Способ количественного определения дисульфирама в биологических средах
Владельцы патента RU 2701524:
федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр имени академика Е.Н. Мешалкина" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ им. ак. Е.Н. Мешалкина" Минздрава России) (RU)
Изобретение относится к способу количественного определения дисульфирама в биологических средах, включающему экстракцию определяемого вещества этилацетатом из биологической ткани с последующим определением его методом высокоэффективной жидкостной хромато-масс-спектрометрии с градиентным режимом элюирования с использованием в качестве подвижной фазы 0,1% раствора муравьиной или уксусной кислоты в воде и 0,1% раствора муравьиной или уксусной кислоты в метаноле или ацетонитриле. Способ позволяет количественно определять дисульфурам в различных биологических тканях. 1 ил., 9 табл., 9 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к патофизиологии, фармакологии и токсикологии, и может быть использовано для определения дисульфирама в биологических средах, в том числе в тканях мышцы и сердца млекопитающих.
В настоящее время разрабатываются новые лекарственные средства, содержащие дисульфирам. Одной из актуальных задач при разработке нового лекарственного средства является изучение его фармакокинетики с целью оценки всасывания, распределения, метаболизма и экскреции у животных и человека. Для проведения исследований фармакокинетики новых лекарственных средств требуется разработать биоаналитические методики количественного определения действующего вещества в биологических средах. В частности, для лекарственных препаратов местного действия, вводимых внутримышечно или интрамиокардиально (в сердечную мышцу), необходимо разработать методику количественного определения действующего вещества в таких биологических средах, как ткани мышцы и сердца.
Для количественного определения действующего вещества биологических средах, как правило, используются хроматографические методы, обладающие специфичностью, высокой чувствительностью, точностью и воспроизводимостью. Одним из самых распространенных для изучения фармакокинетики лекарственного средства является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрической детекцией (ВЭЖХ-МС/МС), который обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами, а именно: высокой чувствительностью, которая позволяет определять микроколичества вещества, и высокой скоростью анализа.
В настоящее время известны только способы количественного определения дисульфирама в крови и моче млекопитающих. Так, для определения дисульфирама в плазме человека применяют твердофазную экстракцию на стадии пробоподготовки, а для анализа использовали метод ВЭЖХ-МС/МС, в котором используют в качестве элюента смесь воды и метилового спирта (22:78), содержащих 0.1% муравьиной кислоты, при изократическом элюировании. Детектирование вели в режиме MRM с регистрацией перехода 296.95/115.94 (Zhang L., Jiang Y., Jing G., Tang Y., Chen X., Yang D., Zhang Y., Tang X. A novel UPLC-ESI-MS/MS method for the quantitation of disulfiram, its role in stabilized plasma and its application. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Set 2013, v. 937, p.54-59). В исследовании (V. О. Doroschuk, A.B. Grogul, Y.S. Mandzyuk, O.G. Makukha, N.O. Grytsyk. Cloud point extraction of disulfiram for its HPLC-MS/MS determination in synthetic urine. Chem. Papers 2016, v. 70 No. 10, p. 1316-1321) описан способ количественного анализа дисульфирама в искусственно приготовленной моче. Способ заключается в жидко-жидкостной мицеллярной экстракции образца мочи с последующим анализом экстракта методом ВЭЖХ-МС/МС.Хроматографическое разделение осуществляли с использованием колонки с обращено-фазным сорбентом С18, в качестве подвижной фазы выступали 0.25% водный раствор уксусной кислоты (элюент А) и ацетонитрил (элюент Б), элюирование проводили в градиентном режиме с увеличением доли элюента Б от 10% до 100%. Детектирование вели в режиме MRM с регистрацией перехода 297.3/116.0. Однако для определения дисульфирама в тканях мышцы и сердца данный способ не применим вследствие существенных отличий тканей мышцы и сердца как биологической матрицы от плазмы крови и мочи.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка нового высокоэффективного способа количественного определения дисульфирама в различных биологических тканях, включая ткани мышцы и сердца млекопитающих. Способ обладает требуемой точностью и прецизионностью внутри цикла для количественного определения дисульфирама в образцах гомогенатов тканей сердца млекопитающих, а также обладает требуемой правильностью и повторяемостью количественного определения дисульфирама в гомогенате тканей мышцы и сердца млекопитающих. Предлагаемое изобретение позволяет получить необходимую и достоверную информацию о способе количественного определения субстанции дисульфирама в биологических тканях, в том числе в тканях мышцы и сердца млекопитающих.
