счет его действия, специфичного в отношении печени, отрицательное регулирование выработки желчи в ответ на постпрандиальную выработку желчи и печеночные митогенные эффекты, которые не наблюдаются в отношении FGF21. Например, у мышей, трансгенных 110 гену FGF19, развивалась аденокарцинома печени вследствие увеличения пролиферации и дисплазии гепатоцитов, и у мышей, получавших rhFGF19, наблюдали пролиферацию гепатоцитов. Перечисленные дополнительные виды активности FGF19, по-видимому, опосредованы его связыванием с FGFR4. FGF19 может связываться с FGFR4 бета-клото-зависимым и бета-клото-независимым способом. Несмотря на то, что было показано, что FGF21 связывается с FGFR4 бета-клото-зависимым образом, эффективная передача сигналов в результате связывания FGF21 с FGFR4 ранее не наблюдалась.

[00070] Связывающие белки, такие как антитела к бета-клото, описанные в настоящей заявке, могут индуцировать передачу сигналов в клетке, аналогичную таковой для FGF19, как описано в настоящей заявке. В условиях in vivo зрелая форма FGF19 является активной формой молекулы. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерный FGF19, приведена ниже; нуклеотиды, кодирующие сигнальную последовательность подчеркнуты.

(SEQ ID NO: 303)

[00071] Аминокислотная последовательность полноразмерного FGF19 приведена ниже; аминокислоты, составляющие сигнальную последовательность, подчеркнуты:

(SEQ ID NO: 304)

[00072] Связывающие белки, такие как антитела к бета-клото, описанные в настоящей заявке, могут индуцировать передачу сигналов в клетке, аналогичную таковой для FGF21, как описано в настоящей заявке. В условиях in vivo зрелая форма FGF21 является активной формой молекулы. В настоящем изобретении предложена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полноразмерный FGF21; нуклеотиды, кодирующие сигнальную последовательность, подчеркнуты:

(SEQ ID NO: 305).

[00073] Аминокислотная последовательность полноразмерного FGF21 приведена ниже; аминокислоты, составляющие сигнальную последовательность, подчеркнуты:

(SEQ ID NO: 306).

[00074] В настоящем изобретении также предложена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полноразмерный FGF21; нуклеотиды, кодирующие сигнальную последовательность, подчеркнуты:

(SEQ ID NO: 428).

[00075] В настоящем изобретении также предложена аминокислотная последовательность, кодирующая полноразмерный FGF21; аминокислоты, кодирующие сигнальную последовательность, подчеркнуты:

(SEQ ID NO: 429)

[00076] Связывающие белки, такие как антитела к бета-клото, описанные в настоящей заявке, связываются с бета-клото 110 отдельности или в комплексе с рецептором FGF, таким как FGFR1c. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая FGFR1c человека (номер доступа в GenBank NM 023110, также обозначенного FGFRαIIIc), приведена ниже:

(SEQ ID NO: 307).

[00077] Аминокислотная последовательность FGFR1c человека (номер доступа в GenBank NP 075598) (также обозначенного FGFRαIIIC) приведена ниже:

(SEQ ID NO: 308).

[00078] Связывающие белки, такие как антитела к бета-клото, описанные в настоящей заявке, могут связываться с бета-клото в комплексе с внеклеточной частью рецептора FGF, такого как FGFR1c. Примером внеклеточной области FGFR1c является:

(SEQ ID NO: 309).

[00079] Примером внеклеточной области FGFR1c (αIIIc) является:

(SEQ ID NO: 427).

[00080] Примером внеклеточной области FGFR1c (βIIIc) является:

(SEQ ID NO: 426).

[00081] В настоящей заявке раскрыто, что белки FGFR1c также могут содержать фрагменты. В настоящей заявке термины используются как взаимозаменяемые для обозначения рецептора, в частности, и если не указано иное, рецептора человека, который при связывании с бета-клото и FGF21 индуцирует сигнальную активность, аналогичную таковой для FGF21.

[00082] Термин FGFR 1с также включает посттрансляционные модификации аминокислотной последовательности FGFR1c, например, возможные N-связанные сайты гликозилирования. Следовательно, антигенсвязывающие белки могут связываться или могут быть получены из белков, гликозилированных в одном или более из положений.

[00083] Связывающие белки, такие как антитела к бета-клото, описанные в настоящей заявке, связываются с бета-клото 110 отдельности или в комплексе с рецептором FGF, таким как FGFR2c. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая FGFR2c человека, приведена ниже:

(SEQ ID NO: 310)

[00084] Аминокислотная последовательность FGFR2c человека приведена ниже; аминокислоты, составляющие сигнальную последовательность, подчеркнуты:

(SEQ ID NO: 311)

[00085] Связывающие белки, такие как антитела к бета-клото, описанные в настоящей заявке, связываются с бета-клото 110 отдельности или в комплексе с рецептором FGF, таким как FGFR3c. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая FGFR3c человека (номер доступа в GenBank NP 000133), приведена ниже:

(SEQ ID NO: 312).

[00086] Аминокислотные последовательности FGFR3c человека приведены ниже; аминокислоты, которые составляют сигнальную последовательность, подчеркнуты:

(SEQ ID NO: 313)

[00087] Связывающие белки, такие как антитела к бета-клото, описанные в настоящей заявке, связываются с бета-клото 110 отдельности или в комплексе с рецептором FGF, таким как FGFR4. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая FGFR4 человека, приведена ниже:

(SEQ ID NO: 314)

[00088] Аминокислотная последовательность FGFR4 человека (номер доступа в GenBank NP 002002.3) приведена ниже; аминокислоты, которые составляют сигнальную последовательность, подчеркнуты:

(SEQ ID NO: 315)

[00089] «Антиген» представляет собой заранее определенный антиген, с которым может селективно связываться антитело. Антиген-мишень может представлять собой полипептид, углевод, нуклеиновую кислоту, липид, гаптен или другие природные или синтетические соединения. Предпочтительно антиген-мишень представляет собой полипептид.

[00090] Термин «антигенсвязывающий фрагмент», «антигенсвязывающий домен», «антигенсвязывающий участок» и аналогичные термины относятся к той части антитела, которая содержит остатки аминокислот, которые взаимодействуют с антигеном и придают связывающему агенту специфичность и аффинность в отношении антигена (например, гипервариабельные области (CDR)).

[00091] Термины «связывается» или «связывание» относятся к взаимодействию между молекулами, включая, например, для образования комплекса. Взаимодействия могут представлять собой, например, нековалентные взаимодействия, включая водородные связи, ионные связи, гидрофобные взаимодействия и/или ван-дер-ваальсовы взаимодействия. Комплекс также может включать связывание двух или более молекул, удерживаемых вместе с помощью ковалентных или нековалентных связей, взаимодействий или сил. Сила суммарных нековалентных взаимодействий между одним антигенсвязывающим сайтом на антителе и одним эпитопом молекулы-мишени, такой как бета-клото, представляет собой аффинность антитела или его функционального фрагмента в отношении данного эпитопа. Отношение скорости ассоциации (k¹) к скорости диссоциации (k^-1) антитела в отношении одновалентного антигена (k¹/k^-1) представляет собой константу ассоциации К, которая является мерой аффинности. Величина К варьируется для различных комплексов антитела и антигена и зависит от k¹ и k^-1. Константа ассоциации К для антитела согласно настоящему изобретению может быть определена любым способом, обеспеченным в настоящей заявке, или любым другим способом, хорошо известным специалистам в данной области техники. Аффинность в одном сайте связывания не всегда отражает истинную силу взаимодействия между антителом и антигеном. В тех случаях, когда сложные антигены, содержащие несколько повторяющихся антигенных детерминант, такие как поливалентный бета-клото, вступают в контакт с антителами, содержащими несколько сайтов связывания, взаимодействие антитела с антигеном в одном сайте увеличит вероятность реакции во втором сайте. Сила таких множественных взаимодействий между поливалентным антителом и антигеном называется авидностью. Авидность антитела может быть лучшим показателем его способности связываться, чем аффинность его отдельных сайтов связывания. Например, высокая авидность может компенсировать низкую аффинность, как иногда обнаруживается для пентамерных антител IgM, которые могут иметь более низкую аффинность, чем IgG, однако высокая авидность IgM, обусловленная его поливалентностью, позволяет этим антителам эффективно связываться с антигеном.

[00092] В настоящей заявке термины «антитела, которые специфично связываются с бета-клото», «антитела, которые специфично связываются с эпитопом бета-клото» и аналогичные термины также используются взаимозаменяемо и относятся к антителам, которые специфично связываются с полипептидом бета-клото, таким как антиген бета-клото или его фрагмент, или эпитоп бета-клото (например, бета-клото человека, таким как полипептид, антиген или эпитоп бета-клото человека). Антитело, которое специфично связывается с бета-клото, (например, бета-клото человека) может связываться с внеклеточным доменом или пептидом, полученным из внеклеточного домена бета-клото. Антитело, которое специфично связывается с антигеном бета-клото (например, бета-клото человека), может обладать перекрестной реактивностью с соответствующими антигенами (например, бета-клото яванских макак). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело, которое специфично связывается с антигеном бета-клото, не вступает в перекрестную реакцию с другими антигенами. Антитело, которое специфично связывается с антигеном бета-клото, может быть выявлено, например, с помощью иммуноферментного исследования, системы Biacore или других способов, известных специалистам в данной области техники. Антитело специфично связывается с антигеном бета-клото в том случае, когда оно связывается с антигеном бета-клото с более высокой аффинностью, чем с любым антигеном с перекрестной реактивностью, согласно результатам определения с использованием экспериментальных методов, таких как радиоиммунологические исследования (РИА) и твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Как правило, сигнал при специфичной или селективной реакции будет 110 меньшей мере в два раза выше фонового сигнала или шума и может быть более чем в 10 раз выше фонового сигнала. См., например, Paul, ed., 1989, Fundamental Irnmunology Second Edition, Raven Press, New York, стр. 332-336, где приведено обсуждение специфичности антител. Антитело «которое связывается с» антигеном, представляющим интерес (например, антигеном-мишенью, таким как бета-клото), представляет собой то, которое связывается с антигеном с достаточной аффинностью так, что антитело можно применять в качестве терапевтического агента для нацеленного воздействия на клетку или ткань, экспрессирующую антиген, и которое не вступает в значимые перекрестные реакции с другими белками. Согласно указанным вариантам реализации степень связывания антитела с «нецелевым» белком будет меньше, чем приблизительно 10% от величины степени связывания антитела с его специфичным белком-мишенью, например, согласно результатам определения с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) или радиоиммунопреципитации (РИА). Применительно к связыванию антитела с молекулой-мишенью, термин «специфичное связывание» или «специфично связывается с» или «специфичен в отношении» конкретного полипептида или эпитопа на конкретном полипептиде-мишени означает связывание, которое измеримо отличается от неспецифичного взаимодействия. Специфичное связывание может быть измерено, например, путем определения связывания молекулы 110 сравнению со связыванием контрольной молекулы, которая обычно представляет собой молекулу с аналогичной структурой, не обладающую связывающей активностью. Например, специфичное связывание может быть определено с помощью конкуренции с контрольной молекулой, которая сходна с молекулой-мишенью, например, с избытком немеченой молекулы-мишени. В этом случае специфичное связывание имеет место, если связывание меченой мишени с зондом конкурентно ингибируется избытком немеченой мишени. В настоящей заявке термин «специфичное связывание» или «специфично связывается с» или «специфичен в отношении» конкретного полипептида или эпитопа на конкретном полипептиде-мишени применим, например, к молекуле, имеющей Kd в отношении мишени 110 меньшей мере приблизительно 10^-4 М, в другом варианте, 110 меньшей мере приблизительно 10^-5 М, в другом варианте, 110 меньшей мере приблизительно 10^-6 М, в другом варианте, 110 меньшей мере приблизительно 10^-7 М, в другом варианте, 110 меньшей мере приблизительно 10^-8 М, в другом варианте, 110 меньшей мере приблизительно 10^-9 М, в другом варианте, 110 меньшей мере, приблизительно 10^-10 М, в другом варианте, 110 меньшей мере приблизительно 10^-11 М, в другом варианте, 110 меньшей мере приблизительно 10^-12 М или более. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения термин «специфичное связывание» относится к связыванию, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде, без существенного связывания с любым другим полипептидом или эпитопом полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело, которое связывается с бета-клото, имеет константу диссоциации (Kd), которая меньше или равна 10 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ или 0,1 нМ. Чем меньше величина K_D, тем выше аффинность антитела к бета-клото. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело к бета-клото связывается с эпитопом бета-клото, который является консервативным для бета-клото из различных видов (например, между бета-клото человека и яванских макак).

[00093] Термин «конкурировать», применительно к антителам к бета-клото (например, антителам-агонистам и связывающим белкам, которые связываются с (i) бета-клото, или (ii) комплексом, содержащим бета-клото и один из FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c и FGFR4), которые конкурируют за один и тот же эпитоп или сайт связывания на мишени, означает конкуренцию между ними, согласно результатам определения с помощью количественного исследования, в котором исследуемое антитело (или его связывающий фрагмент) предотвращает или ингибирует специфичное связывание эталонной молекулы (например, эталонного лиганда или эталонного антигенсвязывающего белка, такого как эталонное антитело) с общим антигеном (например, бета-клото или его фрагментом). Многочисленные типы количественных исследований конкурентного связывания могут быть использованы для определения того, конкурирует ли испытываемое антитело с контрольным антителом за связывание с бета-клото (например, бета-клото человека). Примеры количественных исследований, которые могут быть использованы, включают твердофазный прямой или непрямой радиоиммунологический анализ (РИА), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (ИФА), количественное исследование конкурентного связывания в формате «сэндвич» (см., например, Stahli et al., (1983) Methods in Enzymology 9:242-253); твердофазный прямой биотин-авидин ИФА (см., например, Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137:3614-3619); твердофазное прямое количественное исследование с использованием метки, твердофазное прямое количественное исследование с использованием метки в формате «сэндвич» (см., например, Harlow and Lane, (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); твердофазный прямой РИА с использованием метки I125 (см., например, Morel et al., (1988) Molec. Immunol. 25:7-15); твердофазный прямой биотин-авидин ИФА (см., например, Cheung, et al., (1990) Virology 176:546-552); и прямой РИА с использованием метки (Moldenhauer et al., (1990) Scand. J. Immunol. 32:77-82). Как правило, подходящее количественное исследование включает использование очищенного антигена (например, бета-клото, такого как бета-клото человека), связанного с твердой поверхностью, или клеток, несущих немеченый испытываемый антигенсвязывающий белок (например, испытываемое антитело к бета-клото) или меченый эталонный антигенсвязывающий белок (например, эталонное антитело к бета-клото). Конкурентное ингибирование может быть измерено путем определения количества метки, связанной с твердой поверхностью или клетками в присутствии испытываемого антигенсвязывающего белка. Обычно испытываемый антигенсвязывающий белок присутствует в избытке. Антитела, выявленные с помощью количественного исследования конкурентного связывания (конкурирующие антитела), включают антитела, связывающиеся с одним и тем же эпитопом, что и эталонное антитело, и/или антитела, связывающиеся с соседним эпитопом, который расположен достаточно близко 110 отношению к эпитопу, связанному с эталонным антителом, так, чтобы между антителами возникло стерическое препятствие. Дополнительные сведения, касающиеся методов определения конкурентного связывания, описаны в настоящей заявке. Обычно, если конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфичное связывание эталонных антител с общим антигеном 110 меньшей мере на 23%, например, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или 75%. В некоторых случаях, например, связывание ингибируется 110 меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96% или 97%, 98%, 99% или более.

[00094] Термин «антитело к бета-клото» или «антитело, которое связывается с бета-клото» включает антитело, которое способно связываться с бета-клото с достаточной аффинностью так, что антитело можно использовать в качестве диагностического и/или терапевтического агента для нацеленного воздействия на бета-клото. Предпочтительно степень связывания антитела к бета-клото с нецелевым белком, отличным от бета-клото, составляет менее приблизительно 10% от степени связывания антитела с бета-клото, согласно результатам измерения, например, с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) или иммуноферментного анализа, такого как радиоиммунологический анализ (РИА). Антитело, которое «специфично связывается с» или «специфично в отношении» бета-клото описано выше. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело, которое связывается с бета-клото, описанное в настоящей заявке, имеет константу диссоциации (Kd), которая меньше или равна 10 нМ, 9 нМ, 8 нм, 7 нм, 6 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ или 0,1 нМ, и/или больше или равна 0,1 нМ. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело к бета-клото связывается с эпитопом бета-клото, который является консервативным для бета-клото из различных видов (например, между бета-клото человека и яванских макак).

[00095] «Выделенное» антитело 110 существу не содержит клеточного материала или других загрязняющих белков из клетки или ткани, которые являются его источником, и/или других загрязняющих компонентов, из которых получено антитело, или 110 существу не содержит химических предшественников или других химических веществ, если антитело было получено с помощью химического синтеза. Выражение «по существу не содержит клеточного материала» включает препараты антитела, в которых антитело отделено от клеточных компонентов клеток, из которых оно было выделено или получено с помощью рекомбинантных способов. Следовательно, антитело, которое 110 существу не содержит клеточного материала, включает препараты антитела, содержащие менее чем приблизительно 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% или 1% (по сухой массе) гетерологичного белка (также называемого в настоящей заявке «загрязняющий белок»). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в случае если антитело получено с помощью рекомбинантных способов, оно 110 существу не содержит культуральной среды, например, культуральная среда составляет менее чем приблизительно 20%, 15%, 10%, 5% или 1% от объема препарата белка. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в случае если антитело получено с помощью химического синтеза, оно 110 существу не содержит химических предшественников или других химических веществ, например, оно отделено от химических предшественников или других химических веществ, которые вовлечены в синтез белка. Соответственно, такие препараты антитела содержат менее чем приблизительно 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% или 1% (по сухой массе) химических предшественников или соединений, отличных от антитела, представляющего интерес. Загрязняющие компоненты также могут включать, но не ограничиваются ими, материалы, которые будут препятствовать терапевтическому применению антитела и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело будет очищено (1) до степени чистоты более 95% 110 массе антитела, согласно результатам определения 110 методу Лоури (Lowry et al. J. Bio. Chem. 193: 265-275, 1951), например, 96%, 97%, 98%, или 99% 110 массе, (2) до степени чистоты, достаточной для получения 110 меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности, согласно результатам исследования с помощью электрофореза, в ДСН-ППАГ в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием окраски Кумасси синим или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, поскольку 110 меньшей мере один компонент естественной среды антитела не будет присутствовать. Как правило, однако, выделенное антитело будет получено с помощью 110 меньшей мере одной стадии очистки. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению являются выделенными.

[00096] Четырехцепочечное антитело представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, который состоит из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. В случае IgG масса четырехцепочечного блока обычно составляет приблизительно 150000 Да. Каждая L-цепь связана с Н-цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как две Н-цепи связаны друг с другом с помощью одной или нескольких дисульфидных связей в зависимости от изотипа Н-цепи. Каждая Н и L цепь также имеет регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая Н-цепь содержит на N-конце вариабельную область (VH), за которой расположены три константные области (СН) для каждой из α- и γ-цепей и четыре области СН для μ и ε изотипов. Каждая L-цепь содержит на N-конце вариабельную область (VL), за которой расположена константная область (CL) на другом ее конце. VL совмещена с VH, и CL совмещена с первой константной областью тяжелой цепи (СН1). Конкретные остатки аминокислот, как полагают, образуют контактную поверхность между легкой цепью и вариабельными доменами тяжелой цепи. Спаривание VH и VL образует единый антигенсвязывающий сайт. Описание структуры и свойств различных классов антител, приведено, например, в Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, стр. 71 и глава 6.

[00097] Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к части легкой цепи или тяжелой цепи антитела, которая обычно расположена на N-конце легкой цепи или тяжелой цепи и имеет длину от приблизительно 120 до 130 аминокислот в тяжелой цепи и приблизительно от 100 до 110 аминокислот в легкой цепи, используется при связывании и обуславливает специфичность каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Вариабельная область тяжелой цепи может упоминаться как «VH». Вариабельная область легкой цепи может упоминаться как «VL». Термин «вариабельный» относится к тому факту, что последовательности некоторых сегментов вариабельных областей в значительной степени различаются между антителами. Вариабельная область опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако вариабельность неравномерно распределена 110 всей длине вариабельных областей, содержащих 110 остатков аминокислот. Напротив, вариабельные области состоят из менее вариабельных (например, относительно инвариантных) участков, называемых каркасными участками (FR), которые содержат приблизительно 15-30 аминокислот, разделенных короткими областями с большей вариабельностью (например, предельной вариабельностью), которые называются «гипервариабельные области», каждая из которых содержит приблизительно 9-12 аминокислот в длину. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат четыре FR, в основном принимающих конфигурацию бета-листов, соединенных тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, соединяющие и, в некоторых случаях, образующие часть структуры бета-листа. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости посредством FR и, совместно с гипервариабельными областями из другой цепи, участвуют в образовании антигенсвязывающего участка антител (см., например, Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). Константные области не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC). Последовательности вариабельных областей существенно различаются между различными антителами. Вариабельность последовательности сосредоточена в CDR, в то время как менее вариабельные участки в вариабельной области называются каркасными участками (FR). CDR легкой и тяжелой цепей в основном принимают участие во взаимодействии антитела с антигеном. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения вариабельная область представляет собой вариабельную область человека.

[00098] Термин «нумерация остатков вариабельной области в соответствии с Kabat» или «нумерация положения аминокислоты в соответствии с Kabat» и их варианты относится к системе нумерации, используемой для вариабельных областей тяжелой цепи или вариабельных областей легкой цепи набора антител в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). При использовании упомянутой системы нумерации фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению или вставке в FR или CDR вариабельной области. Например, вариабельная область тяжелой цепи может содержать вставку одной аминокислоты (остаток 52а в соответствии с Kabat) после остатка 52 в Н2 и вставленные остатки (например, остатки 82а, 82b и 82с и т.д. в соответствии с Kabat) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерация остатков в соответствии с системой Kabat может быть определена для данного антитела путем выравнивания в областях гомологии последовательности антитела со «стандартной» последовательностью, пронумерованной в соответствии с системой Kabat. Система нумерации Kabat, как правило, используется при обозначении остатка в вариабельной области (приблизительно остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи) (например, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). «Система нумерации ЕС» или «индекс ЕС» обычно используется при обозначении остатка в константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, индекс ЕС, описанный в Kabat et al., выше). Термин «индекс ЕС, как в Kabat» относится к нумерации остатков антитела IgG1 человека в соответствии с системой ЕС. Были описаны другие системы нумерации, включая, например, AbM, Chothia, Contact, IMGT и AHon. Различные системы нумерации показаны на фигурах 1-3.

[00099] «Интактное» антитело представляет собой антитело, содержащее антигенсвязывающий сайт, а также CL и 110 меньшей мере константные области тяжелой цепи CH1, СН2 и СН3. Константные области могут включать константные области человека или варианты их аминокислотной последовательности. Предпочтительно интактное антитело имеет одну или более эффекторных функций.

[000100] «Фрагменты антитела» содержат часть интактного антитела, предпочтительно антигенсвязывающий сайт или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv; диатела и дидиатела (см., например, Holliger, P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:6444-8; Lu, D. et al., (2005) J. Biol. Chem. 280:19665-72; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); WO 93/11161; и патенты США №5837242 и 6492123); одноцепочечные молекулы антитела (см., например, патенты США №№4946778; 5260203; 5482858 и 5476786); антитела с двойными вариабельными областями (см., например, патент США №7612181); антитела с одиночной вариабельной областью (sdAbs) (см., например, Woolven et al., Immunogenetics 50: 98-101, 1999; Streltsov et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101:12444-12449, 2004); и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.

[000101] «Функциональный фрагмент» или «связывающий фрагмент» или «антигенсвязывающий фрагмент» терапевтического антитела будет проявлять 110 меньшей мере одну, если не все или некоторые, из биологических функций, характерных для интактного антитела, функцию, включающую 110 меньшей мере связывание с антигеном-мишенью (например, фрагмент, связывающий бета-клото, или фрагмент, который связывается с бета-клото).

[000102] В настоящей заявке термин «гибридный белок» относится к полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность антитела и аминокислотную последовательность гетерологичного полипептида или белка (например, полипептида или белка, который, как правило, не является частью антитела (например, антитело, не связывающееся с антигеном бета-клото)). Термин «гибридизация», при использовании в отношении бета-клото или антитела к бета-клото, относится к соединению пептида или полипептида, или фрагмента, варианта, и/или его производного с гетерологичным пептидом или полипептидом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок сохраняет биологическую активность бета-клото или антитела к бета-клото. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит область VH, область VL, CDR VH (одну, две или три CDR VH) и/или CDR VL (одну, две или три CDR VL) антитела к бета-клото, при этом гибридный белок связывается к эпитопом бета-клото, фрагментом бета-клото и/или полипептидом бета-клото.

[000103] Термин «тяжелая цепь», при использовании в отношении антитела, относится к полипептидной цепи массой приблизительно 50-70 кДа, в которой амино-концевой участок содержит вариабельную область, содержащую от приблизительно 120 до 130 или более аминокислот, и карбокси-концевой участок содержит константную область. Константная область может быть одного из пяти различных типов (например, изотипов), которые обозначаются альфа (α), дельта (δ), эпсилон (ε), гамма (γ) и мю (μ), на основании аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи. Различные тяжелые цепи отличаются 110 размеру: α, δ и γ содержат приблизительно 450 аминокислот, тогда как μ и ε содержат приблизительно 550 аминокислот.В комбинации с легкой цепью указанные различные типы тяжелых цепей образуют пять известных классов (например, изотипов) антител, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно, включая четыре подкласса IgG, а именно: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Тяжелая цепь может представлять собой тяжелую цепь человека.

[000104] Термин «легкая цепь», при использовании в отношении антитела, относится к полипептидной цепи массой приблизительно 25 кДа, в которой амино-концевая часть содержит вариабельную область, содержащую от приблизительно 100 до приблизительно 110 или более аминокислот, и карбокси-концевая часть содержит константную область. Примерная длина легкой цепи составляет от 211 до 217 аминокислот. Существует два различных типа легких цепей, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности константных областей. Аминокислотные последовательности легкой цепи хорошо известны в данной области техники. Легкая цепь может представлять собой легкую цепь человека.

[000105] В настоящей заявке термин «хозяин» относится к животному, такому как млекопитающее (например, человеку).

[000106] В настоящей заявке термин «клетка-хозяин» относится к конкретной клетке-субъекту, которая может быть трансфецирована молекулой нуклеиновой кислоты, и потомству или потенциальному потомству такой клетки. Потомство такой клетки может не быть идентичным родительской клетке, трансфецированной молекулой нуклеиновой кислоты, вследствие мутаций или воздействий окружающей среды, которые могут иметь место в последующих поколениях или при интеграции молекулы нуклеиновой кислоты в геном клетки-хозяина.

[000107] В настоящей заявке термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции 110 существу гомогенных антител, например, индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах, и каждое моноклональное антитело, как правило, будет распознавать один эпитоп на антигене. Согласно конкретным вариантам реализации в настоящей заявке «моноклональное антитело» представляет собой антитело, полученное с помощью одной гибридомы или другой клетки, причем такое антитело связывается только с эпитопом бета-клото, согласно результатам определения, например, с помощью ИФА или другого количественного исследования связывания антигена или конкурентного связывания, известного в данной области техники. Термин «моноклональное» не ограничен каким-либо конкретным способом получения антитела. Например, моноклональные антитела, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены с помощью методики гибридом, впервые описанной Kohler et at, Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены с использованием способов рекомбинантных ДНК в бактериальных клетках, эукариотических животных клетках или растительных клетках (см., например, патент США №4816567). «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из фаговых библиотек антител с использованием способов, описанных в Clackson et at, Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et at, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), например. Другие способы получения клональных клеточных линий и моноклональных антител, экспрессируемых такими линиями, хорошо известны в данной области техники (см., например, главу 11 в: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel et at, eds., John Wiley and Sons, New York). Примеры способов получения моноклональных антител представлены в примерах, приведенных в настоящей заявке.

[000108] Термин «нативный», при использовании применительно к биологическим материалам, такими как молекулы нуклеиновых кислот, полипептиды, клетки-хозяева и т.п., относится к тем, которые встречаются в природе и не подвергались манипуляциям, модификациям и/или изменениям (например, выделенные, очищенные, отобранные) человеком.

[000109] Антитела согласно настоящему изобретению могут включать «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты указанных антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (см. патент США №4816567 и Morrison et at, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

[000110] «Гуманизированные» формы антител из видов, отличных от человека (например, мыши), представляют собой химерные антитела, которые включают иммуноглобулины человека (например, антитело-реципиент), в которых нативные остатки CDR заменены остатками соответствующей CDR из вида, отличного от человека (например, донорного антитела), такого как мышь, крыса, кролик или примат, отличный от человека, с требуемой специфичностью, аффинностью и активностью. В некоторых случаях один или более остатков FR иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками из FR видов, отличных от человека. Гуманизированные антитела также могут содержать остатки, которые не обнаруживаются в реципиентном антителе или в донорном антителе. Перечисленные модификации вносят для того чтобы дополнительно улучшить характеристики антитела. Тяжелая или легкая цепи гуманизированного антитела могут содержать 110 существу все из 110 меньшей мере одной или более вариабельных областей, в которых все или 110 существу все из CDR соответствуют таковым иммуноглобулина вида, отличного от человека, и все или 110 существу все FR содержат последовательность иммуноглобулина человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гуманизированное антитело будет содержать 110 меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, Fc иммуноглобулина человека. Более подробная информация приведена в Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596 (1992); Carter et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA 89:4285-4289 (1992); и патенте США №6800738 (выдан 5 октября 2004 г.), №6719971 (выдан 27 сентября 2005 г.), №6639055 (выдан 28 октября 2003 г.), №6407213 (выдан 18 июня 2002 г.) и №6054297 (выдан 25 апреля 2000 г.).

[000111] «Антитело человека» представляет собой антитело, аминокислотная последовательность которого соответствует таковой антитела, вырабатываемого человеком, и/или была получена с использованием любой из методик получения антител человека, описанных в настоящей заявке. Это определение антитела человека конкретно исключает гуманизированное антитело, содержащее антигенсвязывающие остатки из вида, отличного от человека. Антитела человека могут быть получены с использованием различных методик, известных в данной области техники, включая библиотеки фагового дисплея (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581 (1991) и библиотеки дрожжевого дисплея (Chao et al., Nature Protocols 1: 755-768 (2006)). Для получения моноклональных антител человека также доступны способы, описанные в Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). См. также работу van Dijk и van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Антитела человека могут быть получены путем введения антигена трансгенному животному, которое было модифицировано для выработки таких антител в ответ на иммунизацию антигеном, но у которого были блокированы эндогенные локусы, например, мышам (см., например, Jakobovits, A., Curr. Opin. Biotechnol. 1995, 6(5):561-6; and Taussing, Curr. Opin. Biotechnol. 1997, 8(4):455-8; и патенты США №№6075181 и 6150584 для получения информации о технологии XENOMOUSE™). См. также, например, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006), для получения информации об антителах человека, полученных с помощью технологии гибридом В-клеток человека.

[000112] Термин «CDR» относится к одной из трех гипервариабельных областей (H1, Н2 или Н3) в пределах некаркасной области β-листа каркасного участка VH иммуноглобулина (Ig или антитела), или к одной из трех гипервариабельных областей (L1, L2 или L3) в пределах некаркасной области β-листа каркасного участка VL антитела. Соответственно, области CDR представляют собой последовательности вариабельной области, которые распределены в пределах последовательностей каркасных участков. Области CDR хорошо известны специалистам в данной области техники и были определены, например, Kabat как наиболее гипервариабельные области в пределах вариабельных областей (V) антител (Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat, Adv. Prot. Chem. 32:1-75 (1978)). Последовательности областей CDR также были определены структурно Chothia как остатки, которые не являются частью консервативного Р-складчатого каркасного участка, и, следовательно, способны принимать различные конформации (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Оба варианта терминологии хорошо известны специалистам в данной области техники. Последовательности областей CDR также были определены в соответствии с системами AbM, Contact и IMGT. Последовательности областей CDR показаны на фигурах 1-3. Положения CDR в пределах канонической вариабельной области антитела были определены путем сравнения многочисленных структур (Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). Поскольку число остатков в гипервариабельной области варьируется в различных антителах, дополнительные остатки 110 отношению к каноническим положениям обычно нумеруют с использованием букв а, b, с и так далее вслед за номером остатка согласно схеме нумерации канонической вариабельной области (Al-Lazikani et al., выше (1997)). Упомянутая номенклатура также хорошо известна специалистам в данной области техники.

[000113] В настоящей заявке термин «гипервариабельная область», «HVR» или «HV» относится к областям вариабельной области антитела, последовательности которых являются гипервариабельными и/или образуют структурно определенные петли. Как правило, антитела содержат шесть гипервариабельных областей; три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). Несколько определений гипервариабельной области используются в настоящем описании и включены в настоящую заявку. Определение областей, определяющих комплементарность, в соответствии с системой Kabat (CDR) основано на вариабельности последовательности и используется наиболее часто (см., например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Напротив, определение в соответствии с системой Chothia относится к положению структурных петель (см., например, Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Конец петли CDR-H1 в соответствии с системой Chothia, при нумерации с использованием системы нумерации Kabat, варьируется между положениями Н32 и Н34 в зависимости от длины петли (это обусловлено тем, что система нумерации Kabat помещает вставки в Н35А и Н35В, если ни 35А, ни 35В не присутствуют, то петля заканчивается в положении 32, если присутствует только 35А, то петля заканчивается в положении 33, если присутствуют оба остатка 35А и 35В, то петля заканчивается в положении 34). Определение гипервариабельных областей в соответствии с AbM представляет собой компромисс между определением CDR согласно Kabat и определением структурных петель согласно Chothia и используется в программном обеспечении для моделирования антител AbM (Oxford Molecular) (см., например, Martin, в Antibody Engineering, Vol. 2, Chapter 3, Springer Verlag). «Контактные» гипервариабельные области основаны на исследовании имеющихся сложных кристаллических структур. Остатки из каждой из указанных гипервариабельных областей или CDR отмечены ниже.

[000114] Недавно была разработана и широко применяется универсальная система нумерации, международная иммуногенетическая информационная система® (IMGT) (Lafranc et ai, Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77 (2003)). IMGT представляет собой интегрированную информационную систему, специализирующуюся на иммуноглобулинах (Ig), Т-клеточных рецепторах (TR) и главном комплексе гистосовместимости (МНС) человека и других позвоночных. В соответствии с этой системой CDR называют, исходя из аминокислотной последовательности и расположения в пределах легкой или тяжелой цепей. Поскольку «положение» областей CDR в структуре вариабельной области иммуноглобулина является консервативным между видами, и они присутствуют в структурах, называемых петлями, остатки CDR и каркасные участки могут быть легко выявлены с использованием систем нумерации, которые выравнивают последовательности вариабельных областей в соответствии со структурными признаками. Эта информация может быть использована при прививке и замене остатков CDR из иммуноглобулинов одного вида в акцепторный каркасный участок из, как правило, антитела человека. Дополнительная система нумерации (АНоп) была разработана Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 309: 657-670 (2001). Соответствие между системой нумерации, включая, например, нумерацию 110 Kabat и уникальную систему нумерации IMGT, хорошо известно специалистам в данной области техники (см., например, Kabat, выше; Chothia and Lesk, выше; Martin, выше; Lefranc et ah, выше), а также показано на фигурах 1-3. Типичная система, приведенная в настоящей заявке, сочетает системы нумерации Kabat и Chothia.

[000115] Гипервариабельные области могут содержать «расширенные гипервариабельные области», такие как: 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 или 89-96 (L3) в VL и 26-35 или 26-35А (H1), 50-65 или 49-65 (Н2) и 93-102, 94-102, или 95-102 (Н3) в VH. В настоящей заявке термины «HVR» и «CDR» используются взаимозаменяемо.

[000116] Термин «константная область» или «константный домен» относится к карбокси-концевой части легкой цепи и тяжелой цепи, которая непосредственно не вовлечена в связывание антитела с антигеном, но проявляет различные эффекторные функции, такие как взаимодействие с рецептором Fc. Указанные термины относятся к части молекулы иммуноглобулина, имеющей более консервативную аминокислотную последовательность 110 сравнению с другой частью иммуноглобулина, вариабельной областью, которая содержит антигенсвязывающий сайт.Константная область может содержать области CH1, СН2 и СН3 тяжелой цепи и область CL легкой цепи.

[000117] Термин остатки «каркаса» или «FR» включает остатки вариабельной области, фланкирующие CDR. Остатки FR присутствуют, например, в химерных, гуманизированных, человеческих, доменных антителах, диателах, линейных антителах и биспецифичных антителах. Остатки FR представляют собой остатки вариабельной области, отличные от остатков гипервариабельной области или CDR.