Поставленная задача решается способом количественного определения дисульфирама в биологических средах, в том числе в тканях мышцы и сердца млекопитающих, включающим экстракцию определяемого вещества этилацетатом из образца, представляющего собой гомогенат ткани в физиологическом растворе в соотношении 20:80 (масса органа, г/объем физиологического раствора, мл), с последующим определением его методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией с градиентным режимом элюирования с использованием в качестве компонентов подвижной фазы 0,1% водного раствора муравьиной кислоты или уксусной кислоты и 0,1% раствора муравьиной кислоты или уксусной кислоты в метаноле или ацетонитриле.
Наиболее оптимальными, но не необходимыми режимами высокоэффективной жидкостной хроматографии при этом являются:
| скорость подачи потока элюента | - 0,15 мл/мин; |
| объем вводимой пробы | - 10 мкл; |
| детектор | - тандемный масс-спектрометрический; |
| время анализа | - 8 мин; |
| температура термостата колонки | - 35°С. |
Осуществление предлагаемого способа представлено в примерах.
Пример 1. Подбор условий хромато-масс-спектрометрического анализа
Определение действующего вещества дисульфирам в биологических средах проводили методом ВЭЖХ-МС/МС на масс-спектрометре QTRAP 3200 (АВ Sciex, США) в комплексе с жидкостным хроматографом LC-20AD (Shimadzu, Япония).
Приготовление подвижной фазы А (ПФ А)
В мерную колбу вместимостью 2 л помещали 2 мл муравьиной кислоты, доводили объем раствора водой очищенной до метки и перемешивали.
Приготовление подвижной фазы Б (ПФ Б)
В мерную колбу вместимостью 1 л помещали 1 мл муравьиной кислоты, доводили объем раствора метанолом до метки и перемешивали.
Приготовление субстанции дисульфирама с концентрацией 0,1 мг/мл
Около 1 г (точная навеска) субстанции дисульфирама помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, прибавляют 8 мл ацетона и перемешивают до полного растворения, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.
Приготовление исходных градуировочных растворов субстанции дисульфирама
Из раствора субстанции дисульфирама с концентрацией 0,1 мг/мл методом последовательного разбавления ацетоном готовили растворы субстанции дисульфирама с концентрациями: 250, 200, 100, 50, 25, 10, 5 и 2,5 мкг/мл.
Подбор масс-спектрометрических условий
Раствор субстанции дисульфирама с концентрацией 500 нг/мл анализировали методом масс-спектрометрии при прямом вводе (без использования хроматографа) для получения полного масс-спектра.
При анализе раствора в режиме Q1 (простое сканирование масс) в диапазоне 50-400 Да наблюдается масс-спектр (представлен отдельным документом) с интенсивным ионом с m/z 297.4, соответствующий протонированной молекуле дисульфирама. При фрагментации этого иона в режиме низкой энергии соударения (СЕ=10 V) наблюдается образование осколков с m/z=116.1 и 88.1.
С целью получения наиболее интенсивных ионов-фрагментов проводили оптимизацию параметра СЕ (Collision Energy), в результате чего установили оптимальное значение данного показателя.
Исходя из проведенных экспериментов, количественное определение дисульфирама в образцах проводили по MRM-переходу 297.4 → 116.1.