[000118] Антитело со «зрелой аффинностью» представляет собой антитело, содержащее одно или более изменений (например, вариации аминокислотной последовательности, включая изменения, вставки и/или делеции) в одной или более из его HVR, которые приводят к улучшению аффинности антитела в отношении антигена, 110 сравнению с исходным антителом, которое не содержит указанное(ые) изменение(я). Предпочтительные антитела с созревшей аффинностью будут иметь величины аффинности в отношении антигена-мишени в наномолярном или даже пикомолярном диапазоне. Антитела со зрелой аффинностью получают с помощью способов, известных в данной области техники. Для обзора см. Hudson and Souriau, Nature Medicine 9:129-134 (2003); Hoogenboom, Nature Biotechnol. 23: 1105-1116 (2005); Quiroz and Sinclair, Revista Ingeneria Biomedia 4: 39-51 (2010).

[000119] «Блокирующее» антитело или «антитело-антагонист» представляет собой антитело, которое ингибирует или уменьшает биологическую активность антигена, с которым оно связывается. Например, блокирующие антитела или антитела-антагонисты могут в значительной степени или полностью ингибировать биологическую активность антигена.

[000120] «Антитело-агонист» представляет собой антитело, которое инициирует ответ, например, то, которое имитирует 110 меньшей мере один из видов функциональной активности полипептида, представляющего интерес (например, FGF19 или FGF21). Антитело-агонист включает антитело, которое является лигандом-миметиком, например, если лиганд связывается с рецептором на поверхности клетки и связывание индуцирует передачу сигналов в клетке или виды активности, опосредованные межклеточным путем передачи сигналов, и антитело, которое индуцирует аналогичную передачу сигналов в клетке или активацию.

[000121] Термин «агонист» бета-клото относится к молекуле, которая способна активировать или иным образом увеличивать один или более видов биологической активности бета-клото, например, в клетке, экспрессирующей бета-клото и рецептор FGF. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения агонист бета-клото (например, антитело-агонист, описанное в настоящей заявке), может, например, активировать или иным образом увеличивать активацию и/или пути передачи сигналов в клетке, экспрессирующей белок бета-клото и рецептор FGF, увеличивая тем самым биологическую активность клеток, опосредованную бета-клото, 110 сравнению с биологической активностью, опосредованной бета-клото, в отсутствие агониста. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению представляют собой антитела-агонисты к бета-клото, включая антитела, которые индуцируют передачу сигналов, аналогичную таковой для FGF21 или FGF21.

[000122] Термин «аффинность связывания» обычно относится к силе всех нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, связывающего белка, такого как антитело) и его партнером 110 связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, в настоящей заявке «аффинность связывания» относится к природной аффинности связывания, которая отражает взаимодействие в соотношении 1:1 между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность связывающей молекулы X в отношении ее партнера 110 связыванию Y в общем случае может быть представлена константой диссоциации (K_D). Аффинность может быть измерена обычными способами, известными в данной области техники, включая те, которые описаны в настоящей заявке. Низкоаффинные антитела обычно медленно связываются с антигеном и, как правило, легко диссоциируют, в то время как высокоаффинные антитела обычно связываются с антигеном быстрее и, как правило, остаются связанными более длительное время. В данной области техники известны различные способы измерения аффинности связывания, любой из которых может быть использован для целей настоящего изобретения. Конкретные иллюстративные варианты реализации включают те, которые описаны далее. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения «K_D» или «значение K_D» может быть измерено с помощью количественных способов исследований, известных в данной области техники, например, с помощью количественного исследования связывания. Величина K_D может быть измерена с помощью количественного исследования связывания радиоактивномеченого антигена (РИА), например, проводимого с использованием фрагмента Fab антитела, представляющего интерес, и его антигена (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). K_D или значение K_D также может быть измерено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, используя систему Biacore, например, BIAcore™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Пискатауэй, Нью-Джерси, США), или интерферометрии бислоя с использованием, например, системы OctetQK384 (ForteBio, Менло-Парк, Калифорния, США). Величина «скорости прямой реакции» или «скорости связывания» или «скорости ассоциации» или «коп» также может быть определена с помощью методик поверхностного плазмонного резонанса или интерферометрии бислоя, описанных выше, с использованием, например, BIAcore™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Пискатауэй, Нью-Джерси, США) или системы OctetQK384 (ForteBio, Менло-Парк, Калифорния, США).

[000123] Выражение «по существу сходный» или «по существу аналогичный» обозначает достаточно высокую степень сходства между двумя числовыми значениями (например, одним, связанным с антителом согласно настоящему изобретению, и другим, связанным с контрольным антителом) так, что специалист в данной области техники будет рассматривать разницу между этими двумя значениями, как имеющую незначительную биологическую и/или статистическую достоверность или не имеющую ее, применительно к биологической характеристике, измеренной на основании этих значений (например, значений K_D). Например, различие между двумя значениями может быть менее чем приблизительно 50%, менее чем приблизительно 40%, менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 10%, менее чем приблизительно 5%, в зависимости от значения для эталонного антитела.

[000124] В настоящей заявке выражение «по существу сниженный» или «по существу различный» обозначает достаточно высокую степень различия между двумя числовыми значениями (например, одним, связанным с антителом согласно настоящему изобретению, и другим, связанным с контрольным антителом) так, что специалист в данной области техники будет рассматривать различие между указанными двумя значениями как статистически достоверное, применительно к биологической характеристике, измеренной на основании указанных значений. Например, различие между указанными двумя значениями может быть предпочтительно более чем приблизительно 10%, более чем приблизительно 20%, более чем приблизительно 30%, более чем приблизительно 40%, более чем приблизительно 50%, в зависимости от значения для эталонного антитела.

[000125] «Эффекторные функции» антитела относятся к тем видам биологической активности, которые связаны с областью Fc (например, областью Fc с нативной последовательностью или областью Fc с измененной аминокислотной последовательностью) антитела и варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание рецептора Fc; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; снижение активности рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора); и активацию В-клеток.

[000126] В настоящей заявке термин «область Fc» используется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая, например, области Fc с нативной последовательностью, рекомбинантные области Fc и варианты областей Fc. Несмотря на то, что границы области Fc тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьироваться, область Fc тяжелой цепи IgG человека часто определяется как участок от остатка аминокислоты в положении Cys226 или от Pro230 до карбокси-конца тяжелой цепи. С-концевой лизин (остаток 447 в соответствии с системой нумерации ЕС) в области Fc может быть удален, например, в процессе получения или очистки антитела, или при рекомбинантном конструировании нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела. Соответственно, состав интактных антител может включать популяции антител, в которых удалены все остатки К447, популяции антител, в которых остатки К447 не удалены, и популяции антител, содержащие смесь антител как содержащих остатки К447, так и не содержащих их.

[000127] «Функциональная область Fc» обладает «эффекторной функцией» области Fc с нативной последовательностью. Примеры «эффекторных функций» включают связывание C1q; комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC); связывание рецептора Fc; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; снижение активности рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора, BCR) и т.д. Перечисленные эффекторные функции обычно требуют объединения области Fc с областью связывания или доменом связывания (например, вариабельной областью или доменом антитела) и могут быть оценены с использованием различных количественных способов исследований, описанных в настоящей заявке.

[000128] «Область Fc с нативной последовательностью» содержит аминокислотную последовательность, которая идентична природной аминокислотной последовательности области Fc, не подвергавшейся манипуляциям, модификациям и/или изменениям человеком (например, выделенную, очищенную, выбранную, включая или в комбинации с другими последовательностями, такими как последовательности вариабельной области). Области Fc с нативной последовательностью включают область Fc IgG1 человека с нативной последовательностью (не-А и А аллотипы); область Fc IgG2 человека с нативной последовательностью; область Fc IgG3 человека с нативной последовательностью; и область Fc IgG4 человека с нативной последовательностью, а также их природные варианты.

[000129] «Вариант области Fc» содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной последовательности области Fc 110 меньшей мере одной модификацией аминокислоты (например, заменой, добавлением или делецией), предпочтительно одной или более заменами аминокислот. Предпочтительно вариант области Fc содержит 110 меньшей мере одну замену аминокислоты 110 сравнению с областью Fc с нативной последовательностью или областью Fc исходного полипептида, например, от приблизительно одной до приблизительно десяти замен аминокислот и предпочтительно от приблизительно одной до приблизительно пяти замен аминокислот в нативной последовательности области Fc или в области Fc исходного полипептида. В настоящей заявке вариант области Fc предпочтительно обладает 110 меньшей мере приблизительно 80% гомологией с областью Fc с нативной последовательностью и/или с областью Fc исходного полипептида, и более предпочтительно 110 меньшей мере приблизительно 90% гомологией с ними, например, 110 меньшей мере приблизительно 95% гомологией с ними. Например, ниже приведена аминокислотная последовательность варианта, в котором жирным шрифтом показаны замены двух остатков аминокислот аланином в двух положениях последовательности Fc IgG1 человека:

(SEQ ID NO: 316)

Указанный вариант последовательности может быть использован в конструкциях гуманизированных тяжелых цепей, например, представленных ниже для гуманизированной цепи 5H23-vH3 (см., например, пример 7), обозначенной 5H23(vH3)-hIgG1(E233A)(L235A), приведенной ниже; аминокислоты, составляющие сигнальную последовательность, подчеркнуты, и последовательность вариабельной области выделена жирным шрифтом:

(SEQ ID NO: 317)

[000130] Термин «константная область легкой цепи» включает константные области каппа- и лямбда-цепи. Типичная константная область каппа-цепи представлена ниже:

(SEQ ID NO: 318)

Указанная последовательность константной области каппа-цепи может быть использована в конструкциях гуманизированных легких цепей, например, приведенных ниже для гуманизированной цепи 5H23-vL2 (см., например, пример 7), представленной ниже; аминокислоты, составляющие сигнальную последовательность, подчеркнуты, и последовательность вариабельной области выделена жирным шрифтом:

(SEQ ID NO: 319)

[000131] Термин «вариант», применительно к бета-клото или антителу к бета-клото, может относиться к пептиду или полипептиду, содержащему одну или более (например, от приблизительно 1 до приблизительно 25, от приблизительно 1 до приблизительно 20, от приблизительно 1 до приблизительно 15, от приблизительно 1 до приблизительно 10 или от приблизительно 1 до приблизительно 5) замен, делений и/или добавлений в аминокислотной последовательности 110 сравнению с нативной или немодифицированной последовательностью бета-клото. Например, вариант бета-клото может быть получен в результате одного или более (например, от приблизительно 1 до приблизительно 25, от приблизительно 1 до приблизительно 20, от приблизительно 1 до приблизительно 15, от приблизительно 1 до приблизительно 10 или от приблизительно 1 до приблизительно 5) изменений в аминокислотной последовательности нативного бета-клото. Также в качестве примера вариант антитела к бета-клото может быть получен в результате одного или более (например, от приблизительно 1 до приблизительно 25, от приблизительно 1 до приблизительно 20, от приблизительно 1 до приблизительно 15, от приблизительно 1 до приблизительно 10 или от приблизительно 1 до приблизительно 5) изменений в аминокислотной последовательности нативного или ранее не модифицированного антитела к бета-клото. Варианты могут быть природного происхождения, такие как аллельные варианты или варианты сплайсинга, или могут быть искусственно сконструированы. Варианты полипептидов могут быть получены из соответствующих молекул нуклеиновых кислот, кодирующих варианты. Согласно конкретным вариантам реализации вариант бета-клото или вариант антитела к бета-клото 110 меньшей мере сохраняет функциональную активность бета-клото или антитела к бета-клото, соответственно. Согласно конкретным вариантам реализации вариант антитела к бета-клото связывается с бета-клото и/или является антагонистом в отношении активности бета-клото. Согласно конкретным вариантам реализации вариант антитела к бета-клото связывается с бета-клото и/или является агонистом в отношении активности бета-клото. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вариант кодируется вариантом полиморфизма единичного нуклеотида (SNP) молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует бета-клото или области VH или VL антитела к бета-клото или подобласти, такие как одна или более CDR.

[000132] Термин «вектор» относится к веществу, которое используют для переноса или включения последовательностей нуклеиновых кислот, включая, например, для введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Векторы, подходящие для использования, включают, например, векторы для экспрессии, плазмиды, фаговые векторы, вирусные векторы, эписомы и искусственные хромосомы, которые могут включать последовательности для отбора или маркеры, пригодные для стабильной интеграции в хромосому клетки-хозяина. Помимо этого, векторы могут содержать один или более генов селективных маркеров и соответствующие последовательности контроля экспрессии. Гены селективных маркеров, которые могут быть включены, например, обеспечивают устойчивость к антибиотикам или токсинам, восполняют разные виды ауксотрофной недостаточности или снабжают необходимыми питательными веществами, которые не присутствуют в культуральной среде. Последовательности для контроля экспрессии могут включать конститутивные и индуцируемые промоторы, энхансеры транскрипции, терминаторы транскрипции и тому подобное, которые хорошо известны в данной области техники. Если две или более молекул нуклеиновых кислот должны быть совместно экспрессированы (например, тяжелая и легкая цепи антитела или VH и VL антитела), то обе молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены, например, в один вектор для экспрессии или в отдельные векторы для экспрессии. При экспрессии с использованием одного вектора кодирующие нуклеиновые кислоты могут быть функционально связаны с обычной последовательностью контроля экспрессии или связаны с различными последовательностями контроля экспрессии, такими как один индуцируемый промотор и один конститутивный промотор. Введение молекул нуклеиновых кислот в клетку-хозяина может быть подтверждено с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. Такие способы включают, например, исследования нуклеиновых кислот, такие как нозерн-блоттинг или амплификацию мРНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или иммуноблоттинг для экспрессии генных продуктов, или другие подходящие аналитические способы для проверки экспрессии введенной последовательности нуклеиновой кислоты или соответствующего ей генного продукта. Специалисты в данной области техники поймут, что молекулы нуклеиновых кислот экспрессируются в количестве, достаточном для получения желаемого продукта (например, антитела к бета-клото, описанного в настоящей заявке), также будет очевидно, что уровни экспрессии могут быть оптимизированы для получения достаточной экспрессии с использованием способов, хорошо известных в данной области техники.

[000133] Термин «антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» или «ADCC» относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемый Ig, связанный на рецепторах Fc (FcR), присутствующих на некоторых цитотоксических клетках (например, природных клетках-киллерах (NK), нейтрофилах и макрофагах), позволяет указанным цитотоксическим эффекторным клеткам специфично связываться с клеткой-мишенью, несущей антиген, и вызывать гибель клетки-мишени под действием цитотоксинов. Антитела «вооружают» цитотоксические клетки и абсолютно необходимы для такого вида гибели клеток. Первичные клетки, которые опосредуют ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Известно, что FcR экспрессируется на гемопоэтических клетках (см., например, таблицу 3, стр. 464, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)). Чтобы оценить ADCC-активность представляющей интерес молекулы, может быть выполнено количественное исследование ADCC в условиях in vitro (см., например, патенты США №5500362 или 5821337). Эффекторные клетки, подходящие для таких количественных исследований, включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и природные клетки-киллеры (NK). В другом варианте или дополнительно, ADCC-активность представляющей интерес молекулы может быть оценена в условиях in vivo, например, в животной модели (см., например, Clynes et al. (USA) 95:652-656 (1998)). Для использования могут быть выбраны антитела с незначительной ADCC-активностью или лишенные ее.

[000134] Термин «рецептор Fc» или «FcR» описывает рецептор, который связывается с областью Fc антитела. Предпочтительным FcR является FcR человека с нативной последовательностью. Также предпочтительным FcR является тот, который связывается с антителом IgG (например, гамма-рецептором) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и, в другом варианте, формы альтернативного сплайсинга указанных рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), имеющие сходные аминокислотные последовательности, которые отличаются главным образом своими цитоплазматическими доменами (см., например, обзор Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Рецепторы Fc известны в данной области техники (см., например, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)). В настоящей заявке термин «FcR» включает другие FcR, в том числе те, которые будут выявлены в будущем. Термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG плоду (см., например, Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). Были описаны варианты антител с улучшенным или уменьшенным связыванием с FcR (см., например, WO 2000/42072, патенты США №№7183387, 7332581 и 7335742; Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)).

[000135] Термин «комплемент-зависимая цитотоксичность» или «CDC» относится к лизису клетки-мишени в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (соответствующего подкласса), которые связаны с их когнатным антигеном. Чтобы оценить активацию комплемента, может быть выполнено количественное исследование CDC (см., например, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)). Были описаны варианты полипептидов с измененными аминокислотными последовательностями области Fc (полипептиды, содержащие вариант области Fc), а также с повышенной или сниженной способностью связываться с C1q (см., например, патент США №6194551, WO 1999/51642, Idusogie et al J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)). Для использования могут быть выбраны антитела с незначительной CDC-активностью или лишенные ее.

[000136] Термин «внеклеточный домен» полипептида бета-клото или «ВКД» относится к форме полипептида бета-клото, которая 110 существу не содержит трансмембранного и цитоплазматического доменов. Например, ВКД полипептида бета-клото может содержать менее 1% указанных трансмембранных и/или цитоплазматических доменов и предпочтительно может содержать менее 0,5% указанных доменов. Термин «идентичность» относится к взаимосвязи между последовательностями двух или более полипептидных молекул или двух или более молекул нуклеиновых кислот, согласно результатам определения с помощью выравнивания и сравнения последовательностей. Термин «процент идентичности» означает процент идентичных остатков между аминокислотами или нуклеотидами в сравниваемых молекулах и рассчитывается на основании размера самой небольшой из сравниваемых молекул. При проведении таких расчетов пробелы при выравнивании (если таковые имеются) должны быть рассмотрены с помощью конкретной математической модели или компьютерной программы (например, «алгоритма»). Способы, которые могут быть использованы для вычисления идентичности выравниваемых нуклеиновых кислот или полипептидов, включают способы, описанные в Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), (1988) New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., (1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; и Carillo et al., (1988) SIAM J. Applied Math. 48:1073.

[000137] При расчете процента идентичности сравниваемые последовательности могут быть выровнены так, чтобы получить наибольшее соответствие между последовательностями. Для определения процента идентичности может быть использован программный пакет GCG, который включает GAP (Devereux et ah, (1984) Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, Университет штата Висконсин, Мэдисон, Висконсин, США). Компьютерный алгоритм GAP используется для выравнивания двух полипептидов или полинуклеотидов, для которых должен быть определен процент идентичности последовательностей. Последовательности могут быть выровнены для оптимального совпадения соответствующей аминокислоты или нуклеотида в них («совпадающий участок», согласно результатам определения с помощью алгоритма). В комбинации с этим алгоритмом используют штраф на внесение пробела (который рассчитывают как 3× среднюю диагональ, где «средняя диагональ» представляет собой среднее значение диагонали используемой матрицы сравнения; «диагональ» представляет собой балл или число, присвоенное каждому точному совпадению аминокислот конкретной матрицей сравнения) и штраф за продолжение пробела (который, как правило, составляет 1/10 штрафа за внесение пробела), а также матрицу сравнения, такую как РАМ 250 или BLOSUM 62. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в алгоритме также используется стандартная матрица сравнения (см., Dayhoff et ah, (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352, чтобы получить информацию о матрице сравнения РАМ 250; Henikoff et ah, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919, чтобы получить информацию о матрице сравнения BLOSUM62).

[000138] Типичные параметры для определения процента идентичности полипептидов или нуклеотидных последовательностей с использованием программы GAP включают следующие: (i) алгоритм: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453; (ii) матрица сравнения: BLOSUM 62 из Henikoff et al., 1992, выше; (iii) штраф на внесение пробела: 12 (но без штрафа для концевых пробелов) (iv) штраф за удлинение пробела: 4; и (v) порог сходства: 0.

[000139] Некоторые схемы выравнивания для выравнивания двух аминокислотных последовательностей могут привести к совпадению только короткого участка двух последовательностей, и такой небольшой выровненный участок может иметь очень высокую идентичность последовательностей, даже если между двумя полноразмерными последовательностями отсутствует значимая взаимосвязь. Соответственно, выбранный способ выравнивания (например, программа GAP) может быть скорректирован, если это необходимо для выравнивания участка, который охватывает несколько аминокислот, например, 110 меньшей мере 50 смежных аминокислот полипептида-мишени.

[000140] Термин «процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей» 110 отношению к эталонной последовательности полипептида определяется как процент остатков аминокислот в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в эталонной последовательности полипептида, после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей и без учета любых консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществлять различными способами, которые известны специалистам в данной области техники, например, с использованием общедоступного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания 110 всей длине сравниваемых последовательностей.

[000141] Термин «модификация» остатка/положения аминокислоты относится к изменению первичной аминокислотной последовательности 110 сравнению с исходной аминокислотной последовательностью, когда изменение происходит в результате изменения последовательности с участием указанного остатка/положения аминокислоты. Например, типичные модификации включают замену остатка другой аминокислотой (например, консервативную или неконсервативную замену), вставку одной или более (например, как правило, менее 5, 4 или 3) аминокислот рядом с указанным остатком/положением и/или удаление указанного остатка/положения.

[000142] «Эпитоп» представляет собой сайт на поверхности молекулы антигена, с которым связывается одна молекула антитела, такой как локализованный участок на поверхности антигена, такого как полипептид бета-клото, фрагмент полипептида бета-клото или эпитоп бета-клото, который способен связываться с одним или более антигенсвязывающими участками антитела и который обладает антигенной или иммуногенной активностью у животного, такого как млекопитающее (например, человек), и который способен вызывать иммунный ответ. Эпитоп, обладающий иммуногенной активностью, представляет собой часть полипептида, которая вызывает гуморальный ответ у животного. Эпитоп, обладающий антигенной активностью, представляет собой часть полипептида, с которой связывается антитело, согласно результатам определения с помощью любого способа, хорошо известного в данной области техники, включая, например, с помощью иммунологического количественного исследования. Антигенные эпитопы не обязательно должны быть иммуногенными. Эпитопы часто состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как боковые цепи аминокислот или Сахаров, и имеют специфичные трехмерные структурные характеристики, а также специфичные характеристики зарядов. Термин «эпитоп» в частности включает линейные эпитопы и конформационные эпитопы. Область полипептида, которая принимает участие в образовании эпитопа, может представлять собой смежные аминокислоты полипептида, или эпитоп может быть образован двумя или более несмежными областями полипептида. Эпитоп может, но не обязательно, представлять собой характерную трехмерную поверхностную структуру антигена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эпитоп бета-клото представляет собой характерную трехмерную поверхностную структуру полипептида бета-клото. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения эпитоп бета-клото представляет собой линейную характерную структуру полипептида бета-клото. В целом антиген имеет несколько или много различных эпитопов и может вступать в реакцию со многими различными антителами.

[000143] Антитело связывается с «эпитопом» или «по существу с одним и тем же эпитопом» или «одним и тем же эпитопом», что и эталонное антитело, когда оба антитела распознают идентичные, перекрывающиеся или смежные эпитопы в трехмерном пространстве. Наиболее широко используемыми и быстрыми способами определения того, связываются ли два антитела с идентичными, перекрывающимися или смежными эпитопами в трехмерном пространстве, являются количественные исследования конкурентного связывания, которые можно осуществлять в различных форматах, например, с использованием меченого антигена или меченого антитела. При проведении некоторых количественных исследований антиген иммобилизуют на 96-луночном планшете или экспрессируют на поверхности клетки, и способность немеченых антител блокировать связывание меченых антител измеряют с использованием радиоактивных, флуоресцентных или ферментных меток.

[000144] «Картирование эпитопа» представляет собой способ выявления сайтов связывания или эпитопов антител на антигенах-мишенях. Эпитопы антител могут представлять собой линейные эпитопы или конформационные эпитопы. Линейные эпитопы образованы непрерывной последовательностью аминокислот в белке. Конформационные эпитопы образованы аминокислотами, которые не являются смежными в последовательности белка, но которые сближаются при складывании белка в его трехмерную структуру. Индуцированные эпитопы образуются в том случае, если трехмерная структура белка находится в измененной конформации, например, после активации или связывания другого белка или лиганда (например, связывание бета-клото с рецептором FCF, таким как FGRFR1c, FGFR2c, FGFR3c или FGFR4c).

[000145] «Эпитоп-специфичная сортировка» представляет собой способ группировки антител в зависимости от эпитопов, которые они распознают. Более конкретно, эпитоп-специфичная сортировка включает способы и системы для установления способности различных антител распознавать эпитопы с помощью количественных исследований конкурентного связывания в комбинации с вычислительными процессами для кластеризации антител на основании их свойств в отношении распознавания эпитопа и идентификации антител с различной специфичностью связывания.

[000146] Термины «заболевание, опосредованное бета-клото» и «расстройство, опосредованное бета-клото» и «состояние, опосредованное бета-клото» используются взаимозаменяемо и относятся к любому заболеванию, расстройству или состоянию, которое полностью или частично вызвано или возникает в результате активности бета-клото или взаимодействия бета-клото с рецептором FGF, таким как FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c или FGFR4, и/или, в другом варианте, к любому заболеванию, расстройству или состоянию, при котором желательной является имитация или усиление действия FGF19 и/или FGF21 в условиях in vivo.

[000147] В настоящей заявке термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству агента (например, антитела, описанного в настоящей заявке, или любого другого агента, описанного в настоящей заявке), которое является достаточным для уменьшения и/или ослабления степени тяжести и/или продолжительности указанного заболевания, расстройства или состояния, и/или симптома, связанного с ним. Терапевтически эффективное количество агента, включая терапевтический агент, может представлять собой количество, необходимое для (i) уменьшения или облегчения распространения или прогрессирования указанного заболевания, расстройства или состояния, (ii) уменьшения или ослабления рецидива, риска развития или начала указанного заболевания, расстройства или состояния, и/или (iii) улучшения или усиления профилактического или терапевтического действия другой терапии (например, терапии, не включающей введение антитела согласно настоящему изобретению). Термин «терапевтически эффективное количество» вещества/молекулы/агента согласно настоящему изобретению (например, антитела к бета-клото) может изменяться в зависимости от таких факторов как патологическое состояние, возраст, пол и масса тела индивидуума и способность вещества/молекулы/агента вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество включает количество, при котором терапевтически благоприятное действие превосходит любые токсические или вредные эффекты вещества/молекулы/агента. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству антитела или другого агента (например, лекарственного препарата), которое является эффективным для «лечения» заболевания, расстройства или состояния у субъекта или млекопитающего.

[000148] В настоящей заявке «эффективное количество», как правило, представляет собой количество, достаточное для уменьшения степени тяжести и/или частоты симптомов, устранения симптомов и/или основной причины, предотвращения возникновения симптомов и/или их основной причины, и/или улучшения или устранения повреждений, которые возникли в результате или связаны с заболеванием, расстройством или состоянием, включая, например, сахарный диабет, ожирение, дислипидемию, сердечно-сосудистые заболевания, метаболический синдром или в целом любое заболевание, расстройство или состояние, при котором желательной является имитация или усиление действия FGF19 и/или FGF21 в условиях in vivo. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения эффективное количество представляет собой терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество. Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для излечения заболевания, расстройства или состояния (например, сахарного диабета 2 типа, ожирения, дислипидемии, НАСГ, сердечно-сосудистых заболеваний, метаболического синдрома или в целом любого заболевания, расстройства или состояния, при котором желательной является имитация или усиление действия FGF19 и/или FGF21 в условиях in vivo) или симптомов заболевания, в частности заболевания, расстройства или состояния, или симптомов, связанных с указанным заболеванием, расстройством или состоянием, или иным образом предотвращения, препятствования, замедления или обратного прогрессирования заболевания, расстройства или состояния, или любого другого нежелательного симптома, связанного с указанным заболеванием, расстройством или состоянием, каким-либо способом. Термин «профилактически эффективное количество» означает количество фармацевтической композиции, которая, при введении субъекту, будет оказывать желаемое профилактическое действие, например, предотвращать или задерживать начало (или рецидив) сахарного диабета, ожирения или дислипидемии, или снижать вероятность начала (или рецидива) заболевания, расстройства или состояния, или связанного симптома(ов), включая, например, сахарный диабет, ожирение, дислипидемию, сердечно-сосудистые заболевания, метаболический синдром или в целом любое заболевание, расстройство или состояние, при котором желательной является имитация или усиление действия FGF19 и/или FGF21 в условиях in vivo) или связанных симптомов. Полноценное терапевтическое или профилактическое действие не обязательно происходит при введении одной дозы и может иметь место только после введения серии доз. Следовательно, терапевтически или профилактически эффективное количество может быть введено в один или несколько приемов.

[000149] Термин «профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Как правило, но не обязательно, поскольку профилактическую дозу используют у субъектов перед началом или на ранней стадии заболевания, расстройства или состояния, профилактически эффективное количество может быть меньше, чем терапевтически эффективное количество.

[000150] Термин «хроническое» введение относится к непрерывному введению агента(ов) (например, в течение периода времени, например, нескольких дней, недель, месяцев или лет), в отличие от краткосрочной схемы, с тем чтобы сохранить первоначальное терапевтическое действие (активность) в течение продолжительного периода времени. «Периодическое» введение относится к виду лечения, которое осуществляют не последовательно без перерыва, а напротив циклически.

[000151] Введение «в комбинации с» одним или более дополнительными терапевтическими агентами включает одновременное (например, совместное) и последовательное введение в любом порядке. Термин «в комбинации», применительно к введению других терапевтических средств (например, других агентов), включает использование более одного терапевтического средства (например, одного агента). Использование термина «в комбинации» не ограничивает порядок, в котором терапевтические средства вводят субъекту. Первое терапевтическое средство (например, агент) может быть введено перед (например, за 1 минуту, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель или 12 недель), одновременно или после (например, через 1 минуту, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель или 12 недель) введения второго терапевтического средства (например, агента) субъекту, который имел, имеет или восприимчив к заболеванию, опосредованному бета-клото.

[000152] Любое дополнительное терапевтическое средство (например, агент) можно вводить в любом порядке с другими дополнительными терапевтическими средствами (например, агентами). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела могут быть введены в комбинации с одним или более терапевтическими средствами, такими как агенты (например, терапевтическими средствами, включая агенты, которые не являются антителами, которые вводят в настоящее время) для предотвращения, лечения, контроля и/или облегчения заболевания, опосредованного бета-клото. Неограничивающие примеры терапевтических средств (например, агентов), которые могут быть введены в комбинации с антителом, включают, например, анальгетики, анестетики, антибиотики или иммуномодуляторы, или любые другие агенты, перечисленные в Фармакопее США и/или Настольном справочнике врача. Примеры агентов, которые можно применять в комбинированной терапии, включают, но не ограничиваются ими: нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат (НПВП), такой как аспирин, ибупрофен и другие производные пропионовой кислоты (алминопрофен, беноксапрофен, буклоксовую кислоту, карпрофен, фенбуфен, фенопрофен, флупрофен, флурбипрофен, индопрофен, кетопрофен, миропрофен, напроксен, оксапрозин, пирпрофен, пранопрофен, супрофен, тиапрофеновую кислоту и тиоксапрофен), производные уксусной кислоты (индометацин, ацеметацин, алклофенак, клиданак, диклофенак, фенклофенак, фенклозовую кислоту, фентиазак, фуирофенак, ибуфенак, изоксепак, окспинак, сулиндак, тиопинак, толметин, зидометацин и зомепирак), производные фенаминовой кислоты (флуфенаминовую кислоту, меклофенамовую кислоту, мефенамовую кислоту, нифлумовую кислоту и толфенамовую кислоту), производные бифенилкарбоновой кислоты (дифлунизал и флуфенизал), оксикамы (изоксикам, пироксикам, судоксикам и теноксикан), салицилаты (ацетилсалициловую кислоту, сульфасалазин) и пиразолоны (апазон, безпиперилон, фепразон, мофебутазон, оксифенбутазон, фенилбутазон). Другие комбинации включают ингибиторы циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2). Другие агенты для комбинации включают стероиды, такие как преднизолон, преднизон, метилпреднизолон, бетаметазон, дексаметазон или гидрокортизон. Указанная комбинация может быть особенно предпочтительной, поскольку один или более побочных эффектов стероида может быть уменьшен или даже устранен путем уменьшения дозы стероида, необходимой при лечении пациентов, при использовании в комбинации с антителами согласно настоящему изобретению. Дополнительные примеры агентов для комбинаций включают цитокин-подавляющий(е) противовоспалительный(е) препарат(ы) (CSAIDs); антитела к или антагонисты других цитокинов или факторов роста человека, например, ФНО, ЛТ, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-15, ИЛ-16, ИЛ-18, ЕМАР-II, ГМ-КСФ, FGF или PDGF. Комбинации агентов могут включать антагонисты ФНО, такие как химерные, гуманизированные или человеческие антитела к ФНО, ремикейд, фрагменты антител к ФНО (например, CDP870), а также растворимые рецепторы ФНО, р55 или р75, их производные p75TNFRIgG (энбрел^®) или p55TNFR1gG (ленерцепт^®), растворимый рецептор ИЛ-13 (sIL-13), а также ингибиторы ФНО-превращающего фермента (ТАСЕ); аналогичным образом, эффективными могут быть ингибиторы ИЛ-1 (например, ингибиторы интерлейкин-1-превращающего фермента). Другие комбинации включают интерлейкин-11, анти-P7s и гликопротеиновый лиганд Р-селектина (PSGL). Другие примеры агентов, которые можно применять в комбинированной терапии, включают интерферон-β1a (авонекс); интерферон-β1b (бетасерон^®); копаксон; гипербарический кислород; внутривенный иммуноглобулин; кладрибин; и антитела к или антагонисты других цитокинов или факторов роста человека (например, антитела к лиганду CD40 и CD80).

[000153] В настоящей заявке термин «носители» включает фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы, которые являются нетоксичными для клетки или млекопитающего, подвергающегося их воздействию, в используемых дозах и концентрациях. Обычно физиологически приемлемый носитель представляет собой водный буферный раствор с заданным значением рН. Примеры физиологически приемлемых носителей включают буферы, такие как буферы на основе фосфата, цитрата и других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные ((например, содержащие, менее приблизительно 10 остатков аминокислот) полипептиды, белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон, аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как твин, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и плюроновые кислоты™. Термин «носитель» также может относиться к разбавителю, адьюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному и неполному)), вспомогательному веществу или среде, с которой вводят лекарственное средство. Указанные носители, включая фармацевтические носители, могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая те, которые получены из нефти, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Вода является типичным носителем, если композицию (например, фармацевтическую композицию) вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, в частности, для растворов для инъекций. Подходящие вспомогательные вещества (например, фармацевтические вспомогательные вещества) включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и тому подобное. Композиция, если необходимо, также может содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов или рН-забуферивающих агентов. Композиции могут быть в виде растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, препаратов с замедленным высвобождением и тому подобного. Композиции для введения внутрь, включая составы, могут содержать стандартные носители, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния фармацевтической степени чистоты и т.д. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA. Композиции, включая фармацевтические соединения, могут содержать профилактически или терапевтически эффективное количество антитела к бета-клото, например, в выделенной или очищенной форме, совместно с подходящим количеством носителя, чтобы обеспечить форму для надлежащего введения субъекту (например, пациенту). Состав должен соответствовать способу введения.

[000154] В настоящей заявке термин «фармацевтически приемлемый» означает наличие одобрения регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или упоминание в Фармакопее США, Европейской Фармакопее или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и более конкретно у человека.

[000155] Термин «фармацевтический состав» относится к препарату, который находится форме, обеспечивающей эффективную биологическую активность активного ингредиента (например, антитела к бета-клото), и который не содержит дополнительных компонентов, неприемлемо токсичных для субъекта, которому будет введен препарат. Указанный состав может быть стерильным.

[000156] «Стерильный» состав является асептическим или не содержит каких-либо живых микроорганизмов и их спор.

[000157] В настоящей заявке термин «поликлональные антитела» относится к популяции антител, которая вырабатывается при иммуногенном ответе на белок, содержащий множество эпитопов, и, следовательно, содержит множество различных антител, направленных на один и тот же или на различные эпитопы в белке. Способы получения поликлональных антител известны в данной области техники (см., например, в главе 11: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York).

[000158] «Выделенная нуклеиновая кислота» представляет собой нуклеиновую кислоту, например, РНК, ДНК или смешанный полимер, который 110 существу отделен от других геномных последовательностей ДНК, а также белков или комплексов, таких как рибосомы и полимеразы, которые присутствуют совместно с нативной последовательностью в природных условиях. «Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой ту, которая отделена от других молекул нуклеиновых кислот, которые присутствуют в природном источнике молекулы нуклеиновой кислоты. Более того, «выделенная» молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула кДНК, может 110 существу не содержать другого клеточного материала или культуральной среды, если она получена с помощью рекомбинантных способов, или 110 существу не содержит химических предшественников или других химических веществ, если она получена с помощью химического синтеза. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения одну или более молекул нуклеиновых кислот, кодирующих антитело, описанное в настоящей заявке, выделяют или очищают. Термин включает последовательности нуклеиновых кислот, которые были удалены из их природной среды, и включает выделенные молекулы рекомбинантной или клонированной ДНК и химически синтезированные аналоги или аналоги, биологически синтезированные с помощью гетерологичных систем. 110 существу, чистая молекула может содержать выделенные формы молекулы.

[000159] В настоящей заявке термины «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота» используются взаимозаменяемо, относятся к полимерам нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут представлять собой дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания, и/или их аналоги, или любой субстрат, который может быть введен в полимер с помощью ДНК- или РНК-полимеразы или с помощью синтетической реакции. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. В настоящей заявке термин «олигонуклеотид» в целом относится к коротким, как правило, одноцепочечным, как правило, синтетическим полинуклеотидам, которые, как правило, но не обязательно, содержат менее приблизительно 200 нуклеотидов в длину. Термины «олигонуклеотид» и «полинуклеотид» не являются взаимоисключающими. Приведенное выше описание полинуклеотидов в равной степени и в полной мере применимо к олигонуклеотидам. Клетка, которая вырабатывает антитело к бета-клото согласно настоящему изобретению, может включать исходную гибридомную клетку, а также бактериальные и эукариотические клетки-хозяева, в которые была введена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело. Подходящие клетки-хозяева описаны ниже.

[000160] Если не указано иное, левый конец любой одноцепочечной полинуклеотидной последовательности, раскрытой в настоящей заявке, представляет собой 5'-конец; левое направление двухцепочечных полинуклеотидных последовательностей называется 5'-направление. Направление от 5'-конца к 3'-концевому добавлению синтезируемых транскриптов РНК называется направлением транскрипции; области последовательности на цепи ДНК, последовательность которой идентична таковой РНК-транскрипта, которые расположены в направлении 5'-конца относительно 5'-конца РНК-транскрипта, называются «левыми» последовательностями; области последовательности на цепи ДНК, последовательность которой идентична таковой РНК-транскрипта, которые расположены в направлении 3'-конца относительно 3'-конца РНК-транскрипта, называются «правыми» последовательностями.

[000161] Термин «вкладыш в упаковку» используется для обозначения инструкций, обычно включенных в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, способах использования, дозировке, способах введения, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся использования таких терапевтических продуктов.

[000162] Термины «предотвращать», «предотвращающий» и «предотвращение» относятся к полному или частичному ингибированию развития, рецидива, начала или распространения заболевания, опосредованного бета-клото, и/или симптомов, связанных с ним, в результате введения терапии или комбинированных видов терапии согласно настоящему изобретению (например, комбинации профилактических или терапевтических агентов, таких как антитела согласно настоящему изобретению).

[000163] Термин «профилактический агент» относится к любому агенту, который может частично или полностью ингибировать развитие, рецидив, начало или распространение заболевания, опосредованного бета-клото, и/или симптомов, связанных с ним, у субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения термин «профилактический агент» относится к антителу к бета-клото, описанному в настоящей заявке. Согласно некоторым другим вариантам реализации настоящего изобретения термин «профилактический агент» относится к агенту, за исключением антитела к бета-клото, описанного в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения профилактический агент представляет собой агент, который, как известно, можно будет использовать или который использовали, или который используется в настоящее время для предотвращения заболевания, расстройства или состояния, опосредованного бета-клото, и/или симптома, связанного с ним, или затрудняет начало, развитие, прогрессирование и/или тяжесть заболевания, расстройства или состояния, опосредованного бета-клото, и/или симптома, связанного с ним. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения профилактический агент представляет собой гуманизированное антитело к бета-клото, такое как гуманизированное моноклональное антитело к бета-клото.

[000164] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения «профилактически эффективный титр в сыворотке крови» представляет собой титр в сыворотке крови у субъекта, предпочтительно у человека, который полностью или частично ингибирует развитие, рецидив, начало или распространение заболевания, расстройства или состояния, опосредованного бета-клото, и/или симптомов, связанных с ним, у субъекта.

[000165] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения «терапевтически эффективный титр в сыворотке крови» представляет собой титр в сыворотке крови у субъекта, предпочтительно у человека, который снижает степень тяжести, продолжительность и/или симптомы, связанные с заболеванием, расстройством или состоянием, опосредованным бета-клото, у субъекта.

[000166] Термин «рекомбинантное антитело» относится к антителу, которое получают, экспрессируют, конструируют или выделяют с помощью рекомбинантных способов. Рекомбинантные антитела могут представлять собой антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного вектора для экспрессии, трансфецированного в клетку-хозяина, антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител, антитела, выделенные из животного (например, мыши или коровы), которое является трансгенным и/или трансхромосомным в отношении генов иммуноглобулина человека (см., например, Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), или антитела, полученные, экспрессированные, сконструированные или выделенные с помощью любых других средств, которые включают соединение последовательностей генов иммуноглобулинов с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела могут содержать вариабельные и константные области, включая те, которые получены из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека (см. Kabat, Е. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, однако, указанные рекомбинантные антитела могут быть подвергнуты мутагенезу в условиях in vitro (или соматическому мутагенезу в условиях in vivo, если используется животное, трансгенное 110 последовательностям Ig человека) и, следовательно, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантного антитела представляют собой последовательности, которые, несмотря на то, что они получены и родственны последовательностям VH и VL зародышевой линии человека, не могут существовать в природе в репертуаре антител зародышевой линии человека в условиях in vivo.

[000167] Термин «титр в сыворотке крови» относится к среднему титру в сыворотке крови у субъекта, рассчитанному на основании нескольких образцов (например, в одной временной точке или в нескольких временных точках) или в популяции, включающей 110 меньшей мере 10, например, 110 меньшей мере 20, или 110 меньшей мере 40 субъектов, вплоть до приблизительно 100, 1000 или более субъектов.

[000168] Термин «побочные эффекты» включает нежелательные и/или неблагоприятные эффекты терапии (например, профилактического или терапевтического агента). Нежелательные эффекты не обязательно являются неблагоприятными. Неблагоприятный эффект терапии (например, профилактического или терапевтического агента) может быть вредным или неудобным, или связанным с риском. Примеры побочных эффектов включают диарею, кашель, гастроэнтерит, свистящее дыхание, тошноту, рвоту, анорексию, спастические боли в животе, лихорадку, боль, потерю массы тела, обезвоживание, алопецию, диспноэ, бессонницу, головокружение, воспаление слизистой оболочки, расстройства со стороны нервной ткани и мышц, усталость, сухость во рту, потерю аппетита, сыпь или припухлости в месте введения, гриппоподобные симптомы, такие как лихорадка, озноб и усталость, расстройства со стороны желудочно-кишечного тракта и аллергические реакции. Другие нежелательные эффекты, испытываемые пациентами, многочисленны и известны в данной области техники. Многие из них описаны в Настольном справочнике врача (68-е изд., 2014).

[000169] Термины «субъект» и «пациент» могут быть использованы взаимозаменяемо. В настоящей заявке, согласно некоторым вариантам реализации, субъект представляет собой млекопитающее, например, не относящееся к приматам (например, коровы, свиньи, лошади, кошки, собаки, крысы и т.д.), или примата (например, обезьяну и человека). Согласно конкретным вариантам реализации субъектом является человек. Согласно одному варианту реализации субъект представляет собой млекопитающее (например, человека), которое имеет заболевание, расстройство или состояние, опосредованное бета-клото. Согласно другому варианту реализации субъект представляет собой млекопитающее (например, человека), которое имеет риск развития заболевания, расстройства или состояния, опосредованного бета-клото.

[000170] Термин «по существу все» относится к 110 меньшей мере приблизительно 60%, 110 меньшей мере приблизительно 65%, 110 меньшей мере приблизительно 70%, 110 меньшей мере приблизительно 75%, 110 меньшей мере приблизительно 80%, 110 меньшей мере приблизительно 85%, 110 меньшей мере приблизительно 90%, 110 меньшей мере приблизительно 95%, 110 меньшей мере приблизительно 98%, 110 меньшей мере приблизительно 99%, или приблизительно 100%.

[000171] Термин «терапевтический агент» относится к любому агенту, который может быть использован в лечении, предотвращении или облегчении заболевания, расстройства или состояния, включая в лечении, предотвращении или облегчении одного или более симптомов заболевания, расстройства или состояния, опосредованного бета-клото, и/или связанного с ними симптома. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения терапевтический агент относится к антителу к бета-клото, описанному в настоящей заявке. Согласно некоторым другим вариантам реализации терапевтический агент относится к агенту, отличному от антитела согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения терапевтический агент представляет собой агент, который, как известно, можно будет использовать или который был использован или в настоящее время используется для лечения, предотвращения или облегчения одного или более симптомов заболевания, расстройства или состояния, опосредованного бета-клото, или связанного с ними симптома.

[000172] Комбинация терапевтических агентов (например, использование агентов, включая терапевтические агенты) может быть более эффективной, чем аддитивное действие любых двух или более терапевтических агентов 110 отдельности (например, синергетическое действие). Синергетическое действие является неожиданным и не может быть предсказано. Например, синергетическое действие комбинации терапевтических агентов позволяет использовать более низкие дозы одного или более агентов и/или менее частое введение агентов субъекту, страдающему заболеванием, опосредованным бета-клото. Возможность использования более низких дозировок терапевтических агентов и/или меньшей частоты введения снижает токсичность, связанную с введением терапевтических агентов субъекту, не вызывая при этом снижения эффективности терапевтических агентов в предотвращении, лечении или облегчении одного или более симптомов заболевания, опосредованного бета-клото. Помимо этого, синергическое действие может привести к повышению эффективности терапевтических агентов в предотвращении, лечении или облегчении одного или более симптомов заболевания, опосредованного бета-клото. Наконец, синергическое действие комбинированной терапии (например, терапевтических агентов) может позволить избежать или уменьшить неблагоприятные или нежелательные побочные эффекты, связанные с использованием любого терапевтического агента 110 отдельности.

[000173] Термин «терапия» относится к любому протоколу, способу и/или агенту, который может быть использован в предотвращении, контроле, лечении и/или облегчении заболевания, расстройства или состояния, опосредованного бета-клото. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения термины «виды терапии» и «терапия» относятся к биологической терапии, поддерживающей терапии и/или другим видам терапии, которые можно применять в предотвращении, контроле, лечении и/или облегчении заболевания, расстройства или состояния, опосредованного бета-клото, как известно специалисту в данной области техники, например, медицинскому персоналу.

[000174] Термин «детектируемый зонд» относится к композиции, которая обеспечивает детектируемый сигнал. Термин включает, но не ограничивается ими, любой флуорофор, хромофор, радиоактивную метку, фермент, антитело или фрагмент антитела и тому подобное, которые обеспечивают детектируемый сигнал благодаря своей активности.

[000175] Термин «диагностический агент» относится к веществу, вводимому субъекту, которое облегчает диагностику заболевания, расстройства или состояния. Такие вещества могут быть использованы для выявления, точного определения и/или определения локализации процесса, вызывающего заболевание. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диагностический агент включает вещество, которое конъюгировано с антителом к бета-клото, описанным в настоящей заявке, которое при введении субъекту или при контакте с образцом субъекта облегчает диагностику заболевания, опосредованного бета-клото.

[000176] Термин «детектируемый агент» относится к веществу, которое может быть использовано для установления наличия или присутствия желаемой молекулы, такой как антитело к бета-клото, описанное в настоящей заявке, в образце или у субъекта. Детектируемый агент может представлять собой вещество, которое может быть визуализировано, или вещество, которое поддается определению и/или измерению иным образом (например, путем количественной оценки).

[000177] Термин «кодирует» или его грамматические эквиваленты, при использовании в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, относится к молекуле нуклеиновой кислоты в ее нативном состоянии или молекуле, которая подвергается манипуляциям с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, которую можно транскрибировать для получения мРНК, которая затем транслируется с образованием полипептида и/или его фрагмента. Антисмысловая цепь является комплементарной цепью указанной молекулы нуклеиновой кислоты, и кодирующая последовательность может быть получена на ее основании.

[000178] Термин «вспомогательное вещество» относится к инертному веществу, которое обычно используют в качестве разбавителя, среды, консерванта, связующего или стабилизирующего агента, и включает, но не ограничивается ими, белки (например, сывороточный альбумин и т.д.), аминокислоты (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, лизин, аргинин, глицин, гистидин и т.д.), жирные кислоты и фосфолипиды (например, алкилсульфонаты, каприловую кислоту и т.д.), поверхностно-активные вещества (например, ДСН, полисорбат, неионное поверхностно-активное вещество и т.д.), сахариды (например, сахарозу, мальтозу, трегалозу и т.д.) и многоатомные спирты (например, маннит, сорбит и т.д.). См., также, руководство Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA, которое полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

[000179] Применительно к пептиду или полипептиду в настоящей заявке термин «фрагмент» относится к пептиду или полипептиду, который содержит последовательность, которая меньше полноразмерной аминокислотной последовательности. Указанный фрагмент может возникнуть, например, в результате укорочения на амино-конце, укорочения на карбокси-конце и/или внутренней делеции остатка(ов) аминокислотной последовательности. Фрагменты, например, могут возникнуть в результате альтернативного сплайсинга РНК или активности протеаз в условиях in vivo. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фрагменты бета-клото включают полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, содержащую 110 меньшей мере 5 смежных остатков аминокислот, 110 меньшей мере 10 смежных остатков аминокислот, 110 меньшей мере 15 смежных остатков аминокислот, 110 меньшей мере 20 смежных остатков аминокислот, 110 меньшей мере 25 смежных остатков аминокислот, 110 меньшей мере 40 смежных остатков аминокислот, 110 меньшей мере 50 смежных остатков аминокислот, 110 меньшей мере 60 смежных остатков аминокислот, 110 меньшей мере 70 смежных остатков аминокислот, 110 меньшей мере 80 смежных остатков аминокислот, 110 меньшей мере 90 смежных остатков аминокислот, 110 меньшей мере 100 смежных остатков аминокислот, 110 меньшей мере 125 смежных остатков аминокислот, 110 меньшей мере 150 смежных остатков аминокислот, 110 меньшей мере 175 смежных остатков аминокислот, 110 меньшей мере 200 смежных остатков аминокислот, 110 меньшей мере 250, 110 меньшей мере 300, 110 меньшей мере 350, 110 меньшей мере 400, 110 меньшей мере 450, 110 меньшей мере 500, 110 меньшей мере 550, 110 меньшей мере 600, 110 меньшей мере 650, 110 меньшей мере 700, 110 меньшей мере 750, 110 меньшей мере 800, 110 меньшей мере 850, 110 меньшей мере 900 или 110 меньшей мере 950 смежных остатков аминокислот аминокислотной последовательности полипептида бета-клото или антитела, которое связывается с полипептидом бета-клото. Согласно конкретному варианту реализации фрагмент полипептида бета-клото или антитело, которое связывается с антигеном бета-клото, сохраняет 110 меньшей мере 1, 110 меньшей мере 2, или 110 меньшей мере 3 или более функций полипептида или антитела.

[000180] Термины «контролировать», «контролирующий» и «контроль» относятся к благоприятному влиянию, которое получает субъект в результате терапии (например, с применением профилактического или терапевтического агента), которое не приводит к излечению заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъекту вводят один или более терапевтических агентов (например, профилактических или терапевтических агентов, таких как антитело согласно настоящему изобретению), чтобы «контролировать» заболевание, опосредованное бета-клото, или один или более его симптомов, для того чтобы предотвратить прогрессирование или ухудшение заболевания.

[000181] Термины «примерно» или «приблизительно» означают в пределах 20%, в пределах 15%, в пределах 10%, в пределах 9%, в пределах 8%, в пределах 7%, в пределах 6%, в пределах 5%, в пределах 4%, в пределах 3%, в пределах 2%, в пределах 1% или меньше заданного значения или диапазона.

[000182] Термин «вводить» или «введение» относится к инъекции или физической доставке иным образом вещества, поскольку оно присутствует вне организма (например, антитела к бета-клото, описанного в настоящей заявке), пациенту, например, через слизистую оболочку, с помощью внутрикожной, внутривенной, внутримышечной доставки и/или любого другого способа физической доставки, описанного в настоящей заявке, или способом, известным в данной области техники. При лечении заболевания, расстройства или состояния, или их симптома, введение вещества, как правило, происходит после начала развития заболевания, расстройства или состояния, или их симптомов. При предотвращении заболевания, расстройства или состояния или их симптомов, введение вещества, как правило, происходит до начала развития заболевания, расстройства или состояния или их симптомов.

[000183] Применительно к полипептиду в настоящей заявке термин «аналог» относится к полипептиду, который обладает аналогичной или идентичной функцией, что и полипептид бета-клото, фрагмент полипептида бета-клото или антитело к бета-клото, но не обязательно содержат аминокислотную последовательность, которая аналогична или идентична таковой полипептида бета-клото, фрагмента полипептида бета-клото или антитела к бета-клото, или обладает структурой, которая аналогична или идентична таковой полипептида бета-клото, фрагмента полипептида бета-клото или антитела к бета-клото. Полипептид, который имеет аналогичную аминокислотную последовательность, относится к полипептиду, который удовлетворяет 110 меньшей мере одному из следующих условий: (а) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая 110 меньшей мере на 30%, 110 меньшей мере на 35%, 110 меньшей мере на 40%, 110 меньшей мере на 45%, 110 меньшей мере на 50%, 110 меньшей мере на 55%, 110 меньшей мере на 60%, 110 меньшей мере на 65%, 110 меньшей мере на 70%, 110 меньшей мере на 75%, 110 меньшей мере на 80%, 110 меньшей мере на 85%, 110 меньшей мере на 90%, 110 меньшей мере на 95%, или 110 меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности полипептида бета-клото (например, SEQ ID NO: 297), фрагмента полипептида бета-клото или антитела к бета-клото, описанного в настоящей заявке, (b) полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид бета-клото, фрагмент полипептида бета-клото или антитело к бета-клото (или его область VH или VL), описанное в настоящей заявке, содержащий 110 меньшей мере 5 остатков аминокислот, 110 меньшей мере 10 остатков аминокислот, 110 меньшей мере 15 остатков аминокислот, 110 меньшей мере 20 остатков аминокислот, 110 меньшей мере 25 остатков аминокислот, 110 меньшей мере 40 остатков аминокислот, 110 меньшей мере 50 остатков аминокислот, 110 меньшей мере 60 остатков аминокислот, 110 меньшей мере 70 остатков аминокислот, 110 меньшей мере 80 остатков аминокислот, 110 меньшей мере 90 остатков аминокислот, 110 меньшей мере 100 остатков аминокислот, 110 меньшей мере 125 остатков аминокислот или 110 меньшей мере 150 остатков аминокислот (см., например, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY); и (с) полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая 110 меньшей мере на 30%, 110 меньшей мере на 35%, 110 меньшей мере на 40%, 110 меньшей мере на 45%, 110 меньшей мере на 50%, 110 меньшей мере на 55%, 110 меньшей мере на 60%, 110 меньшей мере на 65%, 110 меньшей мере на 70%, 110 меньшей мере на 75%, 110 меньшей мере на 80%, 110 меньшей мере на 85%, 110 меньшей мере на 90%, 110 меньшей мере на 95%, или 110 меньшей мере на 99% идентична нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид бета-клото, фрагмент полипептида бета-клото или антитело к бета-клото (или его область VH или VL), описанное в настоящей заявке. Полипептид, структура которого аналогична структуре полипептида бета-клото, фрагмента полипептида бета-клото или антитела к бета-клото, описанного в настоящей заявке, относится к полипептиду, который имеет вторичную, третичную или четвертичную структуру, аналогичную таковой полипептида бета-клото, фрагмента бета-клото или антитела к бета-клото, описанного в настоящей заявке. Структура полипептида может быть определена способами, известными специалистам в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, рентгеновскую кристаллографию, ядерный магнитный резонанс и кристаллографическую электронную микроскопию.

[000184] Термин «композиция» включает продукт, содержащий определенные ингредиенты (например, антитело согласно настоящему изобретению) необязательно в определенных количествах, а также любой продукт, который, прямо или косвенно, получен из комбинации указанных ингредиентов, необязательно, в определенных количествах.

[000185] Применительно к полипептиду в настоящей заявке термин «производное» относится к полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность полипептида бета-клото, фрагмента полипептида бета-клото или антитела, связывающегося с полипептидом бета-клото, которая была изменена путем введения замен, делеций или добавлений остатков аминокислот. В настоящей заявке термин «производное» также относится к полипептиду бета-клото, фрагменту полипептида бета-клото или антителу, которое связывается с полипептидом бета-клото, который был химически модифицирован, например, путем ковалентного присоединения к полипептиду молекулы любого типа. Например, но не ограничиваясь этим, полипептид бета-клото, фрагмент полипептида бета-клото или антитело к бета-клото может быть химически модифицировано, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления, связывания с клеточным лигандом или другим белком и т.д. Производные модифицированы таким способом, который отличается от природных модификаций или модификаций исходного пептида или полипептида 110 типу или расположению прикрепленных молекул. Производные дополнительно содержат делецию одной или более химических групп, которые присутствуют на пептиде или полипептиде в природных условиях. Производное полипептида бета-клото, фрагмента полипептида бета-клото или антитела к бета-клото может быть химически модифицировано с помощью химических модификаций с использованием методик, известных специалистам в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, специфичное химическое расщепление, ацетилирование, придание фармацевтической формы, метаболический синтез туникамицина и т.д. Также производное полипептида бета-клото, фрагмента полипептида бета-клото или антитела к бета-клото может содержать одну или более неклассических аминокислот. Производное полипептида обладает функцией, которая аналогична или идентична таковой полипептида бета-клото, фрагмента полипептида бета-клото или антитела к бета-клото, описанного в настоящей заявке.

КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

[000186] В настоящем изобретении предложены связывающие белки, такие как антитела, которые связываются с бета-клото (например, бета-клото человека и/или бета-клото яванских макак). Антитела согласно настоящему изобретению можно применять, например, для диагностики или лечения заболеваний, расстройств или состояний, связанных с экспрессией бета-клото. Согласно некоторым вариантам реализации антитела согласно настоящему изобретению можно применять для диагностики или лечения заболеваний, расстройств или состояний, таких как сахарный диабет 2 типа, ожирение, дислипидемия, НАСГ, сердечно-сосудистые заболевания, метаболический синдром или в целом любого заболевания, расстройства или состояния, при котором желательной является имитация или усиление действия FGF19 и/или FGF21 в условиях in vivo.

[000187] В настоящем изобретении предложены антитела, которые связываются с полипептидом бета-клото, фрагментом полипептида бета-клото, пептидом бета-клото или эпитопом бета-клото. Согласно некоторым вариантам реализации антитела к бета-клото связываются с внеклеточным доменом (ВКД) бета-клото. В настоящем изобретении также предложены антитела, которые конкурентно блокируют связывание антитела к бета-клото согласно настоящему изобретению с полипептидом бета-клото. Антитела к бета-клото согласно настоящему изобретению также могут быть конъюгированы или гибридизованы рекомбинантным способом с диагностическим агентом, детектируемым агентом или терапевтическим агентом. В настоящем изобретении также предложены композиции, содержащие антитело к бета-клото.

[000188] В настоящем изобретении также предложены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих тяжелую цепь иммуноглобулина, легкую цепь иммуноглобулина, область VH, область VL, CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и/или CDR3 VL антител к бета-клото, которые связываются с полипептидом бета-клото, фрагментом полипептида бета-клото, пептидом бета-клото или эпитопом бета-клото. В настоящем изобретении также предложены векторы и клетки-хозяева, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела к бета-клото, которые связываются с полипептидом бета-клото, фрагментом полипептида бета-клото, пептидом бета-клото или эпитопом бета-клото. В настоящем изобретении также предложены способы получения антител, которые связываются с полипептидом бета-клото, фрагментом полипептида бета-клото, пептидом бета-клото или эпитопом бета-клото.

[000189] В настоящем изобретении также предложены способы применения антител к бета-клото. Способы включают лечение, предотвращение или облегчение заболевания, расстройства или состояния, включая лечение, предотвращение или облегчение одного или более симптомов заболевания, расстройства или состояния у субъекта. Неограничивающие примеры заболеваний, расстройств или состояний включают расстройства усвоения глюкозы и осложнения, связанные с ними, включая сахарный диабет (1 и 2 типов), гестационный диабет, гипергликемию, резистентность к инсулину, нарушение метаболизма глюкозы, «преддиабет» (нарушенный уровень глюкозы натощак (IFG) или нарушенная толерантность к глюкозе (ЮТ)), или другие физиологические расстройства, связанные или возникшие в результате гипергликемического состояния, включая, например, гистологические изменения, такие как разрушение панкреатических β-клеток. Например, субъекты, страдающие заболеванием, расстройством или состоянием, которые нуждаются в лечении, могут иметь уровень глюкозы в плазме крови натощак (FPG) превышающий приблизительно 100 мг/дл. Другие расстройства, связанные с гипергликемией, включают повреждение почек (например, повреждение канальцев или нефропатию), дегенерацию печени, повреждение глаз (например, диабетическую ретинопатию или катаракту) и синдром диабетической стопы. Другие заболевания, расстройства или состояния включают дислипидемии и их осложнения, такие как, например, атеросклероз, ишемическую болезнь сердца, цереброваскулярные заболевания и т.п. или иные заболевания, расстройства или состояния, которые могут быть связаны с метаболическим синдромом, такие как ожирение и повышенная масса тела (включая их сопутствующие состояния, такие как, но не ограничиваясь ими, неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП), неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) и синдром поликистозных яичников (СПКЯ)), или тромбозы, гиперкоагуляция и протромботические состояния (артериальные и венозные), гипертония, сердечно-сосудистые заболевания, инсульт и сердечная недостаточность. Перечисленные заболевания, расстройства или состояния включают атеросклероз, хронические воспалительные заболевания кишечника (например, болезнь Крона и неспецифичный язвенный колит), астму, системную красную волчанку, артрит или другие воспалительные ревматические заболевания. Другие заболевания, расстройства или состояния включают клеточные опухоли из жировой ткани, липоматозные карциномы, включая, например, липосаркомы, плотные опухоли и новообразования. Другие заболевания, расстройства или состояния включают нейродегенеративные заболевания и/или демиелинизирующие заболевания центральной и периферической нервной системы, и/или неврологические заболевания, включая нейровоспалительные процессы и/или другие периферические нейропатии, включая болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, болезнь Паркинсона, прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию и синдром Гийена-Барре. Другие заболевания, расстройства или состояния включают нарушения со стороны кожи и дерматологические нарушения и/или нарушения процессов заживления ран, включая эритема-плоскоклеточные дерматозы. Другие заболевания, расстройства или состояния включают синдром X, остеоартрит и острый респираторный дистресс-синдром. В настоящей заявке термин «гипергликемический» или «гипергликемия», при использовании в отношении заболевания, расстройства или состояния у субъекта, относится к кратковременному или хроническому аномально высокому уровню глюкозы в крови субъекта. Заболевание, расстройство или состояние может быть вызвано задержкой в метаболизме глюкозы или всасывании так, что субъект проявляет непереносимость глюкозы или имеет повышенный уровень глюкозы, который обычно не обнаруживается у нормальных субъектов (например, у субъектов с преддиабетом и непереносимостью глюкозы, входящих в группу риска развития диабета, или у пациентов с диабетом). Например, уровни глюкозы в плазме крови натощак (FPG) для нормогликемии могут быть ниже приблизительно 100 мг/дл, в случае нарушенного метаболизма глюкозы от приблизительно 100 до 126 мг/дл, а у пациентов с диабетом выше приблизительно 126 мг/дл. Способы предотвращения (например, у пациентов, предрасположенных к наличию конкретного расстройства) относятся к задержке, замедлению или ингибированию прогрессирования или начала, или лечению (например, облегчению) ожирения или нежелательной массы тела (например, превышающей нормальный индекс массы тела или «ИМТ», 110 сравнению с таковым у соответствующего субъекта сопоставимого возраста, пола, расы и т.д.). Способы лечения ожирения или нежелательной массы тела (включая сопутствующие состояния ожирения, например, обструктивное апноэ сна, артрит, рак (например, рак молочной железы, рак эндометрия и рак толстой кишки), камней в желчном пузыре или гипергликемии включают приведение в контакт или введение связывающего белка, такого как антитело к бета-клото, описанное в настоящей заявке, в количестве, эффективном для лечения ожирения или нежелательной массы тела. Например, субъект может иметь индекс массы тела выше 25, например, 25-30, 30-35, 35-40 или более 40. Способы предотвращения (например, у пациентов, предрасположенных к развитию конкретного расстройства) относятся к задержке, замедлению или ингибированию прогрессирования или начала, или лечению нежелательных уровней или патологически повышенных уровней ЛПНП, ЛПОНП, триглицеридов и холестерина в сыворотке/плазме крови, все из которых, 110 отдельности или в комбинации, могут привести, например, к образованию бляшек, сужению или закупорке кровеносных сосудов, а также повышенному риску развития гипертензии, инсульта и ишемической болезни сердца. Указанные заболевания, расстройства или состояния могут быть обусловлены, например, генетической предрасположенностью или рационом питания.

Антитела к бета-клото

[000190] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложены антитела к бета-клото, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением в качестве терапевтических агентов. Примеры антител включают поликлональные, моноклональные, гуманизированные, человеческие, биспецифичные и гетероконъюгатные антитела, а также их варианты, имеющие улучшенную аффинность или другие свойства.

[000191] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены антитела, которые связываются с бета-клото, включая полипептид бета-клото, фрагмент полипептида бета-клото, пептид бета-клото или эпитоп бета-клото. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела к бета-клото представляют собой гуманизированные антитела (например, содержащие константные области человека), которые связываются с бета-клото, включая полипептид бета-клото, фрагмент полипептида бета-клото, пептид бета-клото или эпитоп бета-клото.

[000192] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело к бета-клото содержит область VH, область VL, CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и/или CDR3 VL любого из моноклональных антител мыши, описанных в настоящей заявке, например, аминокислотную последовательность, приведенную в таблицах 1-10. Соответственно, в некоторых вариантах реализации, выделенное антитело или его функциональный фрагмент согласно настоящему изобретению содержит одну, две и/или три CDR тяжелой цепи, и/или одну, две и/или три CDR легкой цепи из: (а) антитела, обозначенного 5Н23; (b) антитела, обозначенного 1С17; (с) антитела, обозначенного 1D19; (d) антитела, обозначенного 2L12; (е) антитела, обозначенного 3L3; (f) антитела, обозначенного 3N20; (g) антитела, обозначенного 4Р5; (h) антитела, обозначенного 5С23; (i) антитела, обозначенного 5F7; (j) антитела, обозначенного 1G19, представленных в таблицах 1-10.

[000193] Антитело, обозначенное 5Н23, содержит последовательность VH, которая приведена в SEQ ID NO: 25, и последовательность VL, которая приведена в SEQ ID NO: 26.

[000194] Антитело, обозначенное 1С17, содержит последовательность VH, которая приведена в SEQ ID NO: 51, и последовательность VL, которая приведена в SEQ ID NO: 52.

[000195] Антитело, обозначенное 1D19, содержит последовательность VH, которая приведена в SEQ ID NO: 77, и последовательность VL, которая приведена в SEQ ID NO: 78.

[000196] Антитело, обозначенное 2L12, содержит последовательность VH, которая приведена в SEQ ID NO: 103, и последовательность VL, которая приведена в SEQ ID NO: 104.

[000197] Антитело, обозначенное 3L3, содержит последовательность VH, которая приведена в SEQ ID NO: 129, и последовательность VL, которая приведена в SEQ ID NO: 130.

[000198] Антитело, обозначенное 3N20, содержит последовательность VH, которая приведена в SEQ ID NO: 155, и последовательность VL, которая приведена в SEQ ID NO: 156.

[000199] Антитело, обозначенное 4Р5, содержит последовательность VH, которая приведена в SEQ ID NO: 181, и последовательность VL, которая приведена в SEQ ID NO: 182.

[000200] Антитело, обозначенное 5С23, содержит последовательность VH, которая приведена в SEQ ID NO: 207, и последовательность VL, которая приведена в SEQ ID NO: 208.

[000201] Антитело, обозначенное 5F7, содержит последовательность VH, которая приведена в SEQ ID NO: 233, и последовательность VL, которая приведена в SEQ ID NO: 234.

[000202] Антитело, обозначенное IG19, содержит последовательность VH, которая приведена в SEQ ID NO: 259, и последовательность VL, которая приведена в SEQ ID NO: 260.

[000204] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению содержат область VH или домен VH. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению содержат область VL или цепь VL. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению содержат комбинацию (i) домена VH или области VH; и/или (ii) домена VL или области VL.

[000205] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения антитело согласно настоящему изобретению содержит или состоит из шести CDR, например, CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и/или CDR3 VL, определенных в таблицах 1-10. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения антитело согласно настоящему изобретению может содержать менее шести CDR. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит или состоит из одной, двух, трех, четырех или пяти CDR, выбранных из группы, состоящей из CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и/или CDR3 VL, определенных в таблицах 1-10. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит или состоит из одной, двух, трех, четырех или пяти CDR, выбранных из группы, состоящей из CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и/или CDR3 VL мышиного моноклонального антитела, выбранного из группы, состоящей из: (а) антитела, обозначенного 5Н23; (b) антитела, обозначенного 1С17; (с) антитела, обозначенного 1D19; (d) антитела, обозначенного 2L12; (е) антитела, обозначенного 3L3; (f) антитела, обозначенного 3N20; (g) антитела, обозначенного 4Р5; (h) антитела, обозначенного 5С23; (i) антитела, обозначенного 5F7; (j) антитела, обозначенного 1G19; описанных в настоящей заявке. Соответственно, в некоторых вариантах реализации антитело содержит или состоит из любой одной, двух, трех, четырех или пяти CDR из CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и/или CDR3 VL, определенных в таблицах 1-10.

[000206] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению содержат одну или более (например, одну, две или три) CDR VH, перечисленных в таблицах 1-10. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению содержат одну или более (например, одну, две или три) CDR VL, перечисленных в таблицах 1-10. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению содержат одну или более (например, одну, две или три) CDR VH, перечисленных в таблицах 1-10, и одну или более CDR VL, перечисленных в таблицах 1-10. Соответственно, в некоторых вариантах реализации антитела содержат CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела содержат CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела содержат CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254. Согласно некоторым вариантам реализации антитела содержат CDR1 VH и/или CDR2 VH и/или CDR3 VH, которые независимо выбраны из CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, приведенных в любой из аминокислотных последовательностей, перечисленных в таблицах 1-10. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела содержат CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255. Согласно другому варианту реализации антитела содержат CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела содержат CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела содержат CDR1 VL и/или CDR2 VL, и/или CDR3 VL, которые независимо выбраны из CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3, VL, приведенных в любой из аминокислотных последовательностей, перечисленных в таблицах 1-10.

[000207] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую: (1) CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 1, 27, 53, 79, 105, 131, 157, 183, 209 и/или 235, (ii) SEQ ID NO: 7, 33, 59, 85, 111, 137, 163, 189, 215 или 241, (iii) SEQ ID NO: 12, 38, 64, 90, 116, 142, 168, 194, 220 или 246, (iv) SEQ ID NO: 13, 39, 65, 91, 117, 143, 169, 195, 221 или 247, и (v) SEQ ID NO: 18, 44, 70, 96, 122, 148, 174, 200, 226 или 252; (2) CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 2, 28, 54, 80, 106, 132, 158, 184, 210 и/или 236, (ii) SEQ ID NO: 8, 34, 60, 86, 112, 138, 164, 190, 216 или 242, (iii) SEQ ID NO: 14, 40, 66, 92, 118, 144, 170, 196, 222 или 248, (iv) SEQ ID NO: 19, 45, 71, 97, 123, 149, 175, 201, 227 или 253, и (v) SEQ ID NO: 24, 50, 76, 102, 128, 154, 180, 206, 232 или 258; и (3) CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 3, 29, 55, 81, 107, 133, 159, 185, 211 и/или 237, (ii) SEQ ID NO: 9, 35, 61, 87, 113, 139, 165, 191, 217 или 243, (iii) SEQ ID NO: 15, 41, 67, 93, 119, 145, 171, 197, 223 или 249, и (iv) SEQ ID NO: 20, 46, 72, 98, 124, 150, 176, 202, 228 или 254; и/или вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую: (1) CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 4, 30, 56, 82, 108, 134, 160, 186, 212 и/или 238, (ii) SEQ ID NO: 10, 36, 52, 88, 114, 140, 166, 192, 218 или 244, (iii) SEQ ID NO: 16, 42, 68, 94, 120, 146, 172, 198, 224 или 250, и (iv) SEQ ID NO: 21, 47, 73, 99, 125, 151, 177, 203, 229 или 255; (2) CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 5, 31, 57, 83, 109, 135, 161, 187, 213 и/или 239, (ii) SEQ ID NO: 11, 37, 63, 89, 115, 141, 167, 193, 219 или 245, и (iii) SEQ ID NO: 22, 48, 74, 100, 126, 152, 178, 204, 230 или 256; и (3) CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 6, 32, 58, 84, ПО, 136, 162, 188, 214 и/или 240, (ii) SEQ ID NO: 17, 43, 69, 95, 121, 147, 173, 199, 225 или 251, и (iii) SEQ ID NO: 23, 49, 75, 101, 127, 153, 179, 205,231 или 257.