Приготовление градуировочных растворов дисульфирама в гомогенатах тканей мышцы и сердца крыс
В пластиковую центрифужную микропробирку типа «Эппендорф» вместимостью 2 мл помещали 190 мкл холостого гомогената тканей мышцы или сердца крыс, прибавили 10 мкл градуировочного раствора субстанции дисульфирама различных концентрации, перемешивали на встряхивателе Microspin (Biosan, Латвия) при 2000 об/мин в течение 2 мин. Затем вносили 1 мл этилацетата, тщательно перемешивали на встряхивателе при 4000 об/мин в течение 10 мин. Полученную смесь центрифугировали при 11500 g в течение 5 мин. Отбирали 900 мкл органической фазы и упаривали ее под вакуумом до сухого остатка. К сухому остатку прибавляли 1000 мкл метанола и перемешивали на встряхивателе при 2000 об/мин в течение 10 мин. Полученный раствор центрифугировали при 11500 g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость использовали для хромато-масс-спектрометрического анализа.
Подготовка образцов гомогенатов тканей мышцы или сердца крыс, содержащих дисулъфирам
В пластиковую центрифужную микропробирку типа «Эппендорф» вместимостью 2 мл поместили 200 мкл гомогената тканей мышцы или сердца крыс, внесли 1 мл этилацетата, тщательно перемешивали на встряхивателе при 2000 об/мин в течение 10 мин. Полученную смесь центрифугировали при 11500 g в течение 5 мин. Отобрали 900 мкл органической фазы и упарили ее под вакуумом до сухого остатка. К сухому остатку прибавили 1000 мкл метанола и перемешали на встряхивателе при 2000 об/мин в течение 10 мин. Полученный раствор центрифугировали при 11500 g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость использовали для хромато-масс-спектрометрического анализа.
Хроматографические условия
| Скорость потока элюентов | - 0,15 мл/мин; |
| Температура термостата колонки | - 35±1°С; |
| Температура термостата автосамплера | - 10±1°С; |
| Объем вводимой пробы | - 10 мкл; |
| Время анализа | - 8 мин; |
| Время удерживания дисульфирама | - 5,8±0,2 мин. |
Масс-спектрометрические условия:
| Полярность | - положительная; |
| Источник ионов | - турбоэлектроспрей; |
| Напряжение источника ионов | - 5500 В; |
| Температура источника ионов | - 150°С; |
| Газ завесы | - азот, 25 psi; |
| Газ-распылитель | - воздух, 20 psi; |
| Газ-осушитель | - воздух, 20 psi; |
| Тип сканирования | - МС/МС; |
Режим: MRM
Количественное определение дисульфирама в образцах гомогенатов тканей мышцы и сердца проводили по MRM-переходу m/z 297.4→116.1, отвечающему наиболее интенсивному сигналу на масс-хроматограмме.
На фиг. 1 представлен масс-спектр распада дисульфирама при фрагментации иона 297.4
Пример 2 Оценка нижнего предела количественного определения субстанции дисульфирам в гомогенате тканей мышцы крысы с использованием уксусной кислоты в качестве модификатора элюента
Приготовление подвижной фазы А (ПФ А)
В мерную колбу вместимостью 2 л помещали 2 мл уксусной кислоты, доводили объем раствора водой очищенной до метки и перемешивали. Приготовление подвижной фазы Б (ПФ Б)
В мерную колбу вместимостью 1 л помещали 1 мл уксусной кислоты, доводили объем раствора метанолом до метки и перемешивали.
Хроматографические условия и условия детектирования на масс-спектрометре совпадают с условиями, приведенными в примере 1.
Устанавливали минимальную концентрацию аналита в гомогенатах тканей сердца крыс, которая может быть количественно определена в биологическом образце с требуемой прецизионностью. Критерии приемлемости: соотношение сигнал - шум должно составлять не менее 10/1.
Результаты оценки соотношения сигнал/шум для нижнего предела количественного определения дисульфирама в гомогенате тканей мышцы крысы приведены в таблице 1.
Соотношение сигнал/шум для пика дисульфирама с концентрацией 2,5 мкг/мл составляет 156, следовательно, концентрация равная 2,5 мкг/мл является нижним пределом количественного определения субстанции дисульфирама в образцах гомогената тканей мышцы крысы.
Пример 3. Оценка нижнего предела количественного определения субстанции дисульфирам в гомогенате тканей сердца крысы.
Приготовление подвижной фазы А (ПФ А)
В мерную колбу вместимостью 2 л помещали 2 мл муравьиной кислоты, доводили объем раствора водой очищенной до метки и перемешивали.