[000208] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую: (1) CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 1, 27, 53, 79, 105, 131, 157, 183, 209 и/или 235, (ii) SEQ ID NO: 7, 33, 59, 85, 111, 137, 163, 189, 215 или 241, (iii) SEQ ID NO: 12, 38, 64, 90, 116, 142, 168, 194, 220 или 246, (iv) SEQ ID NO: 13, 39, 65, 91, 117, 143, 169, 195, 221 или 247, и (v) SEQ ID NO: 18, 44, 70, 96, 122, 148, 174, 200, 226 или 252; (2) CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 2, 28, 54, 80, 106, 132, 158, 184, 210, и/или 236, (ii) SEQ ID NO: 8, 34, 60, 86, 112, 138, 164, 190, 216 или 242, (iii) SEQ ID NO: 14, 40, 66, 92, 118, 144, 170, 196, 222 или 248, (iv) SEQ ID NO: 19, 45, 71, 97, 123, 149, 175, 201, 227 или 253, и (v) SEQ ID NO: 24, 50, 76, 102, 128, 154, 180, 206, 232 или 258; и (3) CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 3, 29, 55, 81, 107, 133, 159, 185, 211 и/или 237, (ii) SEQ ID NO: 9, 35, 61, 87, 113, 139, 165, 191, 217 или 243, (iii) SEQ ID NO: 15, 41, 67, 93, 119, 145, 171, 197, 223 или 249, и (iv) SEQ ID NO: 20, 46, 72, 98, 124, 150, 176, 202, 228 или 254.

[000209] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению содержат вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую: (1) CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 4, 30, 56, 82, 108, 134, 160, 186, 212, и/или 238, (ii) SEQ ID NO: 10, 36, 52, 88, 114, 140, 166, 192, 218 или 244, (iii) SEQ ID NO: 16, 42, 68, 94, 120, 146, 172, 198, 224 или 250, и (iv) SEQ ID NO: 21, 47, 73, 99, 125, 151, 177, 203, 229 или 255; (2) CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 5, 31, 57, 83, 109, 135, 161, 187, 213, и/или 239, (ii) SEQ ID NO: 11, 37, 63, 89, 115, 141, 167, 193, 219 или 245, и (iii) SEQ ID NO: 22, 48, 74, 100, 126, 152, 178, 204, 230 или 256; и (3) CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 6, 32, 58, 84, ПО, 136, 162, 188, 214 и/или 240, (ii) SEQ ID NO: 17, 43, 69, 95, 121, 147, 173, 199, 225 или 251, и (iii) SEQ ID NO: 23, 49, 75, 101, 127, 153,179, 205, 231 или 257.

[000210] В настоящем изобретении также предложены антитела, содержащие одну или более CDR VH и одну или более (например, одну, две или три) CDR VL, перечисленных в таблицах 1-10. В частности, в настоящем изобретении предложено антитело, содержащее CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252) и CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252); CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256) и CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257) и CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258); CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255) и CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258); и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254) и CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255); CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254) и CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256); VH CDR3 (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254) и VL CDR3 (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), VH CDR2 (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258) и CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258) и VL CDR2 (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256); VH CDR1 (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142,143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), VH CDR3 (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254) и CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255), CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254) и CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256); CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252.), CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255) и CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255) и CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256); CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14,19, 24, 28, 34,40,45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254), CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255) и CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256); CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254), CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254), CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254) и CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254) и CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255)hCDR2 VL(SEQ ID NO: 5, 11,22,31,37,48,57, 63,74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254), CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255) и CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254), CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254), CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR3 VH (SEQ ED NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254), CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255) и CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256); CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254), CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255); CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254), CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254), CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255) и CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254), CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254), CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255), CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR1 VH (SEQ ID NO: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247 и 252), CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254), CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255), CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256) и CDR3 VL (SEQ ID NO: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251 и 257); CDR2 VH (SEQ ID NO: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253 и 258), CDR3 VH (SEQ ID NO: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98,107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249 и 254), CDR1 VL (SEQ ID NO: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250 и 255), CDR2 VL (SEQ ID NO: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245 и 256) или любую комбинацию CDR VH и CDR VL, перечисленных в таблицах 1-10.

[000211] Согласно другому аспекту CDR, раскрытые в настоящей заявке, содержат консенсусные последовательности, полученные из групп родственных антител (см., например, таблицы 1-10). В настоящей заявке раскрыто, что «консенсусная последовательность» относится к аминокислотным последовательностям, содержащим консервативные аминокислоты, которые являются аналогичными у множества последовательностей, и вариабельные аминокислоты, которые изменяются в данных аминокислотных последовательностях. Консенсусные последовательности CDR согласно настоящему изобретению включают CDR, соответствующие CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и/или CDRL3. Консенсусные последовательности CDR антитела к бета-клото приведены на фигуре 2.

[000212] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело или его фрагмент, описанный в настоящей заявке, содержит область VH, которая содержит: (1) FR1 VH, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378; (2) FR2 VH, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 281, 282 и 283; (3) FR3 VH, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381; и/или (4) FR4 VH, содержащий аминокислоту из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 288. Соответственно, согласно некоторым аспектам, гуманизированное антитело содержит область VH, которая содержит FR1 VH, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378. Согласно некоторым аспектам гуманизированное антитело содержит область VH, которая содержит FR2 VH, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 281, 282 и 283. Согласно некоторым аспектам гуманизированное антитело содержит область VH, которая содержит FR3 VH, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения гуманизированное антитело содержит область VH, которая содержит FR4 VH, содержащий аминокислоту, выбранную из SEQ ID NO: 288.

[000213] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело или его фрагмент, описанный в настоящей заявке, содержит область VL, которая содержит: (1) FR1 VL, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384; (2) FR2 VL, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392; (3) FR3 VL, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404; и/или (4) FR4 VL, содержащий аминокислоту из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 296 и 405-407. Соответственно, согласно некоторым аспектам, гуманизированное антитело содержит область VL, которая содержит FR1 VL, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения гуманизированное антитело содержит область VL, которая содержит FR2 VL, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения гуманизированное антитело содержит область VL, которая содержит FR3 VL, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения гуманизированное антитело содержит область VL, которая содержит FR4 VL, содержащий аминокислоту из последовательности SEQ ID NO: 296 и 405-407.

[000214] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело или его фрагмент, описанный в настоящей заявке, содержит область VH и область VL, при этом область VH дополнительно содержит: (1) FR1 VH, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378; (2) FR2 VH, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 281, 282 и 283; (3) FR3 VH, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381; и/или (4) FR4 VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 288; и при этом область VL дополнительно содержит: (1) FR1 VL, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384; (2) FR2 VL, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392; (3) FR3 VL, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404; и/или (4) FR4 VL, содержащий аминокислоту из последовательности, приведенной в SEQ ED NO: 296 и 405-407.

[000215] В настоящем изобретении также предложены антитела, содержащие один или более (например, один, два, три или четыре) FR VH и один или более FR VL, перечисленных в таблице 19. В частности, в настоящем изобретении предложено антитело, содержащее FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378) и FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283) и FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384); FR2 VH (SEQ ED NO: 281, 282 и 283) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381) и FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ED NO: 281, 282 и 283) и FR1 VL (SEQ ED NO: 289, 290 и 382-384); FR1 VH (SEQ ED NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283) и FR2 VL (SEQ ED NO: 291, 292 и 385-392); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283) и FR3 VL (SEQ ED NO: 293, 294, 295 и 393-404), FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ED NO: 281, 282 и 283) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ED NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381) и FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381) и FR3 VL (SEQ ED NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR1 VL (SEQ ED NO: 289, 290 и 382-384) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393- 404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ED NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393- 404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381) и FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288) и FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288) и FR4 VL (SEQ ID NO: NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288) и FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288) и FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR4 VL(SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR4 VL (SEQ ID NO: NO: 296 и 405-407); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: NO: 296 и 405-407); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ED NO: 278, 279, 280 и 378), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ED NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ED NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ED NO: 288), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ED NO: 278, 279, 280 и 378), FR1 VL (SEQ ED NO: 289, 290 и 382-384), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ED NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ED NO: 281, 282 и 283), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ED NO: 281, 282 и 283), FR2 VL (SEQ ED NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ED NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ED NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR2 VL (SEQ ED NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ED NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ED NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ED NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR3 VL (SEQ ED NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ED NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR3 VH (SEQ ED NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR1 VL (SEQ ED NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ED NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ED NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ED NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ED NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392); FR1 VH (SEQ ED NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ED NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ED NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR3 VH (SEQ ED NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ED NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ED NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ED NO: 291, 292 и 385-392) и FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR2 VL (SEQ ED NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ED NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ED NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR1 VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280 и 378), FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ID NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); FR2 VH (SEQ ID NO: 281, 282 и 283), FR3 VH (SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287 и 379-381), FR4 VH (SEQ ID NO: 288), FR1 VL (SEQ ID NO: 289, 290 и 382-384), FR2 VL (SEQ ID NO: 291, 292 и 385-392), FR3 VL (SEQ ED NO: 293, 294, 295 и 393-404) и FR4 VL (SEQ ID NO: 296 и 405-407); или любую комбинацию FR VH (SEQ ID NO: 278, 279, 280, 378, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 379-381 и 288) и FR VL (SEQ ID NO: 289, 290, 382-384, 291, 292, 385-392, 293, 294, 295, 393-404, 296, 405-407), перечисленных в таблице 19.

[000216] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложены антитела, которые конкурируют с одним из типичных антител или функциональных фрагментов за связывание с (i) бета-клото или (ii) комплексом, содержащим бета-клото и один из FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c и FGFR4. Указанные антитела также могут связываться с тем же эпитопом, что и одно из типичных антител согласно настоящему изобретению, или с перекрывающимся эпитопом. Антитела и их фрагменты, которые конкурируют или связываются с тем же эпитопом, что типичные антитела, как ожидается, будут иметь аналогичные функциональные свойства. Типичные антигенсвязывающие белки и фрагменты включают те, которые содержат области VH и VL, и CDR согласно настоящему изобретению, включая те, которые перечислены в таблицах 1-10. Следовательно, в качестве конкретного примера, антитела, которые предложены в настоящей заявке, включают те, которые конкурируют с антителом, содержащим: (а) 1, 2, 3, 4, 5 или все 6 из CDR согласно настоящему изобретению для антител, перечисленных в таблицах 1-10; (b) VH и VL, выбранные из областей VH и VL согласно настоящему изобретению для антител, перечисленных в таблицах 1-10, например, антитела 5Н23 (таблица 1) или (с) две легкие цепи и две тяжелые цепи, содержащие VH и VL согласно настоящему изобретению для антител, перечисленных в таблицах 1-10. Согласно другому аспекту в настоящей заявке предложены антитела, которые связываются с областью, включая эпитоп, бета-клото человека или бета-клото яванских макак. Например, согласно некоторым вариантам реализации, антитело согласно настоящему изобретению связывается с доменом KLB2 бета-клото человека, содержащим остатки аминокислот с 509 110 1044 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297. В другом примере, согласно некоторым вариантам реализации, антитело согласно настоящему изобретению связывается с областью гликозилгидролазы 1 домена KLB2 бета-клото человека, содержащей остатки аминокислот с 517 110 967 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297. В другом примере, согласно некоторым вариантам реализации, антитело согласно настоящему изобретению связывается с областью бета-клото человека, содержащей остатки аминокислот с 657 110 703 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297. В другом примере, согласно некоторым вариантам реализации, антитело согласно настоящему изобретению связывается с областью бета-клото яванских макак, содержащей остатки аминокислот с 657 110 703 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 299.

[000217] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложены антитела, которые связываются со специфичным эпитопом бета-клото человека. Например, согласно некоторым вариантам реализации, антитело согласно настоящему изобретению связывается с эпитопом бета-клото человека, содержащим 110 меньшей мере один из остатков аминокислот 657, 701 и/или 703 бета-клото человека (SEQ ID NO: 297). Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации, антитело согласно настоящему изобретению связывается с эпитопом бета-клото человека, причем указанный эпитоп бета-клото человека содержит 110 меньшей мере остаток аминокислоты 657 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело согласно настоящему изобретению связывается с эпитопом бета-клото человека, причем указанный эпитоп бета-клото человека содержит 110 меньшей мере остаток аминокислоты 701 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297. Согласно некоторым вариантам реализации антитело согласно настоящему изобретению связывается с эпитопом бета-клото человека, причем указанный эпитоп бета-клото человека содержит 110 меньшей мере остаток аминокислоты 703 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297. Согласно некоторым вариантам реализации антитело согласно настоящему изобретению связывается с эпитопом бета-клото человека, причем указанный эпитоп бета-клото человека содержит 110 меньшей мере остатки аминокислот 657 и 701 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297. Согласно некоторым вариантам реализации антитело согласно настоящему изобретению связывается с эпитопом бета-клото человека, причем указанный эпитоп бета-клото человека содержит 110 меньшей мере остатки аминокислот 657 и 703 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297. Согласно некоторым вариантам реализации антитело согласно настоящему изобретению связывается с эпитопом бета-клото человека, причем указанный эпитоп бета-клото человека содержит 110 меньшей мере остатки аминокислот 701 и 703 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297. Согласно некоторым вариантам реализации антитело согласно настоящему изобретению связывается с эпитопом бета-клото человека, причем указанный эпитоп бета-клото человека содержит 110 меньшей мере остатки аминокислот 657, 701 и 703 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 297. Указанные антитела, предложенные выше, могут, согласно некоторым вариантам реализации, индуцировать передачу сигналов, аналогичную таковой для FGF21 или FGF21, в клетке, которая экспрессирует бета-клото человека и рецептор FGF. Помимо этого, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, антитело представляет собой гуманизированное, человеческое или химерное антитело.

1. Поликлональные антитела

[000218] Антитела согласно настоящему изобретению могут включать поликлональные антитела. Способы получения поликлональных антител известны специалистам в данной области техники. Выработка поликлональных антител может быть индуцирована в организме млекопитающего, например, с помощью одной или более инъекций иммунизирующего агента и, если необходимо, адъюванта. Как правило, иммунизирующий агент и/или адъювант будет инъецирован млекопитающему с помощью многократных подкожных или внутрибрюшинных инъекций. Иммунизирующий агент может содержать полипептид бета-клото или его гибридный белок. Иммунизирующий агент может быть конъюгирован с белком, который, как известно, является иммуногенным у млекопитающего, которое иммунизируют, или млекопитающее можно иммунизировать с использованием белка и одного или более адъювантов. Примеры подходящих иммуногенных белков включают, но не ограничиваются ими, гемоцианин лимфы улитки, сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин и соевый ингибитор трипсина. Примеры адъювантов, которые могут быть использованы, включают Ribi, CpG, Poly 1С, полный адъювант Фрейнда и адъювант MPL-TDM (монофосфориллипид А, синтетический дикориномиколат трегалозы). Протокол иммунизации может быть выбран специалистом в данной области техники без проведения дополнительных экспериментов. После этого у млекопитающего берут образец крови, и сыворотку крови количественно исследуют для определения титра антител к бета-клото. В случае необходимости, млекопитающее может быть повторно иммунизировано до тех пор, пока титр антител увеличивается или достигает плато. Помимо этого, или в другом варианте, от иммунизированного животного могут быть получены лимфоциты для слияния и получения моноклональных антител из гибридомы, описанной ниже.

2. Моноклональные антитела

[000219] В другом варианте антитела согласно настоящему изобретению могут представлять собой моноклональные антитела. Моноклональные антитела могут быть получены с использованием метода гибридом, впервые описанного Kohler et at, Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены с помощью методов рекомбинантных ДНК (см., например, патент США №4816567).

[000220] При использовании метода гибридом мышь или другое подходящее животное-хозяина, такое как хомяк, иммунизируют, как описано выше для индукции лимфоцитов, которые вырабатывают или способны вырабатывать антитела, которые будут специфично связываться с белком, используемым для иммунизации. В другом варианте лимфоциты могут быть иммунизированы в условиях in vitro. После иммунизации лимфоциты выделяют и затем гибридизуют с линией клеток миеломы с использованием подходящего агента для гибридизации, такого как полиэтиленгликоль, чтобы получить клетки гибридомы (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

[000221] Клетки гибридомы, полученные таким способом, высевают и размножают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, которые ингибируют размножение или выживание негибридизованных исходных клеток миеломы (также называемых партнером для гибридизации). Например, если в исходных клетках миеломы отсутствует фермент гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT или HPRT), то селективная культуральная среда для гибридом, как правило, будет включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), поскольку указанные вещества предотвращают рост HGPRT-дефицитных клеток.

[000222] Клетки миеломы, которые являются предпочтительными партнерами для гибридизации, включают те, которые эффективно гибридизуются, поддерживают стабильный высокий уровень выработки антител отобранными клетками, вырабатывающими антитела, и чувствительны к селективной среде, которая позволяет отбирать гибридные клетки из негибридизованных исходных клеток. Предпочтительные линии клеток миеломы представляют собой линии клеток миеломы мыши, такие как линия SP-2 и ее производные, например, клетки X63-Ag8-653, которые доступны из Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния, США), и те, которые получены из опухолей мыши МОРС-21 и МРС-11, доступных из Центра распределения клеток Института Солка (Сан-Диего, Калифорния, США). Линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека также были описаны для получения моноклональных антител человека (Kozbor, J., Immunol., 133:3001 (1984); и Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

[000223] Культуральную среду, в которой выращивают клетки гибридомы, количественно исследуют для определения количества вырабатываемых моноклональных антител, направленных к антигену. Специфичность связывания моноклональных антител, вырабатываемых клетками гибридомы, определяют с помощью иммунопреципитации или количественного исследования связывания в условиях in vitro, такого как радиоиммуноанализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Аффинность связывания моноклонального антитела можно определить, например, с помощью анализа Скэтчарда, описанного в Munson et al.,Anal. Biochem., 107:220 (1980).

[000224] После выявления клеток гибридомы, которые вырабатывают антитела с требуемой специфичностью, аффинностью и/или активностью, клоны могут быть субклонированы с помощью методик предельного разведения и размножены стандартными способами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Культуральные среды, подходящие для этой цели, включают, например, среду DMEM или RPMI-1640. Помимо этого, клетки гибридомы могут быть размножены в условиях in vivo в виде асцитных опухолей у животного, например, путем внутрибрюшинной инъекции клеток мышам.

[000225] Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, соответствующим способом отделяют от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки с использованием обычных методик очистки антител, таких как, например, аффинная хроматография (например, с использованием белка А или белка G-сефарозы) или ионообменная хроматография, хроматография на гидроксилапатитном носителе, гель-электрофорез, диализ и т.п.

[000226] ДНК, кодирующая моноклональные антитела, может быть легко выделена и секвенирована с использованием обычных методик (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Клетки гибридом служат в качестве предпочтительного источника указанной ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в векторы для экспрессии, которые затем трансфецируют в клетки-хозяева, такие как клетки E.coli, клетки обезьяны COS, клетки яичника китайского хомяка (СНО) или клетки миеломы, которые исходно не вырабатывают антитела, чтобы синтезировать моноклональные антитела в рекомбинантных клетках-хозяевах. Обзорные статьи 110 способам рекомбинантной экспрессии ДНК, кодирующей антитело, в бактериях включают работы Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) и , Immunol. Revs. 130:151-188 (1992).

[000227] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело, которое связывается с эпитопом бета-клото, содержит аминокислотную последовательность домена VH и/или аминокислотную последовательность домена VL, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с (1) последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей любую одну из областей VH и/или VL, описанных в настоящей заявке, в жестких условиях (например, гибридизация с ДНК, связанной с фильтром, в 6× растворе хлорида натрия/цитрата натрия (SSC) при приблизительно 45°С с последующей одной или более промывками в 0,2×SSC/0,1% ДСН при температуре приблизительно 50-65°С), в очень жестких условиях (например, гибридизация с нуклеиновой кислотой, связанной на фильтре, в 6×SSC при температуре приблизительно 45°С с последующей одной или более промывками в 0,1×SSC/0,2% ДСН при температуре приблизительно 68°С), или в других жестких условиях гибридизации, которые известны специалистам в данной области техники (см., например, Ausubel, F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York стр. 6.3.1-6.3.6 и 2.10.3).

[000228] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело, которое связывается с эпитопом бета-клото, содержит аминокислотную последовательность CDR VH или аминокислотную последовательность CDR VL, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей любую из CDR VH и/или CDR VL, перечисленных в таблицах 1-10, в жестких условиях (например, гибридизация с ДНК, связанной с фильтром, в 6× SSC при приблизительно 45°С с последующей одной или более промывками в 0,2×SSC/0,1% ДСН при температуре приблизительно 50-65°С), в очень жестких условиях (например, гибридизация с нуклеиновой кислотой, связанной с фильтром, в 6× SSC при приблизительно 45°С с последующей одной или более промывками в 0,1×SSC/0,2% ДСН при температуре приблизительно 68°С), или в других жестких условиях гибридизации, которые известны специалистам в данной области техники (см., например, Ausubel, F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology. Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York стр. 6.3.1-6.3.6 и 2.10.3)

[000229] Согласно другому варианту реализации моноклональные антитела или фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, полученных с помощью методик, описанных в, например, Antibody Phage Display: Methods and Protocols, P.M. O'Brien and R. Aitken, eds, Humana Press, Totawa N.J., 2002. В целом, клоны синтетических антител выбирают с помощью скрининга фаговых библиотек, содержащих фаги, которые экспрессируют различные фрагменты вариабельной области (Fv) антитела, гибридизованной с белком оболочки фага. Указанные фаговые библиотеки подвергают скринингу путем связывания с желаемым антигеном. Клоны, экспрессирующие фрагменты Fv, которые способны связываться с желаемым антигеном, адсорбируют на антигене и тем самым отделяют от несвязанных клонов в библиотеке. Связывающиеся клоны затем элюируют от антигена и могут подвергать дополнительным этапам обогащения с помощью циклов адсорбции/элюции от антигена.

[000230] Вариабельные домены могут быть функционально экспрессированы на фаге в виде одноцепочечных фрагментов Fv (scFv), в которых VH и VL ковалентно связаны посредством короткого гибкого пептида, или в виде фрагментов Fab, в которых каждый из них гибридизован с константным доменом и взаимодействует нековалентно, как описано, например, в Winter et al.,Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994).

[000231] Репертуары генов VH и VL могут быть клонированы 110 отдельности с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рекомбинированы случайным образом в фаговых библиотеках, которые затем могут быть подвергнуты скринингу для выявления антигенсвязывающих клонов, как описано в Winter et al., выше. Библиотеки из иммунизированных источников обеспечивают высокоаффинные антитела к иммуногену без необходимости конструирования гибридом. В другом варианте наивный репертуар может быть клонирован, чтобы обеспечить единый источник антител человека к широкому спектру неаутоантигенов, а также аутоантигенов, без необходимости проведения иммунизации, как описано в работе Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). И, наконец, наивные библиотеки также могут быть получены синтетическими способами путем клонирования неперегруппированных сегментов V-гена из стволовых клеток, а также с использованием ПЦР-праймеров, содержащих случайную последовательность, чтобы кодировать гипервариабельные области CDR3 и осуществить перегруппировку в условиях in vitro, как описано, например, в работе Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).

[000232] Скрининг библиотек можно осуществлять с помощью различных методик, известных в данной области техники. Например, бета-клото (например, полипептид, фрагмент или эпитоп бета-клото) можно использовать для покрытия лунок планшетов для адсорбции, экспрессии на клетках-хозяевах, прикрепленных к планшетам для адсорбции, или использовать при сортировке клеток, или конъюгировать с биотином для захвата с помощью гранул, покрытых стрептавидином, или использовать в любом другом способе пэннинга библиотек дисплея. Отбор антител с медленной кинетикой диссоциации (например, хорошей аффинностью связывания) можно улучшить путем использования длительных промывок и моновалентного фагового дисплея, описанного в Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) и в WO 92/09690, а также низкой плотности покрытия антигеном, как описано в Marks et al., Biotechnol, 10: 779-783 (1992).

[000233] Антитела к бета-клото могут быть получены путем разработки соответствующего способа скрининга с использованием антигена, чтобы отобрать фаговый клон, представляющий интерес, с последующим конструированием полноразмерного клона антитела к бета-клото с использованием последовательностей VH и/или VL (например, последовательностей Fv) или различных последовательностей CDR из последовательностей VH и VL клона фага, представляющего интерес, и последовательностей подходящих константных областей (например, Fc), описанных в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.

3. Фрагменты антител

[000234] В настоящем изобретении предложены антитела и фрагменты антител, которые связываются с бета-клото. При определенных обстоятельствах существуют преимущества использования фрагментов антител, а не полноразмерных антител. Меньший размер фрагментов обеспечивает более быстрый клиренс и может привести к улучшению доступа к клеткам, тканям или органам. Обзор некоторых фрагментов антител приведен в работе Hudson et al (2003) Nat. Med. 9:129-134.

[000235] Различные методики были разработаны для получения фрагментов антител. Как правило, фрагменты получали путем протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако в настоящее время фрагменты могут быть получены непосредственно с помощью рекомбинантных клеток-хозяев. Фрагменты антител Fab, Fv и scFv могут быть экспрессированы и секретируются из клеток E.coli или дрожжевых клеток, обеспечивая тем самым легкое получение больших количеств указанных фрагментов. Фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, обсуждавшихся выше. В другом варианте, фрагменты Fab'-SH могут быть непосредственно выделены из клеток E.coli и химически связаны с образованием фрагментов F(ab')₂ (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). В соответствии с другим подходом фрагменты F(ab')₂ могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Фрагменты Fab и F(ab')₂ с увеличенным периодом полувыведения в условиях in vivo, содержащие остатки эпитопа связывания рецептора реутилизации, описаны, например, в патенте США №5869046. Другие методики получения фрагментов антител будут очевидны для специалиста в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации антитело представляет собой одноцепочечный фрагмент Fv (scFv) (см., например, WO 93/16185; патенты США №№5571894 и 5587458). Fv и scFv содержат интактные сайты связывания, которые лишены константных областей; следовательно, они являются подходящими для уменьшения неспецифичного связывания при использовании в условиях in vivo. Гибридные белки scFv могут быть сконструированы, чтобы получить гибрид эффекторного белка и scFv на его амино- или карбокси-конце. (См., например, Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, выше). Фрагмент антитела также может представлять собой «линейное антитело», например, описанное, например, в приведенных выше ссылках. Указанные линейные антитела могут быть моноспецифичными или полиспецифичными, например, биспецифичными.

[000236] Меньшие 110 размеру связывающие структуры, полученные из антитела, представляют собой одиночные вариабельные домены (V-домены), также называемые антителами с одним вариабельным доменом (SdAb). Определенные типы организмов, верблюдовые и хрящевые рыбы, обладают высокоаффинными одиночными V-подобными доменами, прикрепленными к доменной структуре, эквивалентной области Fc, в качестве части их иммунной системы. (Woolven et al., Immunogenetics 50: 98-101, 1999; Streltsov et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101:12444-12449, 2004). V-подобные домены (называемые VhH у верблюдовых и V-NAR у акул) обычно содержат длинные поверхностные петли, которые обеспечивают проникновение в полости антигенов-мишеней. Они также стабилизируют выделенные домены VH путем маскировки гидрофобных поверхностных участков.

[000237] Указанные домены VhH и V-NAR были использованы для конструирования sdAb. Варианты V-домена человека были разработаны с использованием клонов, отобранных из фаговых библиотек, и других подходов, которые обеспечили получение стабильных VL- и VH-производных доменов с высокой прочностью связывания.

[000238] Антитела, которые связываются с бета-клото, предложенные в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, синтетические антитела, моноклональные антитела, полученные рекомбинантными способами антитела, полиспецифичные антитела (включая биспецифичные антитела), человеческие антитела, гуманизированные антитела, антитела, содержащие части верблюжьих антител, химерные антитела, интратела, антиидиотипические (анти-Id) антитела и функциональные фрагменты (например, фрагменты, связывающие бета-клото) любого из вышеперечисленных. Неограничивающие примеры функциональных фрагментов (например, фрагментов, которые связываются с бета-клото) включают одноцепочечные фрагменты Fv (scFv) (например, включая моноспецифичные, биспецифичные и т.д.), Fab, фрагменты F(ab'), фрагменты F(ab)₂, фрагменты F(ab')₂, связанные дисульфидными связями фрагменты Fv (sdFv), фрагменты Fd, фрагменты Fv, диатела, триатела, тетратела и минитела.

[000239] Антитела согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, молекулы иммуноглобулинов и иммунологически активные части молекул иммуноглобулинов, например, молекулы, содержащие антигенсвязывающий сайт, которые связываются с эпитопом бета-клото. Молекулы иммуноглобулинов согласно настоящему изобретению могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекулы иммуноглобулина.

[000240] Варианты и производные антител включают функциональные фрагменты антител, которые сохраняют способность связываться с эпитопом бета-клото. Типичные функциональные фрагменты включают фрагменты Fab (например, фрагмент антитела, который содержит антигенсвязывающий домен и содержит легкую цепь и часть тяжелой цепи, соединенные дисульфидной связью); Fab' (например, фрагмент антитела, содержащий один антигенсвязывающий домен, содержащий фрагмент Fab и дополнительный участок тяжелой цепи, соединенные посредством шарнирной области); F(ab')₂ (например, две молекулы Fab', соединенные межцепочечными дисульфидными связями в шарнирных областях тяжелых цепей; молекулы Fab' могут быть направлены к одному и тому же или различным эпитопам); биспецифичный фрагмент Fab (например, молекула Fab, содержащая два антигенсвязывающих домена, каждый из которых может быть направлен к отдельному эпитопу); одноцепочечный фрагмент Fab, содержащий вариабельную область, также известный как sFv (например, вариабельная антигенсвязывающая детерминирующая область одной легкой цепи и одной тяжелой цепи антитела, соединенных цепью из 10-25 аминокислот); дисульфидсвязанный фрагмент Fv или dsFv (например, вариабельная антигенсвязывающая детерминирующая область одной легкой цепи и одной тяжелой цепи антитела, связанных дисульфидной связью); VH, содержащая остатки антитела верблюда (например, вариабельная антигенсвязывающая детерминирующая область одной тяжелой цепи антитела, в которой некоторые аминокислоты на поверхности контакта VH представляют собой аминокислоты, которые обнаруживаются в тяжелой цепи природных антител верблюда); биспецифичный sFv (например, sFv или молекула dsFv, содержащая два антигенсвязывающих домена, каждый из которых может быть направлен к отдельному эпитопу); диатело (например, димеризованный фрагмент sFv, образующийся при объединении домена VH первого sFv с доменом VL второго sFv, и объединении домена VL первого sFv с доменом VH второго sFv, две антигенсвязывающие области диатела могут быть направлены к одним и тем же или различным эпитопам); и триатело (например, тримеризованный фрагмент sFv, который образуется способом, аналогичным таковому для диатела, но при образовании которого в одном комплексе создаются три антигенсвязывающих домена; три антигенсвязывающих домена могут быть направлены к одним и тем же или различным эпитопам). Производные антител также содержат одну или более последовательностей CDR антигенсвязывающего сайта антитела. Последовательности CDR могут быть связаны друг с другом на остове, если присутствуют две или более последовательностей CDR. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит одноцепочечный фрагмент Fv («scFv»). Фрагменты scFv представляют собой фрагменты антител, содержащие домены VH и VL антитела, причем указанные домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Полипептид scFv может дополнительно содержать полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет фрагменту scFv формировать желаемую структуру для связывания антигена. Для обзора фрагментов scFv см. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

4. Гуманизированные антитела

[000241] В настоящем изобретении предложены гуманизированные антитела, которые связываются с бета-клото, включая бета-клото человека и/или яванских макак. Гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению могут содержать одну или более областей CDR, перечисленных в таблицах 1-10. В данной области техники известны различные способы гуманизации антител из видов, отличных от человека. Например, гуманизированное антитело может содержать один или более остатков аминокислот, введенных в него из источника, который не является человеком. Указанные остатки из видов, отличных от человека, часто называют «импортными» остатками, которые обычно получены из «импортного» вариабельного домена. Гуманизация может быть выполнена, например, в соответствии со способом Winter и сотрудников (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), путем замены последовательностей гипервариабельных областей соответствующими последовательностями антитела человека.

[000242] В некоторых случаях гуманизированные антитела конструируют с помощью прививки CDR, при которой аминокислотные последовательности шести областей, определяющих комплементарность (CDR), исходного антитела из вида, отличного от человека (например, грызунов), прививают на каркас антитела человека. Например, в работе Padlan et al. (FASEB J. 9:133-139, 1995) установлено, что только приблизительно одна треть остатков в CDR фактически вступает в контакт с антигеном, такие остатки были названы «остатки, определяющие специфичность» или SDR. При использовании методики прививки SDR на каркас антитела человека прививают только остатки SDR (см., например, Kashmiri et al., Methods 36: 25-34, 2005).

[000243] Выбор вариабельных доменов человека, как легкой цепи, так и тяжелой цепи, которые будут использованы при получении гуманизированных антител, может быть важным для снижения антигенности. Например, в соответствии с так называемым методом «наилучшего соответствия» последовательность вариабельного домена антитела из вида, отличного от человека (например, грызуна), подвергают скринингу против полной библиотеки известных последовательностей вариабельных доменов человека. Последовательность человека, которая наиболее близка к последовательности грызуна, может быть выбрана в качестве каркаса человека для гуманизированного антитела (Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901). В соответствии с другим способом используют конкретный каркас, полученный из консенсусной последовательности всех антител человека из конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Этот же каркас можно использовать для получения нескольких различных гуманизированных антител (Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623). В некоторых случаях каркас получен из консенсусных последовательностей наиболее распространенных подклассов человека, подгруппы I V_L6 (V_L6I) и подгруппы III V_H (V_HIII). В соответствии с другим способом в качестве источника участков каркаса используют гены зародышевой линии человека.

[000244] В соответствии с другой парадигмой, основанной на сравнении областей CDR, называемой «супергуманизация», гомология FR не имеет значения. Суть способа заключается в сравнении последовательности из вида, отличного от человека, с функциональным репертуаром генов зародышевой линии человека. Затем отбирают гены, кодирующие канонические структуры, которые аналогичны или близкородственны последовательностям мыши. Далее, среди генов, содержащих канонические структуры, аналогичные таковым в антителе из вида, отличного от человека, отбирают те, которые обладают самой высокой гомологией в пределах CDR, и используют в качестве доноров FR. И, наконец, CDR из видов, не относящихся к человеку, прививают на полученные FR (см., например, Tan etal, J. Immunol. 169: 1119-1125, 2002).

[000245] Как правило, желательной также является гуманизация антител с сохранением их аффинности в отношении антигена и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели, в соответствии с одним способом, гуманизированные антитела получают с помощью исследования исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов являются общедоступными и известны специалистам в данной области техники. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и показывают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей иммуноглобулинов-кандидатов. Указанные программы включают, например, WAM (Whitelegg and Rees, Protein Eng. 13: 819-824, 2000), Modeller (Sali and Blundell, /. Mol. Biol. 234: 779-815, 1993) и Swiss PDB Viewer (Guex and Peitsch, Electrophoresis 18: 2714-2713, 1997). Рассмотрение полученных моделей позволяет исследовать вероятную роль остатков в функционировании последовательности иммуноглобулина-кандидата, например, исследовать остатки, которые влияют на способность иммуноглобулина-кандидата связываться с его антигеном. С помощью данного способа остатки FR могут быть выбраны и объединены из реципиентных и донорных последовательностей так, чтобы обеспечить получение желаемой характеристики антитела, такой как повышенная аффинность 110 отношению к антигену(ам)-мишени(ям). В целом, остатки гипервариабельной области непосредственно и наиболее существенно оказывают влияние на связывание антигена.

[000246] Другой способ гуманизации антител основан на индексе гуманизации антитела, названном «содержание цепей человека» (HSC). Этот метод позволяет сравнивать последовательность мыши с репертуаром генов зародышевой линии человека, и различия оценивают как HSC. Последовательность-мишень затем подвергают гуманизации путем максимального увеличения ее HSC, а не использования общей оценки идентичности, чтобы создать несколько различных гуманизированных вариантов. (Lazar et al.,Mol. Immunol. 44: 1986-1998, 2007).

[000247] В дополнение к способам, описанным выше, для получения и отбора гуманизированных антител могут быть использованы эмпирические способы. Указанные способы включают те, которые основаны на получении больших библиотек гуманизированных вариантов и отборе лучших клонов с использованием технологий обогащения или методик скрининга с высокой пропускной способностью. Варианты антител могут быть выделены из библиотек фагового, рибосомного и дрожжевого дисплея, а также путем скрининга бактериальных колоний (см., например, Hoogenboom, Nat. Biotechnol. 23: 1105-1116, 2005; Dufner et al., Trends Biotechnol. 24: 523-529, 2006; Feldhaus et al., Nat. Biotechnol. 21: 163-70, 2003; Schlapschy et al., Protein Eng. Des. Sel. 17: 847-60, 2004).

[000248] При использовании подхода, основанного на библиотеках FR, набор вариантов остатков вводят в FR в определенных положениях с последующим отбором библиотеки для выбора FR, который наилучшим образом поддерживает привитую область CDR. Остатки, которые будут замещены, могут включать некоторые или все из остатков «Vernier», определенных как те, которые потенциально будут участвовать в образовании структуры CDR (см., например, Foote and Winter, /. Mol. Biol. 224: 487-499, 1992), или остатки из более ограниченного набора остатков-мишеней, определенных В аса et al. (J. Biol. Chem. 272: 10678-10684, 1997).

[000249] При перегруппировке FR полноразмерные FR комбинируют с CDR из видов, отличных от человека, вместо создания комбинаторных библиотек выбранных вариантов остатков (см., например, Dall'Acqua et al., Methods 36: 43-60, 2005). Библиотеки могут быть подвергнуты скринингу для оценки связывания с помощью двухстадийного способа отбора, при котором сначала осуществляют гуманизацию VL, а затем VH. В другом варианте может быть использован одностадийный способ перегруппировки FR. Было показано, что указанный способ более эффективен, чем двухстадийный скрининг, поскольку полученные антитела имели улучшенные биохимические и физико-химические свойства, включая повышенную экспрессию, повышенную аффинность и термостойкость (см., например, Damschroder et al., Mol. Immunol. 44: 3049-60, 2007).

[000250] Способ «гуманиринга» основан на экспериментальном выявлении необходимых минимальных детерминант специфичности (MSD) и последовательной замене нечеловеческих фрагментов на фрагменты из библиотек FR человека, и оценке связывания. Замену начинают с участков CDR3 из цепей VH и VL из видов, отличных от человека, и постепенно замещают другие участки антитела из вида, отличного от человека, участками FR человека, включая CDR1 и CDR2 обеих областей VH и VL. Указанная методика, как правило, приводит к сохранению эпитопов и выявлению антител из нескольких подклассов с различными CDR вариабельной области человека. Гуманиринг обеспечивает выделение антител, которые на 91-96% гомологичны антителам, кодируемым генами зародышевой линии человека. (См., например, Alfenito, Cambridge Healthtech Institute's Third Annual PEGS, The Protein Engineering Summit, 2007).

[000251] Метод «конструирования гуманизированных антител» («human engineering») включает изменение антитела или фрагмента антитела из вида, не относящегося к человеку, такого как мышиное или химерное антитело или фрагмент антитела, путем внесения конкретных изменений в аминокислотную последовательность антитела так, чтобы получить модифицированное антитело с пониженной иммуногенностью у человека, которое тем не менее сохраняет желаемые свойства связывания исходных антител из вида, отличного от человека. В целом методика включает классификацию остатков аминокислот антитела из вида, не относящегося к человеку (например, мыши), как остатков «низкого риска», «умеренного риска» или «высокого риска». Классификацию проводят с использованием расчета общего соотношения риск/выгода, который позволяет оценить предсказанные преимущества при осуществлении конкретной замены (например, в отношении иммуногенности у людей), исходя из риска, что замена будет влиять на сворачивание полученного антитела и/или замещение остатками человека. Конкретный остаток аминокислоты человека, который будет вставлен в заданном положении (например, с низким или умеренным риском) последовательности антитела из вида, не относящегося к человеку (например, мыши), может быть выбран путем выравнивания аминокислотной последовательности вариабельных областей антитела из вида, не относящегося к человеку, с соответствующей областью конкретной или консенсусной последовательности антитела человека. Аминокислотные остатки в положениях с низким или умеренным риском в последовательности из вида, отличного от человека, могут быть замещены соответствующими остатками в последовательности антитела человека в соответствии с результатами выравнивания. Методики получения белков с помощью «конструирования гуманизированных антител» описаны более подробно в Studnicka et al., Protein Engineering, 7: 805-814 (1994), в патентах США №№5766886, 5770196, 5821123 и 5869619 и публикации заявки РСТ WO 93/11794.

5. Антитела человека

[000252] Антитела человека к бета-клото могут быть сконструированы путем комбинирования последовательности(ей) вариабельного домена(ов) клона Fv, который выбран из библиотек фагового дисплея, полученных из белков человека, с известной последовательностью константного домена(ов) человека. В другом варианте моноклональные антитела человека к бета-клото согласно настоящему изобретению могут быть получены с помощью метода гибридом. Линии клеток миеломы человека и линии гетеромиеломных клеток мыши-человека для получения моноклональных антител человека были описаны, например, Kozbor /. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).

[000253] Также можно получить трансгенных животных (например, мышей), которые способны при иммунизации вырабатывать полный спектр антител человека, не вырабатывая при этом эндогенные иммуноглобулины. Трансгенные мыши, экспрессирующие репертуар антител человека, были использованы для получения высокоаффинных моноклональных антител, содержащих последовательность человека, направленных к широкому кругу потенциальных мишеней лекарственных препаратов (см., например, Jakobovits, A., Curr. Opin. Biotechnol. 1995, 6(5):561-6; Bruggemann and Taussing, Curr. Opin. Biotechnol. 1997, 8(4):455-8; патенты США 6075181 и 6150584; и Lonberg et al., Nature Biotechnol. 23: 1117-1125, 2005).

[000254] В другом варианте антитела человека могут быть получены посредством иммортализации В-лимфоцитов человека, вырабатывающих антитело, направленное к антигену-мишени (например, такие В-лимфоциты могут быть выделены у индивидуума, или могли быть иммунизированы в условиях in vitro) (см., например, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (l):86-95 (1991); и патент США №5750373).

[000255] Перегруппировка генов может быть использована для получения антител человека из антител видов, не относящихся к человеку, например, антител грызунов, когда антитело человека имеет аффинность и специфичность, аналогичную таковой для исходного антитела из вида, отличного от человека. В соответствии с этим способом, который также называют «импринтинг эпитопа» или «направленный отбор», вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи фрагмента антитела из вида, отличного от человека, полученного с помощью методик фагового дисплея, описанных в настоящей заявке, замещают репертуаром генов вариабельных областей человека с получением популяции химер scFv или Fab, содержащих цепь из вида, не относящегося к человеку/цепь человека. Отбор с использованием антигена позволяет выделить химеры scFv или Fab, содержащие цепь из вида, не относящегося к человеку/цепь человека, в которых цепь человека восстанавливает антигенсвязывающий сайт, разрушенный при удалении соответствующей цепи из вида, отличного от человека, в исходном клоне фагового дисплея (например, эпитоп направляет (осуществляет импринтинг) выбор партнера цепи человека). Если процесс повторяют для того чтобы заменить оставшуюся часть цепи из вида, отличного от человека, то в результате получают антитело человека (см., например, РСТ WO 93/06213 и Osbourn et al., Methods., 36, 61-68, 2005). В отличие от стандартных способов гуманизации антител из видов, отличных от человека, путем прививки CDR, указанная методика обеспечивает получение полностью человеческих антител, которые не содержат остатков FR или CDR нечеловеческого происхождения. Примеры направленного отбора для гуманизации мышиных антител для придания им специфичности в отношении антигенов клеточной поверхности, включают фолатсвязывающий белок, присутствующий на клетках рака яичников (см., например, Figini et al., Cancer Res., 58, 991-996, 1998) и CD147, который экспрессируется с высокими уровнями на клетках гепатоцеллюлярной карциномы (см., например, Bao et al., Cancer Biol. Ther.,4, 1374-1380, 2005).

[000256] Потенциальным недостатком подхода направленного отбора является то, что перегруппировка одной цепи антитела, при сохранении другой цепи в неизменном состоянии, может привести к дрейфу эпитопа. Для того чтобы сохранить эпитоп, который распознается антителом из вида, отличного от человека, можно применять сохранение CDR (см., например, Klirnka et al., Br. J. Cancer., 83, 252-260, 2000; VH CDR2 Beiboer et al., J. Mol. Biol, 296, 833-49, 2000). В соответствии с этим способом обычно сохраняют CDR3 VH из вида, не относящего к человеку, поскольку указанная CDR может располагаться в центре антигенсвязывающего сайта и может быть наиболее важной областью антитела для распознавания антигена. В некоторых случаях, однако, CDR3 VH и CDR3 VL, а также CDR3 VH, CDR3 VL и VL CFR1 антитела из вида, отличного от человека, могут быть сохранены.

6. Биспецифичные антитела

[000257] Биспецифичные антитела представляют собой моноклональные антитела, которые обладают специфичностью связывания в отношении 110 меньшей мере двух различных антигенов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биспецифичные антитела представляют собой человеческие или гуманизированные антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения один из видов специфичности связывания направлен к бета-клото, тогда как другой направлен к любому другому антигену. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения один из видов специфичности связывания направлен к бета-клото, тогда как другой направлен к другому поверхностному антигену, который экспрессируется на клетках, экспрессирующих бета-клото и рецептор FGF (например, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биспецифичные антитела могут связываться с двумя различными эпитопами бета-клото. Биспецифичные антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, F(ab')₂ биспецифичных антител).

[000258] Способы получения биспецифичных антител известны в данной области техники, такие как, например, путем совместной экспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, когда две тяжелые цепи обладают различными видами специфичности (см., например, Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Для получения более подробной информации о создании биспецифичных антител см., например, Bispecific Antibodies, Kontermann, ed., Springer-Verlag, Hiedelberg (2011).

7. Поливалентные антитела

[000259] Поливалентное антитело может подвергаться более быстрой интернализации (и/или катаболизму), чем бивалентное антитело, клеткой, экспрессирующей антиген, с которым связываются антитела. Антитела согласно настоящему изобретению могут представлять собой поливалентные антитела (которые отличаются от антител класса IgM) с тремя или более антигенсвязывающими сайтами (например, тетравалентные антитела), которые могут быть легко получены с помощью рекомбинантной экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидные цепи антитела. Поливалентное антитело может содержать домен димеризации и три или более антигенсвязывающих сайтов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения домен димеризации содержит (или состоит из них) область Fc или шарнирную область. В этом случае антитело будет содержать область Fc и три или более антигенсвязывающих сайта, которые расположены в направлении амино-конца относительно области Fc. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения поливалентное антитело содержит (или состоит из них) от трех до приблизительно восьми антигенсвязывающих сайтов. Согласно одному такому варианту реализации поливалентное антитело содержит (или состоит из них) четыре антигенсвязывающих сайта. Поливалентное антитело содержит 110 меньшей мере одну полипептидную цепь (например, две полипептидные цепи), причем указанная полипептидная(ые) цепь(и) содержит(ат) два или более вариабельных доменов. Например, полипептидная(ые) цепь(и) может содержать VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен, VD2 представляет собой второй вариабельный домен, Fc представляет собой одну полипептидную цепь области Fc, X1 и Х2 представляют собой аминокислоту или полипептид и п равно 0 или 1. Например, полипептидная(ые) цепь(и) может содержать: цепь VH-CH1-гибкий линкер-VH-CH1-область Fc; или цепь VH-CH1-VH-CH1-область Fc. Поливалентное антитело согласно изобретению может дополнительно содержать 110 меньшей мере два (например, четыре) полипептида вариабельного домена легкой цепи. Поливалентное антитело согласно настоящему изобретению может, например, содержать от двух до восьми полипептидов вариабельного домена легкой цепи. Полипептиды вариабельного домена легкой цепи, предусмотренные в настоящей заявке, содержат вариабельный домен легкой цепи и, необязательно, дополнительно содержат домен CL.

8. Модификация области Fc

[000260] Желательной может быть модификация антитела к бета-клото путем модификации области Fc, включая, в отношении эффекторной функции, например, уменьшение или удаление антиген-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) и/или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) антитела. Указанная модификация может быть достигнута путем введения одной или более замен аминокислот в область Fc антитела. Например, было показано, что введение замен в IgG1 человека с использованием остатков IgG2 в положениях 233-236 и остатков IgG4 в положениях 327, 330 и 331 значительно снижает ADCC и CDC (см., например, Armour et al., Eur. J. Immunol. 29:(8):2613-24 (1999); Shields et al., J. Biol.Chem. 276(9): 6591-604 (2001).

[000261] Период полувыведения антитела из сыворотки крови можно увеличить путем встраивания эпитопа связывания рецептора реутилизации в антитело (особенно во фрагмент антитела), например, как описано в патенте США №5739277. Термин «эпитоп связывания рецептора реутилизации» относится к эпитопу области Fc молекулы IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), который отвечает за увеличение периода полувыведения молекулы IgG из сыворотки крови в условиях in vivo.

9. Альтернативные связывающие агенты

[000262] В область настоящего изобретения включены связывающие агенты, не относящиеся к иммуноглобулинам, которые специфично связываются с тем же эпитопом, что и антитело к бета-клото, раскрытое в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения связывающий агент, не относящийся к иммуноглобулинам, представляет собой связывающий агент, который замещает или замещается антителом к бета-клото согласно настоящему изобретению в количественном исследовании конкурентного связывания. Указанные альтернативные связывающие агенты могут включать, например, любой из сконструированных белковых остовов, известных в данной области техники. Указанные остовы могут содержать одну или более CDR, перечисленных в таблицах 1-10. Указанные остовы включают, например, антикалины, которые основаны на остове липокалина, белковой структуры, характеризующейся наличием жесткого бета-циллиндра, который поддерживает четыре гипервариабельные петли, образующие сайт связывания лиганда. Новые виды специфичности связывания могут быть сконструированы с помощью направленного случайного мутагенеза в участках петли, в комбинации с функциональным дисплеем и направленным отбором (см., например, Skerra (2008) FEBS J. 275: 2677-2683). Другие подходящие остовы могут включать, например, аднектины или монотела на основе десятого внеклеточного домена фибронектина III человека (см., например, Koide and Koide (2007) Methods Mol. Biol. 352: 95-109); аффитела на основе Z-домена стафилококкового белка А (см., например, Nygren et al. (2008) FEBS J. 275: 2668-2676)); белки DARP на основе белков с анкириновым повтором (см., например, Stumpp et al. (2008) Drug. Discov. Today 13: 695-701); финомеры, основанные на домене SH3 протеинкиназы Fyn человека (Grabulovski et al. (2007) J. Biol. Chem. 282: 3196-3204); аффитины, основанные на Sac7d из Sulfolobus acidolarius (см., например, Krehenbrink et al. (2008) /. Mol. Biol. 383: 1058-1068); аффилины, основанные на В-кристаллине человека (см., например, Ebersbach et al. (2007) J. Mol. Biol. 372: 172-185); авимеры, основанные на доменах А мембранных рецепторных белков (см., например, Silverman et al. (2005) Biotechnol. 23: 1556-1561); богатые цистеином knottin-пептиды (см., например, Kolmar (2008) FEBS J. 275: 2684-2690); и модифицированные ингибиторы протеиназ типа Кунитца (см., например, Nixon and Wood (2006) Curr. Opin. Drug. Discov. Dev. 9: 261-268) Для обзора см., например, Gebauer and Skerra (2009) Curr. Opin. Chem. Biol. 13: 245-255.

Варианты антител

[000263] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложена модификация(и) аминокислотной последовательности антител, которые связываются с бета-клото или описаны в настоящей заявке. Например, желательным может быть улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела, включая, но не ограничиваясь ими, специфичность, термоустойчивость, уровень экспрессии, эффекторные функции, гликозилирование, сниженную иммуногенность или растворимость. Следовательно, в дополнение к антителам к бета-клото, описанным в настоящей заявке, в настоящем изобретении предложено получение вариантов антител к бета-клото. Например, варианты антитела к бета-клото могут быть получены путем введения соответствующих нуклеотидных замен в кодирующую ДНК и/или путем синтеза желаемого антитела или полипептида. Специалисты в данной области техники поймут, что изменения аминокислот могут изменить посттрансляционные процессы антитела к бета-клото, такие как изменение числа или положения сайтов гликозилирования или изменение характеристик, связанных с закреплением в мембране.

[000264] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению являются химически модифицированными, например, путем ковалентного присоединения любого типа молекулы к антителу. Производные антител могут включать антитела, которые были химически модифицированы, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации с использованием известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления, связывания с клеточным лигандом или другим белком и т.д. Любая из многочисленных химических модификаций может быть осуществлена с помощью известных методик, включая, но не ограничиваясь ими, специфичное химическое расщепление, ацетилирование, придание фармацевтической формы, метаболический синтез туникамицина и т.д. Помимо этого антитело может содержать одну или более неклассических аминокислот.

[000265] Изменения могут представлять собой замену, делецию или вставку одного или более кодонов, кодирующих антитело или полипептид, что приводит к изменению аминокислотной последовательности 110 сравнению с нативной последовательностью антитела или полипептида. Аминокислотные замены могут быть обусловлены заменой одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей аналогичные структурные и/или химические свойства, такой как замена лейцина серином, например, консервативные замены аминокислот.Вставки или делеции необязательно могут включать приблизительно от 1 до 5 аминокислот.Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения замены, делеции или вставки включают менее 25 замен аминокислот, менее 20 замен аминокислот, менее 15 замен аминокислот, менее 10 замен аминокислот, менее 5 замен аминокислот, менее 4 замен аминокислот, менее 3 замен аминокислот или менее 2 замен аминокислот относительно исходной молекулы. В конкретном варианте реализации замена представляет собой консервативную замену аминокислоты, сделанную в положении одного или более предсказанных несущественных остатков аминокислот. Подходящий вариант может быть определен путем осуществления систематических вставок, делеции или замен аминокислот в последовательности и проверки полученных вариантов для определения активности, которую проявляет полноразмерная или зрелая нативная последовательность.

[000266] Вставки в аминокислотные последовательности включают амино- и/или карбокси-концевые гибридизации длиной от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки внутри последовательности одного или множества остатков аминокислот.Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым остатком метионина. Другие варианты вставки в молекулу антитела включают гибридизацию N- или С-конца антитела с ферментом (например, для антитело-направленной фермент-пролекарственной терапии) или полипептидом, который увеличивает период полувыведения антитела из сыворотки крови.

[000267] Существенные модификации биологических свойств антитела осуществляют путем отбора замен, которые значительно различаются 110 своему действию на поддержание (а) структуры полипептидного остова в области замены, например, в виде листа или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени, или (с) объема боковой цепи. В другом варианте консервативные (например, в пределах аминокислотной группы с аналогичными свойствами и/или боковой цепью) замены могут быть осуществлены так, чтобы поддержать или не изменить существенно свойства. Аминокислоты могут быть сгруппированы в соответствии со сходством свойств их боковых цепей (см., например, A.L. Lehninger, в Biochemistry, 2nd Ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1), неполярные: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) незаряженные полярные: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (С), Tyr (Y), Asn (N), Gin (Q); (3) кислые: Asp (D), Glu (E); и (4) основные: Lys (К), Arg (R), His(H).

[000268] В другом варианте природные остатки могут быть разделены на группы на основании общих свойств боковых цепей: (1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; (3) кислые: Asp, Glu; (4) основные: His, Lys, Arg; (5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; и (6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

[000269] Неконсервативные замены влекут замену члена одного из этих классов членом другого класса. Такие замещенные остатки также могут быть введены в консервативные сайты замены или в остальные (неконсервативные) сайты. Соответственно, в одном варианте реализации, антитело или его фрагмент, который связывается с эпитопом бета-клото, содержит аминокислотную последовательность, которая 110 меньшей мере на 35%, 110 меньшей мере на 40%, 110 меньшей мере на 45%, 110 меньшей мере на 50%, 110 меньшей мере на 55%, 110 меньшей мере на 60%, 110 меньшей мере на 65%, 110 меньшей мере на 70%, 110 меньшей мере на 75%, 110 меньшей мере на 80%, 110 меньшей мере на 85%, 110 меньшей мере на 90%, 110 меньшей мере на 95% или 110 меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности мышиного моноклонального антитела, описанного в настоящей заявке. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитело или его фрагмент, который связывается с эпитопом бета-клото, содержит аминокислотную последовательность, которая 110 меньшей мере на 35%, 110 меньшей мере на 40%, 110 меньшей мере на 45%, 110 меньшей мере на 50%, 110 меньшей мере на 55%, 110 меньшей мере на 60%, 110 меньшей мере на 65%, 110 меньшей мере на 70%, 110 меньшей мере на 75%, 110 меньшей мере на 80%, 110 меньшей мере на 85%, 110 меньшей мере на 90%, 110 меньшей мере на 95% или 110 меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности, приведенной в таблицах 1-10. В другом варианте реализации антитело или его фрагмент, который связывается с эпитопом бета-клото, содержит аминокислотную последовательность VH CDR и/или VL CDR, которая 110 меньшей мере на 35%, 110 меньшей мере на 40%, 110 меньшей мере на 45%, 110 меньшей мере на 50%, 110 меньшей мере на 55%, 110 меньшей мере на 60%, 110 меньшей мере на 65%, 110 меньшей мере на 70%, 110 меньшей мере на 75%, 110 меньшей мере на 80%, 110 меньшей мере на 85%, 110 меньшей мере на 90%, 110 меньшей мере на 95% или 110 меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности VH CDR, приведенной в таблицах 1-10, и/или аминокислотной последовательности VL CDR, приведенной в таблицах 1-10. Вариации могут быть внесены с использованием способов, известных в данной области техники, таких как олигонуклеотид-опосредованный (сайт-направленный мутагенез), сканирование аланином и ПЦР-мутагенез. Сайт-направленный мутагенез (см., например, Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), кассетный мутагенез (см., например, Wells et al., Gene, 34:315 (1985)), мутагенез на основе рестрикции-отбора (см., например, Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) или другие известные методики могут быть осуществлены на клонированной ДНК, чтобы получить вариант ДНК антитела к бета-клото.

[000270] Любой остаток цистеина, не участвующий в поддержании правильной конформации антитела к бета-клото, также может быть замещен, например, другой аминокислотой, такой как аланин или серии, для улучшения окислительной стабильности молекулы и предотвращения аберрантной сшивки. Напротив, цистеиновая связь(и) может быть добавлена к антителу к бета-клото, чтобы улучшить его стабильность (например, если антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как фрагмент Fv).

[000271] Согласно некоторым вариантам реализации молекула антитела к бета-клото согласно настоящему изобретению представляет собой «деиммунизированное» антитело. «Деиммунизированное» антитело к бета-клото представляет собой антитело, полученное из гуманизированного или химерного антитела к бета-клото, которое содержит одно или более изменений в его аминокислотной последовательности, что приводит к уменьшению иммуногенности антитела, 110 сравнению с соответствующим исходным недеиммунизированным антителом. Одна из методик получения таких мутированных антител включает выявление и удаление Т-клеточных эпитопов молекулы антитела. На первом этапе иммуногенность молекулы антитела может быть определена несколькими способами, например, путем определения Т-клеточных эпитопов в условиях in vitro или с помощью предсказания таких эпитопов в условиях in silico, как известно в данной области техники. После выявления остатков, критических для функции Т-клеточного эпитопа, могут быть введены мутации, устраняющие иммуногенность и сохраняющие активность антитела. Для обзора см., например, Jones et al., Methods in Molecular Biology 525: 405-423, 2009.

1. Созревание аффинности в условиях in vitro

[000272] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты антител с улучшенным свойством, таким как аффинность, стабильность или уровень экспрессии, 110 сравнению с исходным антителом, могут быть получены с помощью созревания аффинности в условиях in vitro. Аналогично природному прототипу, созревание аффинности в условиях in vitro основано на принципах мутации и селекции. Библиотеки антител экспрессируют в виде фрагментов Fab, scFv или области V на поверхности организма (например, фага, бактерии, дрожжевой клетки или клетки млекопитающего) или совместно (например, ковалентно или нековалентно) с их кодирующей мРНК или ДНК. Отбор экспрессированных антител на основании их аффинности позволяет выделить организмы или комплексы, несущие генетическую информацию, кодирующую антитела. Два или три этапа мутирования и селекции с использованием методов дисплея, таких как фаговый дисплей, как правило, позволяют получить фрагменты антител с низкой величиной аффинности в наномолярном диапазоне. Предпочтительные аффиннозрелые антитела будут иметь величину аффинности в отношении антигена-мишени в наномолярном или даже пикомолярном диапазоне.

[000273] Фаговый дисплей является распространенным способом экспрессии и отбора антител. Антитела экспрессируют на поверхности бактериофагов Fd или М13 в виде гибридных белков с белком оболочки бактериофага. Отбор включает воздействие антигена, что позволяет антителам, экспрессированным на поверхности фага, связываться со своими мишенями, этот процесс называется «пэннинг». Фаг, связанный с антигеном, выделяют, и инфицируют им бактерии, чтобы получить фаговые частицы для дальнейших этапов отбора. Для обзора см., например, Hoogenboom, Methods. Mol. Biol. 178: 1-37, 2002; Bradbury and Marks, J. Immuno. Methods 290: 29-49, 2004).

[000274] В системе дрожжевого дисплея (см., например, Boder et al., Nat. Biotech. 15: 553-57, 1997; Chao et al., Nat. Protocols 1:755-768, 2006) антитело может быть экспрессировано в виде одноцепочечных гибридных вариабельных областей (scFv), в которых тяжелые и легкие цепи соединены между собой гибким линкером. scFv гибридизован с адгезионной субъединицей белка агглютинина Aga2p дрожжей, который прикрепляется к клеточной стенке дрожжей за счет дисульфидных связей с Aga1p.Экспрессия белка с помощью Aga2p отстраняет белок от клеточной поверхности, сводя к минимуму возможные взаимодействия с другими молекулами на клеточной стенке дрожжей. Способы магнитного разделения и проточной цитометрии используют для скрининга библиотеки, чтобы отобрать антитела с улучшенной аффинностью или стабильностью. Связывание с растворимым антигеном, представляющим интерес, определяют путем мечения дрожжей биотинилированным антигеном и вторичным реагентом, таким как стрептавидин, конъюгированный с флуорофором. Изменения поверхностной экспрессии антитела могут быть измерены с помощью иммунофлуоресцентного мечения гемагглютинина или эпитопной метки с-Мус, фланкирующей scFv. Было показано, что уровень экспрессии коррелирует со стабильностью экспрессируемого белка, и, следовательно, могут быть выбраны антитела с улучшенной стабильностью, а также аффинностью (см., например, Shusta et al., J. Mol. Biol. 292: 949-956, 1999). Дополнительным преимуществом дрожжевого дисплея является то, что экспрессируемые белки сворачиваются в эндоплазматическом ретикулуме эукариотической клетки дрожжей, используя шапероны и молекулярный аппарат контроля качества эндоплазматического ретикулума. После того, как созревание завершено, аффинность антитела может быть удобно протитрована во время его экспрессии на поверхности дрожжей, что устраняет необходимость экспрессии и очистки каждого клона. Теоретическое ограничение дисплея на поверхности дрожжевой клетки заключается в потенциально меньшем размере функциональный библиотеки 110 сравнению с другими способами дисплея; однако недавно разработанный подход позволяет использовать систему спаривания клеток дрожжей для создания комбинаторного разнообразия, размер которого составляет 110 оценкам 1014 (см., например, патент США 2003/0186374; Blaise et al., Gene 342: 211-218, 2004).

[000275] При использовании рибосомного дисплея получают комплексы антитело-рибосома-мРНК (ARM) для отбора в бесклеточной системе. Библиотеку ДНК, кодирующей конкретную библиотеку антител, генетически гибридизуют с последовательностью спейсера, у которого нет стоп-кодона. При трансляции указанная последовательность спейсера по-прежнему прикреплена к пептидил-тРНК и занимает рибосомный туннель, позволяя тем самым белку, представляющему интерес, выступать из рибосомы и сворачиваться. Полученный комплекс мРНК, рибосомы и белка может связываться с лигандом, связанным на поверхности, что позволяет одновременно выделять антитело и мРНК, кодирующую его, посредством аффинного захвата лигандом. Связанная с рибосомой мРНК затем подвергается обратной транскрипции в кДНК, которая затем может быть подвергнута мутагенезу и использована в следующем раунде отбора (см., например, Fukuda et al., Nucleic Acids Res. 34, e127, 2006). В способе дисплея мРНК ковалентную связь между антителом и мРНК создают с помощью пуромицина в качестве молекулы адаптера (Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3750-3755, 2001).

[000276] Поскольку указанные способы осуществляют исключительно в условиях in vitro, они обеспечивают два основных преимущества 110 сравнению с другими методиками отбора. Во-первых, разнообразие библиотеки не ограничивается эффективностью трансформации бактериальных клеток, а только количеством рибосом и различных молекул мРНК, присутствующих в условиях in vitro. Во-вторых, случайные мутации могут быть легко введены после каждого раунда отбора, например, с помощью полимераз без исправления ошибок, поскольку ни одна библиотека не должна быть трансформирована после любой стадии диверсификации.

[000277] Разнообразие может быть введено в области CDR или полноразмерные гены вариабельных областей библиотек антител направленным образом или посредством случайного введения. Первый подход включает последовательное нацеленное воздействие на все CDR антитела с помощью высокого или низкого уровня мутагенеза или нацеленного воздействия на отдельные горячие точки соматических гипермутаций (см., например, Но, et al., J. Biol. Chem. 280: 607-617, 2005) или остатки, которые, как предполагают, влияют на аффинность, исходя из экспериментальных данных или структурных предпосылок. Случайные мутации могут быть введены на всем протяжении полноразмерного гена вариабельной области с помощью мутаторных штаммов Е. coli, подверженной ошибкам репликации ДНК-полимеразами (см., например, Hawkins et al., J. Mol Biol. 226: 889-896, 1992) или РНК репликазами. Разнообразие также может быть введено путем замены областей, которые содержат природное разнообразие, с помощью перегруппировки ДНК или аналогичных методик (см., например, Lu et al., J. Biol Chem. 278: 43496-43507, 2003; патент США №5565332; патент США №6989250). В соответствии с другими методиками нацелено воздействуют на гипервариабельные петли, простирающиеся на остатки каркасного участка (см., например, Bond et al., J. Mol. Biol. 348: 699-709, 2005), используют делеции петли и вставки в CDR или используют диверсификацию на основе гибридизации (см., например, патент США №2004/0005709). Дополнительные способы получения разнообразия в CDR, раскрыты, например, в патенте США №7985840.

[000278] Скрининг библиотек можно осуществлять с помощью различных методик, известных в данной области техники. Например, бета-клото может быть иммобилизован на твердых подложках, колонках, упорах или мембранах из целлюлозы/поливинилиденфторида и других фильтрах, может быть экспрессирован на клетках-хозяевах, прикрепленных к адсорбционным планшетам, или использован при сортировке клеток, или конъюгирован с биотином для захвата на гранулах, покрытых стрептавидином, или использован в любом другом способе пэннинга библиотек дисплея.

[000279] Для обзора способов созревания аффинности в условиях in vitro см., например, Hoogenboom, Nature Biotechnology 23: 1105-1116, 2005 и Quiroz and Sinclair, Revista Ingeneria Biomedia 4: 39-51, 2010 и ссылки в них.

2. Модификации антител к бета-клото

[000280] В объем настоящего изобретения включены ковалентные модификации антитела к бета-клото. Ковалентные модификации включают взаимодействие остатков аминокислот-мишеней антитела к бета-клото с органическим дериватизирующим агентом, который способен реагировать с выбранными боковыми цепями или N- или С-концевыми остатками антитела к бета-клото. Другие модификации включают деамидирование остатков глутаминила и аспарагинила до соответствующих остатков глутамила и аспартила, соответственно, гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серила или треонила, метилирование альфа-аминогрупп лизина, аргинина и боковых цепей гистидина (см., например, Т.Е. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), ацетилирование N-концевого амина и амидирование любой С-концевой карбоксильной группы.

[000281] В объем настоящего изобретения также включены другие типы ковалентных модификаций антитела к бета-клото, включая изменение нативного характера гликозилирования антитела или полипептида (см., например, Beck et al., Curr. Pharm. Biotechnol. 9: 482-501, 2008; Walsh, Drug Discov. Today 15: 773-780, 2010) и связывание антитела с одним из множества небелковых полимеров, например, полиэтиленгликолем (ПЭГ), полипропиленгликолем или полиоксиалкиленами, с использованием способа, описанного, например, в патентах США №№4640835, 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337.

[000282] Антитело к бета-клото согласно настоящему изобретению также может быть модифицировано с образованием химерных молекул, содержащих антитело к бета-клото, гибридизованное с другим гетерологичным полипептидом или аминокислотной последовательностью, например, эпитопной меткой (см., например, Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 523-533, 2003) или областью Fc молекулы IgG (см., например, Aruffo, "Immunoglobulin fusion proteins" в Antibody Fusion Proteins, S.M. Chamow and A. Ashkenazi, eds., Wiley-Liss, New York, 1999, pp.221-242).

[000283] В настоящем изобретении также предложены гибридные белки, содержащие антитело согласно настоящему изобретению, которое связывается с антигеном бета-клото, и гетерологичный полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гетерологичный полипептид, с которым гибридизовано антитело, можно применять для нацеливания антитела к клеткам, экспрессирующим бета-клото на поверхности.

[000284] В настоящем изобретении также предложены панели антител, которые связываются с антигеном бета-клото. Согласно конкретным вариантам реализации панели антител имеют различные константы скорости ассоциации, различные константы скорости диссоциации, различные величины аффинности в отношении антигена бета-клото и/или различную специфичность в отношении антигена бета-клото. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения панели содержат или состоят из приблизительно 10, приблизительно 25, приблизительно 50, приблизительно 75, приблизительно 100, приблизительно 125, приблизительно 150, приблизительно 175, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 450, приблизительно 500, приблизительно 550, приблизительно 600, приблизительно 650, приблизительно 700, приблизительно 750, приблизительно 800, приблизительно 850, приблизительно 900, приблизительно 950 или приблизительно 1000 антител или более. Панели антител могут быть использованы, например, в 96-луночных или 384-луночных планшетах, например, для количественных исследований, таких как ИФА.

Получение антител к бета-клото

[000285] Антитела к бета-клото могут быть получены путем культивирования клеток, трансформированных или трансфецированных вектором, содержащим нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело к бета-клото. Полинуклеотидные последовательности, кодирующие полипептидные компоненты антитела согласно настоящему изобретению, могут быть получены с использованием стандартных рекомбинантных методик. Желаемые полинуклеотидные последовательности могут быть выделены и секвенированы из клеток, вырабатывающих антитела, таких как клетки гибридом. Согласно другому варианту полинуклеотиды могут быть синтезированы с использованием синтезатора полинуклеотидов или методов ПЦР. После получения последовательностей, кодирующих полипептиды, их вставляют в рекомбинантный вектор, способный к репликации и экспрессии гетерологичных полинуклеотидов в клетках-хозяевах. Многие векторы, которые доступны и известны в данной области техники, могут быть использованы для целей настоящего изобретения. Выбор подходящего вектора будет зависеть главным образом от размера нуклеиновых кислот, которые будут вставлены в вектор, и конкретной клетки-хозяина, которая будет трансформирована указанным вектором. Клетки-хозяева, подходящие для экспрессии антител согласно настоящему изобретению, включают прокариот, таких как архебактерии и эубактерии, включая грамотрицательные или грамположительные организмы, эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, клетки беспозвоночных, такие как клетки насекомых или растительные клетки, а также клетки позвоночных, такие как линии клеток-хозяев млекопитающих. Клетки-хозяева трансформируют описанными выше векторами экспрессии и культивируют в обычных питательных средах, модифицированных соответствующим образом для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих желаемые последовательности. Антитела, вырабатываемые клетками-хозяевами, очищают с использованием стандартных способов очистки белков, известных в данной области техники.

[000286] Способы получения антител, включая конструирование векторов, экспрессию и очистку, дополнительно описаны в Pluckthun et al., (1996) в Antibody Engineering: Producing antibodies in Escherichia coli: From PCR to fermentation (McCafferty, J., Hoogenboom, H. R., and Chiswell, D. J., eds), 1 Ed., pp. 203-252, IRL Press, Oxford; Kwong, K. & Rader, С, E.coli expression and purification of Fab antibody fragments, Current protocols in protein science editorial board John E Coligan et al., Chapter 6, Unit 6.10 (2009); Tachibana and Takekoshi, "Production of Antibody Fab Fragments in Escherischia coli," в Antibody Expression and Production, M. Al-Rubeai, Ed., Springer, New York, 2011; Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (ed Z. An), John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA.