Приготовление подвижной фазы Б (ПФ Б)
В мерную колбу вместимостью 1 л помещали 1 мл муравьиной кислоты, доводили объем раствора ацетонитрилом до метки и перемешивали.
Хроматографические условия и условия детектирования на масс-спектрометре совпадают с условиями, приведенными в примере 1.
Устанавливали минимальную концентрацию аналита в гомогенатах тканей сердца крыс, которая может быть количественно определена в биологическом образце с требуемой прецизионностью. Критерии приемлемости: соотношение сигнал - шум должно составлять не менее 10/1.
Результаты оценки соотношения сигнал/шум для нижнего предела количественного определения дисульфирама в гомогенате тканей сердца крысы приведены в таблице 2.
Как видно из таблицы 2, соотношение сигнал/шум для пика дисульфирама с концентрацией 2,5 мкг/мл составляет 159:1, что удовлетворяет критерию -соотношение сигнал/шум не менее 10/1.
Пример 4. Оценка линейности количественного определения субстанции дисульфирама в гомогенатах тканей мышцы крысы.
Приготовление подвижной фазы А (ПФ А)
В мерную колбу вместимостью 2 л помещали 2 мл уксусной кислоты, доводили объем раствора водой очищенной до метки и перемешивали.
Приготовление подвижной фазы Б (ПФ Б)
В мерную колбу вместимостью 1 л помещали 1 мл уксусной кислоты, доводили объем раствора ацетонитрилом до метки и перемешивали.
Хроматографические условия и условия детектирования на масс-спектрометре совпадают с условиями, приведенными в примере 2.
Линейность - это способность методики давать величины, прямо пропорциональные концентрации (количеству) анализируемого вещества в образце. Для построения градуировочной кривой готовили и анализировали модельные образцы гомогенатов тканей мышцы крыс, содержащие дисульфирама в концентрациях: 2,5; 5, 10, 25, 50, 100, 200 и 250 мкг/мл, в таблице 3 представлены полученные результаты.
Уравнение градуировочной кривой имеет вид: у=130142 × - 73894.
Критерий приемлемости: квадрат коэффициента корреляции градуировочной кривой должен быть не менее 0,990. Полученные результаты удовлетворяют данному критерию, значение квадрата коэффициента корреляции составляет 0,9974.
Таким образом, подтверждена линейность биоаналитической методики в диапазоне концентраций от 2,5 до 250 мкг/мл. Рассматриваемый диапазон пригоден для количественного определения дисульфирама в гомогенате тканей мышцы крысы.
Пример 5. Оценка нижнего предела количественного определения субстанции дисульфирам в гомогенате тканей мышцы крысы с использованием муравьиной кислоты в качестве модификатора элюента
Нижний предел количественного определения представляет собой минимальную концентрацию анализируемого вещества в образце, которая может быть количественно определена с требуемой правильностью и прецизионностью.
Для установления нижнего предела количественного определения использовали соотношение сигнал/шум. Сравнивали величины сигналов, полученные для контрольного опыта (при отсутствии анализируемого вещества) и для образца с низкой концентрацией анализируемого вещества. Для нижнего предела количественного определения величина отношения сигнал/шум должна составлять не менее 10/1.
Подготовку к анализу и сам анализ проводили так, как указано в примере 1. Результаты оценки соотношения сигнал/шум для нижнего предела количественного определения дисульфирама в гомогенате тканей мышцы крысы приведены в таблице 4.
Соотношение сигнал/шум для пика дисульфирама с концентрацией 2,5 мкг/мл составляет 163, следовательно, концентрация равная 2,5 мкг/мл является нижним пределом количественного определения субстанции дисульфирама в образцах гомогената тканей мышцы крысы.
Пример 6. Оценка нижнего предела количественного определения субстанции дисульфирам в гомогенате тканей сердца крысы с использованием уксусной кислоты в качестве модификатора элюента
Устанавливали минимальную концентрацию аналита в гомогенатах тканей сердца крыс, которая может быть количественно определена в биологическом образце с требуемой прецизионностью. Критерии приемлемости: соотношение сигнал - шум должно составлять не менее 10/1.