[000287] Согласно настоящему изобретению альтернативные способы, которые хорошо известны в данной области техники, могут быть использованы для получения антител к бета-клото. Например, соответствующая аминокислотная последовательность, или ее части, может быть получена путем прямого синтеза пептидов с использованием твердофазных методик (см., например, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, /. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154 (1963)). Синтез белка в условиях in vitro может быть осуществлен с использованием ручных методик или с помощью автоматизированных способов. Различные части антитела к бета-клото могут быть химически синтезированы 110 отдельности и в комбинации с использованием химических или ферментативных способов, чтобы получить желаемое антитело к бета-клото. В другом варианте антитела могут быть очищены из клеток или жидкостей, таких как молоко, организма трансгенного животного, модифицированного для экспрессии антитела, в соответствии со способом, описанным, например, в патенте США №5545807 и патенте США №5827690.

Иммуноконъюгаты

[000288] В настоящем изобретении также предложены конъюгаты, содержащие любое из антител к бета-клото согласно настоящему изобретению, ковалентно связанное с помощью синтетического линкера с одним или более агентами, не являющимися антителами.

[000289] Множество радиоактивных изотопов доступно для получения радиоконъюгированных антител. Примеры включают At²¹¹, I4, I4, Y4, Re4, Re4, Sm4, Bi4, P4, Pb4 и радиоактивные изотопы Lu. В том случае, если для детектирования используется конъюгат, он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например Тс4 или I4, или спиновую метку для ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (также известного как магнитно-резонансная томография, МРТ), такую как йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо. Перечисленные радиоактивные изотопы могут быть встроены в конъюгат известными способами, описанными, например, в Reilly, "The radiochemistry of monoclonal antibodies and peptides," в Monoclonal Antibody and Peptide-Targeted Radiotherapy of Cancer, R.M. Reilly, ed., Wiley, Hoboken N.J., 2010.

[000290] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению конъюгированы или рекомбинантно гибридизованы с диагностическим, детектируемым или терапевтическим агентом или какой-либо другой молекулой. Конъюгированные или рекомбинантно гибридизованные антитела можно применять, например, для мониторинга или прогнозирования начала, развития, прогрессирования и/или степени тяжести заболевания, опосредованного бета-клото, в качестве части процедуры клинического испытания, например, определения эффективности конкретной терапии.

[000291] Диагностику и детектирование можно осуществлять, например, путем связывания антитела с детектируемыми веществами, включая, но не ограничиваясь ими, различные ферменты, такие как, но не ограничиваясь ими, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или ацетилхолинэстераза; простетические группы, такие как, но не ограничиваясь ими, стрептавидин/биотин и авидин/биотин; флуоресцентные материалы, такие как, но не ограничиваясь ими, умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеина, дансилхлорид или фикоэритрин; люминесцентные материалы, такие как, но не ограничиваясь ими, люминол; биолюминесцентные материалы, такие как, но не ограничиваясь ими, люцифераза, люциферин и акворин; хемилюминесцентные материалы, такие как, но не ограничиваясь ими, соединения на основе акридина или HALOTAG; радиоактивные материалы, такие как, но не ограничиваясь ими, йод (I¹³¹, I¹²⁵, I¹²³ и I¹²¹), углерод (С¹⁴), сера (S³⁵), тритий (Н³), индий (In¹¹⁵, In¹¹³, In¹¹² и In¹¹¹), технеций (Тс⁹⁹), таллий (Tl²⁰¹), галлий (Ga⁶⁸, Ga⁶⁷), палладий (Pd¹⁰³), молибден (Mo⁹⁹), ксенон (Хе¹³³), фтор (F¹⁸), Sm¹⁵³, Lu¹⁷⁷, Gd¹⁵⁹, Pm¹⁴⁹, La¹⁴⁰, Yb¹⁷⁵, Ho¹⁶⁶, Y⁹⁰, Sc⁴⁷, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Pr¹⁴², Rh¹⁰⁵, Ru⁹⁷, Ge⁶⁸, Co⁵⁷, Zn⁶⁵, Sr⁸⁵, P³², Gd¹⁵³, Yb¹⁶⁹, Cr⁵¹, Mn⁵⁴, Se⁷⁵, Sn¹¹³ и Sn¹¹⁷; и металлы, испускающие позитроны, с использованием различных видов томографии, регистрирующей испускаемые позитроны, а также ионы нерадиоактивных парамагнитных металлов.

[000292] В настоящем изобретении также предложены антитела, которые конъюгированы или рекомбинантно гибридизованы с терапевтическим фрагментом (или одним или более терапевтическими фрагментами), а также способы их применения. Антитело может быть конъюгировано или рекомбинантно гибридизовано с терапевтическим фрагментом, включая цитотоксин, такой как цитостатический или цитолитический агент, терапевтическим агентом или ионом радиоактивного металла, такого как источник альфа-частиц. Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который является вредным для клеток.

[000293] Также антитело согласно настоящему изобретению может быть конъюгировано или гибридизовано рекомбинантным способом с терапевтическим фрагментом или фрагментом лекарственного препарата, который модифицирует какой-либо биологический ответ.Терапевтические фрагменты или фрагменты лекарственного препарата не ограничены классическими химическими терапевтическими агентами. Например, фрагмент лекарственного препарата может представлять собой белок, пептид или полипептид, обладающий желаемой биологической активностью. Указанные белки могут включать, например, токсин, такой как абрин, рицин А, экзотоксин Pseudomonas, холерный токсин или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухоли, гамма-интерферон, альфа-интерферон, фактор роста нервной ткани, тромбоцитарный фактор роста, тканевой активатор плазминогена, апоптический агент, например, ФНО-гамма, AIM I (см., например, международную публикацию WO 97/33899), AIM II (см., например, международную публикацию WO 97/34911), лиганд Fas (см., например, Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567-1574) и VEGF (см., например, международную публикацию WO 99/23105), антиангиогенный агент, включая, например, ангиостатин, эндостатин или компонент системы свертывания крови (например, тканевой фактор); или модификатор биологического ответа, такой как, например, лимфокин (например, интерферон-гамма, интерлейкин-1 («ИЛ-1»), интерлейкин-2 («ИЛ-2»), интерлейкин-5 («ИЛ-5»), интерлейкин-6 («ИЛ-6»), интерлейкин-7 («ИЛ-7»), интерлейкин-9 («ИЛ-9»), интерлейкин-10 («ИЛ-10»), интерлейкин-12 («ИЛ-12»), интерлейкин-15 («ИЛ-15»), интерлейкин-23 («ИЛ-23»), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор («ГМ-КСФ») и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор («Г-КСФ»)), или фактор роста (например, гормон роста («СТГ»)), или коагулирующий агент (например, кальций, витамин К, тканевые факторы, такие как, но не ограничиваясь ими, фактор Хагемана (фактор XII), высокомолекулярный кининоген (HMWK), прекалликреин ПК), белки системы свертывания крови, фактор II (протромбин), фактор V, XIIa, VIII, XIIIa, XI, XIa, IX, IXa, X, фосфолипид и мономер фибрина).

[000294] В настоящем изобретении также предложены антитела, которые гибридизованы рекомбинантным способом или химически конъюгированы (ковалентно или нековалентно конъюгированы) с гетерологичным белком или полипептидом (или его фрагментом, например, полипептидом, содержащим приблизительно 10, приблизительно 20, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90 или приблизительно 100 аминокислот), для получения гибридных белков, а также способы их применения. В частности, в настоящем изобретении предложены гибридные белки, содержащие антигенсвязывающий фрагмент антитела согласно настоящему изобретению (например, фрагмент Fab, фрагмент Fd, фрагмент Fv, фрагмент F(ab)₂, домен VH, CDR VH, домен VL или CDR VL) и гетерологичный белок, полипептид или пептид. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гетерологичный белок, полипептид или пептид, с которым гибридизовано антитело, можно применять для нацеливания антитела к клеткам конкретного типа, таким как клетка, которая экспрессирует бета-клото или рецептор бета-клото. Например, антитело, которое связывается с рецептором на клеточной поверхности, экспрессируемым клеткой определенного типа (например, иммунной клеткой), может быть гибридизовано или конъюгировано с модифицированным антителом согласно настоящему изобретению.

[000295] Помимо этого, антитело согласно настоящему изобретению может быть конъюгировано с терапевтическими фрагментами, такими как ион радиоактивного металла, таким как источники альфа-частиц, например, Bi²¹³, или макроциклическими хелаторами, которые можно применять для конъюгации ионов радиоактивных металлов, включая, но не ограничиваясь ими, In¹³¹, Lu¹³¹, Y¹³¹, Но¹³¹, Sm¹³¹, с полипептидами. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения макроциклический хелатор представляет собой 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N,N',N'',N'''-этилендиаминтетрауксусную кислоту (DOTA), которая может быть присоединена к антителу с помощью линкерной молекулы. Линкерные молекулы, как правило, известны в данной области техники и описаны, например, в Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; и Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol 26(8):943-50.

[000296] Помимо этого, антитела согласно настоящему изобретению могут быть гибридизованы с последовательностями маркера или «метки», такими как пептид, чтобы облегчить очистку. Согласно конкретным вариантам реализации аминокислотная последовательность маркера или метки представляет собой гексагистидиновый пептид, такой как метка, обеспеченная в векторе pQE (см., например, Qiagen, Inc.), в частности, многие из которых являются коммерчески доступными. Например, те, которые описаны в Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, гексагистидиновая метка обеспечивает удобную очистку гибридизованного белка. Другие пептидные метки, которые можно применять для очистки, включают, но не ограничиваются ими, гемагглютининовую метку («НА»), которая соответствует эпитопу, полученному из белка гемагглютинина вируса гриппа (Wilson et al., 1984, Cell 37:767) и метку «FLAG».

[000297] Способы гибридизации или конъюгации терапевтических фрагментов (включая полипептиды) с антителами хорошо известны (см., например, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", в Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", в Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", в Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", в Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985), Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58; патенты США №№5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851, 5723125, 5783181, 5908626, 5844095, и 5112946; ЕР 307434; ЕР 367166; ЕР 394827; публикацию РСТ WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631 и WO 99/04813; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539, 1991; Traunecker et al., Nature, 331:84-86, 1988; Zheng et al., J. Immunol., 154:5590-5600, 1995; Vil etal, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11337-11341, 1992).

[000298] Гибридные белки могут быть получены, например, с помощью методик перегруппировки генов, перегруппировки мотивов, перегруппировки экзонов и/или перегруппировки кодонов (совместно именуемых «перегруппировка ДНК»). Перегруппировку ДНК можно применять для изменения активности антител к бета-клото согласно настоящему изобретению, включая, например, антитела с более высокой аффинностью и более низкими скоростями диссоциации (см., например, патенты США №№5605793, 5811238, 5830721, 5834252 и 5837458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; и Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308- 313). Антитела или кодируемые антитела могут быть изменены с помощью случайного мутагенеза, используя ПЦР с внесением ошибок, вставку нуклеотидов в случайном порядке или другие способы перед проведением рекомбинации. Полинуклеотид, кодирующий антитело согласно настоящему изобретению, может быть рекомбинирован с одним или более компонентами, мотивами, участками, частями, доменами, фрагментами и т.д. одной или более гетерологичных молекул.

[000299] Антитело согласно настоящему изобретению также может быть конъюгировано со вторым антителом с образованием гетероконъюгата антитела, описанного, например, в патенте США №4676980.

[000300] Терапевтический фрагмент или лекарственный препарат, конъюгированный или гибридизованный рекомбинантным способом с антителом согласно настоящему изобретению, которое связывается с бета-клото (например, полипептидом, фрагментом, эпитопом бета-клото), должен быть выбран так, чтобы достичь желаемого профилактического или терапевтического действия. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой модифицированное антитело. При принятии решения о том, с каким терапевтическим фрагментом или лекарственным препаратом будет конъюгировано или гибридизовано рекомбинантным способом антитело согласно настоящему изобретению, врач или другой медицинский работник может рассмотреть, например, следующие факторы: характер заболевания, степень тяжести заболевания, а также состояние субъекта.

[000301] Антитела, которые связываются с бета-клото, согласно настоящему изобретению также могут быть прикреплены к твердым подложкам, которые являются особенно подходящими для иммунологических количественных исследований или очистки антигена-мишени. Такие твердые носители включают, но не ограничиваются ими, стекло, целлюлозу, полиакриламид, нейлон, полистирол, поливинилхлорид или полипропилен.

[000302] Линкер может представлять собой «расщепляемый линкер», облегчающий высвобождение конъюгированного агента в клетке, однако в объем настоящего изобретения также включены нерасщепляемые линкеры. Линкеры для применения в конъюгатах согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, кислотно-лабильные линкеры (например, гидразоновые линкеры), дисульфидсодержащие линкеры, чувствительные к пептидазам линкеры (например, пептидные линкеры, включающие аминокислоты, например, валин и/или цитруллин, такие как цитруллин-валин или фенилаланин-лизин), фотолабильные линкеры, диметильные линкеры (см., например, Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); патент США №5208020), тиоэфирные линкеры или гидрофильные линкеры, разработанные для того чтобы избежать устойчивости к лекарственным препаратам, опосредованной транспортерами множественной лекарственной устойчивости (см., например, Kovtun et al., Cancer Res. 70: 2528-2537, 2010).

[000303] Конъюгаты антитела и агента могут быть получены с использованием множества бифункциональных агентов, связывающих белки, таких как BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SB АР, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-4-винилсульфонбензойная кислота). В настоящем изобретении также предусмотрено, что конъюгаты антител и агентов могут быть получены с использованием любых подходящих способов, описанных в данной области техники (см., например, в Bioconjugate Techniques, 2nd Ed., G.T. Hermanson, ed., Elsevier, San Francisco, 2008).

[000304] Стандартные стратегии конъюгации для антител и агентов были основаны на случайной химической конъюгации с участием е-аминогруппы остатков лизина или тиольной группы остатков цистеина, что приводит к получению гетерогенных конъюгатов. Разработанные в последнее время методики обеспечивают сайт-специфичную конъюгацию с антителами, что позволяет достичь однородной нагрузки и избежать получения субпопуляций конъюгатов с измененными антигенсвязывающими свойствами или фармакокинетикой. Указанные методики включают конструирование «тиомоноклональных антител», содержащих замены остатков аминокислот остатками цистеина на тяжелых и легких цепях в положениях, которые обеспечивают реактивные тиоловые группы и не нарушают сворачивание и сборку иммуноглобулина или не изменяют характеристики связывания антигена (см., например, Junutula et al., J. Immunol. Meth. 332: 41-52 (2008); Junutula et al., Nat. Biotechnol. 26: 925-932, 2008). В другом способе селеноцистеин котрансляционно встраивают в последовательность антитела с помощью перекодировки стоп-кодона UGA для изменения его функции с терминации трансляции на вставку селеноцистеина, обеспечивая тем самым сайт-специфичную ковалентную конъюгацию в нуклеофильной селенольной группе селеноцистеина в присутствии других природных аминокислот (см., например, Hofer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 12451-12456 (2008); Hofer et al., Biochemistry 48(50): 12047-12057, 2009).

Фармацевтические составы

[000305] Антитела к бета-клото согласно настоящему изобретению могут быть введены любым путем, который соответствует состоянию, подлежащему лечению. Антитело, как правило, будет введено парентерально, например, с помощью инфузии, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрикожного, интратекального и эпидурального пути введения. Доза антитела будет варьироваться в зависимости от характера и/или степени тяжести заболевания, а также состояния субъекта, и дозы антитела находятся в диапазоне от 1 мг до 100 мг. Дозы также могут находиться в диапазоне от 1 мг/кг до 15 мг/кг. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения доза составляет от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 7,5 мг/кг. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения доза составляет приблизительно 5 мг/кг. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения доза составляет приблизительно 7,5 мг/кг. Фиксированные дозы выбирают из группы, состоящей из: (а) 375-400 мг каждые две недели, и (b) 550-600 мг один раз в три недели. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фиксированная доза составляет 375-400 мг один раз в две недели. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фиксированная доза составляет 550-600 мг один раз в три недели. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фиксированная доза составляет 400 мг каждые две недели. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фиксированная доза составляет 600 мг один раз в три недели. Согласно некоторым вариантам последовательного введения каждая из первой дозы и второй дозы находится в диапазоне от 1 мг/кг до 15 мг/кг, причем вторую дозу вводят через 1-4 недели после первой дозы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждая из первой дозы и второй дозы находится в диапазоне от 5 мг/кг до 7,5 мг/кг, причем вторую дозу вводят через 2-3 недели после первой дозы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждая из первой дозы и второй дозы составляет 5 мг/кг, причем вторую дозу вводят через 2 недели после первой дозы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждая из первой дозы и второй дозы составляет 7,5 мг/кг, причем вторую дозу вводят через 3 недели после первой дозы.

[000306] Для лечения заболеваний, расстройств и состояний антитело согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вводят с помощью внутривенной инфузии. Доза, вводимая с помощью инфузии, находится в пределах от приблизительно 1 мкг/м² до приблизительно 10000 мкг/м² на дозу, как правило, одну дозу в неделю, для введения в общей сложности одной, двух, трех или четырех доз. Согласно другому варианту диапазон дозировки составляет от приблизительно 1 мкг/м² до приблизительно 1000 мкг/м², от приблизительно 1 мкг/м² до приблизительно 800 мкг/м², от приблизительно 1 мкг/м² до приблизительно 600 мкг/м², от приблизительно 1 мкг/м² до приблизительно 400 мкг/м²; в другом варианте от приблизительно 10 мкг/м² до приблизительно 500 мкг/м², от приблизительно 10 мкг/м² до приблизительно 300 мкг/м², от приблизительно 10 мкг/м² до приблизительно 200 мкг/м², от приблизительно 1 мкг/м² до приблизительно 200 мкг/м², Доза может быть введена один раз в сутки, один раз в неделю, несколько раз в неделю, но реже одного раза в сутки, несколько раз в месяц, но реже одного раза в сутки, несколько раз в месяц, но реже одного раза в неделю, один раз в месяц или с перерывами, чтобы уменьшить или облегчить симптомы заболевания, расстройства или состояния. Введение может продолжаться с любым из раскрытых интервалов до тех пор, пока не будет достигнуто улучшение заболевания, расстройства или состояния, или облегчение симптомов заболевания, расстройства или состояния, подлежащего лечению. Введение может продолжаться после того как была достигнута ремиссия или облегчение симптомов, в том случае, когда достигнутая ремиссия или облегчение продлевается с помощью продолжающегося введения.

[000307] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении также предложены фармацевтические составы, содержащие 110 меньшей мере одно антитело к бета-клото согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтический состав содержит 1) антитело к бета-клото и 2) фармацевтически приемлемый носитель. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтический состав содержит 1) антитело к бета-клото и/или его иммуноконъюгат и необязательно 2) 110 меньшей мере один дополнительный терапевтический агент.

[000308] Фармацевтические составы, содержащие антитело, получают для хранения путем смешивания антитела, имеющего требуемую степень чистоты, с необязательными физиологически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) в виде водных растворов или лиофилизированных или других высушенных составов. Составы согласно настоящему изобретению также могут содержать более одного активного соединения, если необходимо для конкретного показания, подлежащего лечению, предпочтительно те, которые обладают взаимодополняющей активностью и не оказывают отрицательного влияния друг на друга. Например, помимо антитела к бета-клото, желательным может быть включение в один состав дополнительного антитела, например, второго антитела к бета-клото, которое связывается с другим эпитопом на полипептиде бета-клото, или антитела к какой-либо другой мишени. В качестве альтернативы или дополнительно, композиция может дополнительно содержать другой агент, включая, например, химиотерапевтический агент, цитотоксический агент, цитокин, ингибирующий рост агент, антигормональный агент и/или кардиопротектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения состав содержит алкилирующий агент (например, хлорамбуцил, гидрохлорид бендамустина или циклофосфамид), аналог нуклеозида (например, флударабин, пентостатин, кладрибин или цитарабин), кортикостероид (например, преднизон, преднизолон или метилпреднизолон), иммуномодулирующий агент (например, леналидомид), антибиотик (например, доксорубицин, даунорубицин идаруцибин или митоксентрон), синтетический флавон (например, флавопиридол), антагонист Bcl2 (например, облимерсен или АВТ-263), гипометилирующий агент (например, азацитидин или децитабин), ингибитор FLT3 (например, мидостаурин, сорафениб и АС220). Указанные молекулы могут присутствовать в комбинации в количествах, которые эффективны в соответствии с предполагаемыми целями.

[000309] Антитела согласно настоящему изобретению могут быть изготовлены в любой подходящей форме для доставки в целевую клетку/ткань, например, в виде микрокапсул или макроэмульсий (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980); Park et al., Molecules 10: 146-161 (2005); Malik et al., Curr. Drug. Deliv. 4: 141-151 (2007)); в виде составов с замедленным высвобождением (Putney and Burke, Nature Biotechnol. 16: 153-157, (1998)) или в виде липосом (Maclean et al., Int. J. Oncol. 11: 235-332 (1997); Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 8: 39-45 (2006)).

[000310] Антитело согласно настоящему изобретению также может быть заключено в микрокапсулы, полученные, например, с помощью способов коацервации или путем межфазной полимеризации, например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы, желатина или полиметилметакрилата, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных препаратов (например, липосомы, микросферы альбумина, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Указанные способы описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.

[000311] Различные системы доставки известны и могут быть использованы для введения профилактического или терапевтического агента (например, антитела, которое связывается с бета-клото, описанного в настоящей заявке), включая, но не ограничиваясь ими, инкапсулирование в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать антитело, рецептор-опосредованный эндоцитоз (см., например, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), конструирование нуклеиновой кислоты в качестве части ретровирусного или другого вектора и т.д. Согласно другому варианту реализации профилактический или терапевтический агент или композиция согласно настоящему изобретению может быть доставлена в системе с контролируемым высвобождением или замедленным высвобождением. Согласно одному варианту реализации для достижения контролируемого или замедленного высвобождения может быть использована помпа (см., например, Langer, выше; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Согласно другому варианту реализации полимерные материалы могут быть использованы для достижения контролируемого или замедленного высвобождения профилактического или терапевтического агента (например, антитела, которое связывается с бета-клото, описанного в настоящей заявке) или композиции согласно настоящему изобретению (см., например, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; см. также Levy et al., 1985, Science 228:190; During etal, 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); патент США №5679377; патент США №5916597; патент США №5912015; патент США №5989463; патент США №5128326; публикацию РСТ WO 99/15154; и публикацию РСТ WO 99/20253). Примеры полимеров, используемых в составах с замедленным высвобождением, включают, но не ограничиваются ими, поли-2-гидроксиэтилметакрилат, полиметилметакрилат, полиакриловую кислоту, полиэтилен-со-винилацетат, полиметакриловую кислоту, полигликолиды (PLG), полиангидриды, поли-N-винилпирролидон, поливиниловый спирт, полиакриламид, полиэтиленгликоль, полилактиды (PLA), полилактид-со-гликолиды (PLGA) и полиортоэфиры. Согласно одному варианту реализации полимер, используемый в составе с замедленным высвобождением, является инертным, не содержит выщелачиваемых примесей, является стабильным при хранении, стерильным и биоразлагаемым.

[000312] Согласно другому варианту реализации система с контролируемым или замедленным высвобождением может быть помещена вблизи терапевтической мишени, например, носовых проходов или легких, соответственно, в этом случае требуется только часть системной дозы (см., например, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, выше, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Системы с контролируемым высвобождением обсуждаются, например, в Langer (1990, Science 249:1527-1533). Любая методика, известная специалисту в данной области техники, может быть использована для получения препаратов с замедленным высвобождением, содержащих одно или более антител, которые связываются с бета-клото, описанных в настоящей заявке. (См., например, патент США №4526938, публикацию РСТ WO 91/05548, публикацию РСТ WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Lnt'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, и Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp.Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760).

Терапевтические методы

[000313] Антитело согласно настоящему изобретению можно применять, например, в терапевтических методах в условиях in vitro, ex vivo и in vivo. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложены способы лечения или предотвращения заболевания, расстройства или состояния, в условиях in vivo или в условиях in vitro, причем указанный способ включает воздействие антитела к бета-клото на клетку.

[000314] Согласно одному аспекту антитело согласно настоящему изобретению применяют для лечения или предотвращения заболевания, расстройства или состояния, включая, например, сахарный диабет типа 2, ожирение, дислипидемию, НАСГ, сердечнососудистые заболевания, метаболический синдром или в целом любое заболевание, расстройство или состояние, при котором желательной является имитация или усиление действия FGF19 и/или FGF21 в условиях in vivo.

[000315] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложены способы лечения заболевания, расстройства или состояния, включающие введение индивидууму эффективного количества антитела к бета-клото или его фрагмента. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ лечения заболевания, расстройства или состояния, включает введение индивидууму эффективного количества фармацевтического состава, содержащего антитело к бета-клото и возможно 110 меньшей мере один дополнительный терапевтически агент, такой как те, которые описаны в настоящей заявке.

[000316] Антитело к бета-клото или его фрагмент может быть введен человеку в терапевтических целях. Помимо этого, антитело к бета-клото или его фрагмент можно вводить млекопитающему, отличному от человека, экспрессирующему бета-клото, с которым указанное антитело перекрестно реагирует (например, примату, свинье, крысе или мыши), для ветеринарных целей или в качестве животной модели заболевания человека. В отношении последнего способа следует отметить, что такие животные модели можно применять для оценки терапевтической эффективности антител согласно настоящему изобретению (например, испытания дозировок и продолжительности курсов введения).

[000317] Антитела согласно настоящему изобретению можно применять 110 отдельности или в комбинации с другими композициями в терапии. Например, антитело к бета-клото согласно настоящему изобретению можно вводить совместно с 110 меньшей мере одним дополнительным терапевтическим агентом и/или адъювантом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения дополнительное соединение представляет собой терапевтическое антитело, отличное от антитела к бета-клото.

[000318] Комбинированные терапии, указанные выше, включают комбинированное введение (при котором два или более терапевтических агентов входят в состав одних и тех же или отдельных составов) и раздельное введение, в случае которого антитело к бета-клото или его фрагмент согласно настоящему изобретению может быть введен перед, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента и/или адъюванта. Антитела согласно настоящему изобретению также можно применять в комбинации с дополнительными терапевтическими схемами, включая, но не ограничиваясь ими, те, которые описаны в настоящей заявке.

[000319] Антитело согласно настоящему изобретению (и любой дополнительный терапевтический агент или адъювант) можно вводить с помощью любого подходящего способа, включая парентеральный, подкожный, внутрибрюшинный, внутрилегочной и назальный пути введения, и, если это желательно для местного лечения, внутриочагового пути введения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Помимо этого, антитело или конъюгат соответствующим образом вводят путем пульс-инфузии, в частности, со снижением доз антитела или его фрагмента. Дозирование можно осуществлять любым подходящим способом, например, путем инъекций, например, внутривенных или подкожных инъекций, отчасти в зависимости от того, является ли введение кратковременным или длительным.

[000320] Антитела согласно настоящему изобретению могут быть изготовлены, дозированы и введены в соответствии с требованиями Надлежащей медицинской практики. Факторы, подлежащие рассмотрению применительно к введению антител, включают конкретное расстройство, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, которое лечат, клиническое состояние отдельного пациента, причину расстройства, место доставки агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Антитело к бета-клото может быть, но не обязательно, изготовлено с добавлением одного или более агентов, используемых в настоящее время для предотвращения или лечения рассматриваемого расстройства. Эффективное количество других агентов зависит от количества антитела или иммуноконъюгата, присутствующего в составе, типа расстройства или вида лечения и других факторов, описанных выше. Дополнительные агенты, как правило, используют в тех же дозах и вводят с помощью тех же способов введения, что и те, которые описаны в настоящей заявке, или в дозе, которая составляет от приблизительно от 1 до 99% от доз, описанных в настоящей заявке, или в любой дозировке и любым способом, который является подходящим на основании результатов эмпирического/клинического определения.

[000321] Для предотвращения или лечения заболевания, расстройства или состояния подходящая доза антитела к бета-клото согласно настоящему изобретению (при использовании 110 отдельности или в комбинации с одним или более другими дополнительными терапевтическими агентами, такими как агенты, описанные в настоящей заявке) будет зависеть от типа заболевания, расстройства или состояния, подлежащего лечению, типа антитела, степени тяжести и течения заболевания, расстройства или состояния, от того, вводят антитело в профилактических или терапевтических целях, предыдущей терапии, истории болезни пациента и ответа на антитело и решения лечащего врача. Антитело к бета-клото соответствующим образом вводят пациенту один раз или с помощью серии введений. В зависимости от типа и степени тяжести заболевания в качестве предполагаемой начальной дозы для введения пациенту можно использовать от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг (например, 0,1 мг/кг-20 мг/кг, 1 мг/кг-15 мг/кг и т.д.) антитела, например, с помощью одного или более отдельных введений или путем непрерывной инфузии. Одна типичная суточная доза может варьироваться от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от указанных выше факторов. Для повторного введения в течение нескольких дней или более, в зависимости от состояния, лечение, как правило, будут продолжать до достижения желаемой степени подавления симптомов заболевания. Типичные дозировки антитела могут находиться в диапазоне от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 10,0 мг/кг.Соответственно, пациенту может быть введена одна или более доз антитела, составляющих приблизительно 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг, 2,0 мг/кг, 3,0 мг/кг, 4,0 мг/кг, 5,0 мг/кг, 6,0 мг/кг, 7,0 мг/кг, 8,0 мг/кг, 9,0 мг/кг или 10,0 мг/кг (или любая их комбинация). Указанные дозы можно вводить периодически, например, каждую неделю или один раз в три недели (например, так, что пациент получает от двух до двадцати, или, например, приблизительно шесть доз антитела). Пациенту может быть введена более высокая начальная нагрузочная доза, с последующим введением одной или более низких доз. Примерная схема введения включает введение начальной нагрузочной дозы и затем поддерживающей дозы (например, еженедельно) антитела. Начальная нагрузочная доза может превышать поддерживающую дозу. Однако можно использовать другие схемы дозирования. Прогресс этой терапии легко контролировать с помощью обычных методик и количественных исследований.

Диагностические способы и способы детектирования

[000322] Согласно одному аспекту антитела к бета-клото и их фрагменты согласно настоящему изобретению можно использовать для детектирования наличия бета-клото в биологическом образце. Указанные антитела к бета-клото могут включать те, которые связываются с бета-клото человека и/или яванских макак, но не индуцируют передачу сигналов, которая аналогична таковой для FGF19 и/или FGF21. В настоящей заявке термин «детектирование» включает количественное или качественное детектирование. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биологический образец содержит клетку или ткань.

[000323] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен способ детектирования наличия бета-клото в биологическом образце. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ включает приведение биологического образца в контакт с антителом к бета-клото в условиях, обеспечивающих связывание антитела к бета-клото с бета-клото, и детектирование процесса образования комплекса между антителом к бета-клото и бета-клото.

[000324] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен способ диагностики расстройства, связанного с экспрессией бета-клото. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ включает приведение испытываемой клетки в контакт с антителом к бета-клото; определение уровня экспрессии (количественно или качественно) бета-клото испытываемой клеткой путем детектирования связывания антитела к бета-клото с бета-клото; и сравнение уровня экспрессии бета-клото испытываемой клеткой с уровнем экспрессии бета-клото контрольной клеткой (например, нормальной клеткой, которая имеет то же тканевое происхождение, что и испытываемая клетка или клетка, которая экспрессирует бета-клото на уровне, который сопоставим с таковым для нормальной клетки), при этом более высокий уровень экспрессии бета-клото испытываемой клеткой, 110 сравнению с контрольной клеткой, указывает на наличие расстройства, связанного с повышенной экспрессией бета-клото. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения испытываемая клетка получена от индивидуума, у которого подозревают наличие заболевания, расстройства или состояния, связанного с экспрессией бета-клото, и/или заболевания, расстройства или состояния, при которых желательной является имитация или усиление влияния FGF19 и/или FGF21 в условиях in vivo. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения заболевание, расстройство или состояние представляет собой, например, сахарный диабет типа 2, ожирение, дислипидемию, НАСГ, сердечно-сосудистое заболевание или метаболический синдром. Указанные типичные заболевания, расстройства или состояния могут быть диагностированы с помощью антитела к бета-клото согласно настоящему изобретению.

[000325] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ диагностики или детектирования, такой как те, которые описаны выше, включает детектирование связывания антитела к бета-клото с бета-клото, который экспрессируется на поверхности клетки или в мембранном препарате, полученном из клетки, экспрессирующей бета-клото на своей поверхности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ включает приведение клетки в контакт с антителом к бета-клото в условиях, обеспечивающих связывание антитела к бета-клото с бета-клото, и детектирование процесса образования комплекса между антителом к бета-клото и бета-клото на поверхности клетки. Типичный количественный способ исследования для детектирования связывания антитела к бета-клото с бета-клото, который экспрессируется на поверхности клетки, включает проточную цитометрию («FACS»).

[000326] Некоторые другие способы могут быть использованы для детектирования связывания антитела к бета-клото с бета-клото. Указанные способы включают, но не ограничиваются ими, количественные исследования связывания с антигеном, которые хорошо известны в данной области техники, такие как Вестерн-блоттинг, радиоиммунологические количественные исследования, ИФА (твердофазный иммуноферментный анализ), иммунологические количественные исследования в формате «сэндвич», иммунопреципитацию, флуоресцентные иммунологические количественные исследования, иммунологические количественные исследования с использованием белка А и иммуногистохимические методы (ИГХ).

[000327] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела к бета-клото являются мечеными. Метки включают, но не ограничиваются ими, метки или фрагменты, которые можно детектировать непосредственно (например, флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также фрагменты, такие как ферменты или лиганды, которые можно детектировать косвенно, например, путем ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия. Типичные метки включают, но не ограничиваются ими, радиоизотопы Р³², С¹⁴, I¹²⁵, Н³ и I¹³¹, флуорофоры, такие как хелаторы редкоземельных металлов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люциферазу светлячка и бактериальную люциферазу (см., например, патент США №4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу хрена (ПХ), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, оксидазы сахаридов, например, оксидазу глюкозы, оксидазу галактозы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, оксидазы гетероциклических соединений, такие как уриказа и ксантиноксидаза, в комбинации с ферментом, который использует пероксид водорода для окисления предшественника красителя, таким как ПХ, лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы и тому подобное.

[000328] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела к бета-клото иммобилизованы на нерастворимом матриксе. Иммобилизация обеспечивает отделение антитела к бета-клото от любого бета-клото, который остается в растворе в несвязанной форме. Такое разделение обычно осуществляют путем перевода антитела к бета-клото в нерастворимую форму перед количественным исследованием, например, в результате адсорбции на водонерастворимом матриксе или поверхности (см., например, Bennich et al., US 3720760), или путем ковалентного связывания (например, с помощью поперечных сшивок глутаровым альдегидом), либо путем перевода антитела к бета-клото в нерастворимую форму после образования комплекса между антителами к бета-клото и бета-клото, например, с помощью иммунопреципитации.

[000329] Любой из вышеописанных вариантов реализации диагностики или детектирования можно осуществлять с использованием иммуноконъюгата согласно настоящему изобретению вместо или в дополнение к антителу к бета-клото.

Количественные способы исследований

[000330] Антитела к бета-клото согласно настоящему изобретению могут быть охарактеризованы 110 их физическим/химическим свойствам и/или биологической активности с помощью различных количественных исследований, известных в данной области техники.

1. Количественные исследования активности

[000331] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложены способы количественных исследований для выявления антител к бета-клото, обладающих биологической активностью. Исследования для определения биологической активности могут включать, например, количественные исследования, которые позволяют измерить влияние на метаболизм глюкозы и/или липидов. Например, могут быть использованы количественные исследования уровня глюкозы в крови. Уровень глюкозы в крови (например, в образце крови, полученном из надреза мышиного хвоста, или в образце крови человека) может быть измерен с помощью регистрации сигнала полосок ACCU-СНЕК Active test устройством ACCU-CHEK Active meter (Roche Diagnostics, Индианаполис, Индиана, США), следуя инструкции производителя. Помимо этого, например, может быть использовано количественное исследование липидного профиля. Цельная кровь (например, полученная из надреза на хвосте мыши, или из образца крови человека) может быть собрана в простые капиллярные трубки (BD Clay Adams SurePrep, Becton Dickenson and Co. Sparks, Мэриленд, США). Сыворотка и клетки крови могут быть разделены путем центрифугирования пробирок в Autocrit Ultra 3 (Becton Dickinson and Co. Sparks, Мэриленд, США). Образцы сыворотки могут быть количественно исследованы для определения липидного профиля (триглицериды, общий холестерин, ЛПВП и не-ЛПВП) с использованием клинического анализатора Integra 400 (Roche Diagnostics, Индианаполис, Индиана, США), следуя инструкциям производителя.