Подготовку к анализу и сам анализ проводили так, как указано в примере 2. Результаты оценки соотношения сигнал/шум для нижнего предела количественного определения дисульфирама в гомогенате тканей сердца крысы приведены в таблице 5.
Как видно из таблицы 2, соотношение сигнал/шум для пика дисульфирама с концентрацией 2,5 мкг/мл составляет 159:1, что удовлетворяет критерию -соотношение сигнал/шум не менее 10/1.
Пример 7. Оценка линейности количественного определения субстанции дисульфирама в гомогенатах тканей сердца крысы
Для построения градуировочной кривой готовили и анализировали модельные образцы гомогенатов тканей мышцы крыс, содержащие дисульфирама в концентрациях: 2,5; 5, 10, 25, 50, 100, 200 и 250 мкг/мл, в таблице 6 представлены полученные результаты.
Уравнение градуировочной кривой имеет вид: у=236005 × - 272006.
Критерий приемлемости: квадрат коэффициента корреляции градуировочной кривой должен быть не менее 0,990. Полученные результаты удовлетворяют данному критерию, значение квадрата коэффициента корреляции составляет 0,9966.
Таким образом, подтверждена линейность биоаналитической методики в диапазоне концентраций от 2,5 до 250 мкг/мл. Рассматриваемый диапазон пригоден для количественного определения дисульфирама в гомогенате тканей сердца крысы.
Пример 8. Оценка точности и прецизионности количественного определения субстанции дисульфирама в гомогенатах тканей мышцы крысы
Для оценки точности и прецизионности готовили и анализировали модельные образцы гомогенатов тканей мышцы крыс, содержащие дисульфирам в концентрациях 2,5, 10, 100 и 200 мкг/мл, рассчитывая при этом количественное содержание по градуировочному графику. Точность рассчитывали методом «введено-найдено», в случае оценки прецизионности рассчитывали относительное среднеквадратическое отклонение (RSD). Результаты определения правильности и повторяемости приведены в таблице 7.
Полученные значения точности лежат в диапазоне 96,7-103,6%, что соответствует требованиям (85-115%), величины относительного стандартного отклонения также соответствуют требованиям - не более 15%.
Пример 9. Оценка точности и прецизионности количественного определения субстанции дисульфирама в гомогенатах тканей сердца крысы
Для оценки точности и прецизионности готовили и анализировали модельные образцы гомогенатов тканей сердца крыс, содержащие дисульфирам в концентрациях 2,5, 10, 100 и 200 мкг/мл, рассчитывая при этом количественное содержание по градуировочному графику. Точность рассчитывали методом «введено-найдено», в случае оценки прецизионности рассчитывали относительное среднеквадратическое отклонение (RSD). Результаты определения правильности и повторяемости приведены в таблице 8.
Рассчитанные значения точности между циклами варьируются в пределах 97,2-105,5%. Полученные величины относительного стандартного отклонения соответствуют требованиям - не более 15%.
Таким образом, разработанная методика обладает требуемой точностью и прецизионностью внутри цикла для количественного определения дисульфирама в образцах гомогенатов тканей сердца крыс.
В результате проведенных экспериментов доказано, что разработанная биоаналитическая методика количественного определения дисульфирама в гомогенате тканей мышцы и сердца крысы обладает требуемой правильностью и повторяемостью.
Как видно из приведенных примеров, предлагаемое изобретение позволяет получить необходимую и достоверную информацию о способе количественного определения субстанции дисульфирама в биологических средах, в том числе в тканях мышцы и сердца млекопитающих.
Способ количественного определения дисульфирама в биологических средах, включающий экстракцию определяемого вещества этилацетатом из биологической ткани с последующим определением его методом высокоэффективной жидкостной хромато-масс-спектрометрии с градиентным режимом элюирования с использованием в качестве подвижной фазы 0,1% раствора муравьиной или уксусной кислоты в воде и 0,1% раствора муравьиной или уксусной кислоты в метаноле или ацетонитриле.