2. Количественные исследования связывания и другие способы количественных исследований

[000332] Согласно одному аспекту антитело к бета-клото испытывают для определения его активности в отношении связывания антигена. Например, согласно некоторым вариантам реализации, антитело к бета-клото испытывают для определения его способности связываться с эндогенным или экзогенным бета-клото, который экспрессируется на поверхности клетки. Указанное испытание может быть проведено с помощью количественного исследования методом проточной цитометрии.

[000333] Панель моноклональных антител, индуцированных против бета-клото, может быть сгруппирована на основании эпитопов, которые они распознают, этот процесс известен как сортировка в зависимости от связываемого эпитопа. Сортировку в зависимости от связываемого эпитопа обычно проводят с использованием количественных исследований конкурентного связывания, чтобы оценить способность антитела связываться с антигеном в присутствии другого антитела. В типичном количественном исследовании конкурентного связывания иммобилизованный бета-клото инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с бета-клото, и второе немеченое антитело, способность которого конкурировать с первым антителом за связывание с бета-клото испытывают.Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный бета-клото инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но без второго немеченого антитела. После инкубации в условиях, обеспечивающих связывание первого антитела к бета-клото, избыток несвязанного антитела удаляют и измеряют количество метки, связанной с иммобилизованным бета-клото. Если количество метки, связанной с иммобилизованным бета-клото, существенно снижено в испытываемом образце 110 сравнению с контрольным образцом, это указывает на то, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с бета-клото. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения иммобилизованный бета-клото присутствует на поверхности клетки или в мембранном препарате, полученном из клетки, экспрессирующей бета-клото на ее поверхности.

[000334] Высокопроизводительные способы сортировки в зависимости от связываемого эпитопа также известны в данной области техники (см., например, Jia et al., J. Immunol. Methods 2004, 288(1-2):91-98, где описан способ мультиплексной конкурентной сортировки антител для характеристики моноклональных антител, и Miller et al., J. Immunol. Methods 2011, 365(1-2): 118-25, где описана сортировка в зависимости от связываемого эпитопа мышиных моноклональных антител с помощью мультиплексного количественного исследования спаривания). 3. Картирование эпитопов

[000335] Картирование эпитопов представляет собой процесс идентификации сайтов связывания, или эпитопов, антитела на его белковом антигене-мишени. Эпитопы антитела могут представлять собой линейные эпитопы или конформационные эпитопы. Линейные эпитопы образованы непрерывной последовательностью аминокислот в белке. Конформационные эпитопы образованы аминокислотами, которые не образуют непрерывной последовательности в белке, но которые сближаются при складывании белка в его трехмерную структуру.

[000336] В данной области техники известны различные способы картирования эпитопов антитела на белковых антигенах-мишенях. Указанные способы включают способы мутагенеза, способы пептидного сканирования, способы дисплея, способы, включающие масс-спектроскопию и определение структуры.

[000337] Сайт-направленный мутагенез включает нацеленный сайт-направленный мутагенез, при котором критические аминокислоты выявляют путем систематического введения замен вдоль белковой последовательности, и затем определяют влияние каждой замены на связывание антитела. Введение замен можно осуществлять с помощью «аланин-сканирующего мутагенеза», описанного, например, в Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085, или какой-либо другой формы точечного мутагенеза остатков аминокислот в бета-клото человека. Однако исследования с использованием мутагенеза также могут выявить остатки аминокислот, которые имеют ключевое значение для общей трехмерной структуры бета-клото, но которые непосредственно не участвуют в контактах антиген-антитело, и, соответственно, другие способы могут потребоваться для того чтобы подтвердить функциональный эпитоп, определенный с использованием этого способа.

[000338] Картирование с использованием мутагенеза методом «дробовика» основано на применении обширной библиотеки плазмид, содержащих мутацию гена-мишени, при этом каждый клон в библиотеке несет уникальную мутацию аминокислоты и вся библиотека охватывает каждую аминокислоту в белке-мишени. Клоны, которые составляют библиотеку мутаций, индивидуально вносят в микропланшеты, экспрессируют в живых клетках млекопитающих и испытывают их иммунореактивность с помощью антител, представляющих интерес.Аминокислоты, которые имеют ключевое значение для эпитопов антител, выявляют на основании потери реактивности, и затем картируют на структуре белка для визуализации эпитопов. Благодаря автоматизации исследования новые карты эпитопов могут быть получены в течение от нескольких дней до нескольких недель. Поскольку в указанной методике используется нативная структура белков в клетках млекопитающих, она обеспечивает картирование линейных и конформационных эпитопов на сложных белках. (См, например, Paes et al., J. Am. Chem. Soc. 131(20): 6952-6954 (2009); Banik and Doranz, Genetic Engineering and Biotechnology News 3(2): 25-28 (2010)).

[000339] Эпитоп, связанный с антителом к бета-клото, также может быть определен с помощью методов пептидного сканирования. При пептидном сканировании библиотеки коротких пептидных последовательностей из перекрывающихся сегментов белка-мишени, бета-клото, испытывают для определения их способности связывать антитело, представляющее интерес.Пептиды синтезируют и подвергают скринингу для определения связывания, например, с помощью ИФА или BIAcore, или на чипе, с помощью любого из многочисленных методов твердофазного скрининга (см., например, Reineke et al., Curr. Opin. Biotechnol. 12: 59-64, 2001), аналогично методологии «PEPSCAN» (см., например, WO 84/03564, WO 93/09872). Указанные способы пептидного скрининга могут быть неспособны детектировать некоторые прерывистые функциональные эпитопы, то есть функциональные эпитопы, которые содержат остатки аминокислот, которые не являются смежными вдоль первичной последовательности полипептидной цепи бета-клото.

[000340] Для картирования конформационных эпитопов может быть использована недавно разработанная технология, названная CLIPS (химическое связывание пептидов на каркасах). Свободные концы пептидов прикрепляют на синтетические каркасы так, что прикрепленный к каркасу пептид может принять пространственную структуру, которая соответствует структуре последовательности в интактном белке. Технология CLIPS используется для закрепления линейных пептидов в циклические структуры («однопетлевой» формат), а также для объединения различных частей сайта связывания белка (формат «двойной петли», «тройной петли» и т.д.) так, чтобы создать конформационные эпитопы, которые могут быть количественно исследованы для определения их способности связываться с антителами (см., например, патент США №7972993).

[000341] Эпитопы, связанные с антителами согласно настоящему изобретению, также могут быть картированы с помощью методик дисплея, включая, например, фаговый дисплей, микробный дисплей и дисплей рибосом/мРНК, описанные выше. При использовании указанных способов библиотеки пептидных фрагментов экспрессируют на поверхности фага или клеток. Эпитопы затем картируют с помощью скрининга моноклональных антител к указанным фрагментам, используя количественные исследования селективного связывания. Был разработан ряд вычислительных средств, которые позволяют прогнозировать конформационные эпитопы на основании линейных пептидов, отобранных на основании их аффинности, которые получены с использованием фагового дисплея (см., например, Mayrose et al., Bioinformatics 23: 3244-3246, 2007). Также доступны способы детектирования конформационных эпитопов методом фагового дисплея. Системы микробного дисплея также могут быть использованы для экспрессии антигенных фрагментов, правильно свернутых на клеточной поверхности, чтобы выявить конформационные эпитопы (см., например, Cochran et al., J. Immunol. Meth. 287: 147-158, 2004; Rockberg et al., Nature Methods 5: 1039-1045, 2008).

[000342] Для определения эпитопов антител также могут быть использованы различные способы, включающие протеолиз и масс-спектроскопию (см., например, Baerga-Ortiz et al., Protein Sci. 2002 June; 11(6): 1300-1308). При ограниченном протеолизе антиген расщепляют различными протеазами в присутствии и в отсутствие антитела, и фрагменты идентифицируют с помощью масс-спектрометрии. Эпитоп представляет собой область антигена, которая становится защищенной от протеолиза после связывания с антителом (см., например, Suckau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9848-9852, 1990). Дополнительные способы на основе протеолиза включают, например, селективную химическую модификацию (см., например, Fiedler et al., Bioconjugate Chemistry 1998, 9(2): 236-234, 1998), вырезание эпитопа (см., например, Van de Water et al., Clin. Immunol. Immunopathol 1997, 85(3): 229-235, 1997) и недавно разработанный способ обмена водорода/дейтерия (H/D) (см., например, Flanagan, N., Genetic Engineering and Biotechnology News 3(2): 25-28, 2010).

[000343] Эпитоп, связанный с антителами согласно настоящему изобретению, также может быть определен с помощью структурных методов, таких как определение кристаллической структуры с помощью рентгенографии (см., например, WO 2005/044853), молекулярного моделирования и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), включая определение с помощью ЯМР скоростей обмена H-D лабильных водородов амидных групп в свободной и связанной форме в комплексе с антителом, представляющим интерес (см., например, Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31:11335-11347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32:6884-6891).

[000344] Могут быть получены дополнительные антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и антитело согласно настоящему изобретению, например, путем скрининга антител, индуцированных против бета-клото, которые связываются с эпитопом, путем иммунизации животного пептидом, содержащим фрагмент бета-клото человека, содержащий последовательность эпитопа, или путем отбора антител с использованием фагового дисплея, чтобы определить связывание с последовательностью эпитопа. Антитела, которые связываются с аналогичным функциональным эпитопом, как можно ожидать, проявят аналогичные виды биологической активности, такие как блокирование биологической активности бета-клото, и такие виды активности могут быть подтверждены с помощью функциональных количественных исследований антител. Дополнительные количественные исследования активности

[000345] Согласно одному варианту реализации антитело к бета-клото согласно настоящему изобретению является антителом-антагонистом, которое ингибирует биологическую активность бета-клото. Антитела к бета-клото согласно настоящему изобретению могут быть количественно исследованы для определения их способности ингибировать биологическую активность бета-клото.

[000346] Согласно одному аспекту очищенные антитела к бета-клото могут быть дополнительно охарактеризованы с помощью ряда количественных исследований, включая, но не ограничиваясь ими, N-концевое секвенирование, исследование аминокислотного состава, гель-хроматографию/высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) в неденатурирующих условиях, масс-спектрометрию, ионообменную хроматографию и расщепление папаином.

[000347] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложено измененное антитело, которое обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает указанное антитело подходящим кандидатом для многих способов применения, в которых период полувыведения антител в условиях in vivo имеет важное значение, в то время как некоторые эффекторные функции (такие как CDC и ADCC) являются ненужными или вредными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения виды активности Fc антитела измеряют, чтобы убедиться в том, что сохраняются только желаемые свойства. Количественные исследования цитотоксичности в условиях in vitro и/или в условиях in vivo могут быть проведены, чтобы подтвердить уменьшение/истощение CDC- и/или ADCC-активности. Например, количественные исследования связывания с рецептором Fc (FcR) могут быть проведены, чтобы убедиться в том, что антитело не способно связываться с FcγR (следовательно, скорее всего, лишено ADCC-активности), но при этом сохраняет способность связываться с FcRn. Количественное исследование в условиях in vitro для оценки ADCC-активности молекулы, представляющей интерес, описано, например, в патентах США №500362 или №5821337. Эффекторные клетки, подходящие для проведения указанных количественных исследований, включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и природные клетки-киллеры (NK). В другом варианте или дополнительно, ADCC-активность молекулы, представляющей интерес, можно оценить в условиях in vivo, например, в животной модели, такой как та, которая описана в Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Количественные исследования связывания с Clq также могут быть проведены, чтобы подтвердить, что антитело не способно связываться с C1q и, следовательно, лишено CDC-активности. Чтобы оценить активацию комплемента может быть выполнено количественное исследование CDC, например, описанное в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Исследования связывания с FcRn и определения клиренса/периода полувыведения в условиях in vivo также могут быть выполнены с использованием способов, известных в данной области техники.

[000348] Несмотря на то, что настоящее изобретение было подробно описано с помощью пояснения и примеров для ясности понимания, описания и примеры не должны быть истолкованы как ограничивающие объем настоящего изобретения. Содержание всех патентов и научной литературы, процитированной в настоящей заявке, явным образом полностью включено в настоящую заявку посредством ссылок.

ПРИМЕРЫ

[000349] Ниже приведены примеры способов и композиций согласно настоящему изобретению.

ПРИМЕР 1: ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ К БЕТА-КЛОТО

[000350] Антитела к бета-клото получали, например, путем иммунизации мышей (i) клетками, экспрессирующими бета-клото человека (HuKLB) и рецептор FGFlc (FGFR1c или RIc) и (ii) белком бета-клото HuKLB и бета-клото яванских макак (cyno KLB).

[000351] Например, клетки, экспрессирующие бета-клото, получали, как описано далее. Клетки 293EXPI (Invitrogen) кратковременно совместно трансфецировали последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующих вариант FGFR1c с мутацией в положении аминокислоты 623 (см., например, SEQ ID NO: 308, но с мутацией D623N) и HuKLB (SEQ ID NO: 297). Клетки исследовали для оценки экспрессии R1c и HuKLB с помощью соответствующих специфичных антител методом проточной цитометрии. Клетки промывали 2 раза в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), осаждали центрифугированием и замораживали в отдельных ампулах при плотности 6×10⁷ клеток для последующей иммунизации животных. Животных линии 129/В6 иммунизировали с использованием 1×10⁷ клеток с добавлением адъювантов (RIBI, CpG и PolyIC). Животных повторно иммунизировали каждые 2 недели в течение срока, необходимого для выработки соответствующего титра. Животных повторно иммунизировали с использованием белка HuKLB и CyKLB после 4 повторных иммунизации с использованием клеток 293EXPI, гиперэкспрессирующих R1c и HuKLB. Титры определяли с помощью ИФА и проточной цитометрии. Суспензии отдельных лимфоцитов получали из селезенки и дренирующих лимфатических узлов животных с подходящими титрами. Клетки гибридизовали с клетками миеломы SP2/0 в соотношении 1:2 с помощью слияния методом электрошока. Гибридные клетки высевали при плотности 2,5×10⁶ клеток на чашку в 70 мкл в 24- и 384-луночные планшеты в присутствии HAT для селекции. Через 7 дней 110 50 мкл супернатанта удаляли и заменяли свежими средами, содержащими HAT. Через 10-14 дней культивирования супернатанты собирали и подвергали скринингу с помощью проточной цитометрии, используя клетки 293EXPI, гиперэкспрессирующие R1c и HuKLB, или с помощью Biacore с использованием белка HuKLB для подтверждения связывания. Положительные клоны подвергали дополнительному отбору и субклонировали.

[000352] Во время первого раунда иммунизации и гибридизации 110 меньшей мере 25-30 384-луночных планшетов подвергали скринингу для оценки связывания с HuKLB (например, с белком HuKLB и/или клетками, экспрессирующими HuKLB). Во время второго раунда иммунизации и гибридизации аналогичное количество планшетов, указанное для первого раунда, подвергали скринингу. Тысячи клонов подвергали скринингу, и сотни клонов отобрали для дополнительного исследования, включая количественные исследования связывания, аффинности и специфичности эпитопов, описанных в примерах 2 и 3. Сотни супернатантов гибридом также испытывали в функциональных количественных исследованиях, описанных примерах 4 и 5, включая определение агонистической активности, аналогичной таковой для лигандов рецепторов FGF, FGF19 и/или FGF21 (например, РСР19-подобной и/или FGF21-подобной сигнальной активности).

ПРИМЕР 2: СКРИНИНГ И ОТБОР АНТИТЕЛ К БЕТА-КЛОТО

[000353] Антитела к бета-клото получали из гибридом, например, таких как те, которые описаны в примере 1. Супернатанты гибридом подвергали скринингу для определения связывания с бета-клото (например, бета-клото человека и/или яванских макак) в количественных исследованиях с помощью проточной цитометрии и/или количественных исследованиях с помощью системы Biacore.

[000354] Например, через 2 недели культивирования супернатанты гибридом подвергали скринингу для определения связывания моноклональных антител с бета-клото человека с помощью метода проточной цитометрии. В общих чертах, супернатанты гибридом совместно инкубировали с клетками, гиперэкспрессирующими бета-клото человека, в течение 30 минут при температуре 4°С. После промывки с использованием ФСБ/1% БСА/0,1% азида клетки, гиперэкспрессирующие бета-клото человека, совместно инкубировали с меченым антителом к Fc мыши (Jackson ImmunoResearch) в течение 30 минут при 4°С. После промывки с использованием ФСБ/1% БСА/0,1% азида клетки регистрировали на проточном цитометре (FACS Calibur), и результаты обрабатывали с помощью аналитического программного обеспечения для проточной цитометрии (FlowJo). Связывающее антитело представляет собой то, сигнал которого сдвинут относительно сигнала клеток, инкубированных только с мечеными антителами к Fc мыши.

[000355] Например, через 2 недели культивирования супернатанты гибридом подвергали скринингу для определения связывания моноклональных антител с бета-клото человека с помощью метода скрининга связывания на основе Biacore. В общих чертах, антитело к Fc мыши (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) иммобилизовали на всех четырех проточных ячейках чипа СМ5 с использованием реагентов для связывания аминов (GE Healthcare LifeSciences, Пискатеуэй, Нью-Джерси, США). Супернатанты гибридомы разводили в три раза с использованием буфера ФСБ-Р (ФСБ, содержащий 0,005% Р20) и впрыскивали в течение 30 секунд на проточные ячейки 2, 3 и 4 для захвата антитела (проточную ячейку 1 использовали в качестве эталонной ячейки). Затем быстро впрыскивали бета-клото человека (25 нМ, R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США) в течение 60 секунд при скорости потока 30 мкл/мин, чтобы испытать связывание с захваченным антителом на каждой проточной ячейке.

[000356] После двух раундов иммунизации и гибридизации, описанных в примере 1, пятьдесят-шестьдесят 384-луночных планшетов с супернатантами гибридом количественно исследовали для определения связывания с помощью проточной цитометрии и/или системы Biacore. На основании результатов этих количественных исследований приблизительно 250 антител были идентифицированы, как связывающиеся с бета-клото человека. Указанные антитела очищали, и затем испытывали их аффинность связывания с бета-клото человека и бета-клото яванских макак с помощью системы Biacore, и испытывали их функциональную активность с помощью количественных исследований 110 гену-репортеру, описанных в примере 3.

[000357] В дополнительных количественных исследованиях связывания/скрининга на основе Biacore измеряли аффинность связывания антител к бета-клото человека и яванских макак. Например, антитела классифицировали на основании их аффинности связывания с бета-клото человека и бета-клото яванских макак с помощью измерения K_D с низким разрешением, используя систему Biacore. В общих чертах, антитело к Fc мыши (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) иммобилизовали на всех четырех проточных ячейках чипа СМ5 с использованием реагентов для связывания аминов (GE Healthcare LifeSciences, Пискатеуэй, Нью-Джерси, США). Очищенные антитела захватывали (-100 ед. отв.) на проточных ячейках 2, 3 и 4, и проточную ячейку 1 использовали в качестве эталонной ячейки. Затем впрыскивали бета-клото человека или яванских макак (25 нМ в буфере ФСБ-Р) при скорости потока 70 мкл/мин, и контролировали кинетику связывания при 25°С.

[000358] Измерения аффинности связывания также осуществляли в дополнительных количественных исследованиях с использованием системы Biacore. Например, измерения равновесной константы диссоциации (K_D) проводили с использованием очищенных антител, чтобы оценить их связывание с бета-клото человека и бета-клото яванских макак. Как уже упоминалось выше, антитело к Fc мыши (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) иммобилизовали на всех четырех проточных ячейках чипа СМ5 с использованием реагентов для связывания аминов (GE Healthcare LifeSciences, Пискатеуэй, Нью-Джерси, США). Очищенные антитела захватывали (~ 100 ед.отв.) на проточных ячейках 2, 3 и 4, используя проточную ячейку 1 в качестве эталона. Затем впрыскивали различные концентрации бета-клото человека или яванских макак (от 1,56 нМ до 25 нМ, двукратные разведения в буфере ФСБ-Р) при скорости потока 70 мкл/мин, и оценивали кинетику связывания при 25°С.

[000359] Показательные результаты представлены в виде значений K_D (нМ), приведенных в таблице 11 ниже.

ПРИМЕР 3: СКРИНИНГ И ОТБОР АНТИТЕЛ К БЕТА-КЛОТО

[000360] Антитела, которые были отобраны для связывания с бета-клото, например, такие как те, которые описаны в примере 2, оценивали в количественном исследовании конкурентного связывания и экспериментах 110 сортировке в зависимости от занимаемого эпитопа.

[000361] Например, для проведения количественного исследования конкурентного связывания с помощью проточной цитометрии готовили стандарты антител, которые были конъюгированы с флуорохромом, используя набор для введения метки А488 или А647 в антитела (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Титрование дозы конъюгированного стандартного антитела оценивали с использованием клеток, гиперэкспрессирующих HuKLB. Плато максимального сигнала связывания антитела соответствует ЕС=100 и фоновый сигнал ЕС=0. Количественное исследование конкурентного связывания с помощью проточной цитометрии, используя в качестве конкурента меченое флуорохромом антитело, проводили путем предварительной инкубации клеток, гиперэкспрессирующих HuKLB, с супернатантами гибридомы в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем без этапа промывки добавляли стандартное антитело, меченое А488 или А647, в концентрации ЕС=10. Концентрацию ЕС=10 для отдельного антитела определяли как 10% сигнал, принимая максимальный сигнал за 100% и фоновый сигнал за 0%. После 30 минут инкубации при температуре 4°С клетки промывали и исследовали методом проточной цитометрии. В указанных количественных исследованиях конкурирующее антитело представляет собой антитело, сигнал которого сравним с сигналом другого конкурента, антитела 5Н23. Неконкурирующее антитело представляет собой то, сигнал которого равен сигналу только меченого антитела. Частично конкурирующее антитело представляет собой то, сигнал которого имеет промежуточное значение между сигналами только меченого антитела и фона. Антитела, которые полностью конкурируют с аналогичным стандартным антителом, рассматривают как принадлежащие к одной и той же группе.

[000362] В типичных экспериментах 110 исследованию конкурентного связывания с помощью проточной цитометрии антитело 5Н23 или 3113 использовали в качестве стандартного антитела для положительного контроля (конкурирующее антитело) или отрицательного контроля (неконкурирующее антитело), соответственно. Показательные результаты приведены в таблице 12 ниже, и представлены в виде средней интенсивности флуоресценции (MFI). При интерпретации результатов указанных экспериментов полагали, что сигнал, сравнимый с таковым меченого антитела 110 отдельности, соответствует неконкурирующему антителу, в то время как сигнал, сравнимый с сигналом при конкуренции в присутствии антитела 5Н23, соответствует конкурирующему антителу.

[000363] Чтобы дополнительно оценить сайты связывания антител на бета-клото человека, эксперименты 110 исследованию конкуренции также проводили с помощью системы Biacore. Например, два антитела иммобилизовали на двух проточных ячейках чипа СМ5. Получали комплексы антитела к бета-клото человека с различными антителами (концентрацию антитела титровали в диапазоне 0,1-50 нМ при постоянной концентрации бета-клото 5 нМ) в 96-луночном микропланшете и впрыскивали на поверхности антител. Интенсивность измеренного сигнала (единицы ответа, RU) наносили на график в зависимости от концентрации раствора антитела [нМ]. Если антитело в растворе распознавало тот же эпитоп, что и антитело, иммобилизованное на поверхности чипа, то при увеличении концентрации антитела в растворе наблюдали уменьшение RU (что указывает на конкуренцию за сайт связывания на бета-клото). Тем не менее, если антитело в растворе распознавало другой эпитоп, 110 отношению к иммобилизованному антителу, то наблюдали увеличение RU. В последнем варианте комплекс антитело-клото может связываться с поверхностью иммобилизованного антитела, что ведет к наблюдаемому увеличению сигнала.

[000364] В типичных экспериментах 110 исследованию конкурентного связывания с помощью системы Biacore антитело 5Н23 конкурировало с самим собой за связывание с HuKLB, и дополнительные антитела 1С17, 1D19, 2L12, 3L3, 3N20, 4Р5, 5С23, 5F7 и 1G19 конкурировали с 5Н23. Указанные антитела были отнесены к членам эпитопной группы антитела 5Н23. Последовательности указанных антител, сходных на основании связываемого эпитопа, выровнены и приведены на фигурах 1 и 2. На фигуре 2 также показаны консервативные аминокислотные последовательности для CDR указанных сходных антител.

ПРИМЕР 4: ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

[000365] Антитела к бета-клото, полученные, например, как описано в примере 1, испытывали для определения функциональной активности в клеточных количественных исследованиях 110 гену-репортеру.

[000366] Например, количественное исследование ELK 1-ген-репортер люциферазы, которое позволяет измерить передачу сигналов с участием FGFRIc/бета-клото, выполняли с использованием трансфецированных клеток линий НЕК293, НЕК293Т или L6 (АТСС). Плазмиды для трансфекции включали две репортерные плазмиды Gal4-Elk1 и 5×UAS-Luc (Agilent Technologies PathDetect Elk1 trans-reporting system, каталожный номер 219005) и плазмиды, кодирующие бета-клото человека (GeneCopoeia, каталожный номер ЕХ-Е1104-MO2) или бета-клото яванских макак (бета-клото яванских макак) и FGFR 1 с человека (GeneCopoeia, каталожный номер ЕХ-А0260-МО2). В указанных количественных исследованиях активация рекомбинантно экспрессированного комплекса рецептор FGFR1c/бета-клото в клетках индуцирует внутриклеточную передачу сигналов, что приводит к фосфорилированию ERK и затем Elk1. После фосфорилирования Gal4-Elk1 связывается с промоторной областью 5×UAS и индуцирует транскрипцию гена-репортера люциферазы. Активность люциферазы затем измеряют с помощью ферментативного количественного исследования люциферазы.

[000367] Для проведения указанных экспериментов четыре плазмиды, перечисленные выше (например, 2 репортерные плазмиды, бета-клото, R1c), трансфецировали в свежесобранные клетки в форме суспензии с использованием реагента для трансфекции FuGene6 или Fugene HD (Promega). Плотность клеток и количество реагента для трансфекции оптимизировали для каждого типа клеток и каждой партии Fugene. Соотношение ДНК бета-клото и FGFR1c при трансфекции оптимизировали для каждой клеточной линии и варьировали от 6:1 до 27:1. Трансфецированные клетки высевали в 96-луночный (30000 клеток/100 мкл/лунку) или 384-луночный планшет (7500 клеток/25 мкл/лунку) в нормальной ростовой среде. После инкубации в течение ночи при 37°С добавляли различные антитела к бета-клото. После 6 часов инкубации при 37°С с антителами добавляли равный объем реагента Bright-Glo (Promega), и сигнал люминесценции считывали с использованием считывающего устройства Enspire (Perkin Elmer).

[000368] Показательные результаты, полученные с использованием бета-клото человека и бета-клото яванских макак, трансфецированных в клетки линии НЕК293, представлены в виде значений ЭК₅₀, приведенных в таблице 13 и таблице 14, соответственно, ниже.

[000369] Показательные результаты, полученные в клетках линии L6, трансфецированных с использованием бета-клото человека, представлены в виде значений ЭК₅₀, приведенных в таблице 15 ниже.

[000370] Клетки L6 лишены эндогенных рецепторов и часто используются для изучения специфичности антител в отношении различных трансфецированных подтипов рецепторов FGF. Активация рецептора посредством передачи сигналов с участием FGFR1 с/бета-клото в отсутствие лиганда (например, FGF19 (например, SEQ ID NO: 304) или FGF21 (например, SEQ ID NO: 429)) под действием типичных антител к бета-клото согласно настоящему изобретению наблюдали в клетках L6, трансфецированных FGFR1c (R1c), но не в клетках L6, трансфецированных FGFR2c (R2c), FGFR3c (R3c) или FGFR4 (R4), тогда как в клетках L6, трансфецированных R1c, R2c, R3c и R4, наблюдали активацию под действием контрольного FGF19.

ПРИМЕР 5: ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

[000371] Антитела к бета-клото, полученные, например, как описано в примере 1, испытывали для определения их функциональной активности в клеточном количественном исследовании, таком как количественное исследование с использованием адипоцитов, которое позволяет измерить эндогенную передачу сигналов с участием FGFR1c/бета-клото. FGF19 или FGF21 стимулируют фосфорилирование ERK, увеличение поглощения глюкозы и липолиз в культивируемых адипоцитах. Адипоциты считаются физиологически целесообразной моделью для демонстрации функциональной активности лигандов рецепторов или антител-агонистов, которые имитируют функции лигандов (например, передачу сигналов с участием рецептора под действием лигандов).

[000372] Например, замороженные преадипоциты человека (Lonza, каталожный номер РТ-5005) оттаивали на 1-й день, дифференцировали на 3-й день и поддерживали в среде для дифференциации в течение приблизительно двух недель до начала эксперимента (например, затем истощали на 17-й день, и количественно исследовали на 18-й день). Среда для посева содержала DMEM/F12K, в соотношении 1:1, с добавлением 10% ФБС.Плотность высеваемых клеток составляла 25000 клеток/100 мкл/лунку в 96-луночном планшете. На 3-й день среду заменял средой для дифференциации адипоцитов человека (Cell Applications Inc.). Затем каждые 2-3 дня на клетки наносили свежую среду для дифференциации. На 17-й день (за день до проведения количественного исследования) клетки промывали два раза и оставляли в DMEM/0,1% БСА (Sigma, каталожный номер A3803, БСА, 110 существу не содержащий жирных кислот) в течение ночи. На следующий день вносили свежую среду DMEM/0,1% БСА за 1 ч до обработки клеток испытываемыми антителами к бета-клото в течение 15 минут при 37°С. Набор Cis-bio Cellul'erk (каталожный номер 64ERKPEH) использовали для количественного исследования уровня фосфорилирования ERK в соответствии с протоколом производителя.

[000373] Показательные результаты, полученные с использованием адипоцитов человека, представлены в виде значений ЭК₅₀, приведенных в таблице 16 ниже.

ПРИМЕР 6: ИССЛЕДОВАНИЕ КОНКУРЕНТНОГО СВЯЗЫВАНИЯ ЛИГАНДОВ

[000374] Количественные исследования конкурентного связывания лигандов (FGF19 или FGF21) проводили для оценки влияния взаимодействия антитело-бета-клото человека на связывание бета-клото с его природным лигандом, FGF19 или FGF21.

[000375] Например, проводили количественные исследования конкурентного связывания с помощью системы Biacore, в которых FGF19 (например, SEQ ID NO: 304) или FGF21 (например, SEQ ID NO: 429) иммобилизовали на проточной ячейке (Fc2) чипа СМ5 (с использованием Fcl в качестве эталонной поверхности). Комплексы антитела к бета-клото/бета-клото получали, используя типичные антитела согласно настоящему изобретению, такие как 5Н23 (например, VH SEQ ID NO: 25 и VL SEQ ID NO: 26) или гуманизированное антитело 5Н23 (например, VH SEQ ID NO: 271 и VL SEQ ID NO: 276)). Например, концентрации 5Н23 и контрольного антитела титровали в диапазоне 0,1-67 нМ, при постоянной концентрации бета-клото 5 нМ, в 96-луночном микропланшете и впрыскивали на поверхность FGF19. В другом примере концентрации гуманизированного антитела 5Н23 (например, VH SEQ ID NO: 271 и VL SEQ ID NO: 276) титровали в диапазоне 0,001-67 нМ, при постоянной концентрации бета-клото 2,5 нМ, в 96-луночном микропланшете и впрыскивали на поверхность FGF21. Измеренный сигнал (единиц ответа, RU) наносили на график в зависимости от концентрации раствора антитела [нМ]. Если антитело в растворе распознавало тот же эпитоп, что и лиганд FGF19 или лиганд FGF21, иммобилизованный на поверхности чипа, то при увеличении концентрации антител в растворе наблюдали уменьшение RU, что указывает на конкуренцию с лигандом FGF19 или лигандом FGF21 за сайт связывания на бета-клото. Однако если антитело в растворе распознавало другой эпитоп, нежели иммобилизованный лиганд FGF19 или лиганд FGF21, то наблюдали увеличение RU. В последнем варианте комплекс антитело-клото может связываться с поверхностью иммобилизованного лиганда FGF19 или поверхностью иммобилизованного лиганда FGF21, что ведет к наблюдаемому увеличению сигнала. На основании типичных данных, приведенных ниже в таблице 17А, следует, что контрольное антитело частично конкурировало с лигандом FGF19, что привело к значительному уменьшению величины RU, при этом антитело 5Н23 не конкурировало с лигандом FGF19 за связывание с бета-клото. На основании типичных данных, приведенных ниже в таблице 17 В, следует, что контрольное антитело конкурировало с лигандом FGF21, что привело к значительному снижению величины RU, при этом гуманизированное антитело 5Н23 не конкурировало с лигандом FGF21 за связывание с бета-клото.

[000376] Поскольку 5Н23 и гуманизированное антитело 5Н23 связываются с разными эпитопами бета-клото, 110 сравнению с эндогенными лигандами, такими как FGF19 и FGF21, проводили эксперименты, чтобы установить, существует ли синергетическое действие FGF21 и 5Н23 или гуманизированного антитела 5Н23. В количественном исследовании 110 гену-репортеру с использованием линии клеток НЕК293 (см., например, пример 4) комбинации FGF21 и гуманизированного антитела 5Н23 (например, VH SEQ ID NO: 271 и VL SEQ ID NO: 276) испытывали в молярном соотношении 1:1, или фиксировали концентрацию одного компонента и титровали концентрацию другого. Не наблюдали признаков синергетического действия; максимальное влияние FGF21 не усиливалось в присутствии гуманизированного 5Н23 антитела, и наоборот.

Пример 7: ГУМАНИЗАЦИЯ

[000377] Получали гуманизированные антитела к бета-клото, включая антитела, отобранные, как описано в примерах 1-6.

[000378] Отбирали ряд антител к бета-клото для секвенирования, и области VH и VL указанных антител, включая их CDR, приведены в таблицах 1-10 и на фигурах 1 и 2. Типичное антитело к бета-клото, 5Н23, отобрали для гуманизации. Использовали несколько методов гуманизации. Для некоторых из гуманизированных антител метод гуманизации был эмпирическим и частично основывался на структурной информации, относящейся к вариабельным областям, включая молекулярные модели и требования к структурной устойчивости антител (см, например, Ewert et al., 2004, Methods 34:184-199; Honegger, 2008, Handb. Exp. Pharmacol. 181:47-68; et al., 2009, Protein Eng. Des. Sel. 22: 135-147). Указанный метод также частично основывался на результатах рассмотрения остатков, вступающих в контакт с антигеном, и/или остатков, участвующих в поддержании стабильности каркаса. Например, рассмотрение типичных остатков, вступающих в контакт с антигеном, зависит от размера антигена, в частности остатков за пределами CDR, которые могут вступать в контакт с антигеном, отделов верхней коровой области, центральной коровой области и нижней коровой области, остатков поверхности контакта VH:VL, консервативных остатков Pro/Gly (положительные углы φ) и совпадения остатков, коррелирующих с подтипом VH (см., например, Ewert et al., выше; Honegger, выше; et al., выше).

[000379] Например, был проведен поиск последовательностей VH человека, гомологичных последовательностям каркаса VH 5Н23, и в качестве акцептора для гуманизации была выбрана последовательность VH, кодируемая IGHV1-3*01 зародышевой линии человека (см., например, Ehrenmann et al., 2011, Cold Spring Harbor Protoc. G:737-749). Для некоторых из гуманизированных антител последовательности CDR из VH 5Н23 сначала переносили в соответствующие положения IGHV 1-3*01. Затем несколько остатков аминокислот VH 5Н23 заменяли соответствующими остатками человека 110 отдельности или в комбинациях.

[000380] Помимо этого, например, проводили поиск последовательностей VL человека, гомологичных последовательностям каркаса VL 5Н23, и в качестве акцептора для гуманизации была выбрана область Vκ человека, кодируемая IGKV4-1*01 (см., например, Ehrennmann et al., выше). Для некоторых из гуманизированных антител последовательности CDR из VL 5Н23 сначала переносили в соответствующие положения IGKV4-1*01. Затем несколько остатков аминокислот VL 5Н23 заменяли соответствующими остатками человека 110 отдельности или в комбинациях.

[000381] Для некоторых из гуманизированных антител метод гуманизации был основан на использовании алгоритма построения трехмерной карты вариабельных областей мыши. Этот метод также позволил выявить аминокислоты каркасных участков и остатки, которые важны для формирования структуры CDR или необходимы для связывания с бета-клото. Помимо этого в качестве возможных последовательностей каркаса для гуманизации были выбраны аминокислотные последовательности VH и VL человека с высокой степенью гомологии последовательностям мыши. Как было описано выше, последовательности CDR антитела 5Н23 могут быть перенесены в указанные дополнительные последовательности каркаса человека. Различные последовательности каркаса человека, включая последовательности зародышевой линии (например, IGHV1-3, IGHV1-46, IGHV1-69, IGKV4-1, IGKV1-39 или IGKV3-20) и зрелые индивидуальные последовательности, могут быть пригодны для метода гуманизации. Далее, некоторые аминокислотные остатки VH 5Н23 и/или VL 5Н23 могут быть замещены соответствующими остатками человека 110 отдельности или в комбинации.

[000382] Для некоторых из гуманизированных легких цепей был проведен поиск с помощью IG BLAST для выявления последовательностей зародышевой линии человека, которые были гомологичны последовательности VL 5Н23, и/или тех, которые представляли собой часто используемые последовательности, включая, например, IGKV1-39 и IGKV3-20. Для некоторых из гуманизированных легких цепей последовательности CDR из VL 5Н23 сначала переносили в соответствующие положения IGKV1-39 или IGKV3-20, и затем некоторые аминокислоты отбирали эмпирическим путем для замещения.

[000383] Аминокислотные последовательности, полученных гуманизированных последовательностей VH (vH1-vH9) и VL (от vL1 до vL5, от v1-39a до v1-39p и от v3-20a до v3-20j), представлены с последовательностями VH и VL 5Н23 на фигурах 3A-3D. Например, используя различные методы гуманизации, описанные в настоящем примере, несколько остатков аминокислот VH и VL 5Н23 замещали соответствующими остатками человека, чтобы получить гуманизированные последовательности, приведенные на фигуре 3A-3D.

[000384] Гуманизированные антитела к бета-клото могут быть получены с использованием любой из последовательностей CDR, приведенных в таблице 18, в комбинации с любой из последовательностей каркаса, приведенных в таблице 19.

[000385] Например, гуманизированное антитело к бета-клото может содержать вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую: FR1 (например, SEQ ID NO: 278, 279, 280 или 378); CDR1 (например, SEQ ID NO: 1, 27, 53, 79, 105, 131, 157, 183, 209, 235); FR2 (например, SEQ ID NO: 281, 282 или 283); CDR2 (например, SEQ ID NO: 2, 28, 54, 80, 106, 132, 158, 184, 210 или 236); FR3 (например, SEQ ID NO: 284, 285, 286, 287, 379, 380 или 381); CDR3, (например, SEQ ID NO: 3, 29, 55, 81, 107, 133, 159, 185, 211 или 237); и/или FR4 (например, SEQ ID NO: 288); и/или вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую: FR1 (например, SEQ ID NO: 289, 290, 382, 383 или 384); CDR1 (например, SEQ ID NO: 4, 30, 56, 82,108, 134,160, 186, 212 или 238); FR2 (например, SEQ ID NO: 291, 292 или 385-392); CDR2 (например, SEQ ID NO: 5, 31, 57, 83, 109, 135, 161, 187, 213 или 239); FR3 (например, SEQ ID NO: 293, 294, 295 или 393-404); CDR3, (например, SEQ ID NO: 6, 32, 58, 84, 110, 136, 162, 188, 214, 240); и/или FR4 (например, SEQ ID NO: 296, 405, 406 или 407).

[000386] Как описано в данном примере, гуманизированные антитела к бета-клото были эмпирически разработаны и экспрессированы в виде белков, связывающих бета-клото, включая создание девяти гуманизированных вариантов области VH антитела 5Н23 и тридцати одного гуманизированного варианта области VL антитела 5Н23. Последовательности указанных типичных гуманизированных областей VH и VL5H23 приведены на фигуре 3A-3D.

[000387] Получали гуманизированные антитела, содержащие гуманизированные области VH и гуманизированные области VL, последовательности которых приведены на фигуре 3A-3D. Например, восемнадцать (6×3) комбинаций vH 1-6 и vL1-3 конструировали с использованием константной области (SEQ ID NO: 316) IgG1 (аланин-аланин) и константной области каппа-цепи (SEQ ID NO: 318): vH1-VL1, vH1-vL2, vH1-vL3, vH2-vL1, vH2-vL2, vH2-vL3, vH3-vL1, vH3-vL2, vH3-vL3, vH4-vLl, vH4-vL2, vH4-vL3, vH5-vL1, vH5-vL2, vH5-vL3, vH6-vL1, vH6-vL2, vH6-vL3, последовательности которых приведены на фигуре 3A-3D. Помимо этого были сконструированы гуманизированные антитела, содержащие типичную гуманизированную область VH (например, vH3) и двадцать шесть гуманизированных областей VL (от v1-39a до v1-39p и от v3-20a до v3-20j), последовательности которых приведены на фигуре 3A-3D.

[000388] Гуманизированные антитела испытывали для определения их активности в различных количественных исследованиях, включая, например, те, которые описаны в примерах 2-6. Уровень экспрессии гуманизированных антител с легкими цепями, содержащими vL3 или v1-39с, был низким, и указанные антитела не использовали в дальнейших испытаниях. Показательные результаты, полученные с использованием различных гуманизированных антител к бета-клото, приведены в таблице 20А и 20В ниже.

Препарат 1 = препарат гуманизированного антитела 5Н23 (например, VH SEQ ID NO: 271 и VL SEQ ID NO: 276), экспрессированный одновременно с вариантами LC; препарат 2 = очищенный препарат гуманизированного антитела 5Н23 (например, VH SEQ ID NO: 271 и VL SEQ ID NO: 276). Контрольное антитело = VH SEQ ID NO: 358 и VL SEQ ID NO: 360.

[000389] В дополнительных количественных исследованиях, например, количественных исследованиях 110 гену-репортеру с использованием клеток НЕК293Т, описанных в примере 4, в которых клетки трансфецировали плазмидами, кодирующими бета-клото мыши (например, SEQ ID NO: 301), бета-клото крысы (например, SEQ ID NO: 356), бета-клото хомяка (например, SEQ ID NO: 408), бета-клото кролика (например, SEQ ID NO: 410) или бета-клото собаки (например, SEQ ID NO: 412), а также трансфецировали плазмидами, кодирующими химерный рецептор FGFR1-βIIIc мыши (например, SEQ ID NO: 416), химерный рецептор FGFR1-βIIIc крысы (например, SEQ ID NO: 419), химерный рецептор FGFR1-βIIIc хомяка (например, SEQ ID NO: 417), химерный рецептор FGFR1-βIIIc кролика (например, SEQ ID NO: 420) или рецептор FGFR1-βIIIc собаки (например, SEQ ID NO: 418), соответственно, при обработке антителом к бета-клото, таким как гуманизированное антитело 5Н23 (например, VH SEQ ID NO: 271 и VL SEQ ID NO: 276), не происходила активация химерного комплекса рецептор FGFR1c/бета-клото мыши, крысы, хомяка, кролика или собаки, соответственно. Антитела к бета-клото, описанные в настоящей заявке, включая 5Н23 и гуманизированные антитела 5Н23, а также антитела, которые конкурируют с 5Н23 (например, 1С17, 1D19, 2L12, 3L3, 3N20, 4Р5, 5С23, 5F7 и 1G19, описанные в примере 3), содержащие последовательности CDR, приведенные в таблицах 1-10, активируют комплекс рецептор FGF/бета-клото человека и яванских макак, но не комплексы рецептор FGF/бета-клото мыши, крысы, хомяка, кролика, или собаки, согласно результатам количественных исследований 110 гену-репортеру, описанных выше. При испытании одновалентного фрагмента Fab антитела к бета-клото, полученного с помощью расщепления антитела к бета-клото папаином, такого как гуманизированное антитело 5Н23 (например, VH SEQ ID NO: 271 и VL SEQ ID NO: 276) в количественном исследовании 110 гену-репортеру с использованием клеток линии НЕК293 для определения его способности активировать комплекс рецептор FGFR1c/KLB человека, фрагмент Fab не обладал активностью антитела в концентрации до 67 нМ, в то время как гуманизированное антитело 5Н23 было активно при низких концентрациях в наномолярном диапазоне, который был аналогичен тому, который указан в таблице 20В.

ПРИМЕР 8: ИССЛЕДОВАНИЯ НА ЖИВОТНЫХ

[000390] Влияние антител к бета-клото оценивали в исследованиях на животных, включая яванских макак. В исследованиях на тучных яванских макаках животным вводили типичное антитело к бета-клото, которое связывается с бета-клото человека и бета-клото яванских макак (например, антитело 5Н23 или его гуманизированный вариант), а также антитело, содержащее одну или более CDR из 5Н23, приведенных в таблице 1, или, в другом варианте, антитело, содержащее одну или более CDR из антитела или его гуманизированного варианта, приведенных в таблицах 2-10, которые конкурируют с 5Н23 за связывание с бета-клото человека, как описано в примере 3. Измеряли влияние указанного антитела на различные метаболические параметры. Типичные параметры включают потребление пищи, массу тела, индекс массы тела (ИМТ), окружность живота (АС), толщину кожных складок (SFT), пероральный тест на толерантность к глюкозе (ПТТГ), уровень глюкозы, уровень инсулина и/или уровень триглицеридов в крови натощак и/или после приема пищи (например, после приема пищи) (например, в сыворотке крови).

[000391] В конкретном исследовании двадцать яванских макак со спонтанным ожирением и индексом массы тела равным или выше 40 отбирают и рандомизируют в группы для получения носителя (n=10) и антитела (n=10). Животные получают подкожную инъекцию носителя или антитела к бета-клото на 1-й и 14-й день. Регистрируют энергетическую ценность для каждого приема пищи, и массу тела измеряют один раз в неделю. Образцы крови отбирают один раз в неделю в течение 7 недель для измерения глюкозы, инсулина, липидов и параметров, представляющих интерес, в плазме крови (в другом варианте, сыворотке крови). На 14, 28 и 49 дни проводят пероральный тест на толерантность к глюкозе.

[000392] Типичные эффекты лечения могут включать снижение потребления пищи, снижение массы тела, снижение ИМТ, АС и/или SFT, улучшение толерантности к глюкозе, снижение уровня инсулина, снижение уровня глюкозы, уровня инсулина и/или уменьшение уровней триглицеридов натощак и/или после приема пищи (например, после приема пищи) в плазме крови (в другом варианте в сыворотке крови). Указанные эффекты указывают на улучшение метаболических параметров при лечении с применением антител к бета-клото.

[000393] Например, двадцать самцов макак отбирали для лечения с использованием гуманизированного антитела 5Н23 (например, VH SEQ ID NO: 271 и VL SEQ ID NO: 276) или контрольным носителем на основании их ИМТ (>40) и приручали к иммобилизации в кресле, подкожным инъекциям, забору крови и питанию через желудочный зонд. Был установлен стандартный график кормления.

[000394] Начальные значения различных параметров, представляющих интерес, измеряли до начала лечения. Например, на -7-й день у яванских макак измеряли начальную массу тела, индекс массы тела, окружность живота и толщину кожных складок, и минеральную плотность костной ткани измеряли с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии («DEXA») под анестезией кетамином. Образцы крови отбирали на -3-й день после голодания в течение ночи. Измеряли и исследовали начальные уровни глюкозы, инсулина, общего холестерина, ЛПНП, ЛПВП, триглицеридов в сыворотке крови, а также панель гематологических и биохимических параметров крови. Сразу же после отбора образцов в начальных условиях животных подвергали пероральному тесту на толерантность к глюкозе (ГТТ) путем введения через желудочный зонд 4 г/кг глюкозы, и отбирали образцы через 5, 15, 30, 60, 120 и 180 минут после нагрузки глюкозой, также измеряли уровни глюкозы и инсулина в сыворотке крови. На основании начальных данных животных распределяли на две группы 110 10 животных в каждой группе (например, одна группа для получения антитела, и другую группу использовали в качестве контрольной группы), чтобы достичь аналогичных начальных уровней различных параметров, например, массы тела, индекса массы тела и уровня глюкозы, инсулина и триглицеридов в сыворотке крови.

[000395] Начиная со 0-го дня, одна группа животных (п=10) получала путем подкожной инъекции дозу 10 мг/кг антитела к бета-клото, такого как гуманизированное антитело 5Н23 (например, VH SEQ ID NO: 271 и VL SEQ ID NO: 276), два раза в неделю (например, на 0, 14, 28 и 42-й день) в виде 4 доз. Группа, получавшая контрольный носитель, получала соответствующие носители в те же дни. Лечение проводили утром за 30 минут до утреннего приема пищи, и объем доз составил от 0,1 до 0,2 мл/кг.

[000396] Параметры, представляющие интерес, например, потребление пищи, масса тела, результаты биохимических исследований крови и ПТТГ, контролировали на протяжении всего исследования. Например, потребление пищи регистрировали ежедневно. Массу тела, индекс массы тела, окружность живота и толщину кожных складок измеряли еженедельно, например, на 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91 и 98-й день. Образцы крови собирали еженедельно, например, на 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63 и 70-й день после голодания в течение ночи, чтобы измерить уровни глюкозы, инсулина и липидов, таких как триглицериды. Дополнительный образец крови брали на 98-й день после голодания в течение ночи. ПТТГ проводили после начала исследования, например, на 14, 28 и 56-й день, когда животные получали через желудочный зонд 4 г/кг глюкозы, образцы отбирали через 5, 15, 30, 60, 120 и 180 минут после нагрузки глюкозой, и измеряли уровни глюкозы и инсулина в сыворотке крови. Сканирование с помощью DEXA проводили на 30-й и 72-й дни. Помимо этого на 28-й и 70-й дни исследовали параметры общего и биохимического анализа крови. Двух животных из группы, получавшей носитель, и двух животных из группы, получавшей антитело к бета-клото, подвергли эвтаназии, и аутопсию проводили на 50-й день для оценки безопасности. Во время исследования состояние здоровья всех животных тщательно контролировали.

[000397] Типичные результаты настоящего исследования представлены в таблицах 21-25 ниже. Как показано в таблице 21, масса тела животных, получавших носитель, оставалась постоянной (с небольшим увеличением в ходе исследования); в то время как масса тела животных, получавших антитело к бета-клото, постепенно уменьшалась, и масса тела не вернулась к начальному уровню в течение 8-14 недель (например, во время фазы восстановления). Аналогичным образом, как показано в таблице 22, животные, получавшие носитель, имели относительно стабильный индекс массы тела на всем протяжении исследования, в то время как животные, получавшие антитело к бета-клото, имели снижение уровня ИМТ на всем протяжении исследования. Уровень ИМТ также не вернулся к начальным значениям (например, во время фазы восстановления). Полученные результаты свидетельствуют о том, что лечение с применением антитела к бета-клото привело к уменьшению жировой массы.

[000398] Как показано в таблице 23, уровни инсулина в сыворотке крови у животных, получавших носитель, увеличились во время исследования; в то время как уровни инсулина в сыворотке крови у животных, получавших антитело к бета-клото, значительно уменьшились. Уровни глюкозы в сыворотке крови также снизились у животных, получавших антитело к бета-клото, как показано в таблице 24. Аналогичным образом, в таблице 25 показано, что уровни триглицеридов у животных, получавших носитель, увеличились во время исследования; в то время как уровни триглицеридов у животных, получавших антитела к бета-клото, были значительно снижены.

[000399] Результаты ПТТГ свидетельствуют о том, что до начала лечения начальные уровни инсулина существенно не различались между группами, получавшими носитель, и группами, получавшими антитело к бета-клото. Напротив, после начала лечения наблюдали тенденцию к снижению уровней глюкозы и инсулина у животных, получавших антитело к бета-клото, 110 сравнению с животными, получавшими носитель.

[000400] В другом типичном исследовании сорок самцов яванских макак со спонтанным ожирением были отобраны, приучены и получали корм, как описано выше.

[000401] Начальные значения различных параметров измеряли до начала лечения, как описано выше. Например, начальную массу тела, индекс массы тела, окружность живота и толщину кожных складок измеряли на -4-й день, и образцы крови для измерения глюкозы, инсулина, общего холестерина, ЛПНП, ЛПВП и триглицеридов в сыворотке крови в начальных условиях отбирали на -3-й день после ночного голодания. На основании полученных начальных данных животных распределили на 5 групп (по 8 животных в каждой группе), при этом 4 группы получали различные дозы антитела к бета-клото, такого как гуманизированное антитело 5Н23 (например, VH SEQ ID NO: 271 и VL SEQ ID NO: 276), и одна группа, получала контрольный носитель.

[000402] На 0-й день первая группа животных (n=8) получила путем подкожной инъекции однократную дозу 0,1 мг/кг антитела к бета-клото; вторая группа животных (n=8) получила путем подкожной инъекции однократную дозу 1 мг/кг антитела к бета-клото, и третья группа животных (n=8) получила путем подкожной инъекции однократную дозу 10 мг/кг антитела к бета-клото. Начиная с 0-го дня четвертая группа животных (n=8) получала путем подкожной инъекции дозу 0,1 мг/кг антитела к бета-клото один раз каждые 4 недели в течение 12 недель. В качестве контроля пятая группа животных (n=8) получала дозу носителя один раз каждые 4 недели в течение 12 недель. Лечение проводили утром за 30 минут до утреннего приема пищи, объем доз составил 0,2 мл/кг.

[000403] Параметры, представляющие интерес, контролировали на протяжении всего исследования. Например, энергетическую ценность пищи измеряли для каждого приема пищи. Массу тела, ИМТ, окружность живота и толщину кожных складок измеряли еженедельно. Образцы крови отбирали, например, через 3, 6, 12 и 24 часа и на 3, 4, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84 и 112 день после введения доз(ы), также измеряли параметры, представляющие интерес, например, уровни глюкозы, инсулина, общего холестерина, ЛПНП, ЛПВП и триглицеридов в сыворотке крови. Во время исследования состояние здоровья всех животных тщательно контролировали, как описано выше.

[000404] Типичные результаты данного исследования зависимости ответа от дозы, приведены в таблицах 26-29. В таблице 26 приведены относительные изменения массы тела у животных, получавших антитело к бета-клото, 110 сравнению с изменениями массы тела у животных, получавших носитель. Как показано, однократная доза 0,1 мг/кг, 1 мг/кг или 10 мг/кг антитела к бета-клото при введении путем подкожной инъекции или четыре дозы 1 мг/кг антитела к бета-клото при введении путем подкожной инъекции значительно снижали массу тела. Помимо этого снижение массы тела сохранялось на 112-й день для животных, получивших однократную дозу 10 мг/кг антитела к бета-клото, или для животных, которые получали четыре дозы 1 мг/кг антитела к бета-клото, 110 сравнению с носителем.

[000405] Как показано в таблице 27, однократная доза 0,1 мг/кг, 1 мг/кг или 10 мг/кг антитела к бета-клото при введении путем подкожной инъекции или четыре дозы 1 мг/кг антитела к бета-клото при введении путем подкожной инъекции снижали уровень инсулина в сыворотке крови 110 сравнению с контрольной группой. Помимо этого четыре дозы 1 мг/кг антитела к бета-клото при введении путем подкожной инъекции значительно снижали уровень глюкозы в сыворотке крови, как показано в таблице 28. Более того, уровни триглицеридов в сыворотке крови у животных, получивших однократную дозу 1 мг/кг или 10 мг/кг антитела к бета-клото путем подкожной инъекции или четыре дозы 1 мг/кг антитела к бета-клото путем подкожной инъекции, были снижены 110 сравнению с животными, получавшими носитель, как показано в таблице 29.

[000406] Результаты описанных исследований на животных свидетельствуют об улучшении метаболических параметров при лечении с применением антитела к бета-клото согласно настоящему изобретению, например, таких как уменьшение массы тела, индекса массы тела, окружности живота, толщины кожных складок, уровня глюкозы (например, глюкозы в сыворотке крови), инсулина (например, инсулина в сыворотке крови) и/или триглицеридов (например, триглицеридов в сыворотке крови).

ПРИМЕР 9: КАРТИРОВАНИЕ ЭПИТОПОВ И ДОМЕНОВ

[000407] Исследования проводили для того чтобы локализовать сайт связывания на KLB человека для антител к бета-клото в эпитопной группе 5Н23, включая 5Н23, как описано в примере 3, содержащих последовательности, приведенные в таблицах 1-10 и на фигурах 1-3, и антител к бета-клото человека в эпитопной группе 5Н23, таких как гуманизированные антитела 5Н23 (например, VH SEQ ID NO: 271 и VL SEQ ID NO: 276). Например, количественные исследования связывания с помощью проточной цитометрии для картирования доменов выполняли на клетках линии Expi293 (Life Technologies, А14635), которые были трансфецированы плазмидами, кодирующими варианты KLB: человека, мыши, яванских макак, химерный вариант, в котором последовательность домена KL1 KLB мыши (M1-F506) заменяет домен KL1 KLB человека (M1-F508) для получения KLB мыши-человека (SEQ ID NO: 376), и второй химерный вариант, в котором последовательность KL1 человека (M1-F508) заменяет домен KL1 KLB мыши (M1-F506) для получения KLB человека-мыши (SEQ ID NO: 374). Помимо этого вектор экспрессии pYD7, который не содержал последовательность KLB, трансфецировали в качестве отрицательного контроля.

[000408] В некоторых исследованиях связывание очищенного образца гуманизированного антитела 5Н23 (например, VH SEQ ID NO: 271 и VL SEQ ID NO: 276) с вариантами KLB определяли с помощью проточной цитометрии. Через два дня после трансфекции клетки совместно инкубировали с очищенными антителами: гуманизированным антителом 5Н23 (например, VH SEQ ID NO: 271 и VL SEQ ID NO: 276), контрольным антителом (например, VH SEQ ID NO: 358 и VL SEQ ID NO: 360) и антителом для отрицательного контроля (например, антителом к гемоцианину (KLH) фиссурелловых, которое экспрессировали из конструкции, содержащей SEQ ID NO: 424 и 425), разбавленными до концентрации 1 мкг/мл в ФСБ/1% БСА/0,1% азида в течение 30 минут при температуре 4°С. После промывания с использованием ФСБ/1% БСА/0,1% азида трансфецированные клетки совместно инкубировали с меченым антителом к Fc человека (Jackson ImmunoResearch) в течение 30 минут при температуре 4°С. После промывания с использованием ФСБ/1% БСА/0,1% азида клетки регистрировали на проточном цитометре Calibur (FACS Calibur), и данные обрабатывали с помощью программного обеспечения для проточной цитометрии (FlowJo). Для графического представления данных строили зависимость количества клеток от интенсивности флуоресценции, и для каждого образца определяли среднее значение интенсивности флуоресценции (MFI), как показано в таблице 30.

[000409] Типичное гуманизированное антитело 5Н23 (например, VH SEQ ID NO: 271 и VL SEQ ID NO: 276) связывалось с KLB человека и KLB яванских макак, о чем свидетельствует большая доля клеток с высокой интенсивностью флуоресценции 110 сравнению с клетками, обработанными антителом к KLH в качестве отрицательного контроля, однако типичное гуманизированное антитело 5Н23 не связывалось с KLB мыши. Типичное гуманизированное антитело 5Н23 также связывалось с химерным белком KLB мыши-человека, но не химерным белком KLB человека-мыши, это свидетельствует о том, что антитела к бета-клото, относящиеся к эпитопной группе 5Н23, включая 5Н23, как описано в примере 3, и содержащие последовательности, представленные в таблицах 1-10 и на фигурах 1-3, и антитела к бета-клото человека, относящиеся к эпитопной группе 5Н23, такие как гуманизированные антитела 5Н23 (например, VH SEQ ID NO: 271 и VL SEQ ID NO: 276), связываются с доменом kl2 KLB человека. Напротив, контрольное антитело связывалось с доменом KL1 KLB человека, о чем свидетельствует его связывание с клетками, трансфецированными химерным белком KLB человека-мыши, но не химерным белком KLB мыши-человека.

[000410] Для того чтобы более точно установить специфичные связывающие остатки внутри домена KL2 бета-клото человека, мутагенез методом «дробовика» использовали для точечной мутации отдельных остатков в домене KL2 бета-клото человека на остаток аланина (например, остатки F508A-L1008A). Полученные мутированные белки бета-клото экспрессировали в клетках НЕК-293Т и исследовали с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (проточной цитометрии) для оценки связывания с антителом к бета-клото в эпитопной группе 5Н23, включая 5Н23, как описано в примере 3, содержащим последовательности, представленные в таблицах 1-10 и на фигурах 1-3, и антителами к бета-клото человека в эпитопной группе 5Н23, такими как гуманизированное антитело 5Н23 (например, VH SEQ ID NO: 271 и VL SEQ ID NO: 276) или одновалентный фрагмент Fab гуманизированного антитела 5Н23. Например, скрининг мутированных белков бета-клото проводили при концентрации 0,5 мкг/мл для гуманизированного антитела 5Н23, 1,0 мкг/мл для фрагмента Fab и 2,0 мкг/мл для положительного контроля, поликлонального антитела к бета-клото.

[000411] В результате картирования были выявлены три специфичных связывающих остатка, Н657, Y701 и R703, которые не связывались с гуманизированным антителом 5Н23, но связывались с положительным контролем, поликлональным антителом к бета-клото. Выявленные остатки, представляют собой аминокислоты, изменения боковых цепей которых вносят самый высокий вклад в энергию взаимодействия антитело-эпитоп, как показано в таблице 31. Места расположения трех выявленных остатков были смоделированы с помощью отображения (темные сферы) в эквивалентных положениях на цитозольной бета-глюкозидазе человека (PDB ID# 2JFE; Tribolo et al., J. Mol. Biol. 370, 964-975 (2007)), определенных путем выравнивания двух белков с помощью BLAST, как показано на фигуре 6. Структура показывает эквивалент остатков 521-963 бета-клото. Более низкая реакционная способность мутаций Y701A и R703A в отношении гуманизированного антитела 5Н23 указывает на то, что Y701 и R703 вносят основной вклад в энергию взаимодействия при связывании.

[000412] Следовательно, антитела к бета-клото согласно настоящему изобретению, включая 5Н23 и антитела в эпитопной группе 5Н23, распознают эпитоп в домене KLB2, который содержит остатки Н657, Y701 и/или R703. Указанные антитела, описанные и представленные в примере 3, а также содержащие последовательности CDR, перечисленные в таблицах 1-10 и на фигурах 1-3, можно применять в качестве антител-агонистов для индукции передачи сигналов, опосредованной FGF19 и/или FGF21, включая, например, для снижения массы тела, потребления пищи, ИМТ, уровня инсулина, уровня глюкозы и/или уровней триглицеридов.

[000413] Помимо этого общей особенностью антител к бета-клото согласно настоящему изобретению является их способность конкурировать друг с другом за связывание с бета-клото (см., например, пример 3, в котором описаны антитела в эпитопной группе 5Н23). Конкурентное ингибирование указывает на то, что каждое антитело связывается с одной и той же областью бета-клото (например, одним и тем же эпитопом), подтверждая тем самьм аналогичное действие. Как далее описано в настоящей заявке, антитела к бета-клото включают гуманизированные антитела к бета-клото, включая гуманизированные антитела к бета-клото, полученные или основанные на 5Н23, 1С17, 1D19, 2L12, 3L3, 3N20, 4Р5, 5С23, 5F7 и/или 1G19, содержащие последовательности CDR, перечисленные в таблицах 1-10 или фигурах 1-3, такие как антитела к бета-клото, включая гуманизированные антитела к бета-клото, связываются с конкретной областью бета-клото человека (например, областью KL2 (остатки S509-S1044), описанной выше). Также указанное связывание может быть в значительной степени обусловлено конкретными аминокислотными остатками в пределах области KL2 (например, Н657, Y701 и R703, описанными выше), которые содержат эпитоп, распознаваемый антителами к бета-клото, описанными в настоящей заявке. В совокупности полученные результаты свидетельствуют о том, что наблюдаемое действие антитела к бета-клото, которое получено или основано на 5Н23 или антителе в эпитопной группе 5Н23, включая антитела, содержащие одну или более CDR, описанных в таблицах 1-10 или фигурах 1-3, могут быть экстраполированы на другие антитела к бета-клото, описанные в настоящей заявке, имеющие аналогичную или близкую специфичность в отношении эпитопа (например, аналогичные или сходные CDR). Например, активность антител в условиях in vitro, как показано в примерах 4-7 и выше, а также влияние в условиях in vivo, описанное в примере 8 для типичного гуманизированного антитела к бета-клото, являются типичными для видов активности и влияния антител к бета-клото, описанных в настоящей заявке.

[000414] Варианты реализации настоящего изобретения, описанные выше, являются исключительно пояснительными, и специалисты в данной области техники поймут или смогут установить с использованием только рутинных экспериментов многочисленные эквиваленты конкретных способов, описанных в настоящей заявке. Все такие эквиваленты включены в объем настоящего изобретения и включены в формулу изобретения ниже. Кроме того, в данном описании и формуле изобретения формы единственного числа «а», «an» и «the» включают формы множественного числа, если из контекста явно не следует иное. Следовательно, например, ссылка на «антитело» может включать смесь двух или более указанных антител и тому подобное. Помимо этого специалист с обычной квалификацией в данной области техники поймет, что операционные последовательности должны быть приведены в каком-либо определенном порядке с целью описания и составления формулы настоящего изобретения, однако настоящее изобретение предусматривает различные изменения, выходящие за пределы такого конкретного порядка.

[000415] Содержание всех ссылок, описанных в настоящей заявке, полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

[000416] Другие варианты реализации настоящего изобретения включены в объем нижеследующей формулы изобретения.

[000416] Другие варианты реализации настоящего изобретения включены в объем нижеследующей формулы изобретения.

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с бета-клото человека, содержащие:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, содержащий SEQ ID NO:1, CDR2, содержащий SEQ ID NO:2, и CDR3, содержащий SEQ ID NO:3; и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, содержащий SEQ ID NO:4, CDR2, содержащий SEQ ID NO:5, и CDR3, содержащий SEQ ID NO:6.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, характеризующиеся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент также связываются с бета-клото яванского макака.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, характеризующиеся тем, что указанная вариабельная область тяжелой цепи характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:25 и указанная вариабельная область легкой цепи характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:26.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, характеризующиеся тем, что указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:25.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, характеризующиеся тем, что указанная вариабельная область легкой цепи содержит SEQ ID NO:26.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, характеризующиеся тем, что указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:25 и указанная вариабельная область легкой цепи содержит SEQ ID NO:26.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, характеризующиеся тем, что указанная вариабельная область тяжелой цепи характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:271 и указанная вариабельная область легкой цепи характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:276.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, характеризующиеся тем, что указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:271.

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, характеризующиеся тем, что указанная вариабельная область легкой цепи содержит SEQ ID NO:276.

10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, характеризующиеся тем, что указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:271 и указанная вариабельная область легкой цепи содержит SEQ ID NO:276.

11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-10, которые связываются:

(a) в пределах домена KLB2 бета-клото человека;

(b) в пределах остатков аминокислот с 517 по 967 последовательности SEQ ID NO: 297;

(c) с областью, содержащей остатки аминокислот с 657 по 703 последовательности SEQ ID NO: 297, или

(d) с эпитопом, содержащим по меньшей мере один из остатков аминокислот 657, 701 и/или 703 последовательности SEQ ID NO: 297.

12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с бета-клото человека, которые содержат:

(a) (i) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:27, CDR2 последовательности SEQ ID NO:28 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:29, и (ii) вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:30, CDR2 последовательности SEQ ID NO:31 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:32;

(b) (i) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:53, CDR2 последовательности SEQ ID NO:54 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:55, и (ii) вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:56, CDR2 последовательности SEQ ID NO:57 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:58;

(c) (i) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:79, CDR2 последовательности SEQ ID NO:80, CDR3 последовательности SEQ ID NO:81, и (ii) вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:82, CDR2 последовательности SEQ ID NO:83 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:84;

(d) (i) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:105, CDR2 последовательности SEQ ID NO:106 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:107, и (ii) вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:108, CDR2 последовательности SEQ ID NO:109 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:110;

(e) (i) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:131, CDR2 последовательности SEQ ID NO:132 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:133, и (ii) вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:134, CDR2 последовательности SEQ ID NO:135 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:136;

(f) (i) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:157, CDR2 последовательности SEQ ID NO:158 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:159, и (ii) вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:160, CDR2 последовательности SEQ ID NO:161 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:162;

(g) (i) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:183, CDR2 последовательности SEQ ID NO:184 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:185, и (ii) вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:186, CDR2 последовательности SEQ ID NO:187 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:188;

(h) (i) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:209, CDR2 последовательности SEQ ID NO:210 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:211, и (ii) вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:212, CDR2 последовательности SEQ ID NO:213 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:214;

или

(i) (i) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:235, CDR2 последовательности SEQ ID NO:236 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:237, и (ii) вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDR1 последовательности SEQ ID NO:238, CDR2 последовательности SEQ ID NO:239 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:240.

13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 12, которые содержат:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 51, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 52;

(b) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 77, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 78;

(c) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 103, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 104;

(d) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 129, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 130;

(e) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 155, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 156;

(f) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 181, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 182;

(g) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 207, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 208;

(h) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 233, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 234; или

(i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 259, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 260.

14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1, 2 или 12, которое представляет собой гуманизированное антитело.

15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-14, которое представляет собой химерное антитело.

16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-15, которое представляет собой моноклональное антитело.

17. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-16, характеризующееся тем, что указанный фрагмент представляет собой Fab, Fab', F(аb')₂, Fv, scFv, (scFv)₂, одноцепочечное антитело, антитело с двойной вариабельной областью или линейное антитело.

18. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, характеризующееся тем, что указанное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислоты 23-472 последовательности SEQ ID NO:317.

19. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, характеризующееся тем, что указанное антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислоты 23-240 последовательности SEQ ID NO:319.

20. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, характеризующееся тем, что указанное антитело содержит (i) тяжелую цепь, которая на 90% идентична аминокислотам 23-472 последовательности SEQ ID NO:317, и (ii) легкую цепь, которая на 90% идентична аминокислотам 23-240 последовательности SEQ ID NO:319.

21. Антитело, которое связывается с бета-клото человека, которое содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислоты 23-472 последовательности SEQ ID NO:317, и легкую цепь, содержащую аминокислоты 23-240 последовательности SEQ ID NO:319.

22. Выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-21.

23. Вектор экспрессии, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-21, который содержит полинуклеотид или полинуклеотиды по п. 22.

24. Выделенная клетка, которая вырабатывает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-21, содержащая вектор экспрессии или векторы экспрессии по п. 23.

25. Фармацевтическая композиция для лечения диабета 2 типа, неалкогольного стеатогепатита (НАСГ), неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП), ожирения, дислипидемии, диабета 1 типа, сердечно-сосудистых заболеваний или метаболического синдрома, которая содержит эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-21 и фармацевтически приемлемый носитель.

26. Способ улучшения параметров метаболизма глюкозы у субъекта-человека, включающий введение указанному субъекту-человеку терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-21 или фармацевтической композиции по п. 25, отличающийся тем, что указанное улучшение параметров метаболизма глюкозы представляет собой:

(a) снижение уровней глюкозы;

(b) снижение уровней инсулина;

(c) повышенную чувствительность к инсулину;

(d) сниженную резистентность к инсулину;

(е) сниженный уровень глюкогона;

(f) улучшенную толерантность к глюкозе; и/или

(g) улучшенную функцию поджелудочной железы.

27. Способ по п. 26, характеризующийся тем, что субъект-человек страдает диабетом 2 типа, НАСГ, НАЖБП, дислипидемией, диабетом 1 типа, сердечно-сосудистым заболеванием, метаболическим синдромом или у субъекта ожирение.

28. Способ лечения сахарного диабета 2 типа у субъекта-человека, включающий введение указанному субъекту-человеку терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-21 или фармацевтической композиции по п. 25.

29. Способ лечения ожирения у субъекта-человека, включающий введение указанному субъекту-человеку терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-21 или фармацевтической композиции по п. 25.

30. Способ лечения НАСГ у субъекта-человека, включающий введение указанному субъекту-человеку терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-21 или фармацевтической композиции по п. 25.

31. Способ лечения НАЖБП у субъекта-человека, включающий введение указанному субъекту-человеку терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-21 или фармацевтической композиции по п. 25.

32. Способ по любому из пп. 26-31, характеризующийся тем, что указанный способ включает комбинированную терапию с применением одного или более дополнительных терапевтических агентов.

33. Способ улучшения метаболических параметров у субъекта-человека, включающий введение указанному субъекту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-21 или фармацевтической композиции по п. 25, характеризующийся тем, что улучшение метаболических параметров представляет собой:

(a) снижение массы тела;

(b) снижение индекса массы тела (BMI);

(c) снижение уровней глюкозы;

(d) снижение уровней инсулина; и/или

(е) снижение уровней триглицеридов.

34. Способ по п. 33, характеризующийся тем, что указанный способ включает комбинированную терапию с применением одного или более дополнительных терапевтических агентов.

35. Способ индукции FGF19-подобной передачи сигнала и/или FGF21-подобной передачи сигнала у субъекта-человека, включающий введение указанному субъекту-человеку терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-21 или фармацевтической композиции по п. 25.